專利名稱：：一種檢測乳蛋白含量的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及乳蛋白檢測領(lǐng)域，特別涉及一種檢測乳蛋白含量的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑盒及方法，適用于原料乳、乳制品、食品及飼料等乳蛋白含量的檢測。
背景技術(shù)：
：牛奶是一種組成復(fù)雜、結(jié)構(gòu)有序、具有膠體溶液特征的生物營養(yǎng)溶液，牛奶的營養(yǎng)素全面、易吸收，牛奶中含有的各種化學(xué)成分都是人體所必需的營養(yǎng)素，也是常人膳食中植物性蛋白質(zhì)的重要補(bǔ)充。牛奶中大約含有3000種化合物，其中主要成分有水、脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖和礦物質(zhì)，其微量成分有維生素、酶類、奩脂、色素、激素及生長因子、有機(jī)酸、氣體和體細(xì)胞等。牛奶中各主要成分的含量因牛種和品種(遺傳因素)、年齡和胎次、泌乳階段和季節(jié)、飼養(yǎng)管理條件、產(chǎn)奶水平和擠奶技術(shù)，以及奶牛的個體特征和健康狀況等有一定的差別。牛奶約含3.5%的乳蛋白質(zhì)(人奶約1.25%)，包括酪蛋白、a_乳清蛋白、乳球蛋白、乳球蛋白和脂球膜蛋白、多種酶類等，其中以酪蛋白為主占蛋白總量86%左右，其次為a-乳清蛋白約占總蛋白量的9%，乳球蛋白占總蛋白量的3%左右，它們都含有全部必須的氨基酸，其相對含量與雞蛋蛋白近似，消化率較高，為96.1%。乳蛋白質(zhì)含量是牛奶最重要的質(zhì)量指標(biāo)之一，對于制造干酷和酸奶等乳制品的原料奶尤其重要，國家規(guī)定，只有乳蛋白質(zhì)含量>的飲品才允許稱為含乳飲料。牛奶中的酶有來母牛乳腺組織、血漿及白細(xì)胞的，稱為原生酶，有來自微生物代謝產(chǎn)物的，稱為細(xì)菌酶，有幾種酶被用來控制和檢驗(yàn)牛奶質(zhì)量，最重要的有過氧化氫酶、酌酸酶和解脂酶等，牛奶中的酶對牛奶加工和乳品保存等方面都有影響。乳過氧化物酶是一種血紅素蛋白存在于乳中，牛奶中正常含量為30μg/ml，其分子量為77.5ku。乳過氧化物酶/硫氰酸鹽/過氧化氫(LP/SCN/H202)，簡稱為乳過氧化物酶體系(LP體系)，在牛奶中起強(qiáng)有力的抗菌作用，是牛乳天然抗菌能力的物質(zhì)基礎(chǔ)。牛奶及乳制品的蛋白質(zhì)含量檢測的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)化學(xué)定氮法測算總氮含量來推算蛋白質(zhì)含量，這也是國際通用的方法，但是這種方法不能分辨蛋白質(zhì)的真?zhèn)?，尤其是不能識別化學(xué)物質(zhì)如三聚氰胺、尿素等添加后轉(zhuǎn)變成的“蛋白質(zhì)”，“大頭娃娃米粉”、“三聚氰胺牛奶”事件的發(fā)生和蛋白含量檢測方法的落后有直接的關(guān)系。能夠精確定量檢測原料乳及乳制品中特定蛋白含量的方法有高效液相色譜、毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜聯(lián)用檢測，這些儀器設(shè)備非常昂貴需要數(shù)百萬元，日常維護(hù)和運(yùn)行成本也很大，并且需要對樣品進(jìn)行繁瑣的預(yù)處理，不適合生產(chǎn)中的常規(guī)檢查?，F(xiàn)在已有采用酶聯(lián)免疫方法檢測牛奶及奶制品中的三聚氰胺，但是非均相反應(yīng)，需要反復(fù)清洗與分離，檢測程序繁瑣、耗時長、靈敏度和自動化程度不高，還有些比較方便快速的檢測方法只能定性檢測一個大致的含量范圍不能定量。光激化學(xué)發(fā)光免疫定量法是在化學(xué)發(fā)光免疫分析的基礎(chǔ)上引入激光激發(fā)和納米微球技術(shù)，采用抗體特異性免疫捕獲目標(biāo)分子，以發(fā)光物質(zhì)作為信號放大系統(tǒng)，通過測定發(fā)光強(qiáng)度檢測免疫結(jié)合程度來定量，目標(biāo)分子濃度和發(fā)光強(qiáng)度之間有很好的線性關(guān)系。光激化學(xué)發(fā)光免疫定量法成功的解決了上述檢測方法的不足，因?yàn)榉磻?yīng)是在均相進(jìn)行，操作簡單，樣品不需要預(yù)處理，既加快了反應(yīng)速度，又避免了反復(fù)分離與清洗的過程，可實(shí)現(xiàn)自動化操作，由于其高度的特異性、抗干擾、測量速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，有很好的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、靈敏度高的特異性檢測乳蛋白含量的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑盒及方法。本發(fā)明通過將乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的乳蛋白抗體(乳蛋白抗體與生物素的偶聯(lián)物)以及親和素包被的感光微粒，與被檢測樣品混合后，在均相條件下，乳蛋白抗體可迅速特異性捕獲樣品中的乳蛋白，形成感光微粒_抗體_乳蛋白_抗體_發(fā)光微粒復(fù)合體，在激光激發(fā)下，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為高能態(tài)離子氧，發(fā)光微粒在近距離接受離子氧的激發(fā)后發(fā)射高能級光子，用光子計數(shù)器檢測這些高能級光子，光子數(shù)的多少即精確地反應(yīng)乳蛋白分子的濃度，兩者之間有良好的線性關(guān)系，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線將光強(qiáng)度換算成乳蛋白濃度。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，反應(yīng)中的高能態(tài)離子氧在溶液中生存時間只有4微秒，可傳播直徑約為200nm，當(dāng)樣本中不含乳蛋白時，不能形成雙抗體夾心的復(fù)合體，因距離太遠(yuǎn)活性氧離子無法傳遞到發(fā)光微粒表面就已經(jīng)在溶液中迅速淬滅，發(fā)光微粒不能被激發(fā)無高能級光子產(chǎn)生。檢測時原料乳及乳制品等樣品不需要預(yù)處理可直接測定，仍然有很低的檢測背景值。因此，本發(fā)明通過下列技術(shù)方案來解決上述問題一種檢測乳蛋白含量的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑盒，其中包括乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的乳蛋白抗體、親和素包被的感光微粒以及緩沖液溶劑。根據(jù)本發(fā)明，所說的乳蛋白是指哺乳動物乳如牛乳、羊乳或馬乳等乳中含有的蛋白質(zhì)，例如酪蛋白、a-乳清蛋白、乳球蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、酌酸酶及解脂酶等；相應(yīng)地，所說的乳蛋白抗體可以是以上述乳蛋白為抗原，以兔、鼠、羊等為免疫動物制備的單克隆抗體或多克隆抗體，包括各種亞型，本發(fā)明的試劑盒中使用的乳蛋白抗體可以選擇其中的一個或多個，通?？梢詮氖袌鲑彽?。本發(fā)明優(yōu)選兔抗牛的α-酪蛋白(a-casein)多克隆抗體、兔抗牛的α-乳清蛋白(α-lactalbumin)多克隆抗體作為乳蛋白抗體為例來具體說明。較佳地，試劑盒中還包括乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，可以是以上抗體對應(yīng)的抗原，本發(fā)明的試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)選0.1μg/ml酪蛋白溶液、0.1μg/ml的a_乳清蛋白溶液。根據(jù)本發(fā)明，所述的緩沖液溶劑，即乳蛋白檢測時的反應(yīng)溶液的溶劑可以是常規(guī)的適合抗原抗體反應(yīng)的溶劑體系，如HEPES緩沖體系、Tris緩沖體系等。但本發(fā)明優(yōu)選HEPES緩沖體系，可使檢測方法更穩(wěn)定。更優(yōu)選地，所述的緩沖液溶劑為pH8.0,0.025M的HEPES緩沖體系。所述的PH8.00.025M的HEPES緩沖溶液每IOOOml含有HEPES6g,BSAlg,GlycerIOOg,Dextran-500lg，TritonX-IOO5g,EDTA-Na-2H200.372g,Proclin-3000.5g。所述的緩沖液溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護(hù)作用的物質(zhì)，以及防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑如Tween20，出于對試劑防腐及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優(yōu)選100U/ml慶大霉素和0.05v/v%&Proclin300[2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MCI)]作為防腐劑。根據(jù)本發(fā)明，上述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒，其中，發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)乙烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/Τ0Ρ0或Eu(TTA)3/Phen等，這些微?？捎墒袌錾腺彽?。發(fā)光微粒的發(fā)光量會直接影響最終檢測的發(fā)光效果，市場提供的發(fā)光微粒發(fā)光量一般會在50，00010，000,000光子數(shù)/IOOug發(fā)光微粒范圍內(nèi)，本發(fā)明優(yōu)選150，000350，000光子數(shù)/IOOug發(fā)光微粒。由于最終的檢測反應(yīng)是均相反應(yīng)，發(fā)光微粒的粒徑太小(<50nm)，會使制備過程中的清洗工作比較困難，不利于抗體連接，因此發(fā)光微粒的粒徑范圍應(yīng)在50400nm之間，較好為100300nm之間，優(yōu)選250nm。發(fā)光微粒的表面官團(tuán)可以是任何能連接蛋白質(zhì)的基團(tuán)，如羧基、醛基、胺基、環(huán)氧乙基或鹵代烷基等各種已知的可以連接蛋白質(zhì)的官能團(tuán)，最優(yōu)化的微粒表面官能團(tuán)為羧基或醛基，不同的微粒表面官能團(tuán)，連接抗體的反應(yīng)方式和條件也不相同。醛基表面的微粒有很好的親水性，顆粒均勻穩(wěn)定，微粒表面容易修飾，并且與蛋白的反應(yīng)比較容易，采用NaBH3CN還原胺化反應(yīng)，反應(yīng)生成的碳氮鍵穩(wěn)定，抗體連接的效率高，重復(fù)性好，本發(fā)明選取醛基作為連接蛋白的官能團(tuán)。較佳的，所述的乳蛋白抗體包被的發(fā)光微?？捎上率龇椒ㄖ频?)混合將發(fā)光微粒與乳蛋白抗體混合于MES緩沖液中，其中發(fā)光微粒的濃度為1040mg/ml；2)反應(yīng)加入MES緩沖液配制的NaBH3CN溶液混合并反應(yīng)；3)封閉加入MES緩沖液配制的Glycin(甘氨酸)及NaBH3CN溶液，混勻反應(yīng)后，再加入BSA溶液封閉；4)清洗產(chǎn)物，獲得乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒。較佳地，步驟1)中每Img發(fā)光微粒加入0.052mg的乳蛋白抗體。其中，上述步驟1)_3)中的緩沖液可以是相同的反應(yīng)緩沖液，可為MES緩沖液、磷酸緩沖液，優(yōu)選MES緩沖液，濃度優(yōu)選0.05M,pH為6.0。步驟4)清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步驟采用反應(yīng)緩沖液透析，每次45小時，更換緩沖液4次。透析清洗操作時間較長，且微粒損失較多，造成收率降低。離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應(yīng)緩沖液洗滌，超聲處理打開沉淀，如此反復(fù)35次。離心法清洗時離心力會使發(fā)光微粒暫時聚集在一起，但經(jīng)過超聲處理可以很容易再次分散打開，此法操作時間短，且收率較高。因此本發(fā)明優(yōu)選采用離心法清洗方式。根據(jù)本發(fā)明，所述生物素標(biāo)記的乳蛋白抗體中，生物素標(biāo)記抗體的方法采用常規(guī)的方法(《生物實(shí)驗(yàn)室系列一分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)進(jìn)行，生物素與抗體的摩爾比較佳為5501，優(yōu)選301。根據(jù)本發(fā)明，所述親和素包被的感光微粒可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備(馬宏偉，趙衛(wèi)國，潘柏申，血清心肌肌鈣蛋白I光激化學(xué)發(fā)光免疫測定法的建立[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2007，22(4)398-401)，親和素包被的感光微粒采用NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制備，親和素(Avidin)與感光微粒的質(zhì)量比例無特殊限制，較佳為1310，優(yōu)選15。市售感光微粒均適用于本發(fā)明，微粒粒徑較佳為180260nm，優(yōu)選220nm。本發(fā)明采用上述的試劑盒檢測乳蛋白的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量方法，其可包括下列步驟1)在反應(yīng)孔中加入稀釋后的待測樣品、加有緩沖液溶劑的乳蛋白抗體包被的發(fā)光微?；鞈乙杭吧锼貥?biāo)記的乳蛋白抗體混懸液，獲得初始反應(yīng)溶液，充分混合；2)加入加有緩沖液溶劑的親和素包被的感光微?；鞈乙韩@得最終反應(yīng)溶液進(jìn)行反應(yīng)；3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號值。較佳地，步驟1)中的乳蛋白抗體包被的發(fā)光微?；鞈乙旱臐舛葹?0μg/ml，生物素標(biāo)記的乳蛋白抗體混懸液的濃度為4μg/ml；步驟2)中的親和素包被的感光微?；鞈乙旱臐舛葹?0μg/ml。步驟2)所述的反應(yīng)條件可同常規(guī)。步驟3)可采用現(xiàn)有技術(shù)，所述的激發(fā)光光源波長范圍為600800nm，優(yōu)選640680nm；發(fā)射光檢測波長范圍為500680nm，優(yōu)選610620nm。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法以納米級高分子微粒為基礎(chǔ)，采用特異性抗體免疫捕獲和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的定量檢測技術(shù)來測定樣本中酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等乳蛋白含量，用于判斷產(chǎn)品的質(zhì)量優(yōu)劣，具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏、高通量和操作簡單的特點(diǎn)，使用本發(fā)明的乳蛋白定量檢測方法替代非特異性的化學(xué)定氮法檢測乳蛋白含量，可以用于特異性、快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測乳及乳制品、蛋白類食品、飼料等產(chǎn)品中的乳蛋白含量，從而從根本上杜絕在產(chǎn)品中摻入含氮化合物或非乳蛋白的蛋白質(zhì)冒充乳蛋白含量的事件。圖1是實(shí)施例4.1組配的試劑盒的特異性檢測結(jié)果圖。檢測樣品分別是牛奶、酸奶、a_酪蛋白溶液、水、豆?jié){、牛血清白蛋白水溶液、水解酪蛋白溶液和魚蛋白水溶液，縱坐標(biāo)是光量子讀數(shù)反映樣品中酪蛋白含量的高低。圖2是酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖圖3是實(shí)施例4.2組配的試劑盒測定的a_乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。在下述實(shí)施例中，原料、試劑、儀器來源如下，其中所說的乳蛋白或乳蛋白抗體是以α-酪蛋白及其兔抗牛的多克隆抗體，α-乳清蛋白及其鼠抗牛的多克隆抗體，和乳過氧化物酶及其兔抗牛的多克隆抗體為例來說明。原料及試劑廠家酪蛋白抗體AbcamSSSSCaseinproteinSigmaα-乳清蛋白抗體α-lactalbumin-antibodyBethylα-乳清蛋白α-IactalbuminproteinSigma生物素Biotin-X-X-NHSSigmaTLC595%4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES華美生物工程公司三羥甲基氨基甲烷乙酸鹽TrisSigma牛血清白蛋白BSAEquitech/proteasefree甘氨酸Sigma氰硼氫化鈉NaBH3CNAcros感光微粒(粒徑220nm)博陽生物科技公司發(fā)光微粒(粒徑150-300nm)博陽生物科技公司儀器型號廠家粒徑儀Model370Nicomp酶標(biāo)儀MultiSKANMK3Iabsystem紫外可見分光光度計752P上海光譜有限公司熒光分光光度計F95上海棱光技術(shù)有限公司光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)博陽生物科技公司各個反應(yīng)體系緩沖液配制1)ρΗ8.0的HEPES緩沖液成分為0.05MHEPES、0.3MNaCl禾口0.0015MEDTA-Na-2H20，還含有0.lw/v%&BSA及100U/ml慶大霉素和質(zhì)量百分比為0.05%的Proclin300。2)pH8.0的Tris緩沖液的成分為0.IMTris,0.3MNaCl和0.0015MEDTA-Na-2H20，0.lw/v%的BSA及100U/ml慶大霉素和質(zhì)量百分比為0.05%的Proclin300。3.樣品稀釋緩沖液溶劑配制是PH8.025mMHEPES緩沖液每1000ml含有HEPES6g,BSAlg,Glycer100g,Dextran-500lg,TritonX_1005g，EDTA_Na_2H200.372g,Proclin-3000.5g。實(shí)施例1乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒的制備制備方法1)發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦“l(fā)光微粒于高速冷凍離心機(jī)中12000rpm離心30分鐘，棄去上清，加入一定量0.05M、pH6.0的MES緩沖液(以下簡稱MES反應(yīng)緩沖液)，超聲使微粒重新懸浮，用MES反應(yīng)緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理用MES反應(yīng)緩沖液透析乳蛋白抗體，透析完成后測定濃度，并用MES反應(yīng)緩沖液調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。3)以125的體積比將MES反應(yīng)緩沖液、步驟2)的乳蛋白抗體溶液、步驟1)的發(fā)光微粒混懸液及三部分進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。4)用MES反應(yīng)緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與步驟3)所得反應(yīng)液125的體積比加入，迅速混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時。5)用MES反應(yīng)緩沖液配制75mg/ml的Glycin溶液和25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與步驟4)所得反應(yīng)液2110的體積比加入步驟4)所得反應(yīng)液中，混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時。6)用MES反應(yīng)緩沖液配制200mg/ml的BSA溶液，其與步驟5)所得反應(yīng)液體積比為58，迅速混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時。7)用0.05M、pH8.0的MES緩沖液12000rpm離心3min,清洗三次，最后用pH8.0的MES緩沖液進(jìn)行懸浮，測定粒徑在150300nm范圍，用pH8.0的MES緩沖液調(diào)節(jié)溶液體積使固體含量為10mg/ml。實(shí)施例2乳蛋白抗體與生物素偶聯(lián)物的制備制備方法1)抗體處理按常規(guī)將乳蛋白抗體用0.1MNaHC03溶液透析，測定抗體濃度并調(diào)節(jié)至lmg/ml02)按常規(guī)用DMS0配制16.17mg/ml的Biotin(生物素)溶液。3)標(biāo)記取步驟1)處理好的lmg/ml乳蛋白抗體與步驟2)配好的Biotin溶液，按照生物素和抗體溶液201的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，28°C靜置反應(yīng)1216小時。4)按常規(guī)將反應(yīng)好的乳蛋白抗體與生物素的偶聯(lián)物用pH8.OTris緩沖液透析。5)將步驟4)透析好的生物素和抗體的偶聯(lián)物吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測定抗體濃度，PH8.OTris緩沖液調(diào)節(jié)濃度至0.5mg/ml。6)按照步驟3)將生物素與抗體按照不同體積比制備偶聯(lián)物，用pH8.OTris緩沖液稀釋成g/ml，按照實(shí)施例5方法檢測lOOng/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液每孔發(fā)光光子量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從發(fā)光強(qiáng)度判斷，20401比較好，優(yōu)選301，但是不同的抗體之間有一定的差距。實(shí)施例3親和素包被的感光微粒的制備可以采用現(xiàn)有技術(shù)，具體制備方法如下1)感光微?；鞈乙禾幚磉x用粒徑為220士40nm的感光微粒，吸取一定量的感光微粒于高速冷凍離心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲震蕩至微粒重新懸浮，加入MES反應(yīng)緩沖液調(diào)節(jié)感光微粒濃度至100mg/ml。2)親和素溶液配制稱量一定量Avidin，加MES反應(yīng)緩沖液溶解至8mg/ml。3)混合將處理好的感光微?；鞈乙?、8mg/ml的親和素以及MES反應(yīng)緩沖液，以2:5:1的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。4)反應(yīng)MES反應(yīng)緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與步驟3)的反應(yīng)液125的體積比加入，迅速混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時。5)封閉MES緩沖液配制75mg/ml的Glycin溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與步驟4)的反應(yīng)液2110的體積比加入步驟4)的溶液中，混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時。6)再加入200mg/ml的BSA溶液(MES反應(yīng)緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為58，迅速混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時。7)清洗向反應(yīng)好的溶液中加入pH8.0MES緩沖液，高速冷凍離心機(jī)離心，棄上清，加入新鮮PH8.0的MES緩沖液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最后用少量的緩沖液溶劑進(jìn)行懸浮，測定固含量，用緩沖液溶劑調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。實(shí)施例4試劑盒的組配4.1組建檢測乳蛋白的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑盒，使其包含下列組分，其中乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒、乳蛋白抗體和生物素偶聯(lián)物和親和素包被的感光微粒以緩沖液溶劑為溶劑介質(zhì)配成實(shí)際檢測所需濃度的混懸液，所述濃度可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。1)試劑a50ug/ml酪蛋白抗體包被的發(fā)光微粒混懸液2)試劑b:4yg/ml酪蛋白抗體和生物素偶聯(lián)物混懸液3)試劑c80ug/ml親和素包被的感光微?；鞈乙?)標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ug/ml酪蛋白溶液4.2組建檢測乳蛋白的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑盒，使其包含下列組分1)試劑a50ug/mla-乳清蛋白抗體包被的發(fā)光微?；鞈乙?)試劑b:4yg/mla-乳清蛋白抗體和生物素偶聯(lián)物混懸液3)試劑c80ug/ml親和素包被的感光微?；鞈乙?)標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ug/ml的a-乳清蛋白溶液。實(shí)施例5牛奶樣品中酪蛋白濃度檢測5.1用試劑盒檢測牛奶中酪蛋白含量分別取10ii、9.5ii、10.5iU牛奶(超市購買盒裝)加樣品緩沖液至1ml，混合均勻，從中吸取lOiil加樣品緩沖液至1ml，混合均勻，再次從中吸取10i!加樣品緩沖液至lml，混合均勻，為樣品檢測溶液。移液器吸取檢測溶液5yl于96孔檢測板，依次加入10yl試劑a(50i!g/ml酪蛋白抗體包被的發(fā)光微粒)和lOyl試劑b(4yg/ml酪蛋白抗體和生物素偶聯(lián)物)，將檢測板放入檢測儀，設(shè)定程序條件為振動，37°C孵育20min，加入25iU試劑c(80ug/ml親和素包被的感光微粒)，37°C孵育15min，680nm激發(fā)光逐孔照射，檢測波長610620nm，檢測發(fā)光光子量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中乳蛋白的濃度，也可以用回歸方程法計算出樣本中乳蛋白的含量。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>5.2試劑盒特異性試驗(yàn)分別取0.lml牛奶、酸奶、酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液、水、豆?jié){、牛血清白蛋白水溶液、水解酪蛋白、魚蛋白水溶液，按照5.1中的方法，檢測發(fā)光光子量，比較試劑盒的特異性，結(jié)果見下圖。5.3試劑盒線性檢測取適量0.1ug/ml的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液用樣品緩沖液稀釋配成0.001ug/ml、0.006ug/ml,0.01ug/ml,0.03ug/ml,0.06ug/ml,0.1ug/ml共6個濃度的酪蛋白定標(biāo)溶液，按照上述5.1中的方法測定乳蛋白的濃度，重復(fù)3次求平均值，做線性分析，R2=0.9924。實(shí)施例6牛奶中a-乳清蛋白濃度檢測6.1用試劑盒進(jìn)行檢測取0.lml牛奶(超市購買盒裝)加樣品緩沖液至1ml，混合均勻，從中吸取0.01ml加樣品緩沖液至1ml，混合均勻，再次從中吸取0.01ml加樣品緩沖液至1ml，混合均勻，為樣品檢測溶液。移液器吸取檢測溶液5ill于96孔檢測板，依次加入10u1試劑a(50ug/mla-乳清蛋白抗體包被的發(fā)光微粒)和10yl試劑b(4ug/mla-乳清蛋白抗體和生物素偶聯(lián)物)，將檢測板放入檢測儀，設(shè)定程序條件為振動，37°C孵育20min，自動加入25yl試劑c(80ug/ml親和素包被的感光微粒)，37°C孵育15min，680nm激發(fā)光逐孔照射，檢測波長610620nm，檢測發(fā)光光子量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中a_乳清蛋白的濃度，也可以用回歸方程法計算出樣本中乳清蛋白的含量。利用專業(yè)電腦軟件可以直接讀取濃度結(jié)果，便于大量樣本的快速分析。6.2試劑盒精密度試驗(yàn)取二個已知濃度的a_乳清蛋白溶液于同一個96孔檢測板，每孔5yl共加9孔，按照6.1中的方法，測定a_乳清蛋白濃度，計算變異系數(shù)CV%。結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在6.27.2%之間，變異系數(shù)小于10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>6.3試劑盒線性檢測取適量0.1ug/ml的a-乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液用樣品測定緩沖液稀釋配成lOOng/ml,30ng/ml,10ng/ml,3ng/ml,lng/ml,0.3ng/ml共6個濃度的a_乳清蛋白定標(biāo)溶液，用緩沖液為空白對照，按照上述6.1中的方法測定乳蛋白的濃度，重復(fù)3次求平均值，做線性分析，R2=0.9988。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求一種檢測乳蛋白的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑盒，其特征在于其包括乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的乳蛋白抗體、親和素包被的感光微粒以及緩沖液溶劑。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的緩沖液溶劑為PH8.025mMHEPES緩沖液。3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的PH8.025mMHEPES緩沖液每IOOOml含有HEPES6g,BSAlg,Glycer100g,Dextran-500lg，TritonX-1005g，EDTA-Na_2H200.372g,Proclin-3000.5g。4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒由下述方法制得1)混合將發(fā)光微粒與乳蛋白抗體混合于MES緩沖液中，其中發(fā)光微粒的濃度為1040mg/ml；2)反應(yīng)加入MES緩沖液配制的NaBH3CN溶液混合并反應(yīng)；3)封閉加入MES緩沖液配制的Glycin及NaBH3CN溶液，混勻反應(yīng)后，再加入BSA溶液封閉；4)清洗產(chǎn)物，獲得乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于步驟1)中每Img發(fā)光微粒加入0.052mg的乳蛋白抗體。6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的MES緩沖液的濃度為0.05M、pH為6.0。7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的乳蛋白選自酪蛋白、乳清蛋白和乳鐵蛋白。8.一種采用如權(quán)利要求17任一項所述的試劑盒檢測乳蛋白的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量方法，其特征在于包括下列步驟1)在反應(yīng)孔中加入稀釋后的待測樣品、加有緩沖液溶劑的乳蛋白抗體包被的發(fā)光微?；鞈乙杭吧锼貥?biāo)記的乳蛋白抗體混懸液，獲得初始反應(yīng)溶液，充分混合；2)加入加有緩沖液溶劑的親和素包被的感光微粒混懸液獲得最終反應(yīng)溶液進(jìn)行反應(yīng)；3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號值。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟1)中的乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒混懸液的濃度為50μg/ml，生物素標(biāo)記的乳蛋白抗體混懸液的濃度為4μg/ml；步驟2)中的親和素包被的感光微?；鞈乙旱臐舛葹?0μg/ml。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟3)所述的激發(fā)光光源波長范圍為600800nm；發(fā)射光檢測波長范圍為500680nm。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測乳蛋白的光激化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑盒和方法。該試劑盒包括乳蛋白抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的乳蛋白抗體、親和素包被的感光微粒以及緩沖液溶劑。本發(fā)明的試劑盒和方法可以快速、靈敏、準(zhǔn)確、專一性測定原料乳和乳制品及其他產(chǎn)品中酪蛋白、乳清蛋白等乳蛋白含量。文檔編號G01N21/63GK101813699SQ20091020582公開日2010年8月25日申請日期2009年10月9日優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日發(fā)明者毛曉伏申請人:毛曉伏