專利名稱：：一種快速測(cè)定奶牛亞臨床酮病的試紙制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動(dòng)物疾病檢測(cè)試劑開發(fā)領(lǐng)域，特別是一種制備快速測(cè)定奶牛亞臨床酮病測(cè)試試紙的方法。二、
背景技術(shù)：
隨著奶牛產(chǎn)量的不斷提高和集約化飼養(yǎng)程度的不斷加強(qiáng)，奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝病的發(fā)病率逐年上升，其中酮病是高產(chǎn)奶牛常見的一種代謝性疾病，它主要是由糖類和脂類代謝紊亂引起，通常發(fā)生于產(chǎn)后一個(gè)月。調(diào)查顯示，我國(guó)奶牛酮病的發(fā)病率占泌乳牛的10%-30%,亞臨床酮病的發(fā)生率則更高，據(jù)研究報(bào)道，在泌乳前九周，奶牛亞臨床酮病的發(fā)病率達(dá)59%。亞臨床酮病的發(fā)病率是臨床酮病的10-20倍，但由于缺乏可見的臨床癥狀而不易被發(fā)現(xiàn)，因此給我國(guó)奶牛業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)亞臨床酮病可進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，目前普遍認(rèn)為，血清中β-羥丁酸含量超過1.2mm0l/L就可認(rèn)為奶?；紒喤R床酮病。然而，對(duì)農(nóng)戶來說，采集血樣十分不易，采集尿樣或乳樣檢測(cè)亞臨床酮病就比較簡(jiǎn)單。國(guó)外對(duì)酮病比較重視，研究出了許多快速檢測(cè)尿和乳中酮體的方法及防治手段，如歐洲這種檢測(cè)試條被稱為KetolacBHB,在日本被稱為Sanketopaper，在加拿大被稱為Keto-Test0此外，還有用于人醫(yī)上的商品尿酮體試劑帶和酶法酮體試劑盒等，在人類糖尿病和酮癥酸中毒的診斷取得了較好的效果。但這類試劑用于奶牛的酮病檢測(cè)價(jià)格高昂。而國(guó)內(nèi)對(duì)酮病的重視不夠，快速檢測(cè)方法單一，防治手段跟不上，多年來，堿性亞硝基鐵氰化鈉(酮粉法)試驗(yàn)一直用于酮體的半定量分析，是臨床上初步診斷奶牛亞臨床酮病的一種簡(jiǎn)便方法，但其靈敏度和特異性較低，而且定量測(cè)定乳汁酮體含量來檢測(cè)亞臨床酮病的報(bào)道幾乎沒有。為此，研究開發(fā)成本低、簡(jiǎn)便易行的測(cè)試方法應(yīng)用于奶牛亞臨床酮病檢測(cè)具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速測(cè)定奶牛亞臨床酮病的試紙制備方法，以血中β_羥丁酸濃度>1.2mmol/L為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，開發(fā)尿酮體試劑，具有高特異性和靈敏度，同時(shí)成本低，簡(jiǎn)便易行，結(jié)果迅速，可檢測(cè)多種受測(cè)樣品如血、尿、血清、血漿及乳。具體為一種快速測(cè)定奶牛亞臨床酮病的試紙制備方法為步驟一，將用熱水浴中溶解的阿拉伯樹膠中加入硼酸、氨基乙酸、乙二胺四乙酸二鈉溶液并用氫氧化鈉調(diào)整PH值為7.0后，趁熱浸泡試紙20min，最后于60°C干燥箱烘干，并置干燥箱內(nèi)過夜；步驟二，熱水浴中溶解聚乙二醇、亞硝基鐵氰化鈉、無水乙醇，趁熱浸泡上述試紙20min，取出試紙用濾紙吸干后置于60°C干燥箱烘干，并置干燥箱過夜，即成。本發(fā)明是一種經(jīng)生產(chǎn)實(shí)踐證明的可用于快速篩選奶牛亞臨床酮病的試紙制備方法，該試劑條以血中β-羥丁酸濃度>1.2mmol/L為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)生產(chǎn)實(shí)踐證明成本低，簡(jiǎn)便易行，結(jié)果迅速，具有高特異性和靈敏度，多種受測(cè)樣品如血、尿、血清、血漿及乳均可采用，適用范圍較廣。具體實(shí)施例方式一種快速測(cè)定奶牛亞臨床酮病的試紙制備方法，其具體組分為阿拉伯樹膠、硼砂、氨基乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、聚乙二醇2000、亞硝基鐵氰化鈉和無水乙醇。具體制備方法為步驟一，取阿拉伯樹膠60g于燒杯中，加蒸餾水600ml將燒杯置于熱水浴中使溶解，放置過夜。第二天取清亮液(去雜質(zhì))加熱后，加入硼砂60g、氨基乙酸100g、乙二胺四乙酸二鈉30g，溶解后溶液溫度約40°C，pH約為7.0(可用pH5.5-9試紙測(cè)定)，用氫氧化鈉調(diào)整PH值為7.0后，趁熱浸泡試紙20min，最后于60°C干燥箱烘干，并置干燥箱內(nèi)過夜。步驟二，聚乙二醇60g、亞硝基鐵氰化鈉12g、置于燒杯中，加無水乙醇600ml，在熱水浴中溶解，溶解后的總體積用無水乙醇補(bǔ)充到672ml，趁熱浸泡上述試紙20min，取出試紙用濾紙吸干后置于60°C干燥箱烘干，并置干燥箱過夜。將上述試紙剪成長(zhǎng)0.25cm，寬0.25cm的小塊，用雙面膠粘在長(zhǎng)約5cm，寬約0.25cm的硬紙板上備用即成。效果測(cè)試1、標(biāo)準(zhǔn)色板的繪制選取經(jīng)酮粉法測(cè)定結(jié)果為(_)、(士)、(+)、(++)、(+++)、(++++)的標(biāo)準(zhǔn)尿樣標(biāo)本6個(gè)，依據(jù)上述確定的工藝參數(shù)制備的尿酮試劑帶，在這些標(biāo)本中試驗(yàn)，參照其顏色變化調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)色板。2、試驗(yàn)設(shè)計(jì)(1)采用L9(34)正交設(shè)計(jì)研究浸泡時(shí)間(10min、15min、20min)，溶液PH值(7.0、7.5,8.0)，烘干溫度(50°C、55°C、60°C)對(duì)尿酮體試劑帶檢測(cè)尿酮體效果的影響，從而篩選出最佳制作工藝參數(shù)。試驗(yàn)方案見表1。正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案隨___A(浸泡時(shí)間)BGI^tpH)C(烘干溫度)—D(空白)試驗(yàn)號(hào)11(10)1(7.0)1(50)21(10)2(7.5)2(55)31(10)3(8.0)3(60)42(15)1(7.0)2(55)52(15)2(7.5)3(60)62(15)3(8.0)1(50)73(20)1(7.0)3(60)83(20)2(7.5)1(50)93(20)3(8.0)2(55)_任選已經(jīng)酮粉法測(cè)定的尿酮標(biāo)本50例，將上述試劑帶浸入各樣本，取出后看它們的顏色變化，比較與酮粉法測(cè)定結(jié)果的符合情況，確定制備尿酮體試劑帶的最佳工藝參數(shù)。(2)亞臨床酮病快速檢測(cè)方法的比較選取泌乳期奶牛共286頭，采集新鮮尿樣，分別用自制尿酮體試劑帶和酮粉法檢測(cè)尿酮含量。以血漿β-羥丁酸的濃度(β-羥丁酸的濃度>1.2mmol/L)作為判定酮體真正陽(yáng)性率(即亞臨床酮病)的標(biāo)準(zhǔn)。自制尿酮體試劑帶按上述制備方法制備；酮粉試劑包括亞硝基鐵氰化鈉、硫酸氨、無水碳酸鈉(均為分析純)，購(gòu)自昆明杰輝生物技術(shù)有限公司；羥丁酸/乙酰乙酸試劑盒購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)診斷教研室。3試驗(yàn)結(jié)果(1)確定最佳工藝參數(shù)表2正交設(shè)計(jì)方差分析過程<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表2可知，影響尿酮體試劑帶檢測(cè)效果的因素依次為浸泡時(shí)間>溶液？!1值>烘干溫度。經(jīng)方差分析證明，浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)尿酮體試劑帶檢測(cè)效果有明顯的影響(P<0.05)，而溶液ρΗ、烘干溫度對(duì)其效果的影響不明顯(P均>0.05)。由此，確定浸泡時(shí)間為20min，溶液ρΗ為7.0，烘干溫度為60°C作為制備尿酮體試劑帶的最佳工藝參數(shù)。(2)亞臨床酮病快速檢測(cè)方法的比較結(jié)果自制尿酮體試紙和酮粉法檢測(cè)尿酮的靈敏度、特異性、陰性預(yù)測(cè)值，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，結(jié)果見表3。表3不同檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、陰性估計(jì)值、陽(yáng)性估計(jì)值<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在檢測(cè)尿酮時(shí)，如靈敏度較高，特異性較低，會(huì)造成非酮病牛假陽(yáng)性率增高；而特異性較高，靈敏度太低，則會(huì)造成真正酮體陽(yáng)性牛的漏檢。從表3中可以看出自制尿酮體試劑帶的靈敏度和特異性都較傳統(tǒng)酮粉法高。權(quán)利要求一種快速測(cè)定奶牛亞臨床酮病的試紙制備方法，其特征在于其制備方法為步驟一，將用熱水浴中溶解的阿拉伯樹膠中加入硼酸、氨基乙酸、乙二胺四乙酸二鈉溶液并用氫氧化鈉調(diào)整PH值為7.0后，趁熱浸泡試紙20min，最后于60℃干燥箱烘干，并置干燥箱內(nèi)過夜；步驟二，熱水浴中溶解的聚乙二醇、亞硝基鐵氰化鈉、無水乙醇，趁熱浸泡上述試紙20min，取出試紙用濾紙吸干后置于60℃干燥箱烘干，并置干燥箱過夜，即成。全文摘要本發(fā)明公開一種快速測(cè)定奶牛亞臨床酮病的試紙制備方法，通過先將用熱水浴中溶解的阿拉伯樹膠中加入硼酸、氨基乙酸、乙二胺四乙酸二鈉溶液并用氫氧化鈉調(diào)整pH值為7.0后，趁熱浸泡試紙20min，最后于60℃干燥箱烘干，并置干燥箱內(nèi)過夜；然后，熱水浴中溶解聚乙二醇、亞硝基鐵氰化鈉、無水乙醇，趁熱浸泡上述試紙20min，取出試紙用濾紙吸干后置于60℃干燥箱烘干，并置干燥箱過夜，即成。該試劑條以血中β-羥丁酸濃度＞1.2mmol/L為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)生產(chǎn)實(shí)踐證明成本低，簡(jiǎn)便易行，結(jié)果迅速，具有高特異性和靈敏度，多種受測(cè)樣品如血、尿、血清、血漿及乳均可采用，適用范圍較廣。文檔編號(hào)G01N33/64GK101833006SQ20091009421公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2009年3月13日優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日發(fā)明者冷靜,劉鴻,楊舒黎,毛華明,鄧衛(wèi)東申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)