專利名稱：一種酮體檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬酮體檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種檢測(cè)血、尿、乳中草酰乙酸或丙酮含量的方法。
背景技術(shù)：
奶牛酮病(Ketosis in dairy cows)是圍產(chǎn)期高產(chǎn)奶牛能量代謝障礙性疾病。主要生化特征低血糖癥、酮血癥、酮尿癥、酮乳癥。該病是奶牛業(yè)危害最大的營(yíng)養(yǎng)代謝病之一，發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率5％～30％，國(guó)內(nèi)20％～30％。由于造成高產(chǎn)奶牛泌乳量下降、繁殖能力降低、繼發(fā)乳房炎、胎衣不下、脂肪肝、真胃變位等圍產(chǎn)期疾病，給全世界奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
用于該病早期診斷的方法就是酮體測(cè)定。目前，酮體檢測(cè)方法有試紙條定性檢測(cè)方法；水楊醛比色法、高效液相色譜法及β-羥丁酸試劑盒等定量檢測(cè)方法。以上這些方法的不足之處表現(xiàn)在準(zhǔn)確性差，假陽(yáng)性高，成本高，操作繁瑣，需要昂貴儀器。
目前還沒(méi)有穩(wěn)定性、靈敏度、準(zhǔn)確性兼優(yōu)而又操作簡(jiǎn)便、成本低的酮體檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方便實(shí)用、穩(wěn)定性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、成本低的酮體檢測(cè)的方法。該方法用于血、尿、乳中酮體的檢測(cè)。為現(xiàn)場(chǎng)集約化奶牛場(chǎng)防治奶牛隱性酮病提供依據(jù)。發(fā)明人經(jīng)過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)，對(duì)現(xiàn)有水楊醛比色法進(jìn)行了改良，克服了原有方法準(zhǔn)確性差、假陽(yáng)性高、成本高、操作繁瑣等不足，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種酮體檢測(cè)的方法，它包括如下步驟(1)量取樣品，按體積計(jì)用量1∶6～12加入蒸餾水，混勻；(2)加入12％HClO4，邊加入邊混勻；(3)離心，取上清液置于安瓿中，加入氧化劑混勻，將安瓿封口，高壓加熱；(4)加入顯色液和50％KOH混勻，置于冰箱中16～22小時(shí)；(5)在波長(zhǎng)470nm光下進(jìn)行比色測(cè)定，用空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取光密度讀數(shù)；(6)繪制酮體標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中酮體含量。
本發(fā)明中安瓿用汽油噴燈封口。
本發(fā)明中樣品選自血、尿、乳。
本發(fā)明中氧化劑為0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液。
本發(fā)明中顯色液是由2％水楊醛、5％Na2SO3、6N KOH按體積計(jì)用量2∶1∶1比例配成。
所述方法詳述如下(1)取血液、尿液、乳液0.2ml，加1.2ml～2.4ml蒸餾水，振蕩混合。
(2)加0.4ml的12％HCLO4，邊加邊搖，混勻。
(3)離心去蛋白(3000r/min，15min)，取上清液1ml加入安瓿里，加入氧化劑0.5ml，用汽油噴燈將安瓿封口，在高壓消毒鍋內(nèi)高壓加熱(15磅，30min)。
(4)加入顯色液2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中16-22小時(shí)。
(5)用國(guó)產(chǎn)722光柵分光光度儀，波長(zhǎng)470nm、光徑1cm、溫度4℃～25℃下進(jìn)行比色，空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取測(cè)定管光密度讀數(shù)。
(6)酮體標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制①分別配置濃度為(ug/ml)3.125，6.25，12.5，25，50，100，150，200，250，300，350，400的丙酮標(biāo)準(zhǔn)液。
②加入顯色液和50％KOH，放置在4℃的冰箱中16～22小時(shí)。
③用國(guó)產(chǎn)722光柵分光光度儀，在波長(zhǎng)470nm、光徑1cm、溫度4℃～25℃下進(jìn)行比色，空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取測(cè)定管光密度讀數(shù)。當(dāng)濃度高于100ug/ml時(shí)，因反應(yīng)后顏色較深，依次進(jìn)行2、4、6、8、10、12倍稀釋(倍比稀釋法)，再進(jìn)行比色。
④以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中氧化劑按如下方法配制取0.2g K2Cr2O7加入100ml的6NH2SO4(83.33ml濃硫酸加蒸餾水至500ml)中。
其中顯色液為2％水楊醛(取2.22ml水楊醛加3N KOH至100ml)、5％Na2SO3和6N KOH按體積計(jì)用量2∶1∶1比例配成。
其中酮體標(biāo)準(zhǔn)液(39.7ug/ml≈40ug/ml)按如下方法配制準(zhǔn)確吸取丙酮1ml，加入容量瓶中，加蒸餾水稀釋至100ml，混勻。此溶液含丙酮790mg/l。吸出此溶液25.2ml，用蒸餾水稀釋至500ml，配成40ug/l酮體標(biāo)準(zhǔn)液。
此方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍3～389ug/mL；變異系數(shù)批內(nèi)為2.94％～8.97％，批間為3.48％～11.07％；回收率108％；所配試劑保存期避光，干燥處，1周。
所述方法設(shè)備簡(jiǎn)便、易于操作、可大批量檢測(cè)，同時(shí)其線性范圍、變異系數(shù)、穩(wěn)定性、回收率和所配試劑保存期等基本一致。
新采集的血清、尿液、乳汁，如不能立刻測(cè)定，需要在-20℃保存。
奶牛血、尿、乳樣品酮體水平10-20mg/dl為亞臨床酮病，20mg/dl以上為臨床酮病。
本發(fā)明所述方法的反應(yīng)原理酮體中的乙酰乙酸和β-羥丁酸氧化水解后生成丙酮，丙酮在強(qiáng)堿溶液中與水楊醛生成一種顯色的1，5-雙(2-羥苯基)-3，4-戊二烯酮產(chǎn)物。其顏色的深度與丙酮的含量成正比?？捎霉怆姳壬ê头止夤舛确y(cè)定。
本發(fā)明所述方法的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面試劑來(lái)源方便，價(jià)格低廉；所配溶液易分裝保存，貯存時(shí)間較長(zhǎng)；僅需要簡(jiǎn)易設(shè)備，成本低；工藝簡(jiǎn)便、性能穩(wěn)定，可以對(duì)大批量樣品進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明所述方法可作為檢測(cè)奶牛血、尿、乳中酮體的定量檢測(cè)，作為奶牛酮病的診斷指標(biāo)，適用于現(xiàn)場(chǎng)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。


圖1為酮體標(biāo)準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)為吸光度值(OD)。橫坐標(biāo)為酮體濃度。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1酮體標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程分別配置濃度為(ug/ml)3.125，6.25，12.5，25，50，100，150，200，250，300，350，400的丙酮標(biāo)準(zhǔn)液。去各濃度丙酮標(biāo)準(zhǔn)液1.5ml，加入顯色液(2％水楊醛、5％Na2SO3、6N KOH按體積計(jì)用量2∶1∶1)2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中20小時(shí)。用國(guó)產(chǎn)722光柵分光光度儀，在波長(zhǎng)470nm、光徑1cm、溫度20℃下進(jìn)行比色，空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取測(cè)定管光密度讀數(shù)。當(dāng)濃度高于100ug/ml時(shí)，因反應(yīng)后顏色較深，依次進(jìn)行2、4、6、8、10、12倍稀釋(倍比稀釋法)，再進(jìn)行比色。以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。
表1 酮體標(biāo)準(zhǔn)曲線值

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝0.0176x R2＝0.9834
實(shí)施例2奶牛血、尿、乳中酮體的檢測(cè)分別取正常奶牛和酮病奶牛血樣、尿樣、乳樣各0.2ml，分別加1.2ml蒸餾水，振蕩混合。加0.4ml的12％HCLO4，邊加邊搖，混勻。在3000r/min下離心15min，去蛋白，取上清液1ml加入安瓿里，加入氧化劑(0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液)0.5ml，用汽油噴燈將安瓿封口，在高壓消毒鍋內(nèi)15磅高壓加熱30min。加入顯色液2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中16小時(shí)。用國(guó)產(chǎn)722光柵分光光度儀，在波長(zhǎng)470nm、光徑1cm、溫度4℃下進(jìn)行比色，空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取測(cè)定管光密度讀數(shù)。
表2 奶牛血酮、尿酮和乳酮測(cè)定結(jié)果 單位mg/dl

實(shí)施例3奶牛血、尿、乳中酮體的檢測(cè)分別取正常奶牛和酮病奶牛血樣、尿樣、乳樣各0.2ml，分別加2.4ml蒸餾水，振蕩混合。加0.4ml的12％HCLO4，邊加邊搖，混勻。在3000r/min下離心15min，去蛋白，取上清液1ml加入安瓿里，加入氧化劑(0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液)0.5ml，用汽油噴燈將安瓿封口，在高壓消毒鍋內(nèi)15磅高壓加熱30min。加入顯色液2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中22小時(shí)。用國(guó)產(chǎn)722光柵分光光度儀，在波長(zhǎng)470nm、光徑1cm、溫度25℃下進(jìn)行比色，空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取測(cè)定管光密度讀數(shù)。
表3 奶牛血酮、尿酮和乳酮測(cè)定結(jié)果單位mg/dl

權(quán)利要求
1.一種奶牛酮體檢測(cè)的方法，它包括如下步驟(1)量取樣品，按體積計(jì)用量1∶6～12加入蒸餾水，混勻；(2)加入12％HClO4，邊加入邊混勻；(3)離心，取上清液置于安瓿中，加入氧化劑混勻，將安瓿封口，高壓加熱；(4)加入顯色液和50％KOH混勻，置于冰箱中16～22小時(shí)；(5)在波長(zhǎng)470nm光下進(jìn)行比色測(cè)定，用空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取光密度讀數(shù)；(6)繪制酮體標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中酮體含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中安瓿用汽油噴燈封口。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中樣品選自血、尿、乳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中氧化劑為0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中顯色液是由2％水楊醛、5％Na2SO3、6N KOH按體積計(jì)用量2∶1∶1比例配成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酮體檢測(cè)的方法，該方法可用于血、尿、乳中草酰乙酸或丙酮的檢測(cè)。為現(xiàn)場(chǎng)集約化奶牛場(chǎng)防治奶牛隱性酮病提供依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N21/77GK1851464SQ20051001162
公開(kāi)日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日
發(fā)明者張洪友, 夏成, 吳凌 申請(qǐng)人:張洪友, 夏成, 吳凌