專利名稱：：一種大鼠可誘導(dǎo)多能干細胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠成體細胞重編程為類似胚胎干細胞的可誘導(dǎo)多能干細胞(Inducedpluripotentstemcell,簡稱iPS細胞)及其制備方法。
背景技術(shù)：
：大鼠是重要的實驗動物，在行為學(xué)、癌癥、心血管、血液、自體免疫等疾病、以及生理藥理等方面都有廣泛用途，針對大鼠的研究對于指導(dǎo)生物醫(yī)學(xué)、人類健康和病理學(xué)等方面意義重大。胚胎干細胞是來自胚泡，可無限繁殖同時能維持多能性，即可分化為三個胚層的一類祖細胞。基于胚胎干細胞研究的反向遺傳學(xué)手段對于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、基因敲除模型的建立等方面具有巨大的推動作用。從25年前小鼠胚胎干細胞獲得到現(xiàn)在，人們利用反向遺傳學(xué)手段不斷建立和完善各種小鼠模型(Demers，S.P.，etal.(2007)，Cloningandstemcells,9,512-522)。但數(shù)十年來科學(xué)界始終沒能成功建立大鼠胚胎干細胞(ES)系，首次報道在1994年，P.Lannaccone實驗室宣布獲得了大鼠ES細胞并打出了嵌合體，但三年后，他們卻推翻了當年的成果，原因是污染了小鼠胚胎干細胞(lannaccone,P.M.，Taborn，G.U.，Garton，R丄，etal.(1994).Dev.Biol.163,288-292;Brenin，D.，etal.(1997).Transplant.Proc.29，1761-1765);本世紀初，又有幾個實驗室相繼報道建立了類似大鼠胚胎干細胞(ES-like)的細胞系(Demers，etal.(2007)，Cloningandstemcells9，512-522;Vassilieva，S.，etal.(2000)，Exp.CellRes.258,361-373;Notarianni，E.，etal.(2001)，Placenta22，111—123;Fandrich，F(xiàn).，etal.(2002)，Nat.Med.8，171—178;Buehr，M.，etal.(2003)，Biol.R印rod.68，222-229;Mullins，L.J.，etal.(2004)，J.Physiol.554,4-12;Tesson，L.，etal.(2005)，TransgenicRes.14，531-546)，但缺陷是ES-like細胞得不到長期維持；體內(nèi)驗證ES-like細胞多能性的實驗結(jié)果不理想，即打不出畸胎瘤；沒有成功的嵌合體大鼠得的報道，注射到囊胚的ES-like細胞只能分化成胚外組織，也就無法對生殖系嵌入情況進行探索；此外，對干細胞特征性指標的鑒定也很有限。大鼠胚胎干細胞的建系成為阻礙大鼠在生物醫(yī)學(xué)方面用途廣泛的巨大限制因素，而就前人的這些研究結(jié)果來看，使用傳統(tǒng)方法(小鼠ES細胞的建立方法)建立大鼠ES細胞是相當困難的。2006年8月，Yamanaka實驗室利用外源表達0ct4，Sox2，c-Myc，Klf4四個轉(zhuǎn)錄因子，成功誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細胞為類似小鼠胚胎干細胞的"可誘導(dǎo)的多能干細胞"(inducedpluripotentstemcells,iPS)，這項實驗結(jié)果說明分化細胞可以通過幾個轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)，重編程到全能性的狀態(tài)(Takahashi，K.，andYamanaka，S.(2006).InductionofPluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell126,663-676);2007年，人類iPS的建立，進一步驗證了該方法的可行性(Takahashi，K.，etal.(2007).Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Celll31，861_872;Yu，J.，etal.(2007).3Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science318,1917-1920)。盡管iPS細胞并非百分之百的ES細胞，但有理由相信，iPS細胞可運用到那些使用傳統(tǒng)方法無法建立ES細胞的物種上，比如大鼠。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的首要目的在于，提供一種大鼠可誘導(dǎo)多能干細胞。本發(fā)明的第二個目的在于，提供一種大鼠可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的大鼠可誘導(dǎo)多能干細胞iPS的制備方法，包括步驟A)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體，所述轉(zhuǎn)錄因子選自0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog;B)將步驟A)所得慢病毒載體以組合形式感染大鼠成體細胞，挑選形態(tài)類似胚胎干細胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到大鼠iPS細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述大鼠成體細胞包括大鼠原代骨髓細胞或原代耳尖成纖維細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述慢病毒載體以組合形式攜帶的轉(zhuǎn)錄因子包括0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟B)的傳代培養(yǎng)是將大鼠iPS克隆按l:350的比例傳至輻照過的小鼠胚胎成纖維細胞上。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟B)的篩選是篩選堿性磷酸酶染色呈陽性的細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，還包括步驟C)大鼠iPS細胞的干細胞多能性鑒定。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟C)大鼠iPS細胞的干細胞多能性鑒定包括D)堿性磷酸酶表達呈陽性；E)干細胞表面特異標記SSEA-1(+)、Nanog(+);F)自然分化形成胚狀體后，外胚層NCAM(+)、PAX6(+)，中胚層SM22-a(+)、Myod(+)和內(nèi)胚層Soxl7(+)、AFP(+);G)大鼠iPS細胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟G)形成的畸胎瘤具有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述大鼠iPS細胞的干細胞多能性鑒定還包括H)0ct4基因的啟動子區(qū)域被去甲基化；I)端粒酶活性比大鼠成體細胞高。本發(fā)明有助于確立大鼠ES細胞建系的最適培養(yǎng)條件和方法；大鼠iPS細胞是大鼠基因打靶的良好載體，本發(fā)明的大鼠iPS細胞將利于揭示大鼠各基因功能和復(fù)雜的發(fā)育事件；此外，大鼠iPS是繼小鼠和人的iPS成功誘導(dǎo)后第一項其它物種的iPS，這對于其它模式動物iPS的誘導(dǎo)有著重大指導(dǎo)意義。圖1是病毒載體LV-efla-IRES-EGFP結(jié)構(gòu)圖。4圖2是大鼠iPS細胞形態(tài)熒光鏡檢結(jié)果，其中A:PEF的ES-like克隆形態(tài)B:PEF的ES-like克隆的綠色熒光鏡檢結(jié)果C:BMC的ES-like克隆形態(tài)D:BMC的ES-like克隆的綠色熒光鏡檢結(jié)果E:非ES-like克隆形態(tài)F:非ES-like克隆的綠色熒光鏡檢結(jié)果。圖3是大鼠iPS細胞堿性磷酸酶檢測陽性克隆統(tǒng)計結(jié)果。圖4是大鼠iPS細胞經(jīng)多次挑克隆和傳代后的細胞形態(tài)，其中A:克隆形態(tài)B:克隆綠色熒光鏡檢結(jié)果。圖5是大鼠iPS細胞堿性磷酸酶活性檢測，其中A:由PEF得到的大鼠iPS細胞AP染色結(jié)果，B:由BMC得到的大鼠iPS細胞AP染色結(jié)果。圖6是RealtimePCR檢測大鼠iPS細胞未分化Marker表達情況的電泳圖，從左到右泳道依次是大鼠骨髓細胞，大鼠耳尖成纖維細胞，M13號iPS細胞，F(xiàn)65號iPS細胞，大鼠胚胎細胞，陰性對照。圖7是免疫熒光染色檢測大鼠iPS細胞干細胞相關(guān)marker表達情況，其中A:由BMC得到的大鼠iPS細胞SSEA-l染色結(jié)果，B:由PEF得到的大鼠iPS細胞SSEA-l染色結(jié)果，C:由BMC得到的大鼠iPS細胞Nanog染色結(jié)果，D:由BMC得到的大鼠iPS細胞Nanog染色結(jié)果，其中標尺代表100m。圖8是RealtimePCR檢測大鼠iPS細胞內(nèi)外源基因表達水平，從上到下依次是0ct4，Nanog，Sox2。圖9是大鼠iPS細胞重亞硫酸鹽基因組測序分析結(jié)果，從上到下依次是大鼠耳尖成纖維細胞，大鼠骨髓細胞，M13號iPS細胞，F(xiàn)65號iPS細胞。圖IO是大鼠iPS細胞端粒酶活性檢測，從左到右泳道依次是大鼠骨髓細胞，大鼠耳尖成纖維細胞，M13號iPS細胞，F(xiàn)65號iPS細胞，陽性對照細胞，熱失活陽性對照細胞，裂解液；其中_表示未進行熱失活，+表示熱失活。圖11是RealtimePCR檢測大鼠iPS細胞在體外向三個胚層的分化能力，從左到右泳道依次是大鼠骨髓細胞，大鼠耳尖成纖維細胞，M13號iPS細胞，F(xiàn)65號iPS細胞，M13號iPS細胞分化后的細胞，F(xiàn)65號iPS細胞分化后的細胞，大鼠胚胎細胞，陰性對照。圖12是大鼠iPS細胞畸胎瘤形成情況，其中A:神經(jīng)上皮(外胚層)B:軟骨(中胚層)C:腸樣上皮(內(nèi)胚層)。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。以下實施例中，用到的培養(yǎng)基有大鼠原代骨髓細胞的培養(yǎng)基，具體組成為90%的a-MEM培養(yǎng)液(購自Invitrogen，12571);10%的胎牛血清(購自HyClone，SH30396.03)。大鼠原代耳尖成纖維細胞在原代培養(yǎng)時的培養(yǎng)基，具體組成為69X的D-MEM培養(yǎng)液(購自Invitrogen，11965);30%的胎牛血清(購自HyClone，SH30396.03);lmML-谷氨酸(購自Invitrogen,25030);1%的非必須氨基酸(購自Invitrogen,11140050)。大鼠原代耳尖成纖維細胞傳代后的培養(yǎng)基，具體組成為89X的D-MEM培養(yǎng)液(購自Invitrogen,11965);10%的胎牛血清(購自HyClone，SH30396.03);lmML-谷氨酸(購5自Invitrogen,25030);1%的非必須氨基酸(購自Invitrogen,11140050)。大鼠iPS細胞的培養(yǎng)基，具體組成為79%的KnockoutD-MEM/F12培養(yǎng)液(購自Invitrogen,12660);10%的胎牛血清(購自HyClone，SH30396.03);10%的KnockoutSR(購自Invitrogen,10828);lmML-谷氨酸(購自Invitrogen,25030);1%的非必須氨基酸(購自Invitrogen,11140050);0.ImMP-巰基乙醇(購自Sigma，M7522)。以下實施例中所使用的慢病毒載體LV-efla-IRES-EGFP購自Invitrogen公司，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，具有氨芐抗性。以下實施例中，通用的細胞培養(yǎng)產(chǎn)品均購自Invitrogen公司。實施例1、悔病毒載體的構(gòu)建1.1、從NCBI網(wǎng)站(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)查詢干細胞中特異表達或高表達的特定基因(0ct4，Sox2，c-Myc，Klf4，Lin28，Nanog)的編碼區(qū)，根據(jù)編碼區(qū)序列設(shè)計引物，并引入酶切位點，引物序列如表l所示(其中F表示正向引物，R表示反向引物)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注引物序列中大寫的字母為引入的酶切位點。1.2、PCR擴增以人類總cDNA為模板，利用表1中各基因引物進行PCR擴增，具體如下反應(yīng)體系(25:10XpfxMix2.5ii1，AccuPrimepfx酶0.2ii1，上下游引物(50iiM)各0.25iil，模板O.25ii1，ddH2021.55ii1。反應(yīng)條件95。C2min;95°C20sec，66。C20sec，68。C30sec，循環(huán)35次；68°C10min。1.3、慢病毒載體的構(gòu)建將所得PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用天根公司的通用型DNA純化回收試劑盒(離心柱型)回收各基因片段，分別利用各自酶切位點雙酶切，用相應(yīng)的酶雙酶切慢病毒載體LV-efla-IRES-EGFP，得到慢病毒載體的骨架片段，將慢病毒載體的骨架片段和各基因片段用T4DNA連接酶(Fermentas公司)于22。C連接3h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化GBE180感受態(tài)細菌(制備方法見htto:〃www.chem.uga.edu/scottgrp/GrpProtocols/Competentcellpreparation.htm)，在瓊月旨平板上(含氨芐抗生素)，于37t:培養(yǎng)12小時，從平板上挑取陽性單菌落，使用博大泰克B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定為正確方可使用，將所得載體分別命名為LV-ef1a_0ct4_IRES_EGFP、LV-efla_Sox2_IRES_EGFP、LV-ef1a_c_Myc_IRES_EGFP、LV-efla-Klf4-IRES-EGFP、LV-ef1a-Lin28-IRES_EGFP、LV-ef1a-Nanog-IRES-EGFP。實施例2、細胞培養(yǎng)2.1、大鼠原代骨髓細胞(BMC)的培養(yǎng)取6周SD雄性大鼠的大腿股骨和脛骨，浸泡于75X酒精中10min，使用含雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS沖洗三次，剪開骨兩端，用含10X胎牛血清(FBS)的a-MEM培養(yǎng)基的無菌注射器沖骨髓至15mL無菌離心管中，1200rpm離心5min，使用上述培養(yǎng)基重懸細胞一次，再次1200rpm離心5min，培養(yǎng)基再次重懸后將細胞移入培養(yǎng)瓶中。三天后換液，可見微小克隆，約一周后按1比3傳代，傳代時使用PBS清洗細胞2次，37t:下0.25%胰酶消化5min，大鼠原代骨髓細胞(BMC)在前四代能保持較好狀態(tài)。2.2、大鼠原代耳尖成纖維細胞(PEF)的培養(yǎng)取大鼠耳朵，75%酒精清洗后剃毛，浸泡于含雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS中15min，再依次使用PBS，無血清培養(yǎng)基(D-MEM)清洗耳朵數(shù)次，然后將耳朵浸泡于少量含30%FBS的D-MEM中，同時使用無菌剪刀將其剪成小塊，移至培養(yǎng)瓶中，小塊之間保持較小的距離，培養(yǎng)瓶倒置。6-8小時后，補加含30%FBS的D-MEM，正置，此后每天補加少量該培養(yǎng)基，一般3、4天后可明顯觀察到成纖維細胞，約一周后傳代，傳代時使用PBS清洗細胞2次，37。C下0.25%胰酶消化5min，以10%FBS的D-MEM終止反應(yīng)吹打。首次傳代按1比1或2傳(視細胞量而定)，此后每3至4天傳代，按1比3或4傳，大鼠原代耳尖成纖維細胞(PEF)傳10代以上依然有較好的增殖能力。2.3、其它細胞的培養(yǎng)293T細胞(購自中科院上海生命科學(xué)研究院生化細胞所細胞庫)的培養(yǎng)傳代時37。C下0.25%胰酶消化5min，使用10%FBS的D-MEM終止反應(yīng)，吹打后按1比810傳代。小鼠胚胎成纖維(MEF)細胞根據(jù)文獻(ThomsonJA.，Itskovitz-EldorJ.，ShapiroSS.，etal.Science.Nov61998;282(5391):1145-1147及Xu，C.，etal.NatBiotechnol.2001，19(10):971-4)的方法制備，作為滋養(yǎng)層細胞鋪于平板備用。實施例3、病毒包裝3.1、包裝質(zhì)粒的擴增將實施例1中得到的六種鑒定正確的載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌以進行擴增，經(jīng)AxygenAxyPwpplasmidMaxipr印Kit試劑盒(Axygen公司)中抽后，在超凈工作臺中進行純化，即用中抽后質(zhì)粒的十分之一體積的3MNaAC和2倍體積的無水乙醇混勻后，13000rpm離心15min，去上清，使用75%乙醇漂洗，吸去上清，于超凈工作臺中吹干后，使用無菌去離子蒸餾水溶解質(zhì)粒，最后使用分光光度計及凝膠電泳確定質(zhì)粒的濃度。3.2、轉(zhuǎn)染按照Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試齊U盒(ViraPowerLentiviralExpressionSystems)的說明書，使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將步驟3.1中的六個慢病毒質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒ViraPowerPackagingMix(Invitrogen公司)共同轉(zhuǎn)染293T細胞。具體步驟為轉(zhuǎn)染實驗前一天鋪293T細胞，使第二天細胞可生長至90X滿，對于一個T75瓶，取9iigViraPowerPackagingMix禾口3iig病毒質(zhì)粒于1.5mLopti-MEM中，輕輕混勻，另取已搖勻的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑36y1于另一份1.5mLopti-MEM中，輕輕混勻后，室溫放置5min，將上述兩份分別含DNA和轉(zhuǎn)染試劑的opti-MEM輕輕混勻，室溫放置20min后將上述混合液至于293T細胞90%滿的T75培養(yǎng)瓶中。按相同的方法轉(zhuǎn)染其它五種慢病毒質(zhì)粒。3.3、病毒滴度測定將步驟3.2中轉(zhuǎn)染獲得的六種病毒分別在24h內(nèi)更換培養(yǎng)基，此后收集轉(zhuǎn)染48h，72h和96h的病毒上清，一般無需進行病毒濃縮，而直接取5ill和1ill上述六種病毒，分別于24孔板中懸浮感染15萬293T細胞，同時加入polybrene，由感染48h后六種病毒感染的293T細胞的GFP情況來確定病毒滴度，可由視野中GFP陽性細胞所占比例估算15萬細胞中GFP陽性總細胞數(shù)，繼而獲知單位體積病毒上清中的病毒顆粒數(shù)，即為相應(yīng)病毒的滴度。實施例4、病毒感染將實施例3包裝的慢病毒，以MOI50感染5乂104個大鼠原代耳尖成纖維細胞(PEF)和大鼠原代骨髓細胞(BMC)兩種細胞，所用病毒的滴度約為58X106IU/mL，實驗分為3組a)空白對照組僅攜帶有綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒；b)實驗組1:包含4種因子的第一種慢病毒組合，0ct4，Sox2，Nanog和Lin28;c)實驗組2:包含4種因子的第二種慢病毒組合，0ct4，Sox2，c_Myc和Klf4。每組實驗均有6個平行樣，其中3個用于堿性磷酸酶(AP)染色，統(tǒng)計陽性克隆數(shù)，另3個樣用于克隆挑選。感染48小時后，將上述細胞用0.25%胰酶，371:下消化5min，計數(shù)后傳代轉(zhuǎn)移至鋪好小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的6孔板中，傳代后24h內(nèi)改用人胚胎干細胞(ES)培養(yǎng)基，隔天換液，待出現(xiàn)克隆后每天換液。實施例5、轉(zhuǎn)染后陽性細胞的篩選5.1、感染細胞的熒光鏡檢及堿性磷酸酶(AP)染色用熒光顯微鏡觀察實施例4感染后的細胞，發(fā)現(xiàn)感染后48小時有綠色熒光表達。傳代后24小時空白對照組中沒有克隆形成，實驗組1也沒有克隆形成，實驗組2傳代后2-3天細胞形態(tài)發(fā)生改變，呈圓形和明顯的細胞聚集，克隆出現(xiàn)在傳代后4-6天，實驗組2顯微鏡觀察的結(jié)果如圖2所示，其形態(tài)主要有兩種，一類是小鼠胚胎干細胞類(mES-like)克隆，其細胞致密，克隆表面光滑，邊緣平滑，邊界清晰光亮(見轉(zhuǎn)染PEF所得圖2A、2B，轉(zhuǎn)染BMC細胞所得圖2C、2D);另一類克隆中部明顯突起，細胞相對松散，邊緣不夠平滑，邊界相對模糊(圖2E、2F)，為非ES-like克隆。感染第12天對3組實驗下6個平行樣中的三個進行堿性磷酸酶(AP)染色，統(tǒng)計陽性克隆數(shù)，結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，空白對照組和實驗組1沒有克隆形成，實驗組2(慢病毒組合0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4)克隆基本都顯示較弱的AP陽性，5X104個大鼠BMC和PEF傳代后分別形成10±8個和21±8個AP陽性的iPS細胞集落。由以上結(jié)果可知，轉(zhuǎn)入特定的因子可以使已經(jīng)分化的大鼠成體細胞重編程形成類似胚胎干細胞(ES-like)的克隆(iPS細胞集落)，感染PEF比感染BMC產(chǎn)生的克隆多1倍左右。5.2、陽性細胞的篩選在感染后12天隨機挑選克隆，使用0.25X胰酶37t:下消化5min，吹打為單細胞后，用含10%SR(血清替代物)+10%FBS的D-MEM的KnockD-MEM/F12培養(yǎng)液終止反應(yīng)，此后每天更換該培養(yǎng)基，此時細胞增殖很快，每三天可傳一代，每三天按l:350傳代(視克隆總數(shù)而定)至輻照過的滋養(yǎng)層細胞MEF上，此后不斷進行克隆挑選和AP檢測。大鼠iPS細胞經(jīng)5、6次傳代后，經(jīng)AP檢測發(fā)現(xiàn)陽性率明顯提升。大鼠iPS細胞經(jīng)多次挑克隆和傳代后的細胞形態(tài)鏡檢結(jié)果如圖4所示，由圖4可以看出，經(jīng)多次克隆挑選傳代后，其克隆形態(tài)和挑克隆前第一類(圖2A、2B)的接近。由以上結(jié)果可知，大鼠iPS細胞經(jīng)多次挑克隆和傳代，其形態(tài)逐漸類似于胚胎干細胞。實施例6、干細胞特件柃測l取傳至15代的小鼠成纖維細胞形成的克隆F65和轉(zhuǎn)染骨髓細胞形成的克隆M13進行以下大鼠iPS細胞檢測，以證明其具備干細胞特性。6.1、堿性磷酸酶表達使用ChemiconAlkalinePhosphataseDetectionKit(Millipore公司)進行染色，具體步驟如下使用PBS清洗細胞兩次，4XPFA(多聚甲醛)室溫固定1-2min，TBST清洗一遍，AP染料(按試劑盒中注明的配制)避光染色15min，TBST再清洗一遍后使細胞浸泡于PBS中。顯微鏡檢測，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，細胞被染成紫紅色，而紫紅色表示細胞具有堿性磷酸酶活性，從而說明反復(fù)挑克隆后的大鼠iPS細胞具有很強的堿性磷酸酶活性，進一步地說形成的大鼠iPS克隆具有胚胎干細胞特性，即表達堿性磷酸酶。6.2、大鼠iPS細胞的未分化狀態(tài)檢測用realtimePCR方法檢測大鼠iPS細胞與誘導(dǎo)前細胞大鼠BMC及PEF進行對比，分析其未分化基因表達水平。6.2.1、引物設(shè)計由于未分化的細胞會特異性表達以下基因，包括0ct4、Sox2、Nanog、Nodal、Fgf4、Gal、Leftyb、Lin28、Gabra，所以可通過檢測這些基因的表達情況得知所獲得的大鼠iPS細胞的未分化狀態(tài)。未分化marker引物序列設(shè)計如表2所示，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(其中f表示正向引物，r表示反向引物)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>6.2.2、PCR擴增使用ToyoboSybergreenPCRMix,反應(yīng)體系(15iU):模板0.3ii1，弓|物(5iiM)lii1，SybergreenMix7.5iil，ddH206.2ii1，其中模板為抽提iPS細胞的RNA反轉(zhuǎn)得到的cDNA。反應(yīng)條件94。C，5min;94。C15sec，66。C10sec，72。C15sec，循環(huán)40次；72。C，10min。將所得PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖6所示，其中陽性對照的模板取自大鼠胚胎細胞RNA反轉(zhuǎn)得到的cDNA，陰性對照的模板為未進行反轉(zhuǎn)的RNA。由圖6的結(jié)果可知，大鼠iPS細胞(F65、M13)與誘導(dǎo)前的大鼠BMC及PEF相比，其干細胞相關(guān)的marker,即0ct4，Sox2，Nanog，Nodal，F(xiàn)gf4，Gal，Leftyb，Lin28，Gabrb均有高水平的表達。6.2.3、通過免疫熒光染色檢測胚胎干細胞未分化相關(guān)marker是否表達(包括SSEA-1和Nanog)使用PBS清洗細胞兩次，4XPFA室溫固定30min，PBS洗三次，再用含0.2%BSA+0.1%Triton-lOO的PBS洗兩次，接著使用含1%BSA+4%normalserum+0.1%Triton-lOO的PBS封閉細胞lh，再將一抗(SSEA-1和Nanog)稀釋在含0.2%BSA+0.1%Triton-lOO的PBS中，然后加到樣品上，室溫2h或4。C過夜，然后用PBT(0.1%Triton-lOO的PBS)洗滌細胞3-5次，將二抗(anti-mouseIgM和anti-rabbitIgG)稀釋在含0.2%BSA+0.1%Triton-lOO的PBS中，然后加到樣品上，室溫lh，再用PBT洗三次，將Hochest母液以l:1000用PBS稀釋，室溫避光放置5min，然后PBS洗滌兩次，每次5min，再用4XPFA室溫固定30min，最后用PBS洗滌兩次，每次5min。免疫熒光染色結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，熒光鏡檢檢測到大鼠iPS細胞表達干細胞相關(guān)markerSSEA-1和Nanog，說明大鼠iPS克隆持續(xù)傳代后，仍能自我更新，維持未分化的狀態(tài)，具有胚胎干細胞能自我更新的特性。6.3、大鼠iPS細胞內(nèi)外源基因表達水平檢測6.3.1、引物設(shè)計由于使用人源的基因誘導(dǎo)大鼠BMC及PEF重編程為大鼠iPS細胞，因此使用人源的引物檢測外源基因的表達情況，使用大鼠基因檢測大鼠iPS細胞內(nèi)源基因的表達情況，引物序列如表3所示，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成合成(其中f表示正向引物，r表示反向引物)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>6.3.2、PCR擴增使用ToyoboSybergreenPCRMix反應(yīng)體系(15ii1):模板0.3ii1，弓|物(5iiM)liil，SybergreenMix7.5iil，ddH206.2ii1，其中模板為抽提iPS細胞的RNA反轉(zhuǎn)得到的cDNA。反應(yīng)條件94。C，5min;94。C15sec，66。C10sec，72。C15sec，循環(huán)40次；72。C，10min。根據(jù)定量PCR原理，利用絕對定量，未知樣品的量(拷貝數(shù))可以通過從已知量的標準品的范圍中推算得出。為了建立標準曲線，需要已知濃度的模板(模板即質(zhì)粒載體Lv-efla-0ct4-IRES-EGFP，Lv-efla-Sox2-IRES_EGFP，Lv-efla-Nanog-IRES-EGFP)。模板稀釋后，用這些稀釋樣品作為標準樣品，將未知的待測樣本和標準樣本置于同一次實驗中進行反應(yīng)，用稀釋的樣品標準樣品構(gòu)建標準曲線，通過計算來確定未知樣品中目的基因的量。標準品基因PCR的ct值與起始量(拷貝數(shù))的對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此可作一條ct值對log(拷貝數(shù))的曲線，得到線性相關(guān)得方程式，樣本基因的拷貝數(shù)可以通過對應(yīng)的ct值利用方程式計算得出，將結(jié)果繪制成圖8。由圖8結(jié)果可知，大鼠iPS細胞M13及F65的外源0ct4基因表達水平較內(nèi)源0ct4表達水平高一倍以上。F65外源Sox2基因已沉默，僅表達內(nèi)源Sox2，M13克隆仍有部分外源Sox2基因表達，M13及F65均無外源Nanog表達。由以上結(jié)果可知，得到的大鼠iPS細胞，其內(nèi)源的胚胎干細胞全能性相關(guān)marker0ct4，Nanog，Sox2均得到激活表達，但仍有部分外源0ct4表達，M13有外源Sox2表達。6.4、干細胞特異啟動子去甲基化程度檢測為檢測得到的大鼠iPS細胞的0ct4基因的啟動子區(qū)域是否被去甲基化，先使用Bisulphite處理DNA，具體步驟如下取每份樣品DNA210ng，雙蒸水稀釋到21ill，每管加入新鮮配置的2M的NaOH4iU，5(TC反應(yīng)15min，向該樣品中加入50°C的502%的低熔點瓊脂糖(該瓊脂糖預(yù)先置于IO(TC5min)，混勻后取10于預(yù)冷的300液體石蠟中，冰上至少放置30min，使形成的beads堅硬。然后向beads中加入500新配的2.5M焦亞硫酸鈉(Sodiummetabisulphite)搖勻，使beads位于分層上，離心甩一下，然后50。C避光反應(yīng)4h-12h(不超過16-18h)。接著使用lmlTE(pH8.0)洗3次，每次lOmin，O.5ml0.2MNaOH洗2次，每次15min，再用lmlTE，每次10min，然后每管加100TE，4"C保存。在大鼠目的基因(0ct4)Promoter區(qū)富含CpG區(qū)域的上下游設(shè)計引物，將各富含CpG區(qū)的PCR產(chǎn)物連接至T載體上，轉(zhuǎn)化后抽提質(zhì)粒酶切鑒定送測序，其中的CG區(qū)即為甲基化位點，而TG區(qū)為未甲基化位點，繪制圖譜(AnalysisofDNAmethylationusingbisulphatesequencing,contributedbyDr.AlexeiGratchev)，結(jié)果見圖9。由圖9的結(jié)果可見，誘導(dǎo)前的大鼠BMC及PEF細胞，其0ct4基因的啟動子區(qū)域被高度甲基化，而誘導(dǎo)重編程得到的大鼠iPS細胞的0ct4基因的啟動子區(qū)域被高度去甲基化，誘導(dǎo)后的細胞大鼠BMC及PEF細胞得到有效的重編程。6.5、端粒酶活性檢測按照試劑盒TRAPEZERTelomeraseDetectionKit(Chemicon公司)中的操作步驟，經(jīng)過提取端粒酶、端粒酶延伸反應(yīng)和PCR擴增反應(yīng)，上樣于PAGE膠上染色照相。具體步驟為收集100萬大鼠iPS細胞以及陽性對照細胞(腫瘤細胞或干細胞)，PBS洗一次，使用含150U/mLRNaseinhibitor的1XCHAPSLysisBuffer,冰上裂解30min，12000rpm，4。C離心20min，收集上清，使用LysisBuffer適當稀釋后取少量85。C熱處理，分別取熱處理和非熱處理的上述裂解液，按照試劑盒中所說進行端粒酶延伸反應(yīng)和PCR擴增反應(yīng)。然后上樣于12.5%的非變性PAGE膠上，緩沖液為0.5XTBE，使用EB按1yg/mL染色30min，之后用去離子水洗脫10-20min，凝膠電泳成像的結(jié)果如圖IO所示。由圖IO可知大鼠iPS細胞如M13，F(xiàn)65與大鼠BMC及PEF細胞相比具有較高端粒酶活性，且熱失活情況下細胞端粒酶失活，說明該活性為RNA特異性依賴的端粒酶活性。6.6、擬胚體向三個胚層及滋胚層的分化潛能(大鼠iPS細胞體外分化能力)為了驗證大鼠iPS細胞的多能性，使之自然分化形成胚狀體(EB)，使用相對定量PCR的方法，即在確?？醇一騁即dh表達水平基本一致的情況下，比較各個樣品，其三個胚層不同標記基因的表達水平間的差異。將所得PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖11所示。由圖11的結(jié)果可知，大鼠iPS細胞能夠表達外胚層NCAM、PAX6，中胚層SM22-a、Myod和內(nèi)胚層Soxl7、AFP的分化基因，證明大鼠iPS細胞能夠分化形成胚狀體中所有三個胚層。以上結(jié)果證明形成的克隆多具有胚胎干細胞的特性，具有體外分化成不同的組織細胞的潛能。6.6、畸胎瘤形成的檢測為了驗證得到的克隆在體內(nèi)具有多組織的分化能力，用畸胎瘤石蠟切片，蘇木精一伊紅(HE)染色顯示三個胚層組織細胞。6.6.1、畸胎瘤形成將F65號iPS細胞用0.25%胰酶消化為單細胞，將其鋪于用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中，置于37t:培養(yǎng)箱靜置45min，取上層未貼壁的細胞(feeder貼壁快，故可將feeder與iPS細胞分離)。計數(shù)，500萬iPS細胞懸浮于300iU10%D-MEM中，對先天性免疫缺陷小鼠NOD-SCID小鼠進行后腿肌肉注射。第20天觀察到有瘤形成，于第25-30天將其取出。6.6.2、石蠟切片及HE染色畸胎瘤石蠟切片制作步驟將畸胎瘤用4%PFA固定后，PBS洗三次，依次使用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇脫水lh，繼續(xù)使用100%乙醇脫水lh后，使用100%乙醇脫水過夜，接著用氯仿處理lh，處理三次，之后浸沒于石蠟中2h，隨后包埋，5iim切片。HE染色步驟將石蠟切片用二甲苯(Xylene)洗四次，每次5min(在脫色搖床上進行)，無水乙醇洗兩次，每次10min，95X、90X、80X、70X乙醇依次洗5min，再用蒸餾水洗三次，每次5min，蘇木精染色10min后流水沖洗15-30min至適合的顏色，接著再用蒸餾水洗5min，伊紅A液染lmin，伊紅B液染5min，再用蒸餾水洗，接著用70%乙醇涮洗，90%乙醇涮洗至適合顏色，再用無水乙醇洗兩次，每次10min，最后用Xylene洗四次，每次5min后封片。將玻片顯微鏡鏡檢，結(jié)果如圖12所示。由圖12可以看到，大鼠iPS細胞能夠在體內(nèi)分化形成三個胚層細胞，包括，內(nèi)胚層的腸樣上皮細胞，中胚層的軟骨組織以及外胚層的玫瑰狀結(jié)樣的神經(jīng)上皮細胞。由以上結(jié)果進一步證明形成的克隆多具有胚胎干細胞的特性，具有在體內(nèi)分化成不同的組織細胞的潛能。綜上所述，本發(fā)明大鼠成體細胞重編程為類似胚胎干細胞的可誘導(dǎo)多能干細胞，使用大鼠原代骨髓細胞(BMC)和原代耳尖成纖維細胞(PEF)，已獲得數(shù)株大鼠iPS細胞，并由堿性磷酸酶表達、干細胞表面特異標記(SSEA-1，Nanog)，干細胞特異啟動子去甲基化程度、端粒酶活性、擬胚體向三個胚層及滋胚層的分化潛能以及畸胎瘤形成，確認其干細胞特性。本發(fā)明有助于確立大鼠ES細胞建系的最適培養(yǎng)條件和方法；大鼠iPS細胞是大鼠基因打靶的良好載體，大鼠iPS細胞將利于揭示大鼠各基因功能和復(fù)雜的發(fā)育事件；此外，本發(fā)明的大鼠iPS是繼小鼠和人的iPS成功誘導(dǎo)后第一項其它物種的iPS，這對于其它模式動物iPS的誘導(dǎo)有著重大指導(dǎo)意義。權(quán)利要求一種大鼠可誘導(dǎo)多能干細胞iPS的制備方法，其特征在于，包括步驟A)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體，所述轉(zhuǎn)錄因子選自O(shè)ct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog；B)將步驟A)所得慢病毒載體以組合形式感染大鼠成體細胞，挑選形態(tài)類似胚胎干細胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到大鼠iPS細胞。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大鼠成體細胞包括大鼠原代骨髓細胞或原代耳尖成纖維細胞。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述慢病毒載體以組合形式攜帶的轉(zhuǎn)錄因子包括0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B)的傳代培養(yǎng)是將大鼠iPS克隆按l:350的比例傳至輻照過的小鼠胚胎成纖維細胞上。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B)的篩選是篩選堿性磷酸酶染色呈陽性的細胞。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟C)大鼠iPS細胞的干細胞多能性鑒定。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟C)大鼠iPS細胞的干細胞多能性鑒定包括D)堿性磷酸酶表達呈陽性；E)干細胞表面特異標記SSEA-1(+)、Nanog(+);F)自然分化形成胚狀體后，外胚層NCAM(+)、PAX6(+)，中胚層SM22-a(+)、Myod(+)和內(nèi)胚層Soxl7(+)、AFP(+);G)大鼠iPS細胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟G)形成的畸胎瘤具有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述大鼠iPS細胞的干細胞多能性鑒定還包括H)0ct4基因的啟動子區(qū)域被去甲基化；I)端粒酶活性比大鼠成體細胞高。10.—種按權(quán)利要求19所述任一項制備的大鼠可誘導(dǎo)多能干細胞。全文摘要本發(fā)明涉及一種大鼠可誘導(dǎo)多能干細胞及其制備方法，本發(fā)明的大鼠可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法包括步驟A)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體，所述轉(zhuǎn)錄因子選自O(shè)ct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog；B)將步驟A)所得慢病毒載體以組合形式感染大鼠成體細胞，挑選形態(tài)類似胚胎干細胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到大鼠iPS細胞。本發(fā)明有助于確立大鼠ES細胞建系的最適培養(yǎng)條件和方法；大鼠iPS細胞是大鼠基因打靶的良好載體，大鼠iPS細胞將利于揭示大鼠各基因功能和復(fù)雜的發(fā)育事件。文檔編號G01N33/53GK101748100SQ20081020135公開日2010年6月23日申請日期2008年10月17日優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日發(fā)明者任江濤,崔春,廖婧,肖磊,陳思曄,陳霽君申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院