專利名稱：一種用電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)檢測(cè)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)檢測(cè)蛋白的方法， 屬于化學(xué)分析方法的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
分子信標(biāo)技術(shù)是生物分子探針研究的重點(diǎn)。它可以對(duì)PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)和對(duì)PCR擴(kuò)增過(guò)程(real-time PCR)作實(shí)時(shí)在線 檢測(cè)[文獻(xiàn)Tyagi, F. R. Kramer,NatBiotechnol, 1996， 14,303 — 308; (b) Alsmadi OA， Al-Kayal F， Al-Hamed M, and Meyer BF ,BMC Med Genet 2006， 7, 43-49.];用于基因的定量、定性檢測(cè)和用于基因 點(diǎn)突變等的分析和雙鏈DNA的檢測(cè)[文獻(xiàn)Du H, Disney MD, Miller BL， Krauss TD , J.Am. Chem. Soc.， 2003， 125,4012-4013; (d) Marras，S.A.E.， Kramer,F.R. and Tyagi,S. Genet. Anal. Biomol. E，1999,14， 151-156;進(jìn)行基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和直接應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中對(duì)腫 瘤、SARS、乙肝病毒及艾滋病病毒等各種疾病的檢測(cè)與診斷[文獻(xiàn) Fan, C., Plaxco, K. W., Heeger, A.， J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003， 100, 9134-9137; (f) Douglas Horejsh, Federico Martini, Fabrizio Poccia, Giuseppe Ippolito， Nucleic Acids Res, 2005, 33， el3在醫(yī)學(xué)、 分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域的發(fā)展有著非常重要的意義。
多數(shù)分子信標(biāo)為熒光分子信標(biāo)。由于熒光分子信標(biāo)技術(shù)需要比較 龐大、貴重的檢測(cè)儀器，不適用于一些比較簡(jiǎn)陋的工作場(chǎng)所及在野外 應(yīng)對(duì)突發(fā)事件如生化襲擊等需要野外作業(yè)的場(chǎng)合等。而電化學(xué)檢測(cè) 技術(shù)具有靈敏度高、選擇性好、簡(jiǎn)便價(jià)廉和易攜帶等優(yōu)點(diǎn)。目前電化 學(xué)分子信標(biāo)通常采用以一端固定于電極表面的電化學(xué)分子信標(biāo)。其方 法主要是通過(guò)改變電化學(xué)活性分子與電極表面的距離來(lái)實(shí)現(xiàn)生物分
子/電化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)換[文獻(xiàn)Fan, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.， 2003， 100,9134-9137; Wang, J.， Li， J., Baca， A. J.， Hu, J.， Zhou， F.， Yan， W., Pang， D,W., Anal.Chem.， 2003， 75, 3941-3945; S. S. W. Yeung
T. M. H. Lee., I. M. Hsing" J. Am. Chem. Soc.， 2006, 128, 13374-13375; A. E.Radi, J. L. A. Sa'nchez， E. Baldrich， C. K. O，Sullivan， J. Am. Chem. Soc., 2006， 128, 117-124.]，具有背景電流高， 檢測(cè)靈敏度低并且需要采用固定的方式，對(duì)大容量的樣品檢測(cè)有困難 等。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)已有分析技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于推出一種用電 化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)檢測(cè)蛋白的方法。該方法以電化學(xué)活性開(kāi)關(guān) 適配體信標(biāo)為檢測(cè)探針，無(wú)試劑，不需要固定，選擇性好、靈敏、簡(jiǎn) 便、快速直接均相測(cè)定蛋白等生物分子。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)方案包括電化學(xué)活 性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)的合成和檢測(cè)樣品中特定蛋白分子的兩個(gè)步驟。所 述的適配體信標(biāo)無(wú)電化學(xué)活性，但與目標(biāo)分子結(jié)合后，因其莖環(huán)結(jié)構(gòu) 發(fā)生改變而具有電化學(xué)活性，產(chǎn)生與溶液中的蛋白的濃度呈線性關(guān)系 的氧化峰電流。由此還可計(jì)算蛋白目標(biāo)分子的含量。
現(xiàn)詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。 一種用電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信 標(biāo)檢測(cè)蛋白的方法，其特征在于，具體操作步驟
第一步電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)的合成
每1.0 O.D核酸適配體量合成時(shí)取30pL 3.3xl(T3111011/1的胭脂紅 酸溶液和加入20mg咪唑，調(diào)節(jié)該溶液的pH值6.5，室溫下羧基活化 30分鐘，在偶聯(lián)劑12mgEDC和27mgNHS存在下，加入含1.0 O.D兩 端修飾有氨基的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)特定序列核酸的PBS溶液，調(diào)節(jié)該P(yáng)BS 溶液的pH值至7.3和溶液體積為400pL，在冰水浴下攪拌24小時(shí)， 透析袋于PBS溶液中透析48小時(shí)，去除未與核酸偶聯(lián)的胭脂紅酸， 用HPLC方法提純，得到濃度不低于lxlO'SmolL—1的電化學(xué)活性開(kāi)關(guān) 適配體信標(biāo)，4'C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> 第二步檢測(cè)樣品中特定蛋白分子
在含有待測(cè)的特定蛋白分子溶液的樣品中，加入50^LlxlO—SmolL—1的第一步得到的電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)，控制溶液 的培育條件為PBS溶液的pH=7.3、 [Mg2+] = 1.0 mmoI/L和[Na+]-1.0 mol/L， 37。C下培育30分鐘，電化學(xué)檢測(cè)以PBS溶液為電解液，采 用羧基化的碳納米管修飾電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電 極，鉑電極為對(duì)電極，用示差脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行檢測(cè)，在0.2 0.9V 范圍掃DPV，記錄0.72V處的氧化峰電流值，該氧化峰電流與樣品中 特定蛋白分子濃度呈線性關(guān)系。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、 采用電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)作為檢測(cè)探針，無(wú)需其他試 劑，不要固定，方法簡(jiǎn)單、便捷。
2、 采用電化學(xué)檢測(cè)，具有靈敏、選擇性好，背景信號(hào)低，對(duì)樣 品無(wú)濁度要求，所需儀器簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，適用于野外等簡(jiǎn)陋場(chǎng)合使 用。
3、 可在水溶液中對(duì)特定蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并且檢測(cè)的線性范圍寬， 適用于目標(biāo)量變化大的樣品檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案和工作原理。實(shí)施例 完全按照上述檢測(cè)蛋白的方法的具體操作步驟進(jìn)行操作。 實(shí)施例溶液中凝血酶蛋白的測(cè)定
第一步按3.0 O.D.核酸量的合成，取90nL 3.3xl(T3mo11/1的 胭脂紅酸溶液，加入60mg咪唑，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5，室溫下羧基 活化30分鐘后，在偶聯(lián)劑約12mgEDC和27mgNHS存在下，加入3.0 O.D.的兩端帶有氨基的含anti-thrombin aptamer (29mer)的核酸適配 體PBS溶液(pH=7.3)，溶液體積為1200pL，混合液在冰水浴下攪拌 24小時(shí)，透析袋(分子量為7000)于PBS溶液中透析48小時(shí)，除 去過(guò)量的未與核酸偶聯(lián)的胭脂紅酸，用HPLC方法提純，制得1100pL 濃度為1.5xl(T5！11011/1的電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)，4'C冰箱中保 存?zhèn)溆谩?br> 第二步在分別含有1.0， 2.0， 4.0， 8.0， 12.0 xlO-HmolL"凝血 酶蛋白溶液中，分別加入50pL lxlO—SmolL—1的第一步得到的電化學(xué) 活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)，控制溶液的培育條件為PBS溶液的pH=7.3、 [Mg2+〗=1.0 mmol/L禾卩[Na+] = 1.0 mol/L，37。C下培育30分鐘，電化 學(xué)檢測(cè)以PBS溶液為電解液，采用羧基化的碳納米管修飾電極為工 作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極，用示差脈沖伏 安法(DPV)進(jìn)行檢測(cè)，在0.2 0.9V范圍掃DPV，記錄0.72V處的氧 化峰電流值，該氧化峰電流值分別為0.24， 0.46， 0.79， 1.41, 2.18pA， 經(jīng)計(jì)算，表明氧化峰電流與凝血酶蛋白濃度依從關(guān)系的線性方程為 Y=0.0861+0.1722C，式中，Y為氧化峰電流，單位為^A， C為凝血 酶蛋白濃度，單位為10—"molL—1，相關(guān)系數(shù)為0.9979。 工作原理
胭脂紅酸為羥基蒽醌類化合物，在正、負(fù)電位下都有電化學(xué)響應(yīng)。 分別為位于-0.4V附近的一對(duì)氧化還原峰，對(duì)應(yīng)著胭脂紅酸的蒽醌 基團(tuán)被還原成氫醌及其逆反應(yīng)，以及位于+0.720V的氧化峰，對(duì)應(yīng)氫 醌基團(tuán)被氧化成二醌式結(jié)構(gòu)的過(guò)程。
當(dāng)適配體信標(biāo)以環(huán)莖結(jié)構(gòu)形式存在時(shí)，其處于閉合狀態(tài)時(shí)，由于 其莖部末端的兩個(gè)胭脂紅酸分子靠得很近，其氫醌基團(tuán)間形成穩(wěn)定的 分子間氫鍵，從而使兩個(gè)胭脂紅酸分子締合，締合后的胭脂紅酸分子 處于更加穩(wěn)定的狀態(tài)，不表現(xiàn)出電化學(xué)活性；而當(dāng)適配體信標(biāo)與特定 蛋白分子作用并打開(kāi)后，其構(gòu)型的變化使末端的胭脂紅酸分子被分 開(kāi)，此時(shí)胭脂紅酸分子的締合狀態(tài)被破壞，故能夠表現(xiàn)出電化學(xué)活性。 將胭脂紅酸作為電化學(xué)適配體信標(biāo)的信號(hào)分子，利用適配體信標(biāo)與特 定蛋白分子作用后發(fā)生的構(gòu)型改變，使胭脂紅酸分子可在締合狀態(tài)和 解離狀態(tài)間變化，從而令其具有在電化學(xué)非活性/活性間切換的能力。
權(quán)利要求
1、一種用電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)檢測(cè)蛋白的方法，其特征在于，具體操作步驟第一步電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)的合成每1. 0 O.D核酸適配體量合成時(shí)取30μL 3.3×10-3molL-1的胭脂紅酸溶液和加入20mg咪唑，調(diào)節(jié)該溶液的pH值6.5，室溫下羧基活化30分鐘，在偶聯(lián)劑12mg EDC和27mg NHS存在下，加入含1.0 O.D兩端修飾有氨基的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)特定序列核酸的PBS溶液，調(diào)節(jié)該P(yáng)BS溶液的pH值至7.3和溶液體積為400μL，在冰水浴下攪拌24小時(shí)，透析袋于PBS溶液中透析48小時(shí)，去除未與核酸偶聯(lián)的胭脂紅酸，用HPLC方法提純，得到濃度不低于1×10-5molL-1的電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；第二步檢測(cè)樣品中特定蛋白分子在含有待測(cè)的特定蛋白分子溶液的樣品中，加入50μL1×10-5molL-1的第一步得到的電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)，控制溶液的培育條件為PBS溶液的pH＝7.3、[Mg2+]＝1.0mmol/L和[Na+]＝1.0mol/L，37℃下培育30分鐘，電化學(xué)檢測(cè)以PBS溶液為電解液，采用羧基化的碳納米管修飾電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極，用示差脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行檢測(cè)，在0.2～0.9V范圍掃DPV，記錄0.72V處的氧化峰電流值，該氧化峰電流與樣品中特定蛋白分子濃度呈線性關(guān)系。
全文摘要
一種用電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)檢測(cè)蛋白的方法，屬于化學(xué)分析方法的技術(shù)領(lǐng)域，包括電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)的合成和檢測(cè)樣品中特定蛋白分子的兩個(gè)步驟。所述的適配體信標(biāo)無(wú)電化學(xué)活性，但與目標(biāo)分子結(jié)合后，因其莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而具有電化學(xué)活性，產(chǎn)生與溶液中的蛋白的濃度呈線性關(guān)系的氧化峰電流。由此還可計(jì)算蛋白分子的含量。該方法以電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)適配體信標(biāo)為檢測(cè)探針，無(wú)試劑，不需要固定，選擇性好、靈敏、簡(jiǎn)便、快速直接均相測(cè)定適配體等生物分子，檢測(cè)的線性范圍寬，特別適于檢測(cè)目標(biāo)量變化大的樣品和野外等簡(jiǎn)陋場(chǎng)合使用。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101382518SQ20081020123
公開(kāi)日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2008年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日
發(fā)明者何品剛, 吳繼魁, 帆 張, 方禹之, 莉 林, 程圭芳, 黃翠華 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)