專利名稱：：神農香菊指紋圖譜的測定方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及神農香菊指紋圖譜的測定方法，具體的說是應用指紋圖譜特征對煙用神農香菊的質量進行控制的測定方法。
背景技術：
：神農香菊系菊科菊屬的一個新變種，產于湖北省神農架林區(qū)，分布于海拔2000m以上向陽開闊的空曠地，全株具有特殊的濃郁香氣。民間以其花、葉陰干作香囊。神農香菊中含有的木犀草素具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎、抑菌、抗過敏和免疫增強作用，用于慢性支氣管炎和其他呼吸道疾病的痰多咳嗽者。神農香菊在黃鶴樓淡雅香品類中，能使產品香氣淡雅純正、豐滿細膩，口味自然醇和、純凈舒適，并且具有鎮(zhèn)咳祛痰的作用。但目前對神農香菊的研究均是研究其化學成分，探討神農香菊揮發(fā)油中的化學成分，主要是一些單萜類，倍半萜及其含氧衍生物。如天然產物研究與開發(fā).1994,6(3),32-34;武漢植物學研究.2005,23(6).-610-612;中國中藥雜志.2002，27(8).598-599。昔紋圖譜作為中草藥等質量控制的方法，在國際上已形成共識。指紋圖譜技術針對中藥復雜體系整體性和指紋性特點，是中藥質量控制和生產工藝控制的一種有效技術手段，并已正式出現在相關指導性文件中。指紋圖譜技術結合了指紋圖譜整體定性和指標成分定量兩種手段，可全面反映工藝過程中各類成分質和量的變化情況。指紋圖譜作為神農香菊的質量控制方面目前還沒有研究。菊花指紋圖譜目前也有一些研究，程宏英分析科學學報.2007,23(3),257-262、趙玉叢中草藥.2005,36(10)，1552-1555等研究了不同來源、不同品種菊花的指紋圖譜。但因神農香菊和一般菊花的活性成分含量有很大的差異，主要是神農香菊中的木犀草素含量較高，試驗研究用他們的方法很難將神農香菊中的木犀草素與其他物質較好的分開，具有一定的局限性。
發(fā)明內容基于目前對神農香菊的研究弱點，本發(fā)明建立了一種能將神農香菊活性成分進行有效分離的色譜方法，構建了神農香菊的色譜指紋圖譜，并利用該指紋圖譜特征對神農香菊的質量迸行全面控制。本發(fā)明通過下述步驟來實施(a)標準溶液的制備精密稱取木犀草素，加甲醇溶解、混勻、定容，制成每lml含l.Omg木犀草素的溶液，即得標準溶液；(b)供試品溶液制備精密稱取神農香菊粉末(20目)，精密加入甲醇1040ml，稱定重量，超聲提取1060分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過濾，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至25100ml量瓶中，定容，搖勻，過濾，取濾液，即得供試品溶液；(c)色譜條件用十八垸基硅垸鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相A為PH=2.5的O.Olmol/1磷酸緩沖鹽水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫的程序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>流速0.5ml/min，檢測波長為350nm，柱溫35'C;理論塔板數按木犀草素峰計算；(d)對照指紋圖譜的獲得精密吸取標準溶液和供試品溶液5ul，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，通過標準品木犀草素的色譜峰，確定供試樣品色譜圖中的木犀草素峰，按照色譜圖方法學考察的方法確定神農香菊對照指紋圖"J並l曰5(e)色譜分析將每批次所得的供試品溶液的指紋圖譜與神農香菊對照指紋圖譜經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版比較，來確定神農香菊的質量。本發(fā)明色譜圖的方法學考察1)精密度研究精密吸取供試品溶液5ul，按i述色譜條件，連續(xù)進樣5次，以木犀草素峰作為參照峰，指定其a值為l.OOO，考察儀器精密度。各特征指紋峰相對保留時間和特征指紋峰相對峰面積的RSD值均小于3%，符合指紋圖譜的要求。2)穩(wěn)定性研究精密吸取供試品溶液5ul，按上述色譜條件，分別于Oh、3h、6h、9h、12h、24h進行檢測，以木犀草素峰為參照，指定其a值為l.OOO，考察穩(wěn)定性，各特征指紋峰相對保留時間和特征指紋峰相對峰面積的RSD值均小于3%，符合指紋圖譜的要求。3)重復性研究取神農香菊粉末(20目)各5份，精密稱定，照"供試品溶液的制備"所述的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，以木犀草素峰為參照，指定其a值為1.000，考察方法的重復性，各特征指紋峰相對保留時間和特征指紋峰相對峰面積的RSD值均小于3%，符合指紋圖譜的要求。本發(fā)明的有益效果①本發(fā)明建立的色譜方法具有精密度高、穩(wěn)定性好、重復性好的優(yōu)點，符合指紋圖譜的要求，可作為神農香菊質量檢測方法，全面監(jiān)控,農香菊的質量；②本發(fā)明能將神農香菊活性成分進行有效分離，構建了神農香菊的指紋圖譜，填補了神龍香菊在活性成分分離和指紋圖譜中研究的空白；③對神龍香菊的質量評價不再局限于對某一種成分的研究，而是從整體評價，應用指紋圖譜特征對煙用神農香菊原藥材的質量進行全面控制，確保巻煙產品加香加料的穩(wěn)定性，提供了一種有效的產品質量檢測方法和工藝技術創(chuàng)新的評價平臺。圖1是對照品木犀草素色譜圖，圖2是神農香菊對照指紋圖譜，圖3是十批神農香菊指紋圖譜疊加圖，具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。實施例(a)對照品溶液的制備精密稱取木犀草素(中國藥品生物制品檢定所，批號111520—200201)，加甲醇(色譜純，美國天地公司)制成每lml含1.0mg木犀草素的溶液，制得對照品溶液。(b)神農香菊溶液的制備取10個不同批次神農香菊原藥材粉末(過20目篩)各1.0g，精密稱定，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲提取30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過濾，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至50ml量瓶中，加甲醇至50ml刻度，搖勻，濾過，取濾液，制得神農香菊溶液。表l10個不同批次的神農香菊樣品來源樣品產地采集時樣品間1神農架板倉07.1162神農架板倉07.123神農架八角廟07.1184神農架八角廟07.1295巴東綠蔥坡07.110產地采集時_^_巴東綠蔥坡07.12神農架燕子埡02.10神農架燕子埡03.1神農架天門埡04.10神農架天l，埡05.11(c)色譜條件使用十八垸基硅烷鍵合硅膠為填料的DIONEX-ACCLAIM.120C18(250mmX4.6mm，5m)色譜柱；采用梯度洗脫，流動相A為PH=2.5的0.01mol/l磷酸緩沖鹽水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫的程序如表2:表2梯度洗脫程序時間(min)_流動相A(%)流動相B(%)0~20623820~3562—5238—4835~905248卯~12052—048—100120~1400100流速0.5ml/min，檢測波長為350nm，柱溫35。C;理論塔板數按木犀草素峰計算應不低于3000。(d)對照指紋圖譜的獲得精密吸取對照品溶液和神農香菊溶液5iU，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，通過對照品木犀草素的色譜峰，確定神農香菊原藥材溶液色譜圖中的木犀草素峰，按照色譜圖方法學考察的方法確定神農香菊原藥材對照指紋圖譜。圖1是對照品木犀草素色譜圖。圖2是神農香菊的指紋圖譜。神農香菊的指紋圖譜上相對峰面積大于0.03的峰有17個特征峰，68號峰為木犀草素，如下表3所示:表3神農香菊指紋圖譜特征峰表述<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(e)色譜分析指紋圖譜能夠綜合的評價神農香菊的質量，因此將每批次所得的神農香菊指紋圖譜與神農香菊對照指紋圖譜經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版比較。計算10批神農香菊原藥材的相似度，相似度不低于0.9，說明神農香菊原藥材質量合格。IO批神農香菊原藥材指紋圖譜疊加圖如圖3所示。權利要求1.一種神農香菊指紋圖譜的測定方法，其特征包括如下步驟(a)標準溶液的制備精密稱取術犀草素，加甲醇溶解、混勻、定容，制成每1ml含1.0mg木犀草素的溶液，即得標準溶液；(b)供試品溶液制備精密稱取神農香菊粉末20目，精密加入甲醇10～40ml，稱定重量，超聲提取10～60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過濾，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至25～100ml容量瓶中，定容，搖勻，過濾，取濾液，即得供試品溶液；(c)設定色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相A為PH＝2.5的0.01mol/l磷酸緩沖鹽水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫的程序如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="136"></tables>流速0.5ml/min，檢測波長為350nm，柱溫35℃；理論塔板數按木犀草素峰計算；(d)獲得對照指紋圖譜精密吸取對照品溶液和供試品溶液5μl，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，通過標準品木犀草素的色譜峰，確定供試樣品色譜圖中的木犀草素峰，按照色譜圖方法學考察的方法確定神農香菊原藥材對照指紋圖譜；(e)進行色譜分析將每批次所得的供試品溶液的指紋圖譜與神農香菊對照指紋圖譜經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)比較。全文摘要本發(fā)明提供了一種神農香菊指紋圖譜的測定方法，通過液相色譜儀測定的供試品溶液的指紋圖譜與神農香菊對照指紋圖譜經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)比較，應用指紋圖譜特征對煙用神農香菊原藥材的質量進行全面控制，確保卷煙產品加香加料的穩(wěn)定性。本發(fā)明具有精密度高、穩(wěn)定性好、重復性好的優(yōu)點，能將神農香菊活性成分進行有效分離。文檔編號G01N33/15GK101685088SQ20081019710公開日2010年3月31日申請日期2008年9月27日優(yōu)先權日2008年9月27日發(fā)明者威萬,盧金清,琳李,娟王,詹曉蓮,郭國寧申請人:湖北中煙工業(yè)有限責任公司