專利名稱：：一種弓形蟲感染早期檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種專性細胞內(nèi)寄生的機會致病性原蟲的檢測方法，具體地說是涉及弓形蟲感染早期檢測的方法。
背景技術(shù)：
：弓形蟲(7b^^7as/z忍是一種專性細胞內(nèi)寄生的機會致病性原蟲，它在人和動物的有核細胞內(nèi)寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形蟲病。弓形蟲病呈世界性分布，人類弓形蟲的平均感染率達33%。健康成人感染后一般都不會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但卻會在體內(nèi)持續(xù)很多年。當機體免疫力降低或嚴重感染時，這種隱性感染則可表現(xiàn)出顯著的弓形蟲病癥狀，如弓形蟲眼病、弓形蟲肝炎、弓形蟲淋巴結(jié)炎等。免疫功能低下或嚴重缺損的機體(如AIDS、先天性丙種球蛋白缺乏癥、多發(fā)性骨髓瘤及其它惡性腫瘤患者)，弓形蟲感染常常呈致死性病變。弓形蟲位列孕婦宮內(nèi)感染致胚胎畸形的五大病原體(TORCH)之首，感染的孕婦除自身患病外，平均約40%可通過胎盤將弓形蟲傳染給胎兒，造成流產(chǎn)、死胎、畸形或嬰兒先天性弓形蟲病。胎兒受損程度與胎齡呈負相關(guān)，感染發(fā)生的越早，胎兒受損程度會越嚴重，目前還尚未有弓形蟲病早期診斷的有效方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種弓形蟲的早期診斷方法。為達到上述目的，本發(fā)明公開了一種弓形蟲感染早期檢測的方法，所述弓形蟲感染早期檢測的方法由以下步驟組成1)用碳酸緩沖液稀釋純化后的NTPase-II制成5pg/ml的包被液，10(^1/孔包被96孔酶標板，4'C包被過夜；2)PBST洗板3-5次，2—3min/次，拍干;3)加5%的脫脂奶粉，37"封閉2h;4)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；5)加入稀釋度為h100的被檢血清，10(^1/孔，37'C孵育1.5h;6)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；7)加入稀釋度為l:4000的羊抗鼠酶標二抗IgM，10(^1/孔，37。C孵育lh，PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；8)加入底物顯色液A液和B液，37'C避光顯色10—15min，加終止液，50pl/孔；9)酶標儀讀數(shù)，450nm處空氣調(diào)零后測0D值，以陰性血清的0D45。^平均值和3倍標準差之和作為陰性血清的上限，當血清的0D45。nra^X+3S者即判斷為陽性血清，反之則為陰性。本發(fā)明的弓形蟲感染早期檢測的方法還可以由以下步驟組成1)用碳酸緩沖液稀釋純化后的NTPase-II帝lj成5嗎/ml的包被液，100pl/孔包被96孔酶標板，4'C包被過夜；2)PBST洗板3次，2—3min/次,拍干；3)加5%的脫脂奶粉，37'C封閉2h;4)PBST洗板5次，2—3min/次，拍干;5)加入稀釋度為1:200的被檢血清，lOO^il/孔，37。C孵育1.5h;6)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；7)加入稀釋度為1:4000的羊抗鼠酶標二抗IgG,10(Hil/孔，37。C孵育lh，PBST洗板7次，2—3min/次，拍干;8)加入底物顯色液A液和B液，37。C避光顯色10—15min,加終止液，50^1/孔；9)酶標儀讀數(shù)，450nm處空氣調(diào)零后測0D值，以陰性血清的004^平均值和3倍標準差之和作為陰性血清的上限，當血清'的0D45。^又+3S者即判斷為陽性血清，反之則為陰性。由于NTPase-II(三磷酸核苷水解酶-IInucleosidetriphosphatehydrolase)是弓形蟲可以在宿主體內(nèi)寄生的關(guān)鍵性酶，也是弓形蟲急性感染階段引起機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要抗原，因此利用弓形蟲融合蛋白NTPase-ll對弓形蟲病的早期診斷具有較高的準確性。下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。具體實施方式下面為NTPase-II(nucleosidetriphosphatehydrolase,即弓形蟲融合蛋白三磷酸核苷水解酶-II)在弓形蟲病早期診斷中的應(yīng)用具體實施例。實施例1本檢測方法中弓形蟲的融合蛋白NTPase-II的制備方法包括以下步驟(1)弓形蟲基因組DNA的制備；(2)弓形蟲NTPase-II基因的擴增；(3)弓形蟲NTPase-II基因插入克隆質(zhì)粒；(4)弓形蟲NTPase-II基因插入表達質(zhì)粒；(5)將(4)所得的重組子轉(zhuǎn)入宿主細胞；(6)誘導(dǎo)表達融合蛋白NTPase-II;(7)分離純化(5)的產(chǎn)物得到NTPase-II表達蛋白。具體制備過程如下(一)弓形蟲基因組DNA的制備弓形蟲RH株速殖子連續(xù)在小鼠體內(nèi)傳代，感染3d后無菌操作抽取腹水，蟲體用生理鹽水洗滌3次，加入與蟲體混懸液等量的淋巴細胞分離液，800rpm離心8min后加速至2000rpm離心10min，收集中層蟲體，按DNA提取試劑盒說明書抽提弓形蟲基因組DNA,用分光光度法測定DNA的濃度和純度。(二)弓形蟲NTPase-II基因的擴增根據(jù)弓形蟲NTPase-II參考核苷酸序列和表達載體克隆位點內(nèi)切酶圖譜分析結(jié)果，采用PrimerDesigner引物設(shè)計軟件自行設(shè)計引物，由上?；瞪锛夹g(shù)公司合成，引物序列如下上游引物5'—GAAGATCTACAGACTCATCGTCACTCCG—3，(下劃線為BglII酶切位點)，下游引物5'—GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC—3'(下劃線為HindIII酶切位點)。采用2xPCRMasterMix試劑盒擴增NTPase-II基因，PCR反應(yīng)總體積為50^1:其中含有模板DNA5pl(200ng),上下游引物各(終濃度為0.4pmol/L)。同時設(shè)立空白對照。PCR反應(yīng)參數(shù):95。C5minxl;95。C45s，58。C45s，72。C60sx30;72°C10minxl。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收。(三)T-A克隆及測序回收的PCR產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體16。C過夜連接。連接體系為lOpl:純化的PCR產(chǎn)物3^1，2xbuffer5|al，pGEM-TEasy載體l^d，T4DNA連接酶lpl。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)五co//DH5a，吸取200|al轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細菌涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，篩選陽性克隆。陽性重組子經(jīng)培養(yǎng)和提取質(zhì)粒后，分別進行BglII和HindIII雙酶切及PCR鑒定，并送上?；瞪锛夹g(shù)公司測序。測序結(jié)果采用DNAMAN軟件與Genbank公布的弓形蟲NTPase-II基因序列進行比較。(四)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建將重組克隆質(zhì)粒及pBAD-HisB用BglII和HindIII雙酶切，酶切體系為40^1:重組克隆質(zhì)粒(pGEM-TEasy-NTPase-II)或pBAD-HisB20(il、10xbuffer4pl、BglII2jJ、HindlII2j^1、nuclease-freewater12pl;按膠回收試劑盒說明回收目的片段；16X:連接過夜，連接體系為10(xl:pBAD-HisB1^1、回收后目的片段3pl、T4DNA連接酶ljil、2xbuffer5(xl。(五)重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細胞。將構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒加入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，冰浴30min;迅速放入42'C水浴中熱擊90s;再迅速冰浴5min;加無抗生素的LB，混勻后37。C200rpm振蕩培養(yǎng)45—60min;取一定量在含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上涂布，室溫下干燥，然后倒置放于37"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(六)誘導(dǎo)表達。從平板上挑取白色菌落，在3mlLB液體培養(yǎng)基(含50Kig/mlAmp)中于37°C，200rpm過夜振蕩培養(yǎng)。取50nl過夜培養(yǎng)的菌液加入5mlLB-Amp液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)3h;取lml菌液作為誘導(dǎo)前對照，12000rpm離心30秒收集菌體，4t保存。剩余菌液加20%的卜阿拉伯糖至終濃度為0.2%誘導(dǎo)表達，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)4h。12，000rpm離心30秒收集菌體，-2(TC保存。收集的菌體中加30u1蒸餾水和等體積的2X蛋白上樣緩沖液，混勻后IO(TC煮沸3min，12，OOOrpm離心10min，取上清適量做SDS-PAGE電泳分析。(七)重組蛋白的純化純化加入1/20細胞生長體積的GuNTA-0Buffer(20mmol/LTris-HClpH7.9，0.5mol/LNaCl，纖Glycerol，6mol/LGuanidiumHQ)和PMSF。重懸后超聲破碎。超聲破碎菌離心后取上清，置于-20。C保存。層析將5mlNTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的GuNTA-0Buffer平衡；將樣品加到NTA層析柱中，流速控制在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況；層析用5倍NTA體積的GuNTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/h左右；分別用5倍NTA體積的GuNTA-20，GuNTA-40,GuNTA-60，GuNTA-100,GuNTA-500洗脫，流速控制在15ml/h左右，收集洗脫液；確定目標蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的分布，取各段收集的洗滌液和洗脫液各20pl，以5pl的5X蛋白上樣緩沖液混勻，沸水煮5min后，5000rpm，離心5min，10%SDS-PAGE鑒定。純化重組蛋白蛋白的透析復(fù)性透析袋的處理在300ml500ml透析袋處理液(2%NaHCO"l.Ommol/LEDTA，pH8.0)中將透析袋煮沸10min后以蒸餾水徹底漂洗，然后置于1.0mmol/L的EDTA(pH8.0)中煮沸10min，以滅菌純水里外徹底沖洗透析袋數(shù)次；將純化所得的洗脫液以透析液A稀釋，裝入截留分子量為14kDa的透析袋中，以磁力攪拌器攪拌，4'C依次在鹽酸胍終濃度逐步降低的1L透析液B中進行透析，每10h進行透析液換液一次；取出透析袋置于透析液C中，4'C，15h,以磁力攪拌器攪拌；取出透析袋置于透析液D中，4°C，10h，以磁力攪拌器攪拌。透析液的配制透析液A:20,1/LTris-HCl，pH8.0;透析液B:在透析液A中加入不同量的鹽酸胍，配制成鹽酸胍終濃度分別為6mol/L、4mol/L、2mol/L和lmol/L的透析液B;透析液C:20,1/LTris-HCl，0.6咖ol/LL-精氨酸，10%蔗糖，2畫1/LEDTA，0.5mol/L鹽酸胍，pH8.0;透析液D:20mmol/LTris-HCl，25mmol/LNaCl，0.2mol/L鹽酸胍，pH8.0。上述制備方法中，各種試驗參數(shù)均按常規(guī)操作選擇，可視具體的實驗條件而定，所用的克隆宿主細胞可以為大腸桿菌DH5a、JM109等，表達宿主細胞可以為大腸桿菌BL21、DE3等。誘導(dǎo)表達融合蛋白NTPase-II可采用多種方法，例如使用IPTG、L-阿拉伯糖。本發(fā)明中分離純化融合蛋白NTPase-II亦可采用多種方法，例如使用親和層析、離子交換層析等等。弓形蟲感染早期檢測(一)弓形蟲感染BALB/c小鼠。弓形蟲RH株速殖子連續(xù)在小鼠體內(nèi)傳代，感染3d后無菌操作抽取腹水，蟲體用生理鹽水洗滌3次，加生理鹽水懸浮蟲體，用細胞計數(shù)板在鏡下計數(shù)，制成濃度為2000個/ml的速殖子懸液。使用一次性注射器吸取懸液，0.5ml/只弓形蟲速殖子感染BALB/c小鼠。對10只BALB/c小鼠分別編號，感染前尾靜脈取血，感染后從第二天開始尾靜脈取血，直至小鼠發(fā)病死亡，感染后小鼠存活8天，死后小鼠剪開腹部，用生理鹽水洗滌，鏡下觀察速殖子感染情況。將所有標本的血清析出，置于-2(TC保存。(二)間接ELISA法檢測小鼠血清中抗體的滴度。用碳酸緩沖液稀釋純化后的NTPase-II(nucleosidetriphosphatehydrolase,即三磷酸核苷水解酶-II)制成5pg/ml的包被液，100pl/孔包被96孔酶標板，4'C包被過夜；PBST洗板3-5次，通常3次即可，2—3min/次，拍干；力n5%的脫脂奶粉，37°C封閉2h;PBST洗板5-7次，通常5次即可，2—3min/次，拍千；加入稀釋度為1:100的上述被檢小鼠血清血清，100^1/孔，37。C孵育1.5h;PBST洗板5-7次，以7次為佳，2-3min/次，拍干；加入稀釋度為1:4000的羊抗鼠酶標二抗IgM,100|^1/孔，37。C孵育lh，PBST洗板5-7次，以7次為佳，2—3min/次，拍干；加入底物顯色液A液和B液，37t:避光顯色10—15min，加終止液2mol/L的濃H2S04終止反應(yīng)，5(^1/孔；使用酶標儀檢測反應(yīng)液的吸光度值，于波長450nm處空氣調(diào)零后測0D值。以陰性血清的0045。>平均值和3倍標準差之和作為陰性血清的上限，當血清的0D45。M>^+3S者即判斷為陽性血清，反之則為陰性。本發(fā)明的IgM抗體ELISA結(jié)果如下表所示，可見小鼠血清中的IgM抗體滴度于感染后第三天即能出現(xiàn)陽性反應(yīng)。IgM抗體ELISA結(jié)果如下表天數(shù)(天)12345678陽性血清0.2180.2970.4950.6120.6740.8540.9150.976陰性對照0.1740.1430.1570.1320.1860.1480.1520.183實施例2用碳酸緩沖液稀釋純化后的NTPase-II制成5|ig/ml的包被液，100pl/孔包被96孔酶標板，4。C包被過夜；PBST洗板3-5次，通常3次即可，2—3min/次，拍干；加5%的脫脂奶粉，37。C封閉2h;PBST洗板3-5次，通常5次即可，2—3min/次，拍干；加入稀釋度為1:200的上述被檢小鼠血清，100(!l/孔，37。C孵育1.5h;PBST洗板5-7次，以7次為佳，2—3min/次，拍干；加入稀釋度為1:4000的羊抗鼠酶標二抗IgG，lOO^il/孔，37。C孵育lh，PBST洗板5-7次，以7次為佳，2—3min/次，拍干；加入底物顯色液A液和B液，37"C避光顯色10—15min，加終止液2mol/L的濃}^04終止反應(yīng)，50^1/孔；使用酶標儀檢測反應(yīng)液的吸光度值，于波長450nm處空氣調(diào)零后測0D值。以陰性血清的0D4^平均值和3倍標準差之和作為陰性血清的上限，當血清的0D45Qnm》x+3S者即判斷為陽性血清，反之則為陰性。本發(fā)明的IgG抗體ELISA結(jié)果如下表所示，可見小鼠血清中的IgG抗體滴度于感染后第七天開始出現(xiàn)陽性反應(yīng)。IgG抗體ELISA結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>以上具體實施例中被檢血清與羊抗鼠酶標二抗的稀釋度隨著不同廠家的羊抗鼠酶標二抗不同,須作相應(yīng)調(diào)整。檢測特異性檢驗使用純化后的NTPase-II作為包被抗原，間接ELISA分別檢測本實驗室所收集的瘧原蟲感染、腦囊蟲病、血吸蟲病及肺吸蟲病血清中的IgG抗體，并分別計算出陽性率。反應(yīng)條件及操作步驟如前所述，檢測結(jié)果如下表所示，可見本發(fā)明的檢測特異性較高。間接ELISA檢測特異性檢測結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1、一種弓形蟲感染早期檢測的方法，其特征在于由以下步驟組成1)用碳酸緩沖液稀釋純化后的NTPase-II制成5μg/ml的包被液，100μl/孔包被96孔酶標板，4℃包被過夜；2)PBST洗板3-5次，2-3min/次，拍干；3)加5％的脫脂奶粉，37℃封閉2h；4)PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；5)加入稀釋度為1∶100的被檢血清，100μl/孔，37℃孵育1.5h；6)PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；7)加入稀釋度為1∶4000的羊抗鼠酶標二抗IgM，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；8)加入底物顯色液A液和B液，37℃避光顯色10-15min，加終止液，50μl/孔；9)酶標儀讀數(shù)，450nm處空氣調(diào)零后測OD值，以陰性血清的OD450nm平均值和3倍標準差之和作為陰性血清的上限，當血清的OD450nm≥X+3S者即判斷為陽性血清，反之則為陰性。2、一種弓形蟲感染早期檢測的方法，其特征在于由以下步驟組成1)用碳酸緩沖液稀釋純化后的NTPase-II制成5pg/ml的包被液，100pl/L包被96孔酶標板，4'C包被過夜；2)PBST洗板3-5次，2—3min/次，拍干；3)加5%的脫脂奶粉，37"C封閉2h;4)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；5)加入稀釋度為1:200的被檢血清，100nl/孔，37。C孵育1.5h;6)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；7)加入稀釋度為l:4000的羊抗鼠酶標二抗IgG，10(^1/孔，37。C孵育lh，PBST洗板7次，2—3min/次，拍干；8)加入底物顯色液A液和B液，37°。避光顯色10—15min，加終止液，5C)^il/孔；9)酶標儀讀數(shù)，450nm處空氣調(diào)零后測OD值，以陰性血清的0D4^平均值和3倍標準差之和作為陰性血清的上限，當血清的0D45。n^X+3S者即判斷為陽性血清，反之則為陰性。全文摘要本發(fā)明涉及一種弓形蟲感染早期檢測的方法。弓形蟲三磷酸核苷水解酶-II(NTPase-II)是弓形蟲利用宿主細胞補救合成嘌呤途徑中不可或缺的關(guān)鍵性酶，對弓形蟲的寄生和繁殖都具有重要的作用，也是弓形蟲急性感染階段引起機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要抗原。本發(fā)明是利用聚合酶鏈反應(yīng)將弓形蟲三磷酸核苷水解酶-II基因擴增，插入表達載體中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核細胞進行表達，得到重組融合蛋白NTPase-II，利用重組蛋白NTPase-II作為包被抗原建立間接ELISA法，作為對弓形蟲感染的早期檢測方法。文檔編號G01N33/53GK101315381SQ20081006283公開日2008年12月3日申請日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日發(fā)明者李麗寧,丹沙,潘長旺,峰譚申請人:溫州醫(yī)學(xué)院