專利名稱：原位雜交的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測生物聚合物在細(xì)胞樣品或者組織樣品中的存在和/ 或位置的改進(jìn)的方法。
背景技術(shù)：
原位雜交(ISH)是生物醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域中通常使用的技術(shù)。ISH用于揭 示被研究的生物聚合物在細(xì)胞或者組織中的存在并顯示所述生物聚合物的 位置。將被研究的細(xì)胞或者組織放置在固體表面如載玻片上，并使一種或多 種與被研究的靶生物聚合物互補(bǔ)的探針與生物聚合物雜交或者結(jié)合。然后通 過洗滌除去未結(jié)合的探針。然后檢測保留的結(jié)合的探針的存在或者位置。改 進(jìn)的ISH技術(shù)被描述在美國專利5,871,932和6，022，689中。
一種變化的ISH是熒光ISH(或者FISH)，熒光原位雜交普遍用于例如檢 測來自孕婦的羊水細(xì)胞中的染色體異常。
熒光原位雜交(FISH)依賴于對靶胚胎細(xì)胞中的熒光信號進(jìn)行目視計數(shù)， 而不依賴于對胚胎的基因型與親本基因型進(jìn)行比較。在任何情況下，只要存 在成功的雜交，結(jié)果就能夠提供一些信息，這種技術(shù)還能用于檢測其它可疑 的染色體重排，例如，迪喬治綜合癥(DGS)(Jouannic等，2003)。異常的結(jié)果 對于在臨床上作出決定可能很重要，但是，正常的結(jié)果大大減少了等待所有 的核型的結(jié)果時的焦慮(Marteau等l, 1992)。
由于有了第一個使用FISH的臨床程序?qū)ξ茨芘囵B(yǎng)的羊水細(xì)胞(Ward等 1993)進(jìn)行檢測，世界范圍內(nèi)的幾個中心開始定期使用這種方法對處于中間 三個月(midtrimester)孕期的孕婦進(jìn)行羊水診斷(Witters等，2002)。通常， Vysis的FISH方法(Downers Grove, Illinois, USA)的報告結(jié)果的時間是48小曰寸(http:〃www.vysis.com)。
理想情況下，胚胎正常的明確的指標(biāo)應(yīng)當(dāng)在侵入性診斷程序的當(dāng)天就能 獲得。如果在少于現(xiàn)有技術(shù)的方法所需的兩天的時間內(nèi)能夠獲得未能培養(yǎng)的 羊水細(xì)胞的分析結(jié)果，則可能在侵入性診斷程序的當(dāng)天就獲得胚胎正常的明 確的指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的并有效的對生物聚合物進(jìn) 行原位雜交的方法。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種用于對至少一種分離的細(xì)胞中的生物 聚合物(例如，核酸和/或多肽)進(jìn)行原位雜交的方法，并且，該方法不包括 對多肽進(jìn)行消化。具體地說，本發(fā)明提供了一種用于對至少一種分離的細(xì)胞 中的核酸進(jìn)行原位雜交的方法，并且，該方法不包括對多肽進(jìn)行消化。
更具體地說，本發(fā)明提供了用于對至少一種分離的細(xì)胞中的核酸和/或 多肽進(jìn)行原位雜交的方法，該方法包括以下步驟(a)提供至少一種分離的 細(xì)胞；(b)使所述至少一種細(xì)胞與至少一種低滲溶液接觸；(c)用至少一種固 定劑對所述至少一種細(xì)胞進(jìn)行處理；(d)提供能與至少一種核酸和/或多肽結(jié) 合的至少一種分子，并使該至少一種分子與所述核酸和/或多肽結(jié)合一段時 間；(e)除去所有未結(jié)合的分子；和(f)檢測所有結(jié)合的分子，并且，該方法 不包括對多肽進(jìn)行消化。
所述方法通過使用能與至少一種核酸結(jié)合的至少一種分子和/或能與至 少一種多肽結(jié)合的至少一種分子，可以檢測同一細(xì)胞樣品中的不同的生物聚 合物如核酸和多肽。所述至少一種(第一)分子可以是與所述至少一種核酸 互補(bǔ)的分子，和/或所述至少一種(第二)分子可以是與所述至少一種多肽互 補(bǔ)的分子。此外，所述能與至少一種核酸和/或多肽結(jié)合的分子可以用至少一種標(biāo) 記進(jìn)行標(biāo)記，所述標(biāo)記選自由熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶標(biāo)記和放射性標(biāo)記所 組成的組中。
尤其是，生物聚合物的變性可以在溫度為50-70°C的范圍中進(jìn)行。例如，
在溫度為55°-65°C，尤其是約60。C下進(jìn)行。在本發(fā)明的方法中，所述細(xì)胞 樣品可以是脫水的或者非脫水的。尤其是，所述細(xì)胞樣品是非脫水的。
在本發(fā)明的方法中，步驟(d)中的結(jié)合時間是小于60分鐘；尤其是，所 述結(jié)合時間小于45分鐘；更尤其是，所述結(jié)合時間小于20分鐘。
在本發(fā)明的方法中，步驟(d)包括的至少一個第一溫度暴露，所述第一溫 度暴露在70-90°C的溫度下維持60-120秒。尤其是，所述第一溫度暴露在 75-85。C的溫度下維持80-100秒。尤其是，所述第一溫度暴露約80°C的溫 度下維持90秒。步驟(d)還包括至少一個隨后的溫度暴露，該隨后的溫度暴 露在37- 47°C的溫度下進(jìn)行。尤其是，所述隨后的溫度暴露在40-45°C的溫 度下進(jìn)行。尤其是，所述隨后的溫度暴露約42。C的溫度下進(jìn)行。
在本發(fā)明的方法中，所述細(xì)胞為真核細(xì)胞，例如哺乳動物的細(xì)胞。所述 哺乳動物的細(xì)胞可以是人的細(xì)胞或者非人類的細(xì)胞。更尤其是，所述細(xì)胞可 以是人的羊水細(xì)胞。所述方法可以進(jìn)一步包括診斷步驟。所述診斷步驟可以 包括確定哺乳動物的細(xì)胞中是否存在染色體異常。尤其是，本發(fā)明提供了確 定胚胎是否正常的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，所述方法可以用于檢測羊水細(xì)胞中染色體異 常。尤其是，所述羊水細(xì)胞可以來自孕期哺乳動物。因此，本發(fā)明提供了一 種用于檢測羊水細(xì)胞中的染色體是否異常的方法，該方法包括
(a) 提供從羊水中分離的至少一種細(xì)胞；
(b) 使所述至少一種細(xì)胞與至少一種低滲溶液接觸；
(c) 用至少一種固定劑對所述至少一種細(xì)胞進(jìn)行處理；(d) 提供能與至少一種核酸和/或多肽結(jié)合的至少一種分子，并使該至少 一種分子與所述核酸和/或多肽結(jié)合一段時間；
(e) 除去所有未結(jié)合的分子；
(f) 檢測所有結(jié)合的分子；和
(g) 檢測是否存在染色體異常，
并且，該方法不包括對多肽進(jìn)行消化。
在本發(fā)明的方法中，所述方法可以被用于檢測細(xì)胞樣品中是否存在至少 一種多肽。尤其是，在本發(fā)明的方法中，染色體存在異常與胚胎的異常相關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種用于分析細(xì)胞樣品中是否存 在可疑的核酸和/或多肽的試劑盒，該試劑盒包括至少一種雜交緩沖鹽、變性 劑、雜交試劑、用于低滲溶液的鹽、固定劑、以及能被檢測的至少一種分子， 該試劑盒選擇性地包括與該試劑盒有關(guān)的資料。尤其是，本發(fā)明的試劑盒不 包括任何蛋白酶。更尤其是，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其中，該試劑盒用 于檢測羊水細(xì)胞中的染色體是否異常。更尤其是，本發(fā)明的試劑盒用于診斷 胚胎是否正常。所述試劑盒還可以包括說明書和/或使用說明。


圖1是表示現(xiàn)有技術(shù)的方法和本發(fā)明的一個具體實施方式
(見實施例)
的方法的流程圖。圖l(A)表示來自Vysis的最接近的現(xiàn)有技術(shù)的FISH方法。 圖l(B)表示在本發(fā)明的方法的實施例中描述的方案。然而，本發(fā)明不限
于在圖l(B)中所示的方案中所描述的具體的試劑、量和時間。
對于圖2-7，使用下述的顏色著絲粒列舉探針(centromeric enumeration
probe) (CEP)， CEPX(紅色)；CEPY(綠色)；CEP 18 (淺綠色);基因座特
異性(LSI)探針，LSI21(黃色)；LSI13(紫色)，并相應(yīng)地進(jìn)行了標(biāo)記。為了
易于識別增強(qiáng)了顏色。圖2表示處于分裂間期的細(xì)胞。
圖2A表示CEPX和CEPY在未能培養(yǎng)的雌性羊水細(xì)胞的核中的雜交。 圖2B表示CEPX在未能培養(yǎng)的雌性羊水細(xì)胞的核中的雜交。 圖2C表示未能培養(yǎng)的雌性羊水細(xì)胞的染色體21中的正常二倍體。 圖3和4表示不同的三體性情況。
圖3A表示CEP 18在具有三套染色體18(愛德華氏綜合癥)的未能培養(yǎng)的 羊水細(xì)胞的核中雜交的情況。
圖3B表示LSI 21在具有3套染色體21(唐氏綜合癥(Down's Syndrome))
的未能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞的核中雜交的情況。
圖4A表示LSI 13在具有三套染色體13的未能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞的核中 雜交的情況。
圖4B表示CEP X和CEP Y在具有兩套染色體X和一套染色體Y (47XXY，克蘭費(fèi)爾特(Klinefelter)綜合癥)的未能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞的核
中雜交的情況。
圖5和6表示來自胚胎血液的單核細(xì)胞。
圖5A表示CEP X和CEP Y在來自雄性胚胎血液的單核細(xì)胞的核中的雜父。
圖5B表示來自胚胎血液的單核細(xì)胞的染色體21和染色體13中的正常
的二倍體。
圖6A表示在來自雄性胚胎血液的具有三套染色體18(愛德華氏綜合癥) 的單核細(xì)胞的核中，CEP18雜交的情況。
圖6B表示LSI21在具有3套染色體21 (唐氏綜合癥)的單核細(xì)胞的核中
雜交的情況。
圖6C表示在來自胚胎血液的具有單個X染色體或者單體性染色體X (特納氏綜合癥(Turners syndrome))的單核細(xì)胞的核中的CEPX。圖7表示來自絨毛膜絨毛的細(xì)胞、來自羊水的細(xì)胞和來自胚胎血液的細(xì)胞。
圖7A(i)表示來自絨毛膜絨毛樣品的滋養(yǎng)層細(xì)胞的核中的CEPX禾B CEP Y，和7A(ii)表示來自絨毛膜絨毛樣品的滋養(yǎng)層細(xì)胞的核中的染色體21中的
正常的二倍體。
圖7B(i)表示在未能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞的核中的CEPX，和7B(ii)表示在未 能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞的核中的染色體21中的正常二倍體。
圖7C(i)表示來自胚胎血液樣品的單核細(xì)胞的核中的CEPX和CEP Y， 和7C(ii)表示來自胚胎血液樣品的單核細(xì)胞的核中的染色體21中的三體性。
具體實施方式
定義
生物聚合物-來自活組織的任何分子，如核酸或者蛋白質(zhì)。在本申請 中，術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)"可以互換使用。
同定-在組織學(xué)中，固定是保存并固化細(xì)胞或者組織樣品，以盡可能 地按照與活的機(jī)體中的細(xì)胞或者組織的成分相同的關(guān)系保持樣品。用于固定 的化學(xué)物質(zhì)被稱為固定劑。
互補(bǔ)的-通常，核酸由含氮堿基，如嘧啶(胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)
和胸腺嘧啶(T))或者嘌呤(腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G))組成。這些含氮堿基形 成由嘧啶與嘌呤結(jié)合的氫鍵，并且嘧啶與嘌呤之間的鍵合被稱為"堿基配 對"。更具體地說，A與T或者U結(jié)合，G與C結(jié)合。核酸中的"互補(bǔ)的"是 指存在于兩個不同的核酸序列之間的堿基配對、或者存在于同一核酸序列中 兩個不同區(qū)域之間的堿基配對。蛋白質(zhì)由三維排列的氨基酸組成。蛋白質(zhì)中 的"互補(bǔ)的"是指分子(通常是其它的蛋白質(zhì))與蛋白質(zhì)的配合和結(jié)合。
因此，核酸和蛋白質(zhì)具有可以能與它們結(jié)合或者雜交的互補(bǔ)分子，并且這些分子可以用于檢測與它們互補(bǔ)的生物聚合物。在本領(lǐng)域中，通常將待檢 測的生物聚合物稱為"靶"，并將這些互補(bǔ)分子稱為"探針"。
結(jié)合和/或雜交一分子與核酸和/或多肽的結(jié)合和/或雜交是通過將耙與 探針在一定的溫度孵育一定的時間以使分子結(jié)合而實現(xiàn)的?？梢酝ㄟ^使用附 著在所述互補(bǔ)分子上的可檢測的標(biāo)記分子來檢測分子。
然而，本領(lǐng)域所使用的術(shù)語"雜交"通常是指互補(bǔ)核酸的結(jié)合，為了實現(xiàn) 本發(fā)明的目的，所使用的術(shù)語"雜交"和"結(jié)合"通常是指分子與核酸和/或多肽 的結(jié)合。因此，為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，分子與核酸的"結(jié)合"和/或"雜交" 不需要結(jié)合分子(探針)與靶核酸的每一個核苷酸完全匹配(互補(bǔ))。同樣， 在本發(fā)明中，術(shù)語"原位雜交"還指對核酸和/或多肽進(jìn)行檢測、顯象和定位。
蛋白質(zhì)消化-通常通過酸或者酶(蛋白酶)使蛋白質(zhì)分子完全或者部分 斷裂。部分消化可以改變蛋白質(zhì)的三維形狀或者使蛋白質(zhì)喪失三維形狀，而 完全消化可以將蛋白質(zhì)還原成組成該蛋白質(zhì)的氨基酸分子。
變性-破壞生物聚合物(如核酸或者蛋白質(zhì))的三維形狀。變性可以 是部分的或者完全的。在核酸中，變性是指核酸的兩個互補(bǔ)鏈的分離。在蛋 白質(zhì)中，變性是指蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的改變。
為了方便起見，在本說明書中所提及的參考文獻(xiàn)以參考文獻(xiàn)的列表的形 式列出，并且列在實施例的后面。所述參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容并入本文作為參 考。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是，在進(jìn)行適度的實驗的情況下根據(jù)本發(fā) 明給出的方法可以實施本發(fā)明。所述方法、技術(shù)和化學(xué)物質(zhì)描述在給定的參 考文獻(xiàn)中或者來自標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)和分子生物學(xué)教科書中的方案。本領(lǐng)域公知
的并且沒有詳細(xì)描述的標(biāo)準(zhǔn)的分子生物技術(shù)通常依照如Sambrook和Russd， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (2001)中所述的技術(shù)。于檢測生物聚合物，如核酸，但是本領(lǐng)域的 技術(shù)人員將會認(rèn)識到由于不需要對多肽進(jìn)行消化，該方法還易于適合檢測多 肽或者蛋白質(zhì)。尤其是，本發(fā)明不需要使用蛋白酶來消化多肽。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解的是，原位雜交方法如本發(fā)明的方法能夠檢 測樣品中是否存在一種或多種被研究的生物聚合物。然后，是否存在一種或 多種被研究的生物聚合物可以被用于表示樣品或者從中獲得樣品的受試者 是否異常。
本發(fā)明的方法可以用于檢測是否存在某些核酸或者多聚核苷酸。由于 FISH可以用于取自孕期的受試者的羊水細(xì)胞，因此是否存在這些多聚核苷 酸或者這些多聚核苷酸的數(shù)量可以表示是否存在染色體異常。例如，如果針 對于染色體21的區(qū)域的探針在樣品中檢測到具有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)量的細(xì)胞
的每一個核中具有三套染色體，這個結(jié)果表明染色體21的三體性的情況， 其中，觀察到多了一套染色體21的染色體異常。類似地，如果從來自另一 個受試者的樣品中只檢測到一套x染色體，則表明存在染色體異?；蛘叽嬖?單體性染色體x的遺傳情況。除了能檢測染色體不存在(缺失)、染色體增 加(重復(fù))之外，F(xiàn)ISH還可以用于突出其它的染色體異常，如被研究的染 色體中的環(huán)的形成、倒位、易位和染色體的其它非天然構(gòu)象。因此，術(shù)語"染 色體異常"應(yīng)當(dāng)被理解為與正常核酸或者染色體狀態(tài)相比存在任何核酸或者
染色體差異。因此，"染色體異常"包括但不限于染色體數(shù)量的任何變化，
三體性，單體性，染色體完全不存在、缺失、倒位、易位、環(huán)的形成或者染 色體的任何其它非天然構(gòu)象。因此，在本說明書的隨后部分，本發(fā)明的快速
FISH將被稱為FastFISH。所述方法可以用于檢測是否存在特定的多聚核苷 酸或者用于確定存在的特定的多聚核苷酸的量，并由此檢測和/或鑒定存在的 任何染色體異常。
為了描述本發(fā)明，可以參照由生物技術(shù)公司Vysis (Downers Grove， IL,USA)提供的用于商業(yè)化的著絲粒列舉探針(CEP)和基因座特異性(LSI)探針 的標(biāo)準(zhǔn)方案。CEP和LSI均是Vysis的注冊商標(biāo)。他們的網(wǎng)站中 (http:〃www.vysis.com/VysisProducts—32945.asp)給出的使用CEP和LSI探針 的 Vysis FISH 方案以及處理羊水樣品的方案 (http:〃www.vysis.com/Specimen—32946.asp)概括在圖1A中。
本發(fā)明是對現(xiàn)有FISH方案的改進(jìn)，使本發(fā)明的方法能比現(xiàn)有技術(shù)的 FISH方案在更短的時間完成。尤其是，對于由Vysis提供的CEP和LSI探 針，本發(fā)明可以在小于兩小時的時間內(nèi)完成。在本發(fā)明的方法的條件下，對 于所述的兩種探針，樣品只需要30分鐘的雜交時間。這種較短的時間與Vysis 方案形成鮮明的對比，在Vysis方案中，對于CEP探針需要30分鐘雜交時 間，而對于LSI探針需要12-16小時的雜交時間。
現(xiàn)有技術(shù)的方法
現(xiàn)有技術(shù)的樣品準(zhǔn)備
他們的網(wǎng)站中(http:〃www.vysis.com/VysisProducts—32945.asp)給出的使 用CEP和LSI探針的Vysis FISH方案以及處理羊水樣品的方案 (http:〃www.vysis.com/Specimen—32946.asp)概括在圖1A中并描述如下。
現(xiàn)有技術(shù)的方法概括在圖1A。將二至五毫升(ml)干凈的羊水離心5分鐘 獲得羊水細(xì)胞沉淀。然后將細(xì)胞在37°C的含有蛋白酶胰酶的緩沖液中重懸 至少15分鐘，以減少存在的蛋白質(zhì)的量并增強(qiáng)細(xì)胞對探針的通透性。然后 通過將細(xì)胞離心5分鐘并將細(xì)胞重懸在2-5 ml低滲(0.56% KCl)溶液中而除 去胰酶，隨后在37°C的水浴中孵育20分鐘以使細(xì)胞溶脹。
然后用0.8-2.0 ml的卡諾固定劑(Camoy，s fixative) (3:1的甲醇和冰醋 酸)固定細(xì)胞。然后將懸浮液離心5分鐘并將沉淀重懸在1 ml新制備的卡諾 固定劑中。在為進(jìn)行FISH而進(jìn)行的預(yù)處理步驟之前將溶液在4。C保持至少 30分鐘。現(xiàn)有技術(shù)對樣品的預(yù)處理
將細(xì)胞滴到冷的載玻片上(每滴含有15-25 的細(xì)胞懸浮液)，然后在室 溫下完全干燥以將細(xì)胞固定到載玻片上。干燥時間可能需要30分鐘，這取 決于環(huán)境的濕度。然后在73°C將載玻片在2X SSC (氯化鈉和檸檬酸鈉的緩 沖液)中浸泡2分鐘以使雙螺旋核酸變性。然后在37'C下將載玻片在含有胃 蛋白酶的第二種蛋白酶溶液中浸泡10分鐘，以減少通常與核酸有關(guān)的蛋白 質(zhì)。
然后在室溫下將載玻片在1XPBS(磷酸鹽緩沖鹽溶液)中洗漆5分鐘，接 著在室溫下用1%甲醛固定5分鐘。再在室溫下將載玻片在1XPBS中洗滌5 分鐘，用一系列濃度的醇脫水(分別在70%、 85%和100%的乙醇中脫水1 分鐘)以使核酸"熟化"，從而保持它們的形狀。
現(xiàn)有技術(shù)的雜交方案
將探針(CEP或者LSI， lpL)與7^iL緩沖液和2)iL水混合，然后在73°C 的水浴中加熱5分鐘以使探針變性，防止探針內(nèi)部存在的任何自身互補(bǔ)雜交。 然后，這些探針置于45-50°C的載玻片加熱器上。
將具有細(xì)胞樣品的載玻片在73°C的含有70%甲酰胺和2X SSC的變性 溶液浴中浸泡5分鐘，并用一系列濃度的醇脫水(分別在70%、 85%和100% 的乙醇中脫水1分鐘)。然后將載玻片干燥并將載玻片在45-50°C的載玻片 加熱器上最多放置2分鐘。
對于雜交，將10pL探針混合物置于含有細(xì)胞樣品的載玻片的每一個區(qū) 域并進(jìn)行雜交。對于CEP探針，雜交溫度為42。C，雜交時間為30-60分鐘。 對于LSI探針，雜交溫度為37。C，雜交時間為12-16小時。
在雜交后，在73°C下將載玻片用含有0.4X SSC和0.3% NP-40非離子 表面活性劑的溶液洗滌2分鐘，隨后用含有2X SSC和0.1% NP-40的溶液洗 滌1分鐘。然后在暗處風(fēng)干載玻片，這可能需要30分鐘，取決于環(huán)境的濕度。然后用落射熒光顯微鏡(epifluorescence microscopy)觀察探針。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是對于CEP探針，完成現(xiàn)有技術(shù)的方 案需要約3.2小時。對于LSI探針，由于推薦的雜交時間是12-16小時，因 此完成現(xiàn)有技術(shù)的方案所需要的時間明顯更長。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來 說，為了使樣品中的生物聚合物(如，在這種情況下為核酸)能夠與探針(或 者能夠被檢測或者成像的互補(bǔ)分子)雜交，上述的所有步驟都是必需的或者 必要的。
這些步驟包括蛋白酶處理、低滲溶液處理、固定處理、變性、在雜交溫 度下保持一段時間、洗滌以除去未結(jié)合的探針的步驟。在本領(lǐng)域中，沒有任 何的建議或者暗示這些步驟中的任一步驟可以省去以縮短獲得羊水診斷結(jié) 果的時間，從而減少孕婦的焦慮。更尤其是，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說， 省去蛋白酶處理的步驟不是顯然的，因為蛋白酶處理的步驟在現(xiàn)有技術(shù)的方 法中被認(rèn)為是必需的。
本發(fā)明的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的和/或有效的原位雜交的方法。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了對至少一種細(xì)胞中的核酸和/或多肽進(jìn)行 原位雜交的方法。下文的實施例中使用細(xì)胞樣品以檢測兩種核酸。尤其是， 本發(fā)明提供了一種不需要對多肽進(jìn)行消化的原位雜交的方法。
因此，本發(fā)明提供了一種用于對至少一種分離的細(xì)胞中的核酸和/或多 肽進(jìn)行原位雜交的方法，并且，該方法不包括對多肽進(jìn)行消化。本發(fā)明還提 供了一種用于對至少一種分離的細(xì)胞中的核酸進(jìn)行原位雜交的方法，并且， 該方法不包括對多肽進(jìn)行消化。
更具體地說，本發(fā)明提供了用于對至少一種分離的細(xì)胞中的核酸和/或 多肽進(jìn)行原位雜交的方法，該方法包括以下步驟提供至少一種分離的細(xì)胞; 使所述至少一種細(xì)胞與至少一種低滲溶液接觸；用至少一種固定劑對所述至少一種細(xì)胞進(jìn)行處理；提供能與至少一種核酸和/或多肽結(jié)合的至少一種分 子，并使該至少一種分子與所述核酸和/或多肽結(jié)合一段時間；除去所有未結(jié) 合的分子；和檢測所有結(jié)合的分子，并且，該方法不包括對多肽進(jìn)行消化。 在本發(fā)明的方法中，在用至少一種固定劑處理后將所述至少一種分離的細(xì)胞 施用于表面。在結(jié)合之前可以對所述核酸和多肽進(jìn)行變性步驟，所述變性步 驟可以通過加熱進(jìn)行。
通過使用能與核酸結(jié)合或雜交的至少一種(第一)分子和/或能與多肽 結(jié)合或雜交的至少一種(第二)分子，所述方法可以用于檢測同一細(xì)胞樣品 中的核酸和多肽。
所述能與至少一種核酸和/或多肽結(jié)合或雜交的至少一種分子可以是與 所述至少一種核酸和/或多肽互補(bǔ)的至少一種分子。
此外，所述能與核酸和/或多肽結(jié)合的分子可以用至少一種標(biāo)記進(jìn)行標(biāo) 記，所述標(biāo)記選自由熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、以及它們 的混合物所組成的組中。
在本發(fā)明的方法中，包括結(jié)合的步驟可以包括至少一個第一溫度暴露，
所述第一溫度暴露在70-90°C的溫度下維持60-120秒。尤其是，所述第一溫 度暴露在75-85°C的溫度下維持80-100秒。尤其是，所述第一溫度暴露在約 80。C的溫度下維持90秒。該步驟還包括至少一個隨后溫度暴露，該隨后溫 度暴露37-47。C的溫度下進(jìn)行。尤其是，所述至少一個隨后溫度暴露40-45°C 的溫度下進(jìn)行。尤其是，所述隨后溫度暴露約42。C的溫度下進(jìn)行。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)省去對多肽消化的步驟，例如省去用胃蛋白酶和/ 或胰酶的步驟不僅能節(jié)省時間，而且還能減少核酸的過分伸展。例如，可以 理解的是采用本發(fā)明的方法在制備樣品時省去第一蛋白酶處理可以比現(xiàn)有 技術(shù)節(jié)省約20分鐘。
此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是在本發(fā)明的雜交步驟中，對于CEP探針，雜交時間可以從至少30分鐘縮短至15分鐘。對于LSI探針，縮 短的時間會更明顯，例如，雜交時間從至少12小時縮短到僅僅15分鐘，并 且不會降低或者基本不會降低信號的質(zhì)量。
所述細(xì)胞為真核細(xì)胞，例如哺乳動物的細(xì)胞。所述哺乳動物的細(xì)胞可以 是人的細(xì)胞或者非人類的細(xì)胞。更尤其是，所述細(xì)胞可以是人的羊水細(xì)胞。 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，所述方法可以用于檢測羊水細(xì)胞中的染色體異常。 尤其是，所述羊水細(xì)胞可以來自孕期哺乳動物。此外，盡管在本研究中主要 使用羊水細(xì)胞，但也己經(jīng)測試了其它的細(xì)胞類型，并發(fā)現(xiàn)在其它細(xì)胞中也能 成功地雜交。因此，通過使用不同的熒光探針，其它的細(xì)胞類型，例如，淋 巴細(xì)胞、胚胎有核紅細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、癌細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞等可以 用于這種方案。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以理解的是，在現(xiàn)有技術(shù)中，不進(jìn)行蛋白酶處理 也能使用蛋白探針檢測被研究的多肽是不可能。因此，在本發(fā)明的方法中， 所述方法還可以用于檢測在細(xì)胞樣品中存在至少一種多肽。盡管，本發(fā)明示 例地說明了檢測DNA作為被研究生物聚合物，但對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來 說，本發(fā)明顯然還可以用于其它的生物聚合物，如RNA和/或多肽。結(jié)果成 像的方法可以容易地擴(kuò)展到使用其它的標(biāo)記，如酶標(biāo)記和/或放射性標(biāo)記。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以理解的是，在本發(fā)明的方法中，由于沒有進(jìn)行 蛋白酶處理，因此可以檢測同一樣品中的兩種類型的所述生物聚合物(核酸 和多肽)。例如，能與第一種生物聚合物靶(如核酸)結(jié)合、雜交或者互補(bǔ) 的第一種分子或者探針可以用至少第一種標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，或者能與第二種生 物聚合物靶(如蛋白質(zhì))結(jié)合、雜交或者互補(bǔ)的第二種分子或者探針可以用 至少第二種標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記的合適種類可以是熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶 標(biāo)記和放射性標(biāo)記。
在與同一樣品中的相應(yīng)的靶雜交后，可以使這些探針成像。如果用于這兩種探針的標(biāo)記相同(例如，熒光劑)，則它們可以成像在同一圖像中。如 果標(biāo)記為不同類型，則它們可以分別成像，并可以將分別得到的圖像疊合； 如果需要，可以比較兩種探針的位置。
本發(fā)明提供了一種用于分析在細(xì)胞樣品中是否存在可疑的核酸和/或多 肽的試劑盒。該試劑盒包括至少一種雜交緩沖鹽、變性劑、雜交試劑、用于 低滲溶液的鹽、固定劑、能與至少一種核酸和/或多肽結(jié)合并能夠被檢測的至 少一種分子。所述試劑盒還可以選擇性地包括與該試劑盒有關(guān)的資料，例如， 試劑盒的使用說明書和/或單個的成分。尤其是，本發(fā)明的試劑盒不包括用于 消化多肽的任何試劑和方法。更尤其是，本發(fā)明的試劑盒不包括任何的蛋白 酶。更尤其是，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其中，該試劑盒用于檢測羊水細(xì) 胞中的染色體異常。更尤其是，本發(fā)明的試劑盒用于診斷胚胎是否正常。本 領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以理解的是，可以用可供選擇的化學(xué)物質(zhì)或者試劑代替 以獲得相同的功能。例如，可以用不同的緩沖液代替PBS。
已經(jīng)對本發(fā)明做了一般性的描述，通過參考下述的實施例，所述的內(nèi)容 將能更加易于理解，這些實施例用于說明的目的，不是為了限制本發(fā)明。
實施例
為了證實本發(fā)明的方法即FastFISH的強(qiáng)大的功能，下文對100個未能 培養(yǎng)的羊水樣品進(jìn)行了臨床研究。所有的羊水樣品都是無污質(zhì)的，無肉眼能 觀察到的血細(xì)胞污染物。進(jìn)行羊水診斷的指標(biāo)是孕婦的年齡大于35歲，對 于唐氏綜合癥(頸背半透明或者與母親相似的血清指標(biāo))的陽性篩選測試或 異常胚胎超聲波掃描。還收集一個絨毛膜絨毛樣品、 一個羊水樣品和一個胚 胎血液樣品以進(jìn)行一天確認(rèn)研究。平均孕期為16周(14-24周)，分析100個 樣品中的每個樣品所需要的時間最多為2小時。
在進(jìn)行臨床研究之前，在已知懷孕期的和同時具有染色體13三體性、 染色體18三體性和染色體21三體性并發(fā)癥的懷孕期內(nèi)，在以下樣品中對本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)行測試未能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞(AF)(n二18)，絨毛膜絨毛(CVS) 活組織檢查的細(xì)胞(11=5)，胚胎有核血細(xì)胞、臍帶有核血細(xì)胞和來自新生兒血 液的有核細(xì)胞(11=8)。使用FastFISH對成人的外周血細(xì)胞樣品進(jìn)行測試以檢 測特納綜合癥。在密度梯度離心后，按照與未能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞相同的方式 處理有核血細(xì)胞，避免了培養(yǎng)、中期制備、過夜熟化和延長的雜交過程的幾 天時間。
與現(xiàn)有技術(shù)形成對比，本發(fā)明的FastFISH方法將參照圖1B進(jìn)行描述。 對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，下述的實施例僅涉及特定的方案，然而，本發(fā) 明的方法不能解釋為限定為特定的步驟、化學(xué)物質(zhì)、試劑、時間等。
本發(fā)明的樣品制備
按照與現(xiàn)有技術(shù)相同的方法收集2ml來自100名孕婦的含有羊水細(xì)胞的 羊水樣品。在1800 rpm下將細(xì)胞樣品離心5分鐘，并將細(xì)胞沉淀懸浮在3ml 的預(yù)熱的0.075M KC1低滲溶液中，在37。C下保持30分鐘。然后通過滴加 2ml卡諾氏固定劑將細(xì)胞固定，在1800rpm下將細(xì)胞離心5分鐘。然后將細(xì) 胞沉淀在卡諾氏固定劑中重懸5分鐘。然后將細(xì)胞滴加到冷的載玻片的表面， 并將載玻片在60。C的電爐上放置1分鐘以將細(xì)胞黏附到載玻片上并同時將 被研究的生物聚合物變性。然后，可以對這些載玻片進(jìn)行雜交的步驟。
可以看出，在本發(fā)明的FastFISH方法中，對于樣品制備已經(jīng)省去了第 一蛋白酶處理和離心的步驟，比現(xiàn)有技術(shù)節(jié)省20分鐘。還省去了在73。C的 SSC緩沖液中變性、第二蛋白酶處理、載玻片洗滌、用1%的甲醛固定、另 一次洗滌和在一系列醇中脫水等費(fèi)力的預(yù)處理步驟。省去這些預(yù)處理步驟又 比現(xiàn)有技術(shù)節(jié)省的時間多達(dá)59分鐘。
本發(fā)明的雜交方案
每一個樣品制備兩個載玻片。在一個載玻片上，將與3pL雜交緩沖液(在 2X SSC中的50%甲酰胺和10%葡萄糖硫酸酯，pH 7.0)混合的2pL著絲粒列舉探針(CEP) X/Y探針(Vysis Inc, Downers Grove, Illinois, USA)加到載玻片上 的各個樣品細(xì)胞斑點(diǎn)中。在上述緩沖液存在的情況下，使第二個載玻片上的 細(xì)胞斑點(diǎn)與基因座特異性(LSI) 21探針(Vysis)雜交。用蓋玻片將載玻片覆蓋 并用石蠟?zāi)?Parafilm) (American National Can Company, Chicago, IL, USA)
密封。使用這些探針對兩種不同的載玻片進(jìn)行雜交的典型的結(jié)果表示在圖7B中。
然后將載玻片上的靶DNA在一個原位雜交加熱板(MJ Research PTC-200, Waltham, USA)上進(jìn)行變性，變性的條件為在80°C保持90秒鐘， 隨后使兩種探針在42"C下雜交15分鐘。然后，將與CEP探針雜交的載玻片 在攪拌下在0.4X SSC/0.3% NP-40中在72°C下洗滌2分鐘，并在2X SSC/0.1% NP-40中在室溫下洗滌2分鐘。當(dāng)與LSI探針雜交的載玻片在輕微攪拌下洗 滌1分鐘時獲得更好的信號。
在暗處使載玻片干燥。選擇性地，干燥載玻片可以在干燥劑(如硅膠) 存在下進(jìn)行或者在溫和的干氮流下進(jìn)行，這可以明顯縮短干燥時間，從20 分鐘縮短至10分鐘以下。然后將載玻片置入含有DAPI (Vector Laboratories, Buriingame, CA， USA)的抗熒光變?nèi)醯呐囵B(yǎng)基中，并用裝配有氙氣燈的落射 熒光顯微鏡(Olympus BX61, Center Valley, USA)分析。
實施本發(fā)明的FastFISH方案時，在沒有對每一種探針進(jìn)行增強(qiáng)成像的 情況下計數(shù)每一個載玻片上的50個核需要40分鐘。如果至少80%的核對于 任何特定的探針分別表現(xiàn)出同樣的正?；蛘弋惓５碾s交模式，則樣品被認(rèn)為 是整倍體或者非整倍體。使用FISHView， 2.0 EXPO (ASI， Carlsbad, USA)捕獲 圖像，并使用SPSS 14.0 (SPSS Inc, Chicago, IL)進(jìn)行統(tǒng)計分析。然而，由于 本發(fā)明的方法功能強(qiáng)大(見下文)，將來可以計數(shù)少至25個核，因此，該步 驟所需要的時間將縮短一半。
在摸索研究中，對染色體X、 Y和21進(jìn)行了 FastFISH以驗證本發(fā)明的技術(shù)適合CEP和LSI這兩種商業(yè)探針。在超聲掃描出存在多個胚胎畸形時，
FastFISH還可以用于檢測染色體13和18;當(dāng)錐狀枝干(conotruncal)畸形 顯著時，F(xiàn)astFISH還可以用于檢測22q缺失。這些是FastFISH除了在染色 體X、 Y和21中應(yīng)用以外的應(yīng)用。在IOO個連續(xù)的參與者中，在超聲中發(fā) 現(xiàn)一例胚胎錐狀枝干畸形。使用FastFISH檢測22qll.2缺失以排除DGS;這 是FastFISH除了用于檢測染色體21、 X、 Y、 13和18以外的應(yīng)用。在摸索 研究中，只有在所有100個羊水病歷被分析和記錄后，采用FastFISH的研 究者才能揭示常規(guī)的核型的結(jié)果，而采用核型的細(xì)胞遺傳學(xué)研究者不能揭示 FastFISH的結(jié)果。
為了驗證一天的測試，按照與上述在羊水中進(jìn)行的操作相同的方法在 CVS、 AF和胚胎血樣品上(分別為孕期11、 15、 23周)進(jìn)行FastFISH以檢測 染色體21、 X和Y。所有的步驟在收集樣品的同一天完成。
結(jié)果
未能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞的代表性的結(jié)果如圖2-4所示，從胚胎、臍帶和新 生兒血液獲得的結(jié)果如圖5和6所示。在CVS、 AF和胚胎血樣品中采用 FastFISH檢測染色體21 、 X和Y的一天測試的驗證實驗的結(jié)果如圖7所示。
在探索性臨床研究中，所有的羊水樣品均不含有肉眼可觀查到的血液污 染。母親的平均年齡為36歲(24-45歲)，平均懷孕周期為16周(14-24周)， 分析100個樣品中的每個樣品所需要的時間最多為2小時。檢測了 49個雄 性(XY)胚胎、50個雌性(XX)胚胎和一個47 XXY (Klinefelter綜合癥)胚胎。 如下述的實施例中所述，采用本發(fā)明的FastFISH方法能正確地確定所有這 些病歷。對于患有Klinefelter綜合癥的胚胎，100%的核表示為性染色體三體 性(圖4B)。在三個病例中，對于染色體21探針，至少80%的核具有三個信 號(80.0%、 84.4%和83.3%);用常規(guī)的核型分析確證所有三個胚胎具有染色 體21三體性。在這些病歷的第一個中采用了超過50個核用于評價，用于評價的50個核中的80.0%表現(xiàn)出染色體21三體性。在第二個病例中，只有45 個核可以用于評價，其中的38個核表現(xiàn)出染色體21三體性(84.4%)，而第三 個病歷中的用于評價的38個核中的30個(83.3%)表現(xiàn)出染色體21三體性； 在所有其它97個病例中，超過50個核用于評價三體性狀況。對這些97個 胚胎的剩余的50個核的檢測表示出染色體21為二倍性。在羊水診斷時用超 聲檢測到患有錐狀枝桿的一個病例用于評價DGS，；本發(fā)明的FastFISH方法 表明22qll.2沒有缺失。用FastFISH檢測染色體21、 X、 Y、 13和18也表 明是非整倍體。這些結(jié)果將進(jìn)一步分別通過常規(guī)的FISH和核型分析證實。
在所有病例中，性別、三體性和染色體重排(缺失)狀態(tài)被正確地確認(rèn) (100%為準(zhǔn)確率；較低為95。/。CI (置信區(qū)間)，97.05%)。在這些探索性研究 中，靈敏性為100%、特異性為100%(三個病例為染色體21三體性， 一個病 例為Klinefelter綜合癥)，并且沒有假陽性和假陰性結(jié)果。在所有這些病例中， 雜交都很顯著，并且沒有不提供有用的信息的病例。評價了對于57個樣品 從收集樣品到獲得FastFISH結(jié)果所需要的時間，每天1到5個樣品的代表 性記錄如表l所示。所有這些病例都由相同的技術(shù)人員操作。 一個技術(shù)人員 在--天中易于完成最多2個樣品(6小時)。在同一天中，最多可以完成4到5 個樣品，需要時間分別為10到12.5小時。
表1在分析57個樣品時從收集到獲得結(jié)果所需要的總時間。
每天的樣品數(shù)量(2 個載玻片/樣品)從收集樣品到獲得結(jié)果所需要的總時 間(完成所有樣品所需要的小時；2個 載玻片/樣品；"/XY)檢測的天(時 間)的編號
141
263
7.52
4106
512.54
為了驗證一天的測試，在CVS樣品、AF樣品和胚胎血樣品(分別為孕 期11、 15、 23周)中采用本發(fā)明的FastFISH檢測染色體21、 X和Y，收集樣品和獲得結(jié)果在同一天完成。絨毛膜絨毛和羊水樣品被診斷為染色體21 是二倍體，而胚胎血樣品表現(xiàn)為染色體21三體性(圖7)。所有這些探索性研 究和一天的測試結(jié)果與常規(guī)的測試方法匹配。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解的是，在本發(fā)明的雜交步驟中，CEP探針的 雜交時間從至少30分鐘縮短到15分鐘。LSI探針的雜交的時間減少更為顯 著，從至少12小時減少到只要15分鐘，并且信號的質(zhì)量不受影響。
與現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方案相比，實現(xiàn)了幾個創(chuàng)造性的變化。通常，為了進(jìn) 行FISH，收集的羊水多達(dá)5ml，可能保存一些以在雜交失敗時備用。發(fā)現(xiàn)2 ml的羊水在任何情況下都是足夠的。包括洗滌、超聲和/或覆蓋載玻片在內(nèi) 的步驟都可以省去，使用干凈的載玻片足以獲得良好的雜交和良好的信號質(zhì)
省去使用胃蛋白酶或者胰酶進(jìn)行蛋白質(zhì)消化的步驟不僅能節(jié)省時間，還 能減少核的過分伸展。通過在電爐上加熱冷的載玻片，能確保核的接近(聚 簇)而不導(dǎo)致成團(tuán)或者信號成疊。即使沒有用醇脫水，大多數(shù)的FISH信號 也能容易地在同一焦平面成像。載玻片熟化的作用令人質(zhì)疑，因此省略了該
牛聰
JF扭。
最后，對于CEP和LSI兩種探針，15分鐘的雜交的時間是足夠的。合 并這些變化，并預(yù)留一些時間用于后勤，如為了使用專業(yè)儀器在實驗室之間 移動，對于每一個病例，在未能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞上進(jìn)行FISH可以在兩小時 內(nèi)完成，而采用現(xiàn)有技術(shù)的方法需要3.3小時。使用自動成像分析還可以進(jìn) 一步縮短本技術(shù)所需要的勞動時間，使本技術(shù)實施得更快。
作為整體，由于本發(fā)明的方法所獲得的意想不到的結(jié)果，如對于LSI探 針的雜交所需要的不再是12-16小時，而是15分鐘，因此，這些步驟的組 合不僅僅是改善了工藝，而且使本發(fā)明的方法具有創(chuàng)造性。除了節(jié)省時間外， 所需要的材料的量也減少了，使本發(fā)明的方法比常規(guī)的FISH方案在經(jīng)濟(jì)上 更具有吸引力。參考文獻(xiàn)
Bryndorf T， Christensen B, Vad M， Parner J， Brocks V, Philip J. Prenatal detection of chromosome aneuploidies by fluorescence in situ hybridization: experience with 2000 uncultured amniotic fluid samples in a prospective preclinical trial. Prenat Diagn 1997; 17(4):333-41.
Caccia N, Johnson JM， Robinson GE， Barna T. Impact of prenatal testing on maternal-fetal bonding: chorionic villus sampling versus amniocentesis. Am J Obstet Gynecol 1991; 165(4 Pt 1 ):1122-5.
Evans MI, Bottoms SF， Carlucci T， et al. Determinants of altered anxiety after abnormal maternal serum alpha-fetoprotein screening. Am J Obstet Gynecol 1988; 159(6):1501-4.
Jouannic JM, Martinovic J， Bessieres B， Romana S, Bonnet D. Fluorescence
risk for 22ql 1.2 deletion. Prenat Diagn 2003; 23(7):607-8. Kinger K， Landes G, Shook D, et al. Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by using fluorescence in situ hybridization (FISH). Am J Hum Genet 1992; 51(l):55-65.
Marteau TM, Cook R， Kidd J， et al. The psychological effects of false-positive results in prenatal screening for fetal abnormality: a prospective study. Prenat Diagn 1992; 12(3):205-14.
Pertl B, Yau SC， Sherlock J, Davies AF， Mathew CG, Adinolfi M. Rapid molecular method for prenatal detection of Down's syndrome. Lancet 1994; 343(8907):1197-8.
Ward BE, Gersen SL， Carelli MP， et al. Rapid prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidies by fluorescence in situ hybridization: clinical experience with 4,500 specimens. Am J Hum Genet 1993; 52(5):854-65.
Witters I, Devriendt K， Legius E, et al. Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 in 5049 consecutive uncultured amniotic fluid samples by fluorescence in situ hybridisation (FISH). Prenat Diagn 2002; 22(1 ):29-33.
權(quán)利要求
1、一種用于對至少一種分離的細(xì)胞中的核酸和/或多肽進(jìn)行原位雜交的方法，該方法包括以下步驟(a)提供至少一種分離的細(xì)胞；(b)使所述至少一種細(xì)胞與至少一種低滲溶液接觸；(c)用至少一種固定劑對所述至少一種細(xì)胞進(jìn)行處理；(d)提供能與至少一種核酸和/或多肽結(jié)合的至少一種分子，并使該至少一種分子與所述核酸和/或多肽結(jié)合一段時間；(e)除去所有未結(jié)合的分子；和(f)檢測所有結(jié)合的分子，并且，該方法不包括對多肽進(jìn)行消化。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一種分子包括與至少 -種核酸或至少一種多肽互補(bǔ)的至少一種分子。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的方法，其中，在步驟(c)后將所述至少 一種分離的細(xì)胞施用于表面。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項所述的方法，其中，在步驟(d)之前使所述核酸和/或多肽經(jīng)過變性步驟。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述變性步驟是采用加熱進(jìn)行的。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述變性步驟是在50-70°C的 溫度下進(jìn)行的。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5或者6所述的方法，其中，所述變性步驟是在約60°C的溫度下進(jìn)行的。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的方法，其中，所述能與至少 一種核酸和/或多肽結(jié)合的至少一種分子用至少一種標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，該標(biāo)記選 自由熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶標(biāo)記和放射性標(biāo)記所組成的組中。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任意一項所述的方法，其中，步驟(d)中的結(jié) 合時間少于60分鐘。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述結(jié)合時間少于45分鐘。
11、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述結(jié)合時間少于20分鐘。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1-11中的任意一項所述的方法，其中，步驟(d)包括 至少一個第一溫度暴露，該第一溫度暴露在70-90°C的溫度下進(jìn)行60-120 秒。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述第一溫度暴露在約80°C 的溫度下進(jìn)行90秒。
14、 根據(jù)權(quán)利要求12或者13所述的方法，其中，步驟(d)還包括至少一 個隨后溫度暴露，該隨后溫度暴露在37-47°C的溫度下進(jìn)行。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述隨后溫度暴露在約42°C 的溫度下進(jìn)行。
16、 根據(jù)權(quán)利要求1-15中的任意一項所述的方法，其中，所述至少一 種細(xì)胞是沒有脫水的。
17、 根據(jù)權(quán)利要求1-16中的任意一項所述的方法，其中，所述至少一 種細(xì)胞為哺乳動物的細(xì)胞。
18、 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述至少一種細(xì)胞為人的細(xì)胞。
19、 根據(jù)權(quán)利要求17或者18所述的方法，其中，所述至少一種細(xì)胞為 羊水細(xì)胞。
20、 根據(jù)權(quán)利要求1-19中的任意一項所述的方法，其中，該方法用于 檢測羊水細(xì)胞中的染色體異常。
21、 根據(jù)權(quán)利要求1-20中的任意一項所述的方法，其中，該方法用于 檢測細(xì)胞樣品中是否存在至少一種多肽。
22、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述細(xì)胞從懷孕的哺乳動物中獲得。
23、 根據(jù)權(quán)利要求1-22中的任意一項所述的方法，其中，該方法還包 括診斷步驟。
24、 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述診斷步驟包括確定在哺 乳動物的細(xì)胞中是否存在染色體異常。
25、 根據(jù)權(quán)利要求1-24中的任意一項所述的方法，其中，該方法用于確定胚胎是否正常。
26、 一種用于分析在細(xì)胞樣品中是否存在核酸和/或多肽的試劑盒，該試劑盒包括至少一種變性劑、至少一種雜交試劑、至少一種用于低滲溶液的鹽、至少一種固定劑、以及能與至少一種核酸或者多肽結(jié)合且能夠被檢測 的至少一種分子。
27、 根據(jù)權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，該試劑盒不包括用于消化 多肽的任何試劑或者裝置。
28、 根據(jù)權(quán)利要求26或者27所述的試劑盒，其中，該試劑盒不包括任 何的蛋白酶。
29、 根據(jù)權(quán)利要求26-28中的任意一項所述的試劑盒，其中，該試劑盒 用于檢測羊水細(xì)胞的染色體異常。
30、 根據(jù)權(quán)利要求26-29中的任意一項所述的試劑盒，其中，該試劑盒 用于檢測胚胎是否正常。
31、 一種用于檢測羊水細(xì)胞中的染色體是否異常的方法，該方法包括(a) 提供從羊水中分離的至少一種細(xì)胞；(b) 使所述至少一種細(xì)胞與至少一種低滲溶液接觸；(c) 用至少一種固定劑對所述至少一種細(xì)胞進(jìn)行處理；(d) 提供能與至少一種核酸和/或多肽結(jié)合的至少一種分子，并使該至少 一種分子與所述核酸和/或多肽結(jié)合一段時間；(e)除去所有未結(jié)合的分子；檢測所有結(jié)合的分子；和 (g檢測是否存在染色體異常， 并且，該方法不包括對多肽進(jìn)行消化。
32、根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，染色體存在異常與胚胎的異 常相關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的原位雜交的方法。尤其是，本發(fā)明提供了一種對細(xì)胞樣品中的生物聚合物進(jìn)行原位雜交的方法，并且，該方法不包括對多肽進(jìn)行消化。所述方法可以用于檢查不同類型的生物聚合物，包括檢測同一樣品中的核酸和多肽。尤其是，所述方法用于檢測未能培養(yǎng)的羊水細(xì)胞中的染色體異常。
文檔編號G01N1/28GK101432444SQ200780015541
公開日2009年5月13日 申請日期2007年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月27日
發(fā)明者A·比斯瓦斯, K·R·Bm賈巴盧拉汗, M·A·初拉尼, S·Y·S·霍 申請人:新加坡國立大學(xué)