用于白血病染色體畸變高通量測(cè)序的dna靶向捕獲陣列的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于白血病染色體畸變高通量測(cè) 序的DNA靶向捕獲陣列。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)證實(shí)某些染色體的特異性改變與白血病的 發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后有著密切的關(guān)系。染色體異常的檢測(cè)為白血病的臨床診斷、分期、治療、 預(yù)后的判斷以及微小殘留病變的治療提供重要依據(jù)。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于白血病染色體畸變的檢測(cè)采用高分辨率的顯帶技術(shù)、熒光原位 雜交技術(shù)（FISH)等，染色體顯帶技術(shù)（chromosome banding technology)指借助特殊的 處理程序，使染色體的一定部位顯示出深淺不同的染色體帶紋。這些帶紋具有物種及染 色體的特異性，可更有效地鑒別染色體和研宄染色體的結(jié)構(gòu)和功能。熒光原位雜交技術(shù) (fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)，是根據(jù)已知的特異的DNA序列，以利用焚 光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與被檢測(cè)的染色體的DNA分子雜交，如果被檢測(cè) 的染色體上的靶DNA與所用的探針是同源互補(bǔ)的，即可形成靶DNA與探針的雜交體，經(jīng)熒光 檢測(cè)體系檢測(cè)雜交信號(hào)；這些對(duì)技術(shù)操作和判讀都有較高要求，染色體熒光原位雜交探針 價(jià)格昂貴，且只針對(duì)單一位點(diǎn)；并且染色體技術(shù)只適用于檢測(cè)分裂相的細(xì)胞，分辨率較低， 結(jié)果的準(zhǔn)確判讀需要長(zhǎng)期的專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練。染色體熒光原位雜交技術(shù)雖然能檢測(cè)分裂期細(xì)胞和 分裂間期細(xì)胞，但其每次只能用一種已知探針檢出一種異常，漏檢率很高，且對(duì)技術(shù)操作 要求嚴(yán)格、費(fèi)用較高。
[0004] 高通量測(cè)序又稱(chēng)第二代測(cè)序，是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到 幾百萬(wàn)條DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序時(shí)將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃 表面（即Flow cell)，這些DNA片段經(jīng)過(guò)延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flow cell上形成了數(shù)以 億計(jì)Cluster，每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的 四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆性終止的邊合成邊測(cè)序技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè) 序。目標(biāo)序列捕獲測(cè)序技術(shù)是第二代測(cè)序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來(lái)的應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)首 先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域 互補(bǔ)結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)這些區(qū)段進(jìn)行測(cè)序。該技術(shù)為白 血病染色體畸變的檢測(cè)提供了合適的解決方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種用于白血病染色體畸變高通量靶向測(cè) 序的DNA捕獲陣列，對(duì)37個(gè)與診斷、預(yù)后和治療有關(guān)的白血病/淋巴瘤染色體畸變位點(diǎn)DNA 進(jìn)行捕獲，用來(lái)進(jìn)行高通量靶向測(cè)序的快速篩查，可以有效地一次性檢出37種染色體畸變。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲檢測(cè)的 DNA陣列，該DNA陣列包含的探針特異性結(jié)合涉及37個(gè)染色體畸變的18個(gè)基因，所捕獲的 18個(gè)基因片段分別為：
[0007]
[0009] 37個(gè)白血病染色體畸變分別為：
[0010]
[0011]

[0012] 本發(fā)明的有益效果是：實(shí)現(xiàn)對(duì)與白血病相關(guān)的染色體易位進(jìn)行快速的篩查；芯片 檢測(cè)一次可檢測(cè)多個(gè)樣本，費(fèi)用較低；對(duì)待檢測(cè)的37個(gè)位點(diǎn)準(zhǔn)確率接近100%;不需要細(xì)胞 遺傳學(xué)專(zhuān)業(yè)人員對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0014] 實(shí)施例1用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲測(cè)序的DNA陣列的設(shè)計(jì)
[0015] 米用Agilent SureSelect DNA Design Tool設(shè)計(jì)針對(duì)染色體畸變所涉及的18個(gè) 基因（見(jiàn)表2)的探針。參數(shù)設(shè)置如下：
[0016] Species :H. sapiens，hgl9, GRCH37, February2009 ;Databases :RefSeq，Ensembl， CCDS，Gencode，VEGA，SNP，
[0017] CytoBand ；Region ：Entire Transcribed Region ；Region Extension ： 10 bases from 3' end and 10 bases from 5' end ;Tiling density ：2X ；Masking ：Least Stringent ；Boosting ：Balanced.
[0018] 表2探針靶向捕獲的基因片段
[0019]
[0020] 實(shí)施例2使用本發(fā)明檢測(cè)臨床樣品
[0021] 1.提取骨髓或外周血標(biāo)本提取基因組DNA。
[0022] 2.雜交前準(zhǔn)備
[0023] 2. 1將基因組DNA打成幾百堿基的小片段建立文庫(kù)。
[0024] 2. 2 使用 Agencourt AMPure XP beads 對(duì)樣品進(jìn)行純化。
[0025] 2. 3在DNA片段的3'端加堿基"A"。
[0026] 2. 4 使用 Agencourt AMPure XP beads 對(duì)樣品進(jìn)行純化。
[0027] 2.5加雙末端接頭。
[0028] 2. 6 使用 Agencourt AMPure XP beads 對(duì)樣品進(jìn)行純化。
[0029] 2.7擴(kuò)增加接頭的文庫(kù)。
[0030] 2. 8 使用 Agencourt AMPure XP beads 對(duì)樣品進(jìn)行純化。
[0031] 2.9評(píng)估文庫(kù)的質(zhì)量。
[0032] 3.將該產(chǎn)品與建立的文庫(kù)進(jìn)行雜交捕獲。
[0033] 4.將捕獲的DNA片段變性成單鏈后與測(cè)序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)。 添加未標(biāo)記的dNTP和普通Taq酶進(jìn)行固相橋式PCR擴(kuò)增，單鏈橋型待測(cè)片段被擴(kuò)增成為雙 鏈橋型片段。通過(guò)變性，釋放出互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相表面。將擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè) 序，加入四種熒光標(biāo)記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測(cè)序簇延伸互 補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過(guò)捕獲熒光信 號(hào)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從而獲得待測(cè)片段的序列信息。
[0034] 5.數(shù)據(jù)分析。將測(cè)序片段進(jìn)行排列，與人參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，找出易位的片 段。
[0035] 本發(fā)明用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲測(cè)序的DNA陣列由一系列100堿基 左右、序列部分重合的寡聚核苷酸組成，覆蓋300萬(wàn)（3Mb)堿基的染色體畸變區(qū)域，共37個(gè) 靶點(diǎn)（見(jiàn)表1)。采用200倍測(cè)序覆蓋度（即平均每個(gè)靶序列測(cè)序200次），一個(gè)陣列檢測(cè) 25個(gè)樣品，陣列的總測(cè)序容量在15Gb。本發(fā)明選擇37個(gè)與白血病診斷分型、預(yù)后和治療 效果有關(guān)的染色體畸變（見(jiàn)表1)，針對(duì)其易位點(diǎn)建立靶向捕獲測(cè)序陣列。對(duì)于易位點(diǎn)附近 的靶序列，根據(jù)易位點(diǎn)是否相對(duì)固定，確定每個(gè)靶序列的大小，針對(duì)靶序列合成寡聚核苷酸 標(biāo)簽，固定在芯片上制成陣列，與基因組特定區(qū)域互補(bǔ)達(dá)到"捕獲"，對(duì)捕獲的DNA序列進(jìn)行 "邊合成邊測(cè)序"，再將測(cè)序結(jié)果的短片段進(jìn)行排列，找出染色體易位的位點(diǎn)。
[0036] 表1 37個(gè)染色體畸變以及形成的融合基因
[0037]
[0038]

[0039] 本發(fā)明針對(duì)37個(gè)與診斷、預(yù)后和治療有關(guān)的白血病/淋巴瘤染色體易位，設(shè)計(jì)了 覆蓋這些易位點(diǎn)的靶向捕獲測(cè)序陣列。應(yīng)用這個(gè)陣列，可以對(duì)白血病患者外周血或骨髓標(biāo) 本的DNA進(jìn)行靶向捕獲測(cè)序，對(duì)靶向測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行排列比對(duì)后，找出可能的染色體易位 點(diǎn)。本發(fā)明靶向測(cè)序捕獲的范圍為3Mb，以200倍覆蓋率進(jìn)行邊合成邊測(cè)序，每次檢測(cè)25個(gè) 樣品，總數(shù)據(jù)量為15G(150億堿基）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲檢測(cè)的DNA陣列，其特征在于，該DNA陣 列包含的探針特異性結(jié)合涉及37個(gè)染色體畸變的18個(gè)基因，所捕獲的18個(gè)基因片段分別 為：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲檢測(cè)的DNA陣列，其 特征在于，所述37個(gè)白血病染色體畸變分別為：
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲檢測(cè)的DNA陣列，在本DNA陣列中，包含的探針能夠特異性靶向捕獲37個(gè)染色體畸變所涉及的18個(gè)基因。將樣品與本DNA陣列雜交靶向捕獲染色畸變所涉及的基因序列，然后對(duì)捕獲的序列進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行分析篩查出存在的染色體畸變類(lèi)型。該DNA陣列包含的探針特異性結(jié)合涉及37個(gè)染色體畸變的18個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)與白血病相關(guān)的染色體易位進(jìn)行快速的篩查；芯片檢測(cè)一次可檢測(cè)多個(gè)樣本，費(fèi)用較低；對(duì)待檢測(cè)的37個(gè)位點(diǎn)準(zhǔn)確率接近100％；不需要細(xì)胞遺傳學(xué)專(zhuān)業(yè)人員對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN104894111
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510248837
【發(fā)明人】李衛(wèi)東, 楊付花
【申請(qǐng)人】李衛(wèi)東
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年5月18日