專利名稱：毛細(xì)管電泳-多光子激發(fā)熒光柱上檢測儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于高靈敏度多光子熒光檢測技術(shù)，具體涉及一種毛細(xì)管 電泳一多光子激發(fā)熒光柱上檢測儀。
背景技術(shù)：
毛細(xì)管電泳(high-performance capillary electrophoresis, HPCE) 作為分離分析技術(shù)，具有分離效率高、分析時間短和進(jìn)樣量小等優(yōu)點，且 操作簡單，容易實現(xiàn)自動化。隨著分離模式的多元化和探測技術(shù)的創(chuàng)新，使得毛細(xì)管龜泳在生命科學(xué)、環(huán)境衛(wèi)生和藥物等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
多光子熒光(Multi-photon Excited fluorescence, MPF)技術(shù)作為 新的檢測技術(shù)，具有激發(fā)體積小(10—18L)、光損傷和光毒性小(采用近紅外 激光)、靈敏度高(zmol-ymol水平探測限)和背景噪聲低等特點。近幾年 來，多光子激發(fā)熒光技術(shù)在細(xì)胞化學(xué)成像和氨基酸、蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)等 生命活性物質(zhì)分析應(yīng)用中倍受重視。Shear和Song等人最先將毛細(xì)管電泳和多光子熒光技術(shù)結(jié)合在一起。 Song通過該技術(shù)在amol(l(T"mol)檢測了 Coumarine和DDCS(見Song J M,Inoue T，et al.Highly sensitive detection using laser two-photon excited fluorescence in capillary elec加ptoresis.Journal of chromatography A,1997，765:351—3f9)， Shear等人用 多光子系統(tǒng)研究熒光標(biāo)記的神經(jīng)遞質(zhì)，探究囊泡的分泌，探測極限在1000 個分子以下(Shear J，Brown E B Webb W. Mutiphoton-excited fluorescence of fluoregen-labeled neurotransmitters. Analytical Chemistry, 1996， 68(10): 1778—1783)。
由于多光子熒光過程是指在一個分子極短的時間內(nèi)相繼吸收長波長兩 個光子， 一般兩個光子吸收的時間差小于0. 1飛秒(1飛秒=10—15秒)，然后發(fā)射一個短波長的熒光光子，因此，要實現(xiàn)多光子激發(fā)熒光，在激發(fā)點 必須有足夠大的光子密度，故一般采用大數(shù)值孔徑的物鏡。而大數(shù)值孔徑 的物鏡的焦距大概只有150微米左右，對圓形毛細(xì)管，考慮到圓形毛細(xì)管 壁對激發(fā)光路和熒光收集光路的影響，所以一般采用柱后檢測。柱后檢測 存在的困難是i )、柱后檢測存在對焦點問題，將物鏡的焦點對準(zhǔn)毛細(xì)管 出口中心，采用CCD檢測，增加了檢測系統(tǒng)的設(shè)備成本，而且實驗操作變 得復(fù)雜；ii)、柱后檢測存在雜物堆積問題，實驗中毛細(xì)管中流出的物質(zhì)， 很容易堆積在檢測窗口處，不利于激發(fā)和熒光檢測；iii)、柱后檢測存在清 洗問題，由于毛細(xì)管一端是檢測窗口，使得毛細(xì)管清洗工作復(fù)雜，必須將 毛細(xì)管檢測端移離到清洗池，存在二次對焦難題?？傊?，傳統(tǒng)的檢測裝置 采用復(fù)雜的柱后檢測，實驗操作繁瑣，成本高，而且重復(fù)性較差，靈敏度 也受影響。發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種毛細(xì)管電泳一多 光子激發(fā)熒光柱上檢測儀，該檢測儀具有系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、成本低和操作簡 便的特點。本實用新型提供的毛細(xì)管電泳一多光子激發(fā)熒光柱上檢測儀，包括半導(dǎo) 體激光器、物鏡、計算機(jī)、采集卡、光電倍增管、二向色鏡、帶通濾光片、全反射鏡、鉑電極、直流高壓電源和第一緩沖池，其特征在于該檢測儀 還包括第二緩沖池和柱上檢測器，該柱上檢測器由圓形毛細(xì)管、方形毛細(xì) 管和特氟龍管構(gòu)成，特氟龍管通過嫁接將方形毛細(xì)管和圓形毛細(xì)管連接起 來；方形毛細(xì)管和圓形毛細(xì)管的另一端部分別位于第一、第二緩沖池內(nèi)； 半導(dǎo)體激光器發(fā)出的光束由依次二向色鏡和全反射鏡兩次反射后，進(jìn)入物 鏡，聚焦到柱上檢測器，實現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光，熒光同時被物鏡收集，經(jīng) 過全反射鏡反射，依次透過二向色鏡和帶通濾光片，被光電倍增管探測并 實現(xiàn)放大，并通過采集卡送入計算機(jī)，由計算機(jī)完成熒光信號數(shù)據(jù)處理； 直流高壓電源的二個鉑電極分別位于第一、第二緩沖池內(nèi)，直流高壓直接 加在柱上檢測器的兩端，樣品在柱上檢測器內(nèi)實現(xiàn)分離和多光子熒光檢測。本實用新型通過嫁接的方法，采用特氟龍管，將方形毛細(xì)管和圓形毛 細(xì)管連接起來，其中圓形毛細(xì)管用于分離，方形毛細(xì)管用于柱上檢測。采 用毛細(xì)管電泳一多光子激發(fā)熒光柱上檢測儀，省去了用于聚焦的CCD監(jiān)控
裝置，不但簡化了傳統(tǒng)實驗設(shè)備，降低實驗設(shè)備成本，簡化了復(fù)雜操作的 柱后檢測方式，而且提高了探測靈敏度。本實用新型提供一種經(jīng)濟(jì)的檢測 手段，適合多光子熒光檢測，特別適合于生物體內(nèi)熒光基團(tuán)的多光子激發(fā) 熒光檢測。它改變傳統(tǒng)的多光子激發(fā)熒光信號柱后檢測法，實驗表明，采 用本實用新型檢測儀既保留了圓形毛細(xì)管分離的效果，又簡化了實驗裝置 和實驗操作，同時提高了探測靈敏度。具體的試驗數(shù)據(jù)說明見具體實施方 式部分。


圖1為本實用新型毛細(xì)管電泳一多光子激發(fā)熒光柱后檢測儀的結(jié)構(gòu)示意圖; 圖2為圖1中柱上檢測器的局部結(jié)構(gòu)放大示意圖； 圖3為圓形柱后檢測多光子熒光毛細(xì)管電泳分離圖4為方形柱上檢測多光子熒光毛細(xì)管電泳分離圖；方形100微米； 柱上檢測，長度57/50厘米；電壓20 kV;其他同上；
圖5為本實用新型的毛細(xì)管電泳一多光子激發(fā)熒光柱上檢測儀得到的
多光子熒光毛細(xì)管電泳分離圖。75微米圓形一100微米方形一75微米圓形； 柱上檢測，長度57/50厘米；電壓20 kV;其他同上。
具體實施方式
本實用新型毛細(xì)管電泳一多光子激發(fā)熒光柱上檢測儀采用的是柱上檢測， 它包括光路和電泳二部分。
以下結(jié)合附圖和實例對本實用新型作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
如圖1所示，光路部分包括半導(dǎo)體激光器l、物鏡3、計算機(jī)9、采集卡 10、光電倍增管ll、 二向色鏡12、帶通濾光片15和全反射鏡13。半導(dǎo)體 激光器1發(fā)出的光束由二向色鏡12和全反射鏡13兩次反射后，進(jìn)入物鏡3， 聚焦到柱上檢測器14，實現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光后，熒光同時被物鏡3收集， 經(jīng)過全反射鏡13反射，透過二向色鏡12和帶通濾光片15，熒光被光電倍 增管ll探測并實現(xiàn)放大，送給釆集卡IO,由計算機(jī)9完成熒光信號數(shù)據(jù)處 理，實現(xiàn)定性和定量分析；
電泳部分包括鉑電極8、直流高壓電源2、第一41、第二緩沖池42和 柱上檢測器14。直流高壓通過插在二個緩沖池41, 42的鉑電極8，直接加 在柱上檢測器14的兩端，樣品在柱上檢測器14內(nèi)實現(xiàn)分離和多光子熒光 檢測。
如圖2所示，柱上檢測器14由圓形毛細(xì)管5、方形毛細(xì)管6和特氟龍 管7構(gòu)成。通過嫁接的方法，采用特氟龍管7，將方形毛細(xì)管6和圓形毛細(xì) 管5連接起來。柱上檢測器14的功能如下i)圓形毛細(xì)管用于電泳分 離；圓形毛細(xì)管具有中心對稱性，在高壓電場下，各個部分的電荷分布要
均勻，減少了分離物質(zhì)的附著，有利于分離；ii)特氟龍管用于圓形和 方形毛細(xì)管連接；特氟龍管將圓形毛細(xì)管和方形毛細(xì)管結(jié)合起來，使之連 接處死體積幾乎為零，保證電泳分離的連續(xù)性；iii)方形毛細(xì)管用于熒 光探測；方形毛細(xì)管是內(nèi)外都是平面，高倍物鏡可以直接將激發(fā)光束聚焦 到方形毛細(xì)管中間。與圓形毛細(xì)管不同，方形毛細(xì)管因為管壁是一個平面 結(jié)構(gòu)，對聚焦光束和聚焦點幾乎沒有影響，可以實現(xiàn)多光子熒光激發(fā)和收集。 本實用新型采用方形毛細(xì)管柱上檢測代替?zhèn)鹘y(tǒng)的圓形毛細(xì)管柱后檢 測。實驗操作簡單，不需要添加任何其他輔助設(shè)備，降低了實驗設(shè)備成本; 特別是實驗過程中方便清洗，而且從管口流出的雜質(zhì)也不會造成檢測窗口 污染，有利于熒光的探測和收集。 實例
為了實驗論證本實用新型的可行性和科學(xué)性，我們實驗選擇多種苯胺 (9種，具體見表l)混和衍生后，采用多光子激發(fā)熒光方法，在三種不同 的分離和檢測狀態(tài)下，實現(xiàn)苯胺的分離和檢測采用傳統(tǒng)的圓形毛細(xì)管分 離柱后檢測和方形毛細(xì)管分離柱上檢測；采用本實用新型的毛細(xì)管電泳一 多光子激發(fā)熒光柱上檢測的分離檢測。
上述對比實驗如下，實驗證明，圓形毛細(xì)管分離效果要優(yōu)于方形毛細(xì) 管，而它的檢測靈敏度不于方形毛細(xì)管，實驗具體如下
l.圓形毛細(xì)管柱后檢測電泳圖譜如圖3，物鏡將近紅外光束聚焦在毛 細(xì)管陰極端的出口中心，通過CCD實現(xiàn)對焦。實驗參數(shù)圓形75微米；長
度50厘米；電壓18kV;緩沖液25mmol/L硼砂，用lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)到pH 11; FITC和苯胺分子數(shù)比為10比1混和，漩渦混勻，于暗 處室溫25'C衍生反應(yīng)12小時；苯胺濃度依次是2. 69、 3. 43、 2. 39、 2. 49、 2.63、 2.74、 3.36、 2.64、 2.95 X 1(Tmol/L;虹吸進(jìn)樣15 cm， 60s。
2. 方形毛細(xì)管柱上檢測如電泳圖譜如圖4，物鏡直接透過方形毛細(xì)管 管壁，聚焦在方形毛細(xì)管中心。實驗參數(shù)方形毛細(xì)管的管壁厚度為130 微米，其內(nèi)腔的邊長為100微米；柱上檢測，長度57/50厘米；電壓20kV; 其他同圖3。
3. 方圓結(jié)合的柱上檢測——毛細(xì)管電泳一多光子激發(fā)熒光柱上檢測電 泳圖譜如圖5。它采用特氟龍管將圓形毛細(xì)管和方形毛細(xì)管連接起來，圓 形毛細(xì)管用來分離待測物，方形毛細(xì)管作為探測窗口，物鏡將近紅外光束 直接透過方形毛細(xì)管的方形平面，聚焦在方形毛細(xì)管中央，實現(xiàn)多光子激 發(fā)熒光和熒光收集。實驗參數(shù)75微米圓形一100微米方形一75微米圓形; 柱上檢測，長度57/50厘米；電壓20 kV;其他同上。
實驗電泳圖譜比較說明，采用本實用新型能夠提高分離效率和靈敏度。 表1苯胺中英文對照及其編號
編號名稱英文名稱
1對甲苯胺p-Toludine
2苯胺Aniline
3對氯苯胺p-CWoroaniline
4對乙氧基苯胺p-ethoxyaniline
4一溴苯胺4-Bromoaniline
63 —溴苯胺3-Bromoaniline
了間氨基苯酚m- aminopheol
8鄰氨基苯酚o-aminopheol
9對苯二胺1 ，4-diaminobenzene
備注編號按照其電泳圖譜中峰次順序標(biāo)定
權(quán)利要求1、一種毛細(xì)管電泳-多光子激發(fā)熒光柱上檢測儀，包括半導(dǎo)體激光器(1)、物鏡(3)、計算機(jī)(9)、采集卡(10)、光電倍增管(11)、二向色鏡(12)、帶通濾光片(15)、全反射鏡(13)、鉑電極(8)、直流高壓電源(2)和第一緩沖池(41)，其特征在于該檢測儀還包括第二緩沖池(42)和柱上檢測器(14)，該柱上檢測器14由圓形毛細(xì)管(5)、方形毛細(xì)管(6)和特氟龍管(7)構(gòu)成，特氟龍管(7)通過嫁接將方形毛細(xì)管(6)和圓形毛細(xì)管(5)連接起來；方形毛細(xì)管(6)和圓形毛細(xì)管(5)的另一端部分別位于第一、第二緩沖池(41、42)內(nèi)；半導(dǎo)體激光器(1)發(fā)出的光束由依次二向色鏡(12)和全反射鏡(13)兩次反射后，進(jìn)入物鏡(3)，聚焦到柱上檢測器(14)，實現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光，熒光同時被物鏡(3)收集，經(jīng)過全反射鏡(13)反射，依次透過二向色鏡(12)和帶通濾光片(15)，熒光被光電倍增管(11)探測并實現(xiàn)放大，并通過采集卡(10)傳送給計算機(jī)，由計算機(jī)(9)完成熒光信號數(shù)據(jù)處理；直流高壓電源(2)的二個鉑電極(8)分別位于第一、第二緩沖池(41、42)內(nèi)，直流高壓直接加在柱上檢測器(14)的兩端，樣品在柱上檢測器(14)內(nèi)實現(xiàn)分離和多光子熒光檢測。
專利摘要本實用新型公開了一種毛細(xì)管電泳-多光子激發(fā)熒光柱上檢測儀，該檢測儀包括半導(dǎo)體激光器、物鏡、計算機(jī)、采集卡、光電倍增管、二向色鏡、帶通濾光片、全反射鏡、鉑電極、直流高壓電源、第一、第二緩沖池和柱上檢測器。柱上檢測器采用特氟龍管，將方形毛細(xì)管和圓形毛細(xì)管連接起來，其中圓形毛細(xì)管用來分離(實驗證明方形毛細(xì)管分離效果沒有圓形的好)，而方形毛細(xì)管用于柱上檢測。熒光柱上探測的方形毛細(xì)管與用于分離的圓形毛細(xì)管結(jié)合起來，實現(xiàn)柱上檢測，不但簡化了傳統(tǒng)實驗設(shè)備，降低實驗設(shè)備成本，簡化了復(fù)雜操作的柱后檢測方式，而且提高了探測靈敏度。
文檔編號G01N27/453GK201016928SQ20072008371
公開日2008年2月6日 申請日期2007年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月8日
發(fā)明者劉筆鋒, 勝 陳, 駱清銘 申請人:華中科技大學(xué)