專利名稱：定量測定人體丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于體外臨床診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于測定人體全血、血 清或血漿等中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等生化指標(biāo)的干化學(xué)試紙。
背景技術(shù)：
丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，它催化L一丙氨酸和L一谷氨酸之間氨基的轉(zhuǎn)移。 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶主要存在于肝細(xì)胞的胞漿中，在心肌、骨骼肌及其它組織中的含量較低。 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是肝臟的特異性酶，血清值升高表明肝細(xì)胞質(zhì)膜存在滲漏并退化，其升 高的程度與受累細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。
臨床上測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的試劑可分為液體試劑和干化學(xué)試紙兩類。干化學(xué)試紙 主要用于快速檢測。同液體試劑相比，干化學(xué)試紙具有方便、靈活、污染小、操作簡便等 優(yōu)點(diǎn)。
目前，檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的的干化學(xué)試紙多為國外產(chǎn)品，主要有縱向和橫向兩類。 第一類是以強(qiáng)生公司和富士公司為代表的多層膜干片法，利用感光膠片的涂層技術(shù)將試劑 層、輔助試劑層、光漫射層和分布層等試劑涂布在透明支持層上，從支持層的反面測定光 密度的變化。如專利U.S. PAT.N0.5, 508， 173。第二類是羅氏公司的干化學(xué)產(chǎn)品，U.S. PAT.NO.4,604,264將試劑涂布在多絲的纖維或織物上，全血通過玻璃纖維橫向過濾后與上 試劑層接觸反應(yīng)，通過上部覆蓋的一透明薄膜測定光密度的變化。
上述這些產(chǎn)品，有的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，需要專門的技術(shù)；有的可能存在某些缺陷，如加 樣和測定在同一側(cè)可能會(huì)造成干擾。而且目前應(yīng)用的干式生化分析儀為大中型設(shè)備，它將 若干個(gè)生化項(xiàng)目集中在一臺(tái)儀器上測定。在測定單一的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶項(xiàng)目時(shí)，如流動(dòng) 采血車等場合，其功能和速度會(huì)受到限制。本實(shí)用新型旨在提供獨(dú)立的小型機(jī)和試紙，更 適合丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的大規(guī)?？焖俸Y査。 發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的在于提供一種使用方便、快速的定量測定人體全血、血清或血漿中 的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙。
本實(shí)用新型提供的定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，為長條形， 一端為手持 區(qū)，另一端為測試區(qū)，其結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示。它由上支持層、下支持層、底物層和顯
色層組成。其中，上支持層和下支持層通過自帶的膠層粘合在一起。在上支持層的測試區(qū) 開有加樣孔，下支持層的對應(yīng)位置開有測試孔。底物層和顯色層迭合，位于加樣孔和測試 孔處的上支持層和下支持層之間。
本實(shí)用新型中，上支持層和下支持層可采用高分子聚合材料，如聚乙烯、聚氯乙烯、 聚苯乙烯或聚酯纖維等。其中優(yōu)選聚酯纖維。單片支持層的厚度為100-250um,大小為6 X50mm-12X80mm。上下支持層上的加樣孔和測試孔為圓形，直徑相同，為4-8mm。加樣孔 3用于滴加樣品，測試孔用于觀察和測定反應(yīng)區(qū)顏色的變化。
本實(shí)用新型中，底物層用來接受樣品，樣品在底物層擴(kuò)散，將浸漬在底物層上的試劑 溶解，樣品中的可檢測部分被轉(zhuǎn)運(yùn)到顯色層的樣品面。底物層優(yōu)選反應(yīng)區(qū)面積能容納大約 10-30yl血液，并能將大約6-10pl樣品轉(zhuǎn)運(yùn)至顯色層的材料。適合做底物層的材料包括 玻璃纖維、各種濾紙或無紡布等，特別優(yōu)選玻璃纖維，其結(jié)構(gòu)疏松，血液樣品中的可檢測 部分和試劑能快速滲透至顯色層，縮短了反應(yīng)時(shí)間。
本實(shí)用新型中，顯色層為浸漬有檢測試劑和色原的各種濾紙、無紡布或合成膜等，優(yōu) 選聚砜、聚醚砜或尼龍等材料的合成膜，特別優(yōu)選具有孔徑大小呈梯度變化的孔的合成膜， 合成膜上的小孔孔徑范圍為0.2-10um。合成膜有一個(gè)用于點(diǎn)樣的樣品面，和一個(gè)可觀察 到顏色變化的檢測面。當(dāng)血液滲透到膜的大孔面上后，樣品逐漸穿過膜，流過的孔徑越來 越小。最后，紅細(xì)胞等物質(zhì)到達(dá)膜的某個(gè)位置就不再往下滲透。含有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的 剩余樣品滲透到小孔面，通過一系列反應(yīng)，使色原顏色發(fā)生變化，從而指示樣品中丙氨酸 氨基轉(zhuǎn)移酶的濃度。
本實(shí)用新型中，反應(yīng)試劑分布于底物層和顯色層上。定量全血或血清/血漿滴加于加樣 孔內(nèi)，樣品均勻分布并滲入試劑層中。樣品中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)催化底物L(fēng)一 丙氨酸和a—酮戊二酸鈉，產(chǎn)生L一谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黃素腺嘌 呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化產(chǎn)生過氧化氫。在過氧化物酶作 用下，過氧化氫氧化無色色原生成有色產(chǎn)物，顏色變化與樣品中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性 成正比，用反射光度計(jì)可測定之。
本實(shí)用新型中，反應(yīng)試劑包括緩沖體系、底物、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、色原、 激活劑、穩(wěn)定劑等。緩沖體系可以是磷酸鹽緩沖液、Tris-HCL或Good's緩沖液等，濃度 為0.05M—1.0M，反應(yīng)最佳pH值在6.5-8.0。底物采用L一丙氨酸和a —酮戊二酸鈉，底 物在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的催化下產(chǎn)生L一谷氨酸和丙酮酸。L一丙氨酸的濃度為 0.5M-1.5M, a —酮戊二酸鈉的濃度為5mM-50mM。生成的丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黃素 腺嘌呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化產(chǎn)生過氧化氫。丙酮酸氧化
酶的適宜濃度為30-100U/ml ， FAD濃度為0.1mg/ml-0.2mg/ml ， TPP濃度為 0.4mg/ml-0.8mg/ml;丙酮酸氧化酶的激活劑采用Mg2+， Mg"的濃度為1.0g/L-3.0g/L;酶的穩(wěn)
定劑采用二糖、多糖類或蛋白類穩(wěn)定劑等，如蔗糖、海藻糖和牛血清白蛋白等，在體系中 的重量濃度為0.1-2.0%。在過氧化物酶作用下，過氧化氫氧化無色色原生成有色產(chǎn)物。過 氧化物酶濃度為30-100U/ml。色原作為指示劑，可以是單一組分或兩種組分的色原物質(zhì)， 優(yōu)選色原強(qiáng)吸收處的波長不同于樣品的強(qiáng)吸收處的波長，特別優(yōu)選強(qiáng)吸收處的波長為 610-650nm的色原，濃度為0.03%-0.5%。
為定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性，發(fā)明人還研制了反射式分光光度計(jì)(另案申請專 利)，與本實(shí)用新型試紙條配套使用。6-血樣滴加于試紙條上，反應(yīng)溫度控制在37土 0.3°C，用該光度計(jì)測定試紙反應(yīng)后在630士20nm波長下反射光密度的變化，測試在3. 5_5 分鐘內(nèi)完成。自動(dòng)報(bào)告和存儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并打印。
本實(shí)用新型使用丙酮酸氧化酶法測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性，采用底物層和顯色層迭 合的結(jié)構(gòu)，試劑穩(wěn)定性好，顯色強(qiáng)度高，均勻度好，減少了加樣端測定產(chǎn)生的氣泡、過量 液體、紅細(xì)胞等造成的干擾，可使用全血和血清/血漿作為標(biāo)本。本實(shí)用新型制造工藝簡 單，與專門設(shè)計(jì)的小型反射式光度計(jì)配套，使用更為方便快速。


圖1為本實(shí)用新型的干化學(xué)試紙圖示。
圖2為本實(shí)用新型的干化學(xué)試紙剖面圖示。
圖中標(biāo)號(hào)1為上支持層，2為下支持層，3為加樣孔，4為測試孔，5為底物層，6 為顯色層。
圖3為實(shí)施例1的測定結(jié)果的回歸直線方程。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:上、下支持層采用PVC片，用打孔機(jī)打出加樣孔3和測試孔4，孔直徑為 4mm，孔距為8mm。底物層5采用玻璃纖維，粘貼于上支持層。顯色層6采用尼龍膜，粘貼 于下支持層。將配制好的底物溶液和顯色液用BIO-DOT噴點(diǎn)儀分別點(diǎn)樣于底物層5和顯色 層6，每孔6W。將噴點(diǎn)后的試紙放入30-5(TC的真空干燥箱中，干燥后取出。將上、下支 持層對合粘帖在一起，加樣孔3與測試孔4對齊。用滾刀機(jī)將試紙切成8mm寬的試紙條即 成。
試劑組成如下
磷酸鹽緩沖液 50mM L一丙氨酸 500mM
a —酮戊二酸鈉 10mM MgCl2*6H20: 2.4g/L 過氧化物酶 30U/ml 丙酮酸氧化酶 30U/ml 黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD) : 0. lmg/ml
硫胺素焦磷酸(TPP) : 0.4mg/ml 4-氨基安替比林 1.2g/L DAOS(色原) 0.85g/L
(N-乙基一N— (2—羥基一3—磺酸基丙基)_3， 5 — 二甲氨基苯胺) 牛血清白蛋白 0.2% 將6u 1 7%牛血清白蛋白配制的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶校準(zhǔn)品滴加于加樣孔，用反射式光 度計(jì)進(jìn)行測定，讀取2.5—4分鐘時(shí)的反射強(qiáng)度的變化。結(jié)果見表l:
ALT濃度(U/L) 反射強(qiáng)度變化
15. 6 62. 5
125 200
0.032 0. 050 0. 080 0. Ill
以此建立直線回歸方程為Y(反射強(qiáng)度變化)二O. 0004X(ALT濃度)+0. 0245， r2=0. 9987。 如圖3所示。
實(shí)施例2:上、下支持層采用PET片，用打孔機(jī)打出加樣孔3和測試孔4，孔直徑為 4mm，孔距為8腿。底物層5采用玻璃纖維，顯色層6采用PES膜，寬度為8 mm。將底物 層5和顯色層6分別浸泡于底物溶液和顯色液中，完全浸濕后取出，刮平。將浸濕的試紙 放入30-50℃的真空干燥箱中，干燥后取出。將底物層5粘貼于上支持層，顯色層6粘貼 于下支持層。將上、下支持層對合粘帖在一起，加樣孔3與測試孔4對齊。用滾刀機(jī)將試 紙切成8mm寬的試紙條即成。 試劑組成如下
Good's緩沖液 200rnM
L一丙氨酸 lOOOmM
a -酮戊二酸鈉 20mM
MgCl臭0: 2.0g/L
過氧化物酶 100U/ml
丙酮酸氧化酶 100U/ml
黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD) : 0.2mg/ml
硫胺素焦磷酸(TPP) : 0. 8mg/ml
KH2P04 : 20mM
3',3，，5'， 5，-四甲聯(lián)苯胺(色原) 0.1%
海藻糖 0.5%
用高濃度的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶血清稀釋紅細(xì)胞，得到紅細(xì)胞壓積為20%、 30%、 40 %、 50%和60%的全血標(biāo)本，加樣量為20ul，分別滴加于加樣孔，用反射式光度計(jì)進(jìn)行 測定，讀取3—4分鐘時(shí)的反射強(qiáng)度的變化。結(jié)果見表2:
紅細(xì)胞壓積 反射強(qiáng)度變化
20% 0. 056
30% 0. 063
40% 0. 062
50% 0. 059
60% 0. 039
結(jié)果說明紅細(xì)胞壓積在30% — 50%的全血標(biāo)本在測定時(shí)幾乎不受紅細(xì)胞的干擾。
權(quán)利要求1、一種定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于形狀為長條形，一端為手持區(qū)，另一端為測試區(qū)，由上支持層(1)、下支持層(2)、底物層(5)和顯色層(6)組成；其中，上支持層(1)和下支持層(2)通過自帶的膠粘層粘合在一起；在上支持層(1)的測試區(qū)開有加樣孔(3)，下支持層(2)的對應(yīng)位置開有測試孔(4)；底物層(5)和顯色層(6)迭合，位于加樣孔(3)和測試孔(4)處的上支持層(1)和下支持層(2)之間；底物層(5)和顯色層(6)上浸漬有反應(yīng)試劑。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所述的上支持層和下支持層的材料為高分子聚合材料，單片支持層的厚度為100-250μm，大小為6X50mm-12X80mm，上支持層和下支持層的規(guī)格相同，其上的加樣孔(3)和測試孔(4) 為圓形，直徑為4-8mm。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所述的底物層(5)的材料采用玻璃纖維、各種濾紙或無紡布。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所述的顯色層(6)的材料為各種濾紙、無紡布或合成膜。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所述合成膜為聚砜、聚醚砜或尼龍。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所 述合成膜具有孔徑大小呈梯度變化的孔，其中小孔的孔徑范圍為0.2-10μm。
專利摘要本實(shí)用新型屬于體外臨床診斷試劑領(lǐng)域，具體為一種定量測定人體丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的干化學(xué)試紙。試紙由長條形的上、下支持層組成，在測試區(qū)從上到下依次為加樣孔、底物層、顯色層和測試孔。底物層可選用玻璃纖維、濾紙和無紡布等材料，浸漬有底物等試劑；顯色層為各種濾紙、無紡布或合成膜，浸漬有色原等試劑。樣品從加樣孔進(jìn)入底物層，轉(zhuǎn)運(yùn)至顯色層的樣品面，含有被檢測成分的液體滲透至顯色層的檢測面，通過化學(xué)反應(yīng)引起色原顏色的改變，通過下支持層上的測試孔在顯色層的檢測面即可測定光密度的變化。該試紙用于快速測定人體全血、血清或血漿中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性，是肝功能檢測的重要指標(biāo)之一。
文檔編號(hào)G01N33/52GK201181295SQ20072007344
公開日2009年1月14日 申請日期2007年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日
發(fā)明者朱世成, 縵 王, 漪 田 申請人:上?？迫A生物工程股份有限公司