專利名稱：用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的石蠟切片制樣方法，具體是一種用于原 子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法。
背景技術(shù)：
石蠟切片技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)最常用的技術(shù)之一，包括固定、脫水、包埋、切 片、脫蠟、染色等幾個(gè)主要步驟，常用于在光學(xué)顯微鏡下作組織和細(xì)胞的形態(tài)學(xué) 檢測(cè)。石蠟切片染色之前需要完全脫蠟，以便染色劑著色(見鄭國鋁，谷祝平著 生物顯微技術(shù)，第二版，北京高等教育出版社，1993)。常用的脫蠟試劑是二 甲苯，處理時(shí)間根據(jù)樣品材料的不同和實(shí)驗(yàn)條件等因素不同而有差異， 一般是
15 60min。但是當(dāng)石蠟切片用原子力顯微鏡(AFM)來觀察時(shí)，在脫蠟之前切片 表面不能清晰顯示組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而完全脫蠟后部分表面已被破壞，且粗糙度 太大，因此必須發(fā)展適合原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，榮瑋等在《解剖學(xué)雜志》上(2006， 29(1) P.92)上發(fā)表的"關(guān)于石蠟切片在染色中脫蠟的探討"中提出加熱二甲苯或者 烘烤切片以加快脫蠟的方法，鄧昂在《華中醫(yī)學(xué)雜志》上(2002， 26(5)P.262) 發(fā)表的"病理切片中松節(jié)油代替二甲苯脫蠟"中提出了用松節(jié)油來代替常用的二 甲苯對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟，有助減輕二甲苯對(duì)操作人員的毒性。上述這些方法都 是對(duì)現(xiàn)有石蠟切片脫蠟方法的改善，以更好的適應(yīng)光學(xué)顯微鏡的觀察。但目前尚 無針對(duì)原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法的報(bào)道，因此非常有必要發(fā)展適合 于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片樣品制備技術(shù)，尤其是切片脫蠟技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切 片脫蠟方法，使其具備步驟簡單，操作簡便，所得的切片表面粗糙度合適，能夠 展現(xiàn)組織和細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)，適合于原子力顯微鏡觀察。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟
第一步，按體積比為1: 1的比例將二甲苯和無水乙醇混勻，注滿兩個(gè)染色 缸，將貼附于載玻片表面的石蠟切片全浸入第一個(gè)裝滿二甲苯和無水乙醇混合液 的染色缸中處理1 min，其間輕輕搖動(dòng)一次。
第二步，將第一個(gè)染色缸中的石蠟切片取出，立即浸入裝滿二甲苯的染色缸 中，在室溫25 'C的條件下處理15 min 30 min。其間每隔5 min輕輕搖動(dòng)染 色缸一次。
第三步，將切片取出，立即浸入第二個(gè)裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色 缸中處理2 min，其間輕輕搖動(dòng)一次。
第四步，將切片取出，立即浸入裝滿無水乙醇的染色缸中處理2min，取出 晾干，即獲得適合于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片。
在上述發(fā)明中，石蠟切片經(jīng)過二甲苯的脫蠟處理，組織和細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)已 暴露出來，可以供原子力顯微鏡觀察和形態(tài)分析，分辨率在亞細(xì)胞的水平，能夠 分辨細(xì)胞膜、細(xì)胞核以及胞內(nèi)基質(zhì)，還包括細(xì)胞間質(zhì)和胞外基質(zhì)。尤其細(xì)胞核形 態(tài)完整，且凸出于細(xì)胞基質(zhì)，在原子力顯微鏡下易于分辨和識(shí)別。本方法步驟簡 單，操作方便。


圖1為不同脫蠟時(shí)間的石蠟切片在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖像 其中A是未經(jīng)脫蠟的石蠟切片樣品，B是本發(fā)明實(shí)施例l中制備的樣品， 切片脫蠟時(shí)間為15 min， C是脫蠟時(shí)間為65 min的樣品。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中制備的樣品在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖像。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限 于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
將貼附在載玻片表面的石蠟切片浸入體積比為1:1的二甲苯和無水乙醇混 合液中處理lmin，立即轉(zhuǎn)入二甲苯中處理15min，其間輕輕搖晃兩次。到時(shí)間 后，再轉(zhuǎn)入體積比為1:1的二甲苯和無水乙醇混合液中處理2min，最后轉(zhuǎn)入無 水乙醇中處理2min，取出晾干，供原子力顯微鏡觀察。
將上述方法脫蠟的石蠟切片在原子力顯微鏡下觀察，所得圖像見圖1A，可 見切片表面粗糙度合適，細(xì)胞輪廓清晰，胞內(nèi)有凸出的細(xì)胞核，細(xì)胞間有基質(zhì)。 掃描范圍50umX50ym。如果是未經(jīng)脫蠟處理的石蠟切片直接用原子力顯微鏡 觀察，因?yàn)楸砻姹灰粚邮灨采w，不能顯示組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，見圖1B。如果 是脫蠟時(shí)間在60 min以上，切片將被完全脫蠟，則表面結(jié)構(gòu)已被部分破壞，粗 糙度很大，難以觀察到組織和細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)，見圖1C。
實(shí)施例2
將貼附在載玻片表面的石蠟切片浸入體積比為1:1的二甲苯和無水乙醇混 合液中處理lmin，立即轉(zhuǎn)入二甲苯中處理30min，其間輕輕搖晃三次。到時(shí)間 后，再轉(zhuǎn)入體積比為1:1的二甲苯和無水乙醇混合液中處理2 min，最后轉(zhuǎn)入無 水乙醇中處理2min，取出晾干，供原子力顯微鏡觀察。
將上述方法脫蠟的石蠟切片在原子力顯微鏡下觀察，所得圖像見圖2，可見 切片表面粗糙度合適，細(xì)胞輪廓清晰，排列分散，胞內(nèi)有一個(gè)或兩個(gè)凸出的細(xì)胞 核，細(xì)胞間有基質(zhì)填充。掃描范圍50iimX50um。
權(quán)利要求
1、一種用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其特征在于包括如下步驟第一步，按體積比為1∶1的比例將二甲苯和無水乙醇混勻，注滿兩個(gè)染色缸，將貼附于載玻片表面的石蠟切片全浸入第一個(gè)裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色缸中處理；第二步，將第一個(gè)染色缸中的石蠟切片取出，立即浸入裝滿二甲苯的染色缸中，在室溫下處理；第三步，將切片取出，立即浸入第二個(gè)裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色缸中處理；第四步，將切片取出，立即浸入裝滿無水乙醇的染色缸中處理，取出晾干，即獲得適合于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其 特征是，第一步中，所述處理，其時(shí)間為l min，其間輕輕搖動(dòng)一次。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其 特征是，第二步中，所述室溫，是指25 °C。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法， 其特征是，第二步中，所述處理，其時(shí)間為15 min 30 min，其間每隔5 min 輕輕搖動(dòng)染色缸一次。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其 特征是，第三步中，所述處理，其時(shí)間為2min，其間輕輕搖動(dòng)一次。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其 特征是，第四步中，所述處理，其時(shí)間為2 min。
全文摘要
一種用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明步驟為按體積比為1∶1的比例將二甲苯和無水乙醇混勻，注滿兩個(gè)染色缸，將貼附于載玻片表面的石蠟切片全浸入第一個(gè)裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色缸中處理；將第一個(gè)染色缸中的石蠟切片取出，立即浸入裝滿二甲苯的染色缸中，在室溫下處理；將切片取出，立即浸入第二個(gè)裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色缸中處理；將切片取出，立即浸入裝滿無水乙醇的染色缸中處理，取出晾干，即獲得適合于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片。本發(fā)明方法步驟簡單，所用試劑僅兩種，操作簡便，適合供原子力顯微鏡觀察的各種組織和細(xì)胞石蠟切片的脫蠟。
文檔編號(hào)G01N1/28GK101196444SQ200710172159
公開日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2007年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日
發(fā)明者孫潔林, 彤 季, 李鑫輝, 鈞 胡 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)