專利名稱：哺乳動物細(xì)胞因子、相關(guān)試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與在控制哺乳動物細(xì)胞(例如哺乳動物免疫系統(tǒng)的細(xì)胞)生物學(xué)和生理學(xué)方面起作用的蛋白質(zhì)相關(guān)的組合物以及方法。具體而言，本發(fā)明提供可用于例如調(diào)節(jié)各種細(xì)胞類型(包括造血細(xì)胞)的活化、發(fā)育、分化和功能的純化基因、蛋白質(zhì)、抗體、相關(guān)試劑和方法。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)一般是指這樣的技術(shù)，所述技術(shù)通過將得自供體源的遺傳信息整合到載體中用于后續(xù)加工，諸如通過引入到宿主中，由此使所轉(zhuǎn)移的遺傳信息在該新環(huán)境中復(fù)制和/或表達(dá)。通常，該遺傳信息以互補(bǔ)DNA(cDNA)的形式存在，所述互補(bǔ)DNA衍生自編碼所需蛋白產(chǎn)物的信使RNA(mRNA)。該載體通常是一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有將用于隨后復(fù)制的cDNA加入宿主中的能力，在某些情況下，實際有能力控制該cDNA的表達(dá)，并由此指導(dǎo)在該宿主中合成所編碼的產(chǎn)物。
一段時間以來，已經(jīng)知道哺乳動物的免疫應(yīng)答基于稱為“免疫網(wǎng)絡(luò)”的一系列復(fù)雜的細(xì)胞相互作用。參見例如Paul，(1998)FundamentalImmunology(第4版)Raven Press，NY。最近的研究已經(jīng)提供了對該網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部運作的新的了解。盡管已經(jīng)清楚許多免疫應(yīng)答實際上確實圍繞淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和其它細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)樣相互作用運轉(zhuǎn)，但免疫學(xué)家現(xiàn)在一般堅持這樣一種觀點稱為淋巴因子、細(xì)胞因子或單核因子的可溶性蛋白，在控制這些細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用。因此，人們對細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的分離、特征鑒定和作用機(jī)制相當(dāng)感興趣，對這些信息的了解將導(dǎo)致在許多醫(yī)學(xué)異常(例如免疫系統(tǒng)失調(diào))的診斷和治療方面取得相當(dāng)大的進(jìn)展。這些因子中的某些因子是造血生長因子，例如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。參見例如Thomson(1998編輯)TheCytokine Handbook(第3版)Academic Press，San Diego；Mire-Sluis和Thorpe，(1998編輯)CytokinesAcademic Press，San Diego；Metcalf和Nicola(1995)The Hematopoietic Colony Stimulating FactorsCambridgeUniversity Press；和Aggarwal和Gutterman(1991)Human CytokinesBlackwell Pub。免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)，在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起重要作用。大多數(shù)細(xì)胞因子是多效的，具有多種生物活性，包括抗原呈遞、活化、CD4+T細(xì)胞亞群的增殖和分化、B細(xì)胞的抗體應(yīng)答和過敏表現(xiàn)。另外，細(xì)胞因子可以用于范圍廣泛的直接或間接涉及免疫系統(tǒng)和/或造血細(xì)胞的退行性病癥或異常病癥的診斷和治療。
淋巴因子顯然以多種方式介導(dǎo)細(xì)胞活性。已經(jīng)表明，它們支持多能造血干細(xì)胞的增殖、生長和/或分化為大量的祖細(xì)胞(progenitor)，所述祖細(xì)胞包括構(gòu)成復(fù)雜的免疫系統(tǒng)的多樣化的細(xì)胞譜系。所述細(xì)胞組分之間正常和平衡的相互作用是健康的免疫應(yīng)答所必需的。當(dāng)連同其它因子一起給予淋巴因子時，不同的細(xì)胞譜系常常以不同方式應(yīng)答。
對免疫應(yīng)答尤為重要的細(xì)胞譜系包括兩類淋巴細(xì)胞B細(xì)胞，它們可以產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白(具有識別并結(jié)合外源物質(zhì)以實現(xiàn)將其去除的能力的蛋白質(zhì))；和各種亞群的T細(xì)胞，它們分泌淋巴因子，并誘導(dǎo)或抑制B細(xì)胞和構(gòu)成免疫網(wǎng)絡(luò)的各種其它細(xì)胞(包括其它T細(xì)胞)。這些淋巴細(xì)胞與許多其它細(xì)胞類型相互作用。
根據(jù)以上所述，可明顯看出，新的淋巴因子(例如與G-CSF和/或IL-6相關(guān)的淋巴因子)的發(fā)現(xiàn)和研制，可能有助于用于范圍廣泛的直接或間接涉及免疫系統(tǒng)和/或造血細(xì)胞的退行性病癥或異常病癥的新療法。特別是，對于增加或增強(qiáng)已知淋巴因子有益活性的淋巴因子的發(fā)現(xiàn)和研制應(yīng)該是非常有利。最初，新基因IL-B30根據(jù)其預(yù)測的結(jié)構(gòu)被鑒定為潛在的細(xì)胞因子，并且被分為象IL-6和G-CSF一樣的長鏈細(xì)胞因子(國際專利申請PCT/US98/15423(WO 99/05280)。IL-6和相關(guān)細(xì)胞因子如制癌蛋白M、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和cardiothrophin-1對血細(xì)胞生成、血小板生成、急性期應(yīng)答的誘導(dǎo)、破骨細(xì)胞生成、神經(jīng)元分化和存活以及心肥大具有生物活性。IL-B30在小鼠中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)出與IL-6在小鼠中過量表達(dá)后觀察到的相似表型，包括發(fā)育不良、系統(tǒng)性炎癥、不育癥和死亡。IL-B30看來是一種參與炎癥的新細(xì)胞因子。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于IL-B30(在本文中也稱為IL-B30蛋白)的生理學(xué)作用及其在免疫應(yīng)答中作用的發(fā)現(xiàn)。特別是，已經(jīng)闡明了IL-B30在涉及炎癥、傳染病、血細(xì)胞發(fā)育(hematopoietic development)和病毒感染的途徑中的作用。本發(fā)明具體涉及包含IL-12 p40亞基與白介素-B30(IL-B30)組合的組合物及其生物活性。本發(fā)明包括編碼兩種多肽或融合蛋白的核酸、其生產(chǎn)方法和應(yīng)用。部分根據(jù)本發(fā)明的核酸與本文所公開的互補(bǔ)DNA(cDNA)序列的同源性和/或根據(jù)功能分析，鑒定了本發(fā)明的核酸。也提供多肽、抗體和使用它們的方法，包括使用核酸表達(dá)法。提供對依賴生長因子生理學(xué)或免疫應(yīng)答的控制進(jìn)行調(diào)節(jié)或干涉的方法。
本發(fā)明部分基于這樣一種發(fā)現(xiàn)先前例如在USSN 08/900,905和09/122,443中描述的天然形式的IL-12的p40亞基也與IL-B30細(xì)胞因子相關(guān)。因此，這兩種多肽一起共表達(dá)，導(dǎo)致功能性受體結(jié)合和信號。
本發(fā)明提供多種組合物，所述組合物包含a)一種大致純的包含得自IL-12 p40的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段的多肽和一種大致純的包含得自IL-B30的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段的多肽；b)一種大致純的包含得自IL-12 p40的至少11個連續(xù)氨基酸的多肽和一種大致純的包含得自IL-B30的至少11個連續(xù)氨基酸的多肽；c)一種大致純的多肽，所述多肽包含IL-12 p40的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段和IL-B30的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；或d)一種大致純的多肽，所述多肽包含IL-12 p40的一個至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段和IL-B30的一個至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段。各種實施方案包括這樣的組合物a)其中所述多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段包括一個至少9個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；b)其中所述多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段是兩個至少9個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；c)其中所述IL-12 p40的至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段至少有15個連續(xù)氨基酸；d)其中所述IL-B30的至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段至少有15個連續(xù)氨基酸；e)還包含一種選自水性化合物的載體，包括水、鹽水和/或緩沖液；f)配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；或g)所述組合物是無菌組合物。其它實施方案包括那些組合物a)其中所述多肽中的至少一種i)是可檢測標(biāo)記的；ii)是重組產(chǎn)生的；iii)未經(jīng)糖基化；iv)是變性的；v)連接于固體基質(zhì)；或vi)與另一化學(xué)部分綴合；b)包含一種大致純的IL-12 p40多肽和一種大致純的IL-B30多肽；c)包含一種大致純的含與IL-B30融合的IL-12 p40的多肽；或d)與IL-18、IL-12、放射或化學(xué)療法、免疫佐劑或抗病毒劑聯(lián)合。試劑盒實施方案包括那些試劑盒，所述試劑盒包括這樣一種所述組合物和a)一個包含所述多肽的區(qū)室；或b)關(guān)于所述試劑盒中試劑的使用或處理的說明。
本發(fā)明的核酸組合物包括例如一種分離或重組的核酸，所述分離或重組的核酸編碼a)一種大致純的包含得自IL-12 p40的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段的多肽和一種大致純的包含得自IL-B30的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段的多肽；b)一種大致純的包含得自IL-12 p40的至少11個連續(xù)氨基酸的多肽和一種大致純的包含得自IL-B30的至少11個連續(xù)氨基酸的多肽；c)一種大致純的多肽，所述多肽包含IL-12 p40的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段和IL-B30的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；或d)一種大致純的多肽，所述多肽包含IL-12 p40的一個至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段和IL-B30的一個至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段。各種實施方案包括這樣一種核酸a)其中所述多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段包括一個至少9個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；b)其中所述多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段是兩個至少9個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；c)其中所述IL-12 p40的至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段至少有15個連續(xù)氨基酸；d)其中所述IL-B30的至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段至少有15個連續(xù)氨基酸；e)其中所述IL-12 p40得自靈長類；f)其中所述IL-B30得自靈長類；g)所述核酸是一種表達(dá)載體；h)所述核酸還包含一個復(fù)制起點；i)所述核酸包含一個可檢測標(biāo)記；j)所述核酸包含合成核苷酸序列；k)所述核酸小于6kb，最好小于3kb；或l)所述核酸得自靈長類。也提供包含所述重組核酸的細(xì)胞，包括其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、靈長類細(xì)胞或人類細(xì)胞。試劑盒實施方案包括那些試劑盒，所述試劑盒包括一種所述核酸和a)一個包含所述核酸的區(qū)室；b)一個還包含一種靈長類IL-12 p40多肽的區(qū)室；c)一個還包含一種靈長類IL-B30多肽的區(qū)室；或d)關(guān)于所述試劑盒中試劑的使用或處理的說明。
另一方面，本發(fā)明提供一種核酸，所述核酸a)在50℃和低于1M鹽的30分鐘洗滌條件下與靈長類IL-12 p40的天然成熟編碼部分雜交；和b)在50℃和低于1M鹽的30分鐘洗滌條件下與靈長類IL-B30的天然成熟編碼部分雜交。各種實施方案包括這樣一種所述核酸，其中a)用于IL-12 p40的所述洗滌條件是60℃和低于400mM的鹽；b)用于IL-B30的所述洗滌條件是60℃和低于400mM的鹽；c)所述核酸在一個至少50個核苷酸的序列段內(nèi)表現(xiàn)出與編碼靈長類IL-12p40的序列有同一性；和/或d)所述核酸在一個至少50個核苷酸的序列段內(nèi)表現(xiàn)出與編碼靈長類IL-B30的序列有同一性。優(yōu)選實施方案包括這樣一種核酸，其中a)用于IL-12 p40的所述洗滌條件是65℃和低于150mM的鹽；b)用于IL-B30的所述洗滌條件是65℃和低于150mM的鹽；c)所述核酸在一個至少90個核苷酸的序列段內(nèi)表現(xiàn)出與編碼靈長類IL-12 p40的序列有同一性；和/或d)所述核酸在一個至少90個核苷酸的序列段內(nèi)表現(xiàn)出與編碼靈長類IL-B30的序列有同一性。
提供與例如TNFα拮抗劑、IL-12拮抗劑、IL-10或類固醇聯(lián)合的所述IL-12 p40/IL-B30組合物的拮抗劑。
本發(fā)明也提供一種結(jié)合化合物，例如包含得自一種抗體的抗原結(jié)合部位的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物與所述的IL-12 p40/IL-B30組合物特異性地結(jié)合，但不與或者IL-12 p40或IL-B30多肽特異性地結(jié)合，所述組合物，a)包含一種大致純的多肽，所述多肽包含大致純的IL-12 p40多肽和一種大致純的IL-B30多肽；或b)包含一種大致純的多肽，所述多肽包含與IL-B30融合的IL-12 p40。其它結(jié)合化合物包括那些化合物，其中a)所述結(jié)合化合物在一個容器中；b)所述結(jié)合化合物是Fv、Fab或Fab2片段；c)所述結(jié)合化合物與另一化學(xué)部分綴合；或d)所述抗體i)是針對IL-12 p40/IL-B30組合物產(chǎn)生的；ii)是經(jīng)免疫選擇的；iii)是一種多克隆抗體；iv)表現(xiàn)出與抗原的Kd至少為30mM；v)連接于固體基質(zhì)，包括微珠或塑料膜；vi)處于無菌組合物中；或vii)是可檢測標(biāo)記的，包括放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。某些優(yōu)選形式包括組合物，所述組合物包含a)一種無菌結(jié)合化合物，如已描述的；或b)所述結(jié)合化合物和一種載體，其中所述載體是i)一種水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或ii)配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。另外，提供試劑盒實施方案，所述試劑盒包括所述結(jié)合化合物和a)一個包含所述結(jié)合化合物的區(qū)室；或b)關(guān)于所述試劑盒中試劑的使用或處理的說明。
此外，本發(fā)明提供生產(chǎn)抗原抗體復(fù)合物的方法，所述方法包括在合適條件下使靈長類IL-12 p40/IL-B30組合物與一種所述結(jié)合化合物接觸，由此讓所述復(fù)合物形成。各種方法包括那些方法，其中a)從其它細(xì)胞因子中純化所述復(fù)合物；b)從其它抗體中純化所述復(fù)合物；c)所述接觸是與包含一種細(xì)胞因子的樣品接觸；d)所述接觸使得可以定量檢測所述抗原；e)所述接觸是與包含所述抗體的樣品接觸；或f)所述接觸使得可以定量檢測所述抗體。
本發(fā)明也提供調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織的生理學(xué)或發(fā)育的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與IL-12 p40/IL-B30組合物或其拮抗劑接觸。一種優(yōu)選方法是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理學(xué)或發(fā)育的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與IL-12 p40/IL-B30組合物接觸，并且所述接觸導(dǎo)致IFNγ的產(chǎn)生增加。通常，所述細(xì)胞在宿主生物體內(nèi)，并且所述生物表現(xiàn)出Th1應(yīng)答增強(qiáng)，例如選自以下的一種效應(yīng)抗腫瘤效應(yīng)、佐劑效應(yīng)、抗病毒效應(yīng)或拮抗過敏的效應(yīng)。通常，所述接觸與以下聯(lián)合IL-18、IL-12、放射療法或化學(xué)療法、免疫佐劑或抗病毒治療劑。
在另一實施方案中，所述拮抗劑是抗IL-12受體亞基β1的抗體。因此，本發(fā)明也包括一種已描述的方法，其中所述接觸是與拮抗劑接觸，并且所述接觸導(dǎo)致IFNγ的產(chǎn)生相對減少。因此，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)宿主生物體內(nèi)細(xì)胞生理學(xué)或發(fā)育的方法，所述方法包括將所述拮抗劑給予所述生物，其中所述接觸導(dǎo)致自身免疫病或慢性炎癥的緩解。
對所述兩種亞基相關(guān)性的鑒定，提供了增加以下物質(zhì)分泌的方法a)一種靈長類IL-B30，這種方法包括表達(dá)所述多肽與IL-12 p40；或b)一種靈長類IL-12 p40，這種方法包括表達(dá)所述IL-12 p40與IL-B30。最好是，或者a)所述增加是增加至少3倍；或者b)所述表達(dá)是表達(dá)一種編碼IL-B30和IL-12 p40的重組核酸。
提供篩選結(jié)合所述IL-12 p40/IL-B30組合物的受體的方法，例如所述方法包括使所述復(fù)合物與表達(dá)所述受體的細(xì)胞在允許所述復(fù)合物與所述受體結(jié)合的條件下接觸，由此形成一種可檢測的相互作用。最好是，所述相互作用導(dǎo)致所述細(xì)胞內(nèi)的一種生理學(xué)反應(yīng)。
本發(fā)明也提供調(diào)節(jié)動物體內(nèi)白細(xì)胞運輸或激活的方法，所述方法包括使所述動物體內(nèi)的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞與治療量的哺乳動物IL-B30蛋白的激動劑接觸；或者與治療量的哺乳動物IL-B30蛋白的拮抗劑接觸。優(yōu)選實施方案包括其中所述哺乳動物IL-B30蛋白是一種靈長類蛋白質(zhì)；和/或所述拮抗劑是與哺乳動物IL-B30結(jié)合的抗體。某些實施方案包括其中所述單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞包括小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或樹突細(xì)胞，或其中所述動物表現(xiàn)出炎癥、白細(xì)胞增生性病癥、神經(jīng)變性性病癥或創(chuàng)傷后病癥的體征或癥狀。優(yōu)選實施方案包括其中所述體征或癥狀是在肺組織、肝組織、神經(jīng)組織、淋巴組織、骨髓組織、胰腺、胃腸組織、甲狀腺組織、肌肉組織或皮膚或白纖維組織中。
其它方法包括其中所述調(diào)節(jié)是抑制白細(xì)胞的功能；和/或其中所述給予是給予所述激動劑。所述激動劑最好是哺乳動物IL-B30。
某些實施方案包括其中所述動物正經(jīng)歷以下病癥的體征或癥狀自身免疫、炎癥、組織特異性自身免疫、變性性自身免疫、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化、脈管炎、遲發(fā)型過敏反應(yīng)、皮膚移植、移植、脊柱損傷、中風(fēng)、神經(jīng)變性、傳染病、局部缺血、癌癥、腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、Castleman病、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松或IL-6相關(guān)病癥。所述給藥可以與以下藥物聯(lián)合給予抗炎細(xì)胞因子激動劑或拮抗劑、鎮(zhèn)痛藥、消炎藥或類固醇。
提供各種其它方法，其中所述調(diào)節(jié)是增強(qiáng)所述白細(xì)胞的功能和/或所述給予是給予所述拮抗劑。所述拮抗劑最好是一種與哺乳動物IL-B30結(jié)合的抗體；或所述哺乳動物IL-B30的一種突變蛋白，所述突變蛋白與所述哺乳動物IL-B30競爭與IL-B30受體的結(jié)合，但基本上沒有信號。在各種實施方案中，所述方法適用于所述動物經(jīng)歷傷口愈合或凝血塊形成的體征或癥狀的情況。所述給藥通常與以下聯(lián)合一種血管生成因子；一種生長因子，包括FGF或PDGF；一種抗生素；或一種凝血因子。
最后，本發(fā)明提供通過給予IL-B30或其激動劑誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞增殖的方法。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述本文引用的所有參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中，其程度與具體而單獨地表明每個單獨的出版物或?qū)＠暾埻ㄟ^引用結(jié)合到本文中的程度一樣。
大綱I.一般描述II. 純化的IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物A. 物理特性B. 生物特性III. 物理變異體A. 序列變異體、片段B. 翻譯后變異體1.糖基化2.其它IV. 功能變異體A. 類似物、片段1.激動劑2.拮抗劑B. 模擬物1.蛋白質(zhì)2.化學(xué)藥品C. 物種變異體V.抗體A. 多克隆抗體B. 單克隆抗體C. 片段、結(jié)合組合物VI. 核酸A. 天然分離物；方法B. 合成基因C. 分離方法VII.制備p40/IL-B30復(fù)合物、模擬物A.重組方法B.合成方法C.天然純化VIII.應(yīng)用A.診斷應(yīng)用B.治療應(yīng)用IX. 試劑盒A.核酸試劑B.蛋白試劑C.抗體試劑X. 分離p40/IL-B30復(fù)合物的受體I.一般描述本發(fā)明提供有關(guān)使哺乳動物蛋白質(zhì)配對以制備可溶性細(xì)胞因子的描述和內(nèi)容，所述可溶性細(xì)胞因子例如可以在免疫細(xì)胞或其它細(xì)胞之間介導(dǎo)信號的分泌型分子。參見例如Paul，(1998)FundamentalImmunology(第4版)，Raven Press，N.Y.。某些可溶性因子由異源二聚體多肽構(gòu)成，例如IL-6和IL-12。有可能是生理學(xué)形式的二聚體形式以及片段或拮抗劑將可用于例如對表達(dá)受體的細(xì)胞進(jìn)行生理調(diào)節(jié)。包含p40/IL-B30復(fù)合物的功能細(xì)胞因子有可能對造血細(xì)胞有或者刺激效應(yīng)或者抑制效應(yīng)，造血細(xì)胞包括例如淋巴樣細(xì)胞，諸如T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、造血祖細(xì)胞等。所述蛋白質(zhì)也可用作抗原，例如免疫原，用于產(chǎn)生針對所述蛋白質(zhì)各種表位(線性表位和構(gòu)象表位)的抗體。
IL-12 p40亞基已有描述。參見例如Seiler等，美國專利5547852；Scott和Trinchieri，美國專利5571515；Gately等，美國專利5650492；Liesehke和Mulligan，美國專利5891680；Warne等，美國專利5744132；和登記號gbM86671、gbAF133197、gbU16674、gbU83184、embY07762、embY11129.1、gbM65272、gbAF007576、gbU19841、gbU11815、gbU57752、gbAF004024、gbU49100、gbU19834和embX97019。從人基因組序列中鑒定出編碼IL-B30的序列。所述分子命名為huIL-B30。嚙齒動物序列例如得自小鼠的序列也有描述。參見例如USSN08/900,905和09/122,443。本發(fā)明包括包含這兩種多肽(例如p40和IL-B30)組合的組合物以及編碼這兩種序列的核酸構(gòu)建體。也提供識別所述組合的抗體以及例如協(xié)同產(chǎn)生所述兩種信息或多肽的方法。
人IL-B30基因編碼一種小的具有約198個氨基酸的可溶性細(xì)胞因子樣蛋白質(zhì)。所述psort預(yù)測的信號序列可能是大約17個殘基，可能從Met至大約Ala。參見表1和SEQ.ID.NO1和2。IL-B30表現(xiàn)出長鏈細(xì)胞因子成員特征性的結(jié)構(gòu)基序。比較可得自GenBank的序列，例如IL-B30、G-CSF和IL-6。也參見USSN 08/900,905和09/122,443。表1得自靈長類(例如人)的編碼IL-B30的核酸(SEQ ID NO1)。翻譯的氨基酸序列為SEQ ID NO2。ATG CTG GGG AGC AGA GCT GTA ATG CTG CTG TTG CTG CTG CCC TGG ACA 48Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr-21 -20 -15 -10GCT CAG GGC AGA GCT GTG CCT GGG GGC AGC AGC CCT GCC TGG ACT CAG 96Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln-5 1 5 10TGC CAG CAG CTT TCA CAG AAG CTC TGC ACA CTG GCC TGG AGT GCA CAT144Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His15 20 25CCA CTA GTG GGA CAC ATG GAT CTA AGA GAA GAG GGA GAT GAA GAG ACT192Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr30 35 40ACA AAT GAT GTT CCC CAT ATC CAG TGT GGA GAT GGC TGT GAC CCC CAA240Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln45 50 55GGA CTC AGG GAC AAC AGT CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CAC CAG GGT288Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly60 65 70 75CTG ATT TTT TAT GAG AAG CTG CTA GGA TCG GAT ATT TTC ACA GGG GAG336Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu80 85 90CCT TCT CTG CTC CCT GAT AGC CCT GTG GCG CAG CTT CAT GCC TCC CTA384Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu95 100 105CTG GGC CTC AGC CAA CTC CTG CAG CCT GAG GGT CAC CAC TGG GAG ACT432Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr110 115 120CAG CAG ATT CCA AGC CTC AGT CCC AGC CAG CCA TGG CAG CGT CTC CTT480Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu125 130 135CTC CGC TTC AAA ATC CTT CGC AGC CTC CAG GCC TTT GTG GCT GTA GCC528Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala140 145 150 155GCC CGG GTC TTT GCC CAT GGA GCA GCA ACC CTG AGT CCC TAA 570Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro160 165MLGSRAVMLLLLLPWTAQGRAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVAQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP編碼序列ATGCTGGGGA GCAGAGCTGT AATGCTGCTG TTGCTGCTGC CCTGGACAGCTCAGGGCAGA GCTGTGCCTG GGGGCAGCAG CCCTGCCTGG ACTCAGTGCCAGCAGCTTTC ACAGAAGCTC TGCACACTGG CCTGGAGTGC ACATCCACTAGTGGGACACA TGGATCTAAG AGAAGAGGGA GATGAAGAGA CTACAAATGATGTTCCCCAT ATCCAGTGTG GAGATGGCTG TGACCCCCAA GGACTCAGGGACAACAGTCA GTTCTGCTTG CAAAGGATCC ACCAGGGTCT GATTTTTTATGAGAAGCTGC TAGGATCGGA TATTTTCACA GGGGAGCCTT CTCTGCTCCCTGATAGCCCT GTGGCGCAGC TTCATGCCTC CCTACTGGGC CTCAGCCAACTCCTGCAGCC TGAGGGTCAC CACTGGGAGA CTCAGCAGAT TCCAAGCCTCAGTCCCAGCC AGCCATGGCA GCGTCTCCTT CTCCGCTTCA AAATCCTTCGCAGCCTCCAG GCCTTTGTGG CTGTAGCCGC CCGGGTCTTT GCCCATGGAGCAGCAACCCT GAGTCCCTAA嚙齒動物(例如小鼠)的IL-B30(SEQ ID NO3和4)CGCTTAGAAG TCGGACTACA GAGTTAGACT CAGAACCAAA GGAGGTGGAT AGGGGGTCCA 60CAGGCCTGGT GCAGATCACA GAGCCAGCCA GATCTGAGAA GCAGGGAACA AG ATG 115Met-21CTG GAT TGC AGA GCA GTA ATA ATG CTA TGG CTG TTG CCC TGG GTC ACT163Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val Thr-20 -15 -10 -5CAG GGC CTG GCT GTG CCT AGG AGT AGC AGT CCT GAC TGG GCT CAG TGC211Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln Cys1 5 10CAG CAG CTC TCT CGG AAT CTC TGC ATG CTA GCC TGG AAC GCA CAT GCA259Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His Ala15 20 25CCA GCG GGA CAT ATG AAT CTA CTA AGA GAA GAA GAG GAT GAA GAG ACT307Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu Thr30 35 40AAA AAT AAT GTG CCC CGT ATC CAG TGT GAA GAT GGT TGT GAC CCA CAA355Lys Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro Gln45 50 55 60GGA CTC AAG GAC AAC AGC CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CGC CAA GGT403Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln Gly65 70 75CTG GCT TTT TAT AAG CAC CTG CTT GAC TCT GAC ATC TTC AAA GGG GAG451Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly Glu80 85 90CCT GCT CTA CTC CCT GAT AGC CCC ATG GAG CAA CTT CAC ACC TCC CTA 499Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser Leu95 100 105CTA GGA CTC AGC CAA CTC CTC CAG CCA GAG GAT CAC CCC CGG GAG ACC 547Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr110 115 120CAA CAG ATG CCC AGC CTG AGT TCT AGT CAG CAG TGG CAG CGC CCC CTT 595Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro Leu125 130 135 140CTC CGT TCC AAG ATC CTT CGA AGC CTC CAG GCC TTT TTG GCC ATA GCT 643Leu Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile Ala145 150 155GCC CGG GTC TTT GCC CAC GGA GCA GCA ACT CTG ACT GAG CCC TTA GTG 691Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val160 165 170CCA ACA GCT TAAGGATGCC CAGGTTCCCA TGGCTACCAT GATAAGACTA 740Pro Thr Ala175ATCTATCAGC CCAGACATCT ACCAGTTAAT TAACCCATTA GGACTTGTGC TGTTCTTGTT 800TCGTTTGTTT TGCGTGAAGG GCAAGGACAC CATTATTAAA GAGAAAAGAA ACAAACCCCA 860GAGCAGGCAG CTGGCTAGAG AAAGGAGCTG GAGAAGAAGA ATAAAGTCTC GAGCCCTTGG 920CCTTGGAAGC GGGCAAGCAG CTGCGTGGCC TGAGGGGAAG GGGGCGGTGG CATCGAGAAA 980CTGTGAGAAA ACCCAGAGCA TCAGAAAAAG TGAGCCCAGG CTTTGGCCAT TATCTGTAAG1040AAAAACAAGA AAAGGGGAAC ATTATACTTT CCTGGGTGGC TCAGGGAAAT GTGCAGATGC1100ACAGTACTCC AGACAGCAGC TCTGTACCTG CCTGCTCTGT CCCTCAGTTC TAACAGAATC1160TAGTCACTAA GAACTAACAG GACTACCAAT ACGAACTGAC AAA 1203MLDCRAVIMLWLLPWVTQGLAVPRSSSPDWAQCQQLSRNLCMLAWNAHAPAGHMNLLREEEDEETKNNVPRIQCEDGCDPQGLKDNSQFCLQRIRQGLAFYKHLLDSDIFKGEPALLPDSPMEQLHTSLLGLSQLLQPEDHPRETQQMPSLSSSQQWQRPLLRSKILRSLQAFLAIAARVFAHGAATLTEPLVPTAIL-B30與相關(guān)細(xì)胞因子蛋白的結(jié)構(gòu)同源性提示這種分子的相關(guān)功能。然而，對于IL-12 p40多肽與IL-B30多肽相關(guān)性的鑒別使得可以對活性p40/IL-B30二聚體進(jìn)行生物測定。IL-12 p40/IL-B30組合物可以或者由代表每種多肽的不同多肽構(gòu)成，或者由IL-12 p40與IL-B30的融合構(gòu)建體構(gòu)成。觀察表明，所述二聚體能夠誘導(dǎo)各種細(xì)胞類型(例如PBMC)產(chǎn)生干擾素-γ(IFNγ)，提示了將使用的二聚體的生物學(xué)功能。此外，實驗表明，IL-12受體β1亞基是p40/IL-B30二聚體受體的一種組分。
IFNγ激活巨噬細(xì)胞，刺激殺腫瘤活性和殺微生物活性。它也調(diào)節(jié)I類和II類MHC分子的表達(dá)，包括正調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及樹突細(xì)胞上的II類分子，以及誘導(dǎo)表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和其它細(xì)胞上的表達(dá)，使得它們能夠呈遞抗原。所述細(xì)胞因子是Th1樣細(xì)胞因子，它促進(jìn)Th1樣CD4+T細(xì)胞的發(fā)育，但抑制Th2樣T細(xì)胞的發(fā)育。它是一種對IL-4誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞合成IgE和IgG4的強(qiáng)有力的相對特異性的抑制劑，雖然在較高濃度下它非特異性的抑制所有抗體同種型的產(chǎn)生。IFNγ增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL介導(dǎo)的針對細(xì)胞內(nèi)生物和腫瘤的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答。同IL-12一樣，IFNγ傾向于促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性應(yīng)答，而抑制過敏性炎癥和IgE的合成。參見例如Karupiah，(1997編輯)Gamma Interferon in Antiviral DefenseChapman和Hall；Jaffe，(1992編輯)Anti-Infective Applications of Interferon-GammaMarcel Dekker (ISBN0824786882)；Sutterwala等，(1999)J.Leukoc.Biol.65543-551；Billiau等，(1998)Ann.NY Acad.Sci.85622-32；和Gessani等，(1998)CytokineGrowth Factor Rev.9117-123。
IL-B30激動劑或拮抗劑也可以用作功能拮抗劑或受體拮抗劑，例如它們阻斷IL-6或IL-12與其相應(yīng)受體的結(jié)合，或介導(dǎo)相反的作用。因此，IL-B30及其拮抗劑可以用于治療異常醫(yī)學(xué)病癥，包括免疫失調(diào)，例如T細(xì)胞免疫缺陷、慢性炎癥或組織排斥，或用于心血管病癥或神經(jīng)生理學(xué)病癥。激動劑有可能用于增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)免疫的治療方面，例如用于抗腫瘤、輔助劑(adjuvant)和抗病毒情況，或拮抗過敏反應(yīng)。拮抗劑有可能用于阻斷這類增強(qiáng)的免疫，例如用于細(xì)胞引起自身免疫病或慢性炎癥的情況下。
天然抗原能夠介導(dǎo)導(dǎo)致靶細(xì)胞中生物應(yīng)答或生理應(yīng)答的各種生物化學(xué)應(yīng)答。優(yōu)選的實施方案可能來自人類，但在自然界中存在其它靈長類或其它物種的對應(yīng)物。其它哺乳動物物種(例如靈長類、犬科動物、貓科動物和嚙齒動物)中的其它蛋白質(zhì)的序列也應(yīng)該可利用。
特別是，已經(jīng)證實了IL-12 p40亞基與IL-B30的相關(guān)性。IL-12 p40分子和IL-B30分子應(yīng)該是一起進(jìn)化的。假如這兩種分子在功能上相關(guān)，則它們可能以IL-12的方式一起作用。參見例如Trinchieri(1998)Adv.Immunol.7083-243；Gately等，(1998)Ann.Rev.Immunol.16495-521；和Trinchieri(1998)Int.Rev.Immunol.16365-396。
然而，作為復(fù)合物，預(yù)期所述復(fù)合物與該細(xì)胞因子受體家族的兩個tall信號受體相互作用。這在IL-12受體亞基β1的情況下已得到證實。可以測試其它相關(guān)受體與所述可溶性復(fù)合物的結(jié)合。已經(jīng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)各種這些能夠進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的tall受體的一系列細(xì)胞，例如BAF/3。
IL-12 p40和IL-B30(或單一的組合構(gòu)建體)在同一細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染子的上清液，用來測試這些不同細(xì)胞，以觀察是否有增殖性應(yīng)答或其它信號應(yīng)答。就這一點而論，所述細(xì)胞因子的大多數(shù)生理效應(yīng)可能是由于所述蛋白質(zhì)的復(fù)合物所致。因此，以下有關(guān)由所述細(xì)胞因子引起的生物學(xué)描述中的許多，可能實際上是包含所述亞基組合的復(fù)合物在生理上實現(xiàn)的。
以下的描述也適用于IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物。構(gòu)建了IL-12 p40亞基與所述IL-B30的融合體，例如超IL-6(hyper IL-6)。參見例如Fischer等，(1997)Nature Biotechnol.15142-145；Rakemann等，(1999)J Biol. Chem.2741257-1266；和Peters等，(1998)J.Immunol.1613575-3581；所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。此外，所述細(xì)胞因子復(fù)合物與包含IL-12受體亞基β1的受體的匹配，使得可以將抗該亞基的抗體鑒定為所述細(xì)胞因子復(fù)合物受體的拮抗劑。II.純化的p40/IL-B30復(fù)合物人IL-B30的氨基酸序列作為一個實施方案示于SEQ ID NO2中?？梢杂貌捎盟峁┑男蛄械臉?biāo)準(zhǔn)方法，例如PCR技術(shù)或通過雜交，分離其它天然存在的編碼該蛋白的核酸。在提供所述細(xì)胞因子亞基的序列信息以便于鑒別該蛋白抗原與其它蛋白并例舉多種變異體方面，這些從氨基至羧基提供的氨基酸序列是重要的。此外，所述肽序列使得可以制備肽，以產(chǎn)生識別區(qū)段的抗體，而核苷酸序列使得可以制備寡核苷酸探針，這兩種都是用于檢測或分離例如克隆編碼這種序列的基因的策略。
當(dāng)用于蛋白質(zhì)方面時，本文所用的術(shù)語“人可溶性IL-B30”’將包括其氨基酸序列相應(yīng)于得自SEQ ID NO2的可溶性多肽的蛋白質(zhì)。其有效片段(significant fragment)通常保留相似的功能，例如抗原性。優(yōu)選實施方案包括特定長度的多個不同的(例如非重疊)區(qū)段。通常，所述多個為至少2個、更通常為至少3個、優(yōu)選5個、7個或甚至更多個。盡管可以列舉最小的長度，但更長的各種大小的長度也可能是合適的，例如一個7個氨基酸長度的區(qū)段和兩個12個氨基酸長度的區(qū)段。相似的特征適用于IL-12 p40多肽，也適用于任一種或這兩種的多核苷酸。
例如抗體的結(jié)合組分通常以高親和性與IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物結(jié)合，所述高親和性例如至少約100nM，通常優(yōu)于約30nM，優(yōu)選優(yōu)于約10nM，更優(yōu)選優(yōu)于約3nM。在非人類的哺乳動物物種(例如其它靈長類、有蹄類動物或嚙齒動物)中會發(fā)現(xiàn)相應(yīng)蛋白(counterpart protein)復(fù)合物。例如鳥類或兩棲類的非哺乳動物物種也應(yīng)該具有結(jié)構(gòu)上或功能上相關(guān)的基因和蛋白。
本文所用的術(shù)語“多肽”包括有效片段或區(qū)段，包括一段至少約8個氨基酸的氨基酸殘基序列段，一般至少約12個氨基酸，通常至少約16個氨基酸，優(yōu)選至少約20個氨基酸，在特別優(yōu)選的實施方案中，為至少約30個或30個以上的氨基酸，例如35、40、45、50個氨基酸等。在或者所述IL-B30或IL-12 p40亞基的所有實際的組合中，這類片段可以具有實際上在所有位置開始和/或結(jié)束的末端，例如于殘基1、2、3等開始，和于例如殘基175、174、173等結(jié)束。特別感興趣的肽具有相應(yīng)于結(jié)構(gòu)域邊界的末端，例如所述IL-B30的螺旋A、B、C和/或D或IL-12 p40的Ig結(jié)構(gòu)域。參見下文。
術(shù)語“結(jié)合組合物”是指與IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物特異性地結(jié)合(例如在抗體-抗原相互作用中)、但不與單獨的所述各個組分特異性結(jié)合的分子。特異性的范圍可以更寬或更窄，例如對特定實施方案具有特異性，或?qū)?shù)組相關(guān)實施方案具有特異性，例如對靈長類、嚙齒動物具有特異性等。耗竭或吸收可以提供所需的選擇性，例如以耗竭與單獨的任一種多肽組分結(jié)合的抗體。也提供了與IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物特異性締合(associate)(或者共價或者非共價的)的化合物，例如蛋白質(zhì)，包括在天然生理相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的特異性締合。所述分子可以是聚合物或化學(xué)試劑。功能類似物可以是具有結(jié)構(gòu)修飾的蛋白質(zhì)，或者它可以是具有與所述合適結(jié)合決定簇相互作用的分子形狀的分子。所述化合物可以用作受體結(jié)合相互作用的激動劑或拮抗劑，參見例如Goodman等(編輯)，Goodman & Gilman’sThePharmacological Bases of Therapeutics(當(dāng)前版)Pergamon Press。
例如在蛋白質(zhì)方面，大致純通常是指該蛋白沒有其它污染蛋白、核酸或來源于所述原始來源生物的其它生物物質(zhì)?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)方法，通常根據(jù)重量分析純度，純度通常為至少約40％，一般至少約50％，常常至少約60％，通常至少約80％，優(yōu)選至少約90％，在最優(yōu)選實施方案中，純度至少約95％。通常加入載體或賦形劑。包含大致純的IL-12p40和IL-B30的組合物將不具有大量的天然與所述兩種多肽的復(fù)合物不相連的外來多肽。
多肽或片段的溶解性取決于環(huán)境和所述多肽。許多參數(shù)影響多肽的溶解性，包括溫度、電解質(zhì)環(huán)境、所述多肽的大小和分子特征以及所述溶劑的性質(zhì)。通常，使用所述多肽的溫度范圍為約4℃至約65℃。使用時的溫度常常高于約18℃。對于診斷目的，所述溫度通常約為室溫或更高的溫度，但低于該測定中組分的變性溫度。對于治療目的，所述溫度常常為體溫，對于人和小鼠而言通常為約37℃，盡管在某些情況下，在原位或體外所述溫度可以升高或降低。
所述多肽的大小和結(jié)構(gòu)應(yīng)該一般為大致穩(wěn)定狀態(tài)，通常不是變性狀態(tài)。在四級結(jié)構(gòu)中所述多肽可以與其它多肽結(jié)合，例如以賦予溶解性，或與脂質(zhì)或去污劑結(jié)合。特別是，優(yōu)選由所述兩種多肽結(jié)合構(gòu)成的復(fù)合物，如融合組合物。
所述溶劑和電解質(zhì)通常是為保存生物活性所用類型的生物相容的緩沖液，通常接近生理水性溶劑。所述溶劑常常具有中性pH，通常為約5和10之間，最好為約7.5。在某些情況下，加入一種或多種去污劑，通常為溫和的非變性去污劑，例如CHS(膽固醇半琥珀酸酯(cholesteryl hemisuccinate))或CHAPS(3-[3-膽酰氨基丙基)二甲銨基]-1-丙磺酸鹽(3-[3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate))，或去污劑的濃度足夠低，以致避免顯著破壞所述蛋白的結(jié)構(gòu)或生理特性。在其它情況下，可以使用強(qiáng)去污劑實現(xiàn)顯著變性。
通常在免疫測定中測定與針對限定免疫原產(chǎn)生的抗體(例如多克隆抗體)特異性結(jié)合或特異性免疫反應(yīng)的IL-B30多肽，所述限定免疫原例如由SEQ ID NO2或其片段的氨基酸序列組成的免疫原、或由SEQ ID NO1產(chǎn)生的多肽。在本發(fā)明的范圍中包括本文描述的那些核酸序列，包括功能變異體，所述核酸序列編碼與針對本文在結(jié)構(gòu)和功能上限定的原型IL-B30多肽產(chǎn)生的多克隆抗體選擇性結(jié)合的多肽。所述免疫測定通常使用針對例如含SEQ ID NO2蛋白的復(fù)合物產(chǎn)生的多克隆抗血清。選擇或耗竭這種抗血清，以便使其對合適的其它密切相關(guān)家族成員(最好是得自同一物種的)的交叉反應(yīng)性低，并且在用于免疫測定之前通過免疫吸收或耗竭，除去任何這類交叉反應(yīng)性。特別是，與單獨的IL-12 p40或IL-B30多肽結(jié)合的抗體是免疫耗竭的靶。也可以分離和鑒定合適的選擇性血清制劑。
為了產(chǎn)生用于免疫測定的抗血清，如本文所述分離出包含所述蛋白質(zhì)(例如SEQ ID NO2的蛋白質(zhì))的復(fù)合物(compls)。例如，可以在哺乳動物細(xì)胞系中產(chǎn)生重組蛋白。用包含SEQ ID NO2蛋白的復(fù)合物，采用標(biāo)準(zhǔn)佐劑例如弗氏佐劑和標(biāo)準(zhǔn)的小鼠免疫方案(參見Harlow和Lane)，免疫合適的宿主，例如小鼠近交品系，如Balb/c?；蛘撸梢詫⒀苌员疚乃_序列的基本全長的合成肽構(gòu)建體用作免疫原。收集多克隆血清，并且在免疫測定中測定針對所述免疫原蛋白的效價，所述免疫測定例如用在固相支持體上固定化的所述免疫原的固相免疫測定，以及進(jìn)行合適的耗竭或選擇。選擇效價為104或更高的多克隆抗血清，并且用競爭性結(jié)合免疫測定，例如Harlow和lane(參見上文，第570-573頁)中描述的競爭性結(jié)合免疫測定，測試其針對其它密切相關(guān)家族成員(例如LIF、CT-1、CNTF)或IL-6家族其它成員的交叉反應(yīng)性。最好是在這種測定中結(jié)合所述靶使用至少兩種個別IL-6/IL-12家族成員。這些長鏈細(xì)胞因子家族成員可以作為重組蛋白產(chǎn)生，并且用本文所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)將其分離。因此，可以鑒定并產(chǎn)生對IL-12 p40/IL-B30家族成員亞類具有所需選擇性或特異性的抗體制劑?；蛘?，可以制備與包含所述IL-12 p40和IL-B30的復(fù)合物的融合多肽形式結(jié)合的抗體。
競爭性結(jié)合形式的免疫測定可以用于交叉反應(yīng)性的測定。例如，可以將所述融合蛋白固定化至固相支持體上。加入到所述測定中的蛋白質(zhì)與所述選擇性抗血清競爭與固定化抗原的結(jié)合。將上述蛋白質(zhì)與所述選擇性抗血清競爭與所述固定化蛋白結(jié)合的能力與所述融合蛋白的能力進(jìn)行比較。采用標(biāo)準(zhǔn)計算法，計算上述蛋白的交叉反應(yīng)性百分比。選擇并合并與上文所列每種蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性低于10％的那些抗血清。然后，通過用以上所列蛋白進(jìn)行免疫吸收，從合并的抗血清中除去所述交叉反應(yīng)性選擇性抗體。
經(jīng)免疫吸收和合并的抗血清然后如上文所述用于競爭性結(jié)合免疫測定中，以比較第二種蛋白質(zhì)與所述免疫原融合蛋白。為了進(jìn)行這種比較，將兩種蛋白質(zhì)在寬范圍的濃度下分別進(jìn)行測定，測定每種蛋白質(zhì)抑制50％的所述選擇性抗血清與固定化融合蛋白結(jié)合所需的量。如果第二種蛋白質(zhì)的所需量低于融合蛋白所需量的2倍，則認(rèn)為第二種蛋白質(zhì)與針對所述免疫原產(chǎn)生的選擇性抗體特異性地結(jié)合。III.物理變異體本發(fā)明也包括包含蛋白質(zhì)或肽的復(fù)合物，所述蛋白質(zhì)或肽與IL-12p40/IL-B30抗原的氨基酸序列具有大致氨基酸序列同一性。所述變異體包括物種變異體、多態(tài)變異體或等位基因變異體。
通過使殘基匹配最優(yōu)化，必要時，根據(jù)需要引入空位，測定氨基酸序列的同源性或序列同一性。也參見Needleham等(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff等，(1983)Time Warps，String Edits，andMacromolecules；The Theory and Practice of Sequence Comparison的第1章，Addison-Wesley，Reading，MA；和IntelliGenetics(Mountain View，CA)的軟件包；和the University of Wisconsin Genetics Computer Group(Madison，WI)的軟件包。當(dāng)將保守取代認(rèn)為是匹配時，序列同一性會有所變化。保守取代通常包括以下組內(nèi)的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。保守性可以應(yīng)用于生物學(xué)特征、功能特征或結(jié)構(gòu)特征。同源的氨基酸序列通常計劃包括蛋白質(zhì)序列中的天然多態(tài)或等位基因變異和種間變異。典型的同源蛋白或肽與所述IL-B30的氨基酸序列的同一性將從25-100％(如果可以引入空位)至50-100％(如果包括保守取代)。同一性的測量結(jié)果將至少為約35％，一般至少為約40％，常常至少為約50％，典型的至少為約60％，通常至少為約70％，優(yōu)選至少為約80％，而更優(yōu)選至少為約90％。
通過核苷酸置換、核苷酸缺失、核苷酸插入和短的核苷酸序列段倒位，可以容易地修飾分離的IL-12 p40或IL-B30 DNA。這些修飾產(chǎn)生編碼這些抗原、其衍生物或具有相似生理、免疫原性、抗原性或其它功能活性的蛋白質(zhì)的新的DNA序列。這些經(jīng)修飾的序列可以用來產(chǎn)生突變抗原，或增強(qiáng)表達(dá)。增強(qiáng)的表達(dá)可以包括基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄增加、翻譯增加和其它機(jī)制?！巴蛔僆L-B30”包括這樣的多肽，它們在其它方面屬于以上提出的IL-B30的序列同一性定義內(nèi)，但其氨基酸序列無論由于缺失、置換，還是由于插入，均不同于通常在自然界中發(fā)現(xiàn)的IL-B30的氨基酸序列。這通常包括與具有SEQ ID NO2序列的蛋白質(zhì)具有顯著同一性、并且與那些序列享有各種生物活性(例如抗原性或免疫原性)的蛋白質(zhì)，在優(yōu)選實施方案中，包含所公開的天然全長序列的大部分。通常最好使用全長序列，盡管截短的變體也是有用的，同樣，通常最需要從天然來源發(fā)現(xiàn)的基因或蛋白。相似的概念適用于不同的IL-B30蛋白，特別是在各種溫血動物(例如哺乳動物和鳥類)中發(fā)現(xiàn)的那些IL-B30蛋白。這些描述一般是指包括各種IL-B30蛋白，但不限于具體論述的特定的靈長類實施方案。
也可以通過插入或缺失氨基酸，進(jìn)行IL-12 p40或IL-B30誘變。可以產(chǎn)生置換、缺失、插入或任何組合，以得到最終的構(gòu)建體。插入包括氨基末端或羧基末端的融合?？梢杂诎忻艽a子進(jìn)行隨機(jī)誘變，然后對所表達(dá)的突變體篩選所需活性。于序列已知的DNA的預(yù)定位點制備置換突變的方法是本領(lǐng)域眾所周知，例如通過M13引物誘變或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。參見例如Sambrook等(1989)；Ausubel等(1987和增補(bǔ)本)；和Kunkel等(1987)Methods in Enzymol.154367-382。優(yōu)選實施方案包括例如1重、2重、3重、5重、7重置換等，最好是核苷酸水平或氨基酸水平的保守置換。所述置換最好遠(yuǎn)離保守的半胱氨酸，通常在遠(yuǎn)離螺旋結(jié)構(gòu)域的區(qū)域中。這種變異體可以用來產(chǎn)生特異性抗體，并且通常享有許多或所有生物學(xué)特性。對所述細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)的識別提供了對于可以被修飾以實現(xiàn)受體相互作用中所需變化的殘基的結(jié)構(gòu)和位置的重要的了解。此外，IL-12 p40與IL-B30蛋白的相互作用需要在相互作用表面中的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)特性。結(jié)構(gòu)分析將進(jìn)一步提供對在復(fù)合物形成以及復(fù)合物與受體相互作用中關(guān)鍵性的表面殘基的預(yù)測。
本發(fā)明也提供重組蛋白，例如采用這些蛋白區(qū)段的異源融合蛋白。異源融合蛋白是天然情況下通常不以同一方式融合的蛋白或區(qū)段的融合體。相似的概念適用于異源核酸序列。
另外，可以組合來自其它蛋白的相似的功能域而制備新的構(gòu)建體。例如，可以在不同的新融合多肽或片段之間“交換”靶結(jié)合區(qū)段或其它區(qū)段。參見例如Cunningham等(1989)Science2431330-1336；和O’Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。
由Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862描述的亞磷酰胺法將產(chǎn)生合適的合成DNA片段?；蛘咄ㄟ^合成互補(bǔ)鏈并使所述鏈在合適的條件下一起退火，或者通過用DNA聚合酶與合適的引物序列，加入互補(bǔ)鏈(例如PCR技術(shù))，通?？色@得雙鏈片段。
在與細(xì)胞因子IL-6家族的比較中，可以將結(jié)構(gòu)分析應(yīng)用于該基因。該家族包括例如IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF、OSM、CNTF和Ob。人和小鼠IL-B30序列與IL-6家族其它成員的序列比對應(yīng)該使得能夠定義結(jié)構(gòu)特性。特別是，可以用例如RASMOL程序確定β-折疊和α-螺旋殘基，參見Bazan等(1996)Nature379591；Lodi等(1994)Science2631762-1766；Sayle和Milner-White(1995)TIBS20374-376；和Gronenberg等(1991)Protein Engineering4263-269。也參見Wilkins等，(1997編輯)Proteome ResearchNew Frontiers inFunctional GenomicsSpringer-Verlay NY。用于置換的優(yōu)選殘基包括預(yù)測與受體相互作用的表面暴露的殘基。應(yīng)該保留功能的其它殘基將是保守置換，特別是對于遠(yuǎn)離表面暴露殘基的位置。IV.功能變異體對IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物的生理反應(yīng)的阻斷，可以是由于競爭性抑制所述配體與其受體的結(jié)合所致。所述受體的一個亞基的鑒定便于進(jìn)一步鑒定(如已描述的)抗所述亞基的抗體以及應(yīng)用所述抗體以阻斷與所述復(fù)合物的結(jié)合和/或信號。
本發(fā)明的體外測定通常使用分離的復(fù)合物、蛋白質(zhì)、包含這些蛋白的受體結(jié)合區(qū)段的可溶性片段、或連接至固相基質(zhì)的片段。這些測定也將使得可以對或者結(jié)合區(qū)段突變和修飾、或者細(xì)胞因子突變和修飾(例如IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物類似物)的效應(yīng)進(jìn)行診斷測定。
本發(fā)明也設(shè)想了使用競爭性藥物篩選測定，例如其中抗所述細(xì)胞因子復(fù)合物的中和抗體或受體結(jié)合片段與測試化合物競爭。
IL-12 p40/IL-B30抗原的“衍生物”包括天然存在形式的氨基酸序列突變體、糖基化變異體、以及與其它化學(xué)部分的共價或聚集綴合物。例如通過采用標(biāo)準(zhǔn)方法將官能團(tuán)(functionality)與在IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物氨基酸側(cè)鏈或于N末端或C末端發(fā)現(xiàn)的基團(tuán)連接，可以制備共價衍生物。參見例如Lundblad和Noyes(1 988)Chemical Reagents forProtein Modification，第1-2卷，CRC Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L；Hugli(1989編輯)Techniques in Protein Chemistry，Academic Press，San Diego，CA；和Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L。
具體地說，糖基化改變包括例如通過在多肽合成和加工期間、或在進(jìn)一步加工步驟中修飾多肽糖基化模式而造成的糖基化改變。參見例如Elbein(1987)Ann.Rev.Biochem.56497-534。也包括具有相同一級氨基酸序列、具有其它微小修飾的肽形式，所述微小修飾包括磷酸化氨基酸殘基，例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。
也提供所述IL-12 p40和IL-B30之間的融合多肽。許多細(xì)胞因子受體或其它表面蛋白是多聚體的，例如同二聚體實體，重復(fù)構(gòu)建體可能具有各種優(yōu)點，包括減輕對蛋白酶剪切的敏感性。典型的實例是報道多肽(例如熒光素酶)與蛋白區(qū)段或結(jié)構(gòu)域(例如受體結(jié)合區(qū)段)的融合體，使得可以容易地確定所述融合配體的存在或位置。參見例如Dull等的美國專利第4,859,609號。其它基因融合配偶體包括細(xì)菌β-半乳糖苷酶、trpE、A蛋白、β-內(nèi)酰胺酶、α淀粉酶、乙醇脫氫酶、酵母α交配因子和檢測或純化標(biāo)記，諸如His6序列的FLAG序列。參見例如Godowski等(1988)Science241812-816。也提供與其它治療實體的融合構(gòu)建體，所述其它治療實體例如待共同給予的、但可被蛋白酶剪切的治療實體。
融合肽通常通過或者重組核酸法或通過合成多肽法制備。用于核酸操作和表達(dá)的技術(shù)一般描述于例如Sambrook等(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory；和Ausubel等(1993編輯)Current Protocols in MolecularBiology，Greene and Wiley，NY。用于多肽合成的技術(shù)描述于例如Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.852149-2156；Merrifield(1986)Science232341-347；Atherton等(1989)Solid Phase Peptide SynthesisAPractical Approach，IRL Press，Oxford；和Grant(1992)Synthetic PeptidesA User’s Guide，W.H.Freeman，NY。可以將重折疊方法應(yīng)用于合成蛋白。
本發(fā)明也設(shè)計了氨基酸序列改變或糖基化改變以外的IL-12 p40或IL-B30蛋白衍生物的應(yīng)用。這類衍生物可以包括與化學(xué)部分或蛋白載體的共價或聚集綴合物。共價或聚集衍生物可用作免疫原、免疫測定中的試劑，或用于諸如親和純化結(jié)合配偶體(例如其它抗原)的純化方法中。通過用本領(lǐng)域熟知的方法將IL-12 p40或IL-B30共價結(jié)合于諸如溴化氰活化的SEPHAROSE的固相支持體，或通過采用或不采用戊二醛交聯(lián)而將其吸附至聚烯烴表面上，可以將IL-12 p40或IL-B30固定化，以用于抗IL-12 p40或IL-B30抗體或替代的結(jié)合組合物的測定或純化。所述IL-12 p40、IL-B30或融合蛋白也可以用可檢測基團(tuán)標(biāo)記，例如用于診斷測定。通過將或者針對多肽或序列組分或互補(bǔ)結(jié)合配偶體(例如受體的結(jié)合部分)的抗體固定化，可以實現(xiàn)IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物的純化。
本發(fā)明的溶解的IL-12 p40/IL-B30多肽或片段可以用作免疫原，用于產(chǎn)生特異性結(jié)合的抗血清或抗體。經(jīng)純化的抗原可以用來篩選單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，包括天然抗體的抗原結(jié)合片段，例如Fab、Fab’、F(ab)2等。經(jīng)純化的IL-12 p40/IL-B30抗原也可以用作試劑，以檢測對存在水平提高的所述細(xì)胞因子復(fù)合物應(yīng)答而產(chǎn)生的抗體，所述細(xì)胞因子復(fù)合物可以是異?；蛱囟ǖ纳韺W(xué)病癥或疾病病癥的診斷性指示物(diagnostic)。本發(fā)明考慮了針對SEQ ID NO1所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列或含所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)片段而產(chǎn)生的抗體。特別是，本發(fā)明考慮了對特定結(jié)構(gòu)域(例如所述IL-B30的螺旋A、B、C或D、或IL-12 p40的Ig結(jié)構(gòu)域)具有結(jié)合親和性的抗體或針對所述特定結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的抗體。
本發(fā)明考慮了其它密切相關(guān)物種變異體的分離。DNA印跡分析和RNA印跡分析將確立相似的遺傳實體存在于其它哺乳動物中。有可能IL-B30廣布于物種變異體中，例如嚙齒動物、兔形目動物、食肉動物、偶蹄類、奇蹄類和靈長類的變異體。
本發(fā)明也提供分離一組相關(guān)抗原的方法，其中所述相關(guān)抗原在結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能方面表現(xiàn)出不同和相似性。所述分子的其它不同物種變異體或多態(tài)變異體的分離和特征鑒定，將大大促進(jìn)所述分子許多生理效應(yīng)的闡明。特別是，本發(fā)明提供用于鑒定不同物種中其它同源遺傳實體的有用探針。
所述分離的基因?qū)⑹沟每梢赞D(zhuǎn)化缺乏IL-B30表達(dá)的細(xì)胞，例如缺乏相應(yīng)蛋白并表現(xiàn)出陰性背景活性的或者物種類型或者細(xì)胞。這應(yīng)該使得可以與未轉(zhuǎn)化對照細(xì)胞相比分析IL-B30的功能。
采用現(xiàn)代分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，特別是比較相關(guān)類別的成員時，剖析影響通過這些抗原介導(dǎo)的各種生理功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件是可能的。參見例如在Cunningham等(1989)Science 2431339-1336中描述的同系物掃描誘變技術(shù)；和O’Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992和Lechleiter等(1990)EMBO J.94381-4390中所用的方法。
胞內(nèi)功能有可能涉及受體信號。然而，蛋白內(nèi)化可以發(fā)生在某些情況下，可能發(fā)生胞內(nèi)組分和細(xì)胞因子之間的相互作用。通過誘變或直接生化方法，例如交聯(lián)或親和法，可以鑒別IL-B30與互作組分相互作用的具體區(qū)段。也可應(yīng)用采用晶體學(xué)方法或其它物理方法的結(jié)構(gòu)分析。對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的進(jìn)一步研究，將包括可以通過親和法或遺傳方法(例如突變體的互補(bǔ)分析)分離的結(jié)合組分的研究。
我們將繼續(xù)對IL-B30表達(dá)和控制的進(jìn)一步研究。與所述抗原結(jié)合的控制元件應(yīng)該表現(xiàn)出有差別的生理、發(fā)育、組織特異性或其它表達(dá)模式。對例如控制元件的上游或下游遺傳區(qū)很感興趣。
對所述IL-B30抗原的結(jié)構(gòu)研究將導(dǎo)致設(shè)計新的抗原，特別是對該分子表現(xiàn)出激動劑或拮抗劑特性的類似物。這可以與先前描述的篩選方法結(jié)合，以分離表現(xiàn)出所需活性譜的抗原。V.抗體可以產(chǎn)生針對其天然存在形式和重組形式的所述p40/IL-B30蛋白各種表位的抗體，所述蛋白包括物種、多態(tài)或等位基因變異體和它們的片段。另外，可以產(chǎn)生針對其活性形式或者無活性形式的IL-B30的抗體，所述IL-B30包括天然形式或變性形式。也考慮了抗獨特型抗體。
通過用所述抗原的預(yù)定片段與免疫原性蛋白的綴合物免疫動物，可以產(chǎn)生針對所述片段的抗體，包括結(jié)合片段和單鏈形式的抗體。從分泌所需抗體的細(xì)胞制備單克隆抗體?？梢愿鶕?jù)與正?；蛉毕菪虸L-B30的結(jié)合來篩選這些抗體，或根據(jù)例如通過受體介導(dǎo)的激動劑或拮抗劑活性進(jìn)行篩選。例如由于抗體立體阻斷與受體的結(jié)合，抗體可以是激動劑或拮抗劑。這些單克隆抗體通常以至少約1mM的KD結(jié)合，其結(jié)合KD更通常至少約300μM，典型的至少約100μM，更典型至少約30μM，優(yōu)選至少約10μM，更優(yōu)選至少約3μM或更好。
本發(fā)明的抗體也可用于診斷應(yīng)用。作為捕獲抗體或非中和抗體，可以根據(jù)其結(jié)合所述抗原而不抑制與受體結(jié)合的能力來篩選所述抗體。作為中和抗體，它們可以用于競爭性結(jié)合測定。它們也可用于檢測或定量測定IL-B30蛋白或其受體。參見例如Chan(1987編輯)ImmunologyA Practical Guide，Academic Press，Orlando，F(xiàn)L；Price和Newman(1991編輯)Principles and Practice of Immunoassay，StocktonPress，N.Y.；和Ngo(1988編輯)Nonisotopic Immunoassay，Plenum Press，N.Y.。交叉吸收或其它試驗將鑒定出表現(xiàn)出不同特異性譜(例如特有的或共享的物種特異性)的抗體。
此外，包括抗原結(jié)合片段在內(nèi)的本發(fā)明抗體可能是有效的拮抗劑，它們與所述抗原結(jié)合，并抑制與例如可能引發(fā)生物學(xué)反應(yīng)的受體的功能結(jié)合。它們也可以用作非中和抗體，可以將其與毒素或放射性核素偶聯(lián)，使得當(dāng)所述抗體與抗原結(jié)合時，殺傷例如在其表面表達(dá)該抗原的細(xì)胞。此外，這些抗體可以或者直接或者借助接頭間接綴合于藥物或其它治療劑，可以實現(xiàn)藥物導(dǎo)向。
抗原片段可以連接至其它物質(zhì)上，特別是連接至多肽，作為待用作免疫原的融合或共價連接的多肽?？乖捌淦慰梢匀诤匣蚬矁r連接至多種免疫原，諸如匙孔血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、破傷風(fēng)類毒素等。有關(guān)制備多克隆抗血清的方法的描述，參見Microbiology，HoeberMedical Division，Harper和Row，1969；Landsteiner(1962)Specificity ofSerological Reactions，Dover Publications，New York；Williams等(1967)Methods in Immunology and Immunochemistry，第1卷，Academic Press，New York；和Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press，NY。
在某些情況下，最好從各種哺乳動物宿主制備單克隆抗體，所述哺乳動物宿主諸如小鼠、嚙齒動物、靈長類、人類等。在例如Stites等(編輯)Basic and Clinical Immunology，(第4版)，Lange MedicalPublications，Los Altos，CA和其中引用的參考文獻(xiàn)；Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(第2版)，Academic Press，New York中；和特別是在Kohler和Milstein(1975)Nature256495-497中(該文獻(xiàn)論述了產(chǎn)生單克隆抗體的一種方法)，可以找到有關(guān)制備這類單克隆抗體的技術(shù)的描述。
其它合適的技術(shù)涉及將淋巴細(xì)胞體外暴露于抗原性多肽，或者暴露于噬菌體或相似載體中抗體文庫的選擇。參見Huse等(1989)“在噬菌體λ中產(chǎn)生免疫球蛋白所有組成組分的大聯(lián)合文庫”，Science2461275-1281；和Ward等(1989)Nature341544-546。本發(fā)明的多肽和抗體可以經(jīng)修飾或不經(jīng)修飾而使用，包括嵌合抗體或人源化抗體。通常通過或者共價或者非共價連接提供可檢測信號的物質(zhì)，標(biāo)記所述多肽和抗體。種類繁多的標(biāo)記和綴合技術(shù)是已知的，并且在科學(xué)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中有廣泛的報道。合適的標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁性微粒等。指出這類標(biāo)記應(yīng)用的專利包括美國專利第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241號。也可以產(chǎn)生重組免疫球蛋白，參見Cabilly的美國專利第4,816,567號；Moore等的美國專利第4,642,334號；和Queen等(1 989)Proc.Natl Acad.Sci.USA8610029-10033。
本發(fā)明的抗體也可以用于分離所述蛋白的親和層析?？梢灾苽淦渲袑⑺隹贵w連接至固相支持體的柱子。參見例如Wilchek等(1984)Meth.Enzymol.1043-55。相反，可以用蛋白質(zhì)耗竭或交叉吸收，以選擇性地制備特異性結(jié)合組合物。
針對每種IL-B30產(chǎn)生的抗體也可以用來產(chǎn)生抗獨特型抗體。這些抗體可用于檢測或診斷與所述相應(yīng)抗原表達(dá)相關(guān)的各種免疫學(xué)病癥。VI.核酸所述肽序列和相關(guān)試劑可用于例如從天然來源檢測、分離或鑒定編碼IL-12 p40和IL-B30兩者的DNA克隆。通常，這可用于從哺乳動物分離基因，相似的方法將適用于分離來自其它物種的基因，所述其它物種例如溫血動物，諸如鳥類和哺乳動物。交叉雜交將使得可以從同一物種分離(例如多態(tài)變異體)或從其它物種分離IL-12 p40或IL-B30。許多不同方法可用來成功地分離合適的核酸克隆。這類基因使得可以構(gòu)建共表達(dá)構(gòu)建體或融合構(gòu)建體。
純化的蛋白或多肽可用于通過標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生抗體，如上所述?？梢詫⒑铣呻幕蚣兓鞍壮蔬f給免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。參見例如Coligan，(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene；和Harlow和Lane，(1989)AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press。
例如，特異性結(jié)合組合物可以用來篩選由表達(dá)IL-12 p40和IL-B30兩者的細(xì)胞系制備的表達(dá)文庫?？梢酝ㄟ^各種染色或免疫熒光方法，進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)的篩選。結(jié)合組合物可以用來親和純化或分選出表達(dá)表面融合蛋白的細(xì)胞。
所述肽區(qū)段也可以用來選擇或鑒定合適的寡核苷酸，以篩選文庫?？梢杂盟鲞z傳密碼選擇可用作篩選探針的合適的寡核苷酸。參見例如GenBank和SEQ ID NO1。與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)結(jié)合，合成寡核苷酸將可用于從文庫選擇正確的克隆?；パa(bǔ)序列也可以用作探針、引物或反義鏈。各種片段應(yīng)該是特別有用的，例如與錨定載體或poly-A互補(bǔ)PCR技術(shù)或與其它肽的互補(bǔ)DNA偶聯(lián)。
本發(fā)明考慮了使用分離的DNA或片段，以編碼相應(yīng)IL-12 p40和IL-B30多肽的生物活性復(fù)合物，特別是缺乏編碼所述序列非翻譯部分的部分。另外，本發(fā)明包括編碼生物活性融合蛋白或多肽、并且能夠在合適條件下與本文所述DNA序列雜交的分離或重組的DNA。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整的抗原或片段，并且具有公開于例如SEQ ID NO2的氨基酸序列，特別是成熟的分泌型多肽。此外，本發(fā)明包括其編碼的蛋白表現(xiàn)出與分泌型IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物具有高度同一性的分離的或重組的DNA或其片段的應(yīng)用。所述分離的DNA可以在5’側(cè)翼和3’側(cè)翼具有相應(yīng)的調(diào)節(jié)序列，例如啟動子、增強(qiáng)子、poly-A添加信號和其它序列?；蛘?，通過將編碼區(qū)段有效連接至異源啟動子，例如通過將啟動子插入內(nèi)源基因上游，可以實現(xiàn)表達(dá)。參見例如Treco等，WO96/294 11或USSN 08/406,030。
“分離的”核酸是基本上與天然伴隨天然序列的其它外來組分(例如來自起源物種的核糖體、聚合酶和/或側(cè)翼基因組序列)分離的核酸，例如RNA、DNA或混合聚合物。該術(shù)語包括已經(jīng)從其天然存在的環(huán)境中取出的核酸序列，包括重組的或克隆的DNA分離物和化學(xué)合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物。大致純的分子包括分離形式的所述分子，例如不同于分離的染色體的分離形式。一般而言，所述核酸在載體或小于約50kb的片段中，所述片段常常小于約30kb，通常小于約10kb，最好小于約6kb。
分離的核酸一般是分子的均一組合物，但在某些實施方案中，將含有少量異質(zhì)性。這種異質(zhì)性通常發(fā)現(xiàn)于所述聚合物末端或?qū)τ谒枭锕δ芑蚧钚圆恢匾牟糠帧?br> “重組的”核酸或者根據(jù)其生產(chǎn)方法或者根據(jù)其結(jié)構(gòu)來定義。根據(jù)其生產(chǎn)方法，重組核酸例如是通過應(yīng)用重組核酸技術(shù)的方法產(chǎn)生的產(chǎn)物，所述重組技術(shù)例如涉及在所述核苷酸序列中人的干涉，通常為人工選擇或人工產(chǎn)生?；蛘?，它可以是通過產(chǎn)生包含天然相互不相鄰的兩種片段的融合體的序列而制備的核酸，但是指排除天然產(chǎn)物，例如天然存在的突變體。因此，例如，包括通過用任何非天然存在的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制備的產(chǎn)物，也包括包含用任何合成寡核苷酸方法所衍生序列的核酸。通常進(jìn)行這樣一種方法，以使一個密碼子被編碼同一種氨基酸或保守氨基酸的豐余密碼子取代，通常同時引入或去除一個序列識別位點。
或者，進(jìn)行該方法，以將所需功能的核酸區(qū)段連接在一起，以產(chǎn)生包括所需功能組合的單一的遺傳實體，其中所述功能組合是未在通?？傻玫降奶烊恍问街邪l(fā)現(xiàn)的組合。限制性酶的識別位點常常是這類人工操作的靶，但可以通過設(shè)計，加入其它位點特異性靶，例如啟動子、DNA復(fù)制位點、調(diào)節(jié)序列、控制序列或其它有用的特征。相似的概念將用于重組(例如融合)多肽。具體包括合成的核酸，它由于遺傳密碼的豐余性而編碼與這些抗原片段相似的多肽；和來自各種不同物種或多態(tài)變異體的序列的融合體。
在核酸方面，有效“片段”是一連續(xù)的區(qū)段，它至少為大約17個核苷酸，一般至少為約22個核苷酸，常常至少為約29個核苷酸，更通常至少約35個核苷酸，典型至少為約41個核苷酸，通常至少為約47個核苷酸，更優(yōu)選至少為約55個核苷酸，在特別優(yōu)選的實施方案中，將至少為約60個或更多個核苷酸，例如67、73、81、89、95個等，包括上百和/或上千個核苷酸。
編碼IL-B30蛋白的DNA對于鑒定編碼相關(guān)或相似蛋白的基因、mRNA和cDNA種類、以及鑒定編碼來自不同物種的同源蛋白的DNA特別有用。在包括靈長類、嚙齒動物、犬科動物、貓科動物和鳥類在內(nèi)的其它物種中會有同系物。各種IL-B30蛋白應(yīng)該是同源的，在本文中包括這些蛋白。然而，如果這些序列的同源性足夠大，則甚至可以在合適條件下采用這些序列，容易地分離與所述抗原進(jìn)化關(guān)系更遙遠(yuǎn)的蛋白。靈長類IL-B30蛋白特別有價值。同IL-12 p40一樣，所述蛋白是所述融合構(gòu)建體或聯(lián)合組合物的主要的靶。
得自基因組序列(例如含有內(nèi)含子)的重組克隆，將可用于轉(zhuǎn)基因研究，包括例如轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和生物，也可以用于基因治療。參見例如Goodnow，(1992)“轉(zhuǎn)基因動物”，Roitt(編輯)Encyclopedia ofImmunology，Academic Press，San Diego，第1502-1504頁；Travis，(1992)Science2561392-1394；Kuhn等，(1991)Science254707-710；Capecchi(1989)Science2441288；Robertson，(1987編輯)Teratocarcinomas andEmbryonic Stem CellsA Practical Approach，IRL Press，Oxford；和Rosenberg，(1992)J.Clinical Oncology10180-199。
在核酸序列比較方面，大致同源性例如同一性是指當(dāng)進(jìn)行比對時，或者所述區(qū)段或者其互補(bǔ)鏈，在插入或缺失適當(dāng)?shù)暮塑账徇M(jìn)行最佳比對時，至少大約50％的核苷酸相同，相同的核苷酸一般至少為約58％，經(jīng)常至少為約65％，常常至少為約71％，典型至少為約77％，通常至少為大約85％，優(yōu)選至少為大約95％至98％或更多，而在特定實施方案中，高達(dá)大約99％或更多的核苷酸相同?；蛘?，當(dāng)所述區(qū)段在選擇性雜交條件下與一條鏈或其互補(bǔ)鏈雜交時，存在著大致同源性，一般使用IL-12 p40和/或IL-B30的序列，例如SEQ ID NO1中的序列。通常，當(dāng)在一段至少大約30個核苷酸的序列段中有至少大約55％同一性時，將發(fā)生選擇性雜交，優(yōu)選在約25個核苷酸的序列段中同一性至少為大約75％，最優(yōu)選在約20個核苷酸中同一性至少為大約90％。參見Kanehisa，(1984)Nuc.Acids Res.12203-213。如上所述的同一性比較的長度可以為更長的序列段，在某些實施方案中為一段至少為大約17個核苷酸、一般至少為大約28個核苷酸、通常至少為大約40個核苷酸、優(yōu)選至少為大約75-100個或更多的核苷酸的序列段。
關(guān)于雜交方面的同源性，嚴(yán)格條件將是通常在雜交反應(yīng)中控制的鹽、溫度、有機(jī)溶劑和其它參數(shù)的嚴(yán)格性的組合條件。嚴(yán)格性溫度條件通常包括超過大約30℃的溫度，通常為超過大約37℃的溫度，典型的為超過大約55℃的溫度，更典型為超過大約60℃或65℃的溫度，優(yōu)選為超過大約70℃的溫度。嚴(yán)格性的鹽條件一般為低于大約1000mM，通常低于大約400mM，典型的低于大約250mM，優(yōu)選低于大約150mM，包括約100、50或甚至20mM。然而，參數(shù)的組合比任何單個參數(shù)的測量值重要得多。參見例如，Wetmur和Davidson，(1968)J.Mol.Biol.31349-370。嚴(yán)格條件下的雜交得到的本底應(yīng)該是本底的至少2倍，最好至少3-5倍或更高。
對于序列比較，通常一個序列用作參比序列，將測試序列與其比較。當(dāng)使用一種序列比較算法時，將測試序列和參比序列輸入計算機(jī)中，必要時指定亞序列坐標(biāo)，并且指定序列運算規(guī)則程序的參數(shù)。然后，該序列比較算法根據(jù)指定的程序參數(shù)，計算測試序列相對于參比序列的序列同一性百分率。
可以用如下進(jìn)行用于比較的序列的光學(xué)序列比對(opticalalignment)例如用Smith和Waterman，(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法、用Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性序列比對算法、通過Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl Acad.Sci.USA852444的相似性搜索方法、通過計算機(jī)實現(xiàn)這些算法(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)、或通過目測檢查(一般參見Ausubel等，見上文)。
有用算法的一個實例是PILEUP。PILEUP采用漸進(jìn)成對序列比對創(chuàng)建一組相關(guān)序列的多序列比對，以顯示關(guān)系和序列同一性的百分率。它也繪出一個進(jìn)化樹或分枝圖(dendrogram)，顯示用來產(chǎn)生所述序列比對的成簇關(guān)系。PILEUP采用Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.35351-360的漸進(jìn)序列比對法的簡化方法。所用的方法類似于Higgins和Sharp，(1989)CABIOSS151-153描述的方法。該程序可以對多達(dá)300個序列進(jìn)行比對，每個序列的最大長度為5,000個核苷酸或氨基酸。多序列比對法以兩個最為相似的序列的成對序列比對開始，產(chǎn)生一個聚類的(a cluster of)雙重比對序列。然后將該聚類與下一個最為相關(guān)的序列或下一聚類比對序列進(jìn)行序列比對。通過簡單地擴(kuò)展兩個單獨序列的成對序列比對，對兩個聚類序列進(jìn)行序列比對。通過一系列漸進(jìn)成對序列比對，得到最終的序列比對。通過指定特定序列以及序列比較區(qū)的其氨基酸或核苷酸坐標(biāo)，并且指定該程序的參數(shù)，運行該程序。例如，可以將參比序列與其它測試序列比較，以采用以下參數(shù)測定序列同一性關(guān)系的百分率默認(rèn)空位加權(quán)值(default gap weight)(3.00)、默認(rèn)空位長度加權(quán)值(default gap length weight)(0.10)和加權(quán)末端空位(weighted end gaps)。
適用于測定序列同一性和序列相似性百分率的算法的另一實例是BLAST算法，該算法在Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215403-410中有描述。公眾可從National Center for Biotechnology Information(httpwww.ncbi.nlm.nih.gov/)得到進(jìn)行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過在查詢序列中鑒別長度為W的短字串，來鑒定高分值序列對(HSP)，當(dāng)與一數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字進(jìn)行比對時，它們或者匹配，或者滿足某一正的最低分值T。T稱為鄰近字串最低分值(Altschul等，參見上文)。這些起始的鄰近字串選中用作種子，起始搜索以尋找含所述字串選中的較長的HSP。然后，只要累積比對分值可以增加，則將所述字串選中沿每個序列在兩個方向上延伸。在以下情況下每個方向上所述字串選中的延伸停止累積比對分值從其最大所得值下降了數(shù)量X；由于累積了一個或多個負(fù)分值的殘基比對，累積分值轉(zhuǎn)為零或零以下；或達(dá)到任一序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定了該序列比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用時，默認(rèn)字長(W)為11，BLOSUM62打分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.NatlAcad.Sci.USA8910915)序列比對(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，并且比較兩條鏈。
除計算序列同一性百分率外，BLAST算法也進(jìn)行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(參見例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl Acad.Sci.USA905873-5787)。BLAST算法提供的相似性的一種測量是最小和概率(P(N))，這提供偶然發(fā)生兩個核苷酸序列或氨基酸序列之間匹配的概率的指標(biāo)。例如，如果在測試核酸與參比核酸的比較中，最小和概率低于約0.1，更優(yōu)選低于約0.01，最優(yōu)選低于約0.001時，認(rèn)為該核酸與參比序列相似。
兩個多肽的核酸序列大致相同的再一指標(biāo)是第一種核酸編碼的多肽與第二種核酸編碼的多肽免疫交叉反應(yīng)，如以下所述。因此，例如在一種多肽與第二種多肽僅由于保守取代而不同時，這兩種多肽通常是大致相同的。兩個核酸序列大致相同的另一指標(biāo)是所述兩種分子在嚴(yán)格條件下相互雜交，如下所述。
通過密切相關(guān)物種的交叉物種雜交，可以克隆并分離來自其它哺乳動物物種的IL-B30。在遠(yuǎn)緣物種之間的同源性可能相對低，因此最好是相對密切相關(guān)的物種的雜交。或者，表現(xiàn)出物種特異性較低的抗體制備物的制備，可用于表達(dá)克隆方法中。VII.制備p40/IL-B30組合；模擬物通過化學(xué)合成、篩選cDNA文庫或篩選由種類繁多的細(xì)胞系或組織樣品制備的基因組文庫，可以獲得編碼所述IL-12 p40或IL-B30或其片段的DNA。參見例如Okayama和Berg，(1982)Mol.Cell.Biol.2161-170；Gubler和Hoffman，(1983)Gene25263-269；和Glover，(1984編輯)DNA CloningA Practical Approach，IRL Press，Oxford。或者，本文提供的序列提供有用的PCR引物，或使得可以合成制備或用其它方法制備編碼IL-12 p40或IL-B30的合適基因；包括天然存在的實施方案。
該DNA可以在種類繁多的宿主細(xì)胞中表達(dá)，用于合成全長IL-12p40和IL-B30或片段，所述全長IL-12 p40和IL-B30或片段進(jìn)而可以例如用來產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體；用于結(jié)合研究；用于構(gòu)建和表達(dá)修飾的分子；和用于結(jié)構(gòu)/功能研究。
本文所用的載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、整合型DNA片段和能夠?qū)NA片段整合到宿主基因組中的其它載體。參見例如Pouwels等，(1985和增補(bǔ)本)Cloning VectorsA Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.；和Rodriguez等，(1988編輯)VectorsA Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses，Buttersworth，Boston，MA。
對于本發(fā)明的目的，當(dāng)DNA序列在功能上相互相關(guān)時，則將它們有效連接。例如，如果DNA作為前蛋白表達(dá)或參與將多肽導(dǎo)向細(xì)胞膜或指導(dǎo)分泌所述多肽，則將前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)序列的DNA有效連接至所述多肽。如果啟動子控制所述多肽的轉(zhuǎn)錄，則將該啟動子有效連接至編碼序列；如果將核糖體結(jié)合位點定位以允許翻譯，則將核糖體結(jié)合位點有效連接至編碼序列。通常，有效連接是指連續(xù)的并且符合讀框，然而，某些遺傳元件諸如阻抑物基因不是鄰接的，但仍結(jié)合于操縱基因序列，進(jìn)而控制表達(dá)。參見例如Rodriguez等，第10章，第205-236頁；Balbas和Bolivar，(1990)Methods inEnzymology18514-37；和Ausubel等，(1993)Current Protocols inMolecular Biology，Greene and Wiley，NY。在此特別感興趣的是這兩種編碼序列的共表達(dá)。
合適表達(dá)載體的代表性實例包括pCDNA1；pCD，參見Okayama等，(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMClneo Poly-A，參見Thomas等，(1987)Cell51503-512；和桿狀病毒載體，諸如pAC 373或pAC610。參見例如Miller，(1988)Ann.Rev.Microbiol.42177-199。
通常最好在提供特定或限定糖基化模式的系統(tǒng)中表達(dá)IL-12 p40和/或IL-B30多肽。參見例如Luckow和Summers，(1988)Bio/Technology647-55；和Kaufman，(1990)Meth.Enzymol.185487-511。
可以將所述IL-12 p40和/或IL-B30或其片段工程改造為連接于細(xì)胞膜的磷脂酰肌醇(PI)，但可以通過用磷脂酰肌醇切割酶(例如磷脂酰肌醇磷脂酶-C)處理從細(xì)胞膜上去除。這釋放出生物活性形式的所述抗原，使得可以用蛋白質(zhì)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化。參見例如Low，(1989)Biochim.Biophys.Acta988427-454；Tse等，(1985)Science2301003-1008；和Brunner等，(1991)J.Cell Biol.1141275-1283。
既然已經(jīng)特征鑒定出所述IL-12 p40和IL-B30，而可以通過合成肽的常規(guī)方法制備其片段或衍生物。這些包括諸如在以下文獻(xiàn)中描述的方法Stewart和Young，(1984)Solid Phase Peptide Synthesis，PierceChemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky，(1984)The Practiceof Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New York；Bodanszky，(1984)ThePrinciples of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New York；和Villafranca，(1991編輯)Techniques in Protein Chemistry II，Academic Press，SanDiego，Ca。VIII.應(yīng)用本發(fā)明提供可供用于例如IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物介導(dǎo)的病癥或以下在診斷試劑盒描述的本文其它方面描述的診斷應(yīng)用的試劑。所述基因可以用于司法科學(xué)，例如以辨別嚙齒動物與人類，或用作辨別表現(xiàn)出差異表達(dá)或修飾模式的不同細(xì)胞的標(biāo)記。所提供的組合物在例如體外測定、科學(xué)研究以及核酸、多肽或抗體的合成或生產(chǎn)中是有用的試劑。
本發(fā)明也提供具有顯著經(jīng)濟(jì)潛力和/或治療潛力的試劑。所述IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物(天然存在的或重組的)、其片段及其抗體與鑒定為對所述復(fù)合物或其各個組分具有結(jié)合親和性的化合物，應(yīng)該可用作教授分子生物學(xué)、免疫學(xué)或生理學(xué)技術(shù)的試劑。例如在生產(chǎn)或使用蛋白質(zhì)、抗體、克隆方法、組織學(xué)等的實際實驗室練習(xí)中，可以用所述試劑制備合適的試劑盒。
所述試劑也可以用于治療與異常生理學(xué)或發(fā)育(包括炎癥)相關(guān)的病癥。它們可以用于有關(guān)可能與特定治療策略的成功相關(guān)的互作組分存在與否的體外測試。特別是，采用本文提供的組合物，通過合適的治療方法將可達(dá)到對各種例如造血細(xì)胞或淋巴細(xì)胞生理的調(diào)節(jié)。參見例如Thomson，(1994編輯)The CytokineHandbook(第2版)AcademicPress，San Diego；Metcalf和Nicola，(1995)The Hematopoietic ColonyStimulating FactorsCambridge University Press；和Aggarwal和Gutterman，(1991)Human CytokinesBlackwell Pub.。
所述細(xì)胞因子復(fù)合物可以誘導(dǎo)多種IFNγ水平，這一觀察結(jié)果提供了有用的有關(guān)治療潛力的了解。特別是，IFNγ的產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)免疫的增強(qiáng)。參見例如Paul，(1998)Fundamental Immunology(第4版)Raven Press，NY；和Delves和Roitt(1 998編輯)The Encyclopedia ofImmunologyAcademic Press(ISBN0122267656)。因此，細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)可用于增強(qiáng)抗腫瘤活性方面，增強(qiáng)疫苗應(yīng)答(體液免疫和細(xì)胞免疫)，增強(qiáng)抗病毒效應(yīng)，以及拮抗某些發(fā)育窗中的過敏反應(yīng)。參見例如Rose和Mackay(1998編輯)The Autoimmune Diseases(第3版)Academic Press，San Diego；和Kay，(1997編輯)Allergy and AllergicDiseases Blackwell Science，Malden MA。相反，拮抗劑可用來阻斷或防止這類IFNγ的增強(qiáng)，由此降低細(xì)胞增強(qiáng)的強(qiáng)度。這些可用于例如自身免疫情況(例如多發(fā)性硬化或銀屑病)或慢性炎癥(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或炎性腸病)。參見例如Samter等(編輯)Immunological Diseases第1和2卷，Little，Brown and Co.。初步結(jié)果提示，在慢性炎癥的維持中所述p40/IL-B30的作用更為重要。因此，在最初發(fā)生所述病癥之后，阻斷可能是有效的。
對于這類治療靶，所述激動劑或拮抗劑將與現(xiàn)有治療劑(例如炎癥的其它調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合使用。因此，所述激動劑通常將與例如IL-18、IL-12、放射治療或化學(xué)治療、疫苗佐劑和/或抗病毒治療劑聯(lián)合?；蛘撸鲛卓箘┛梢耘cTNFα拮抗劑、IL-12拮抗劑、IL-10和/或類固醇聯(lián)合。也可以使用所述細(xì)胞因子的病毒同系物。
例如，與IL-12 p40/IL-B30異常表達(dá)或異常信號相關(guān)的疾病或病癥，應(yīng)該是激動劑或拮抗劑的可能靶。所述新細(xì)胞因子應(yīng)該在影響免疫應(yīng)答(例如炎癥和/或自身免疫失調(diào))的造血細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)或發(fā)育中起作用?；蛘?，它可能影響血管生理學(xué)或發(fā)育或神經(jīng)元作用。相對于所述病癥起始或維持的治療劑的定時給予也可能是重要的。特別是，所述細(xì)胞因子復(fù)合物應(yīng)該在不同方面介導(dǎo)所述細(xì)胞的細(xì)胞因子合成、增殖等。IL-12 p40/IL-B30的拮抗劑，諸如天然存在形式的突變蛋白變異體或封閉性抗體，可以提供一種選擇性和有效的阻斷免疫應(yīng)答的方法，以在諸如炎性應(yīng)答或自身免疫性應(yīng)答的情況下阻斷免疫應(yīng)答。也參見Samter等，(編輯)Immunological Diseases第1和2卷，Little，Brown and Co.。
治療應(yīng)用的具體靶包括例如肺病(哮喘和纖維變性)、EAE模型(它可能是多發(fā)性硬化的有用模型)、糖尿病和腸部炎癥。有關(guān)哮喘參見例如Barnes等，(1998)Mol.Med.Today4452-458；Pauwels等，(1998)Clin.Exp. AllergyAug.28 suppl 31-5；Durham，(1998)Clin.Exp.AllergyJun.28 Suppl 211-16；Leung，(1997)Pediatr.Res.42559-568；Pretolani等，(1997)Res.Immunol.14833-38；Lamkhioued等，(1996)Ann.NY Acad.Sci.796203-208；Erb等，(1996)Immunol.Cell.Biol.74206-208；和Anderson等，(1994)Trends Pharmacol.Sci.15324-332；有關(guān)肺纖維化參見例如Coker等，(1998)Eur.Respir.J.111218-1221；和Bienkowski等，(1995)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.209118-140；有關(guān)EAE模型(多發(fā)性硬化的模型)參見例如Pearson和McDevitt，(1999)Curr.Top.Microbiol.Immunol.23879-122；Miller和Shevach，(1998)Res.Immunol.149753-759；Hoffman和Karpus，(1998)Res.Immunol.149790-794(論述846-847和855-860)；Segal，(1998)Res.Immunol.149811-820(論述850-851和855-860)；Liblau等，(1997)Immunol.Today18599-604；Gold等，(1997)Crit.Rev.Immunol.17507-510；Spack，(1997)Crit.Rev.Immunol.17529-536；和Leonard等，(1997)Crit.Rev.Immunol.17545-553；有關(guān)糖尿病參見例如Almawi等，(1999)J.Clin.Endocrinol.Metab.841497-1502；Rabinovitch等，(1998)Biochem.Pharmacol.551139-1149；和Rabinovitch，(1998)Diabetes Metab.Rev.14129-151；和有關(guān)腸部炎癥參見例如Leach等，(1999)Toxicol.Pathol.27123-133；Braun等，(1999)Curr.Opin.Rheumatol.1168-74；Rugtveit等，(1997)Gastroenterology1121493-1505；Strober等，(1997)Immunol.Today1861-64；和Ford等，(1996)Semin.Pediatr.Surg.5155-159。
P40/IL-B30對記憶激活細(xì)胞的刺激導(dǎo)致包括粘著分子在內(nèi)的表型的改變。在用p40/IL-B30刺激后CD69L高度表達(dá)，而CD54顯著減少。這些粘著分子表達(dá)的改變可能使得可以調(diào)節(jié)記憶細(xì)胞例如通過毛細(xì)血管后微靜脈(HEV)進(jìn)入初級和次級淋巴結(jié)的T/DC細(xì)胞富含區(qū)。記憶細(xì)胞也被觸發(fā)變?yōu)閷L-12刺激敏感。因此，在抗原誘導(dǎo)IL-12后不久快速產(chǎn)生IFN且其產(chǎn)量高。因此，p40/IL-B30可以通過提高應(yīng)答速率、增加記憶細(xì)胞數(shù)或這兩者，加速記憶細(xì)胞的免疫應(yīng)答。所述p40/IL-B30可能對記憶細(xì)胞具有差別的特異效應(yīng)，而對原初細(xì)胞的效應(yīng)較低或沒有效應(yīng)。相反，在許多慢性炎癥例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病等中，所述活動性病灶依賴于記憶性CD45Rb低細(xì)胞。因此，拮抗劑可能有效地阻斷這種慢性期炎癥。
在通過RNA印跡分析表現(xiàn)出產(chǎn)生IL-12 p40和/或IL-B30 mRNA的每種細(xì)胞類型中的各種異常病癥是已知的。參見Berkow(編輯)TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy，Merek & Co.，Rahway，N.J.；Thorn等，Harrison’s Principles of Internal Medicine，McGraw-Hill，N.Y.；和Weatherall等，(編輯)Oxford Textbook of Medicine，Oxford UniversityPress，Oxford。許多其它醫(yī)學(xué)病癥和疾病涉及被巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞活化，許多這些病癥和疾病對用本文提供的激動劑或拮抗劑的治療有反應(yīng)。參見例如Stites和Terr(1991編輯)Basic and Clinical ImmunologyAppleton和Lange，Norwalk，Connecticut；和Samter等(編輯)，Immunological DiseasesLittle，Brown and Co.。這些醫(yī)學(xué)難題應(yīng)該易于采用本文提供的組合物預(yù)防或治療。
可以純化IL-12 p40/IL-B30細(xì)胞因子復(fù)合物、拮抗劑、抗體等，然后將其給予獸醫(yī)學(xué)患者或人類患者。例如在常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑(例如免疫原性佐劑)中，可以將這些試劑聯(lián)合另外的有效成分或惰性成分以及生理上無毒的穩(wěn)定劑、賦形劑或防腐劑，用于治療用途?？梢詫⑦@些組合物過濾除菌，將這些組合物通過在劑量管制瓶中凍干或貯存于穩(wěn)定化水性制劑中，以劑量形式放置。本發(fā)明也設(shè)想了包括非補(bǔ)體結(jié)合形式在內(nèi)的抗體或其結(jié)合片段的應(yīng)用。
可以用IL-12 p40/IL-B30、融合蛋白或其片段進(jìn)行藥物篩選，以鑒定對IL-12 p40/IL-B30具有結(jié)合親和性或?qū)L-12 p40/IL-B30功能具有其它相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)的化合物，包括相關(guān)組分的分離。然后，可以利用后續(xù)的生物測定，確定候選化合物是否具有內(nèi)在刺激活性，并且是否由此因為它阻斷所述細(xì)胞因子復(fù)合物的活性而成為阻斷劑或拮抗劑。同樣，具有內(nèi)在刺激活性的化合物，可以激活所述信號途徑，并由此因為它刺激所述細(xì)胞因子復(fù)合物的活性而成為激動劑。本發(fā)明還設(shè)想了抗IL-12 p40、IL-B30或所述復(fù)合物的封閉性抗體作為拮抗劑的治療應(yīng)用和刺激性抗體作為激動劑的治療應(yīng)用。該方法應(yīng)該對于其它IL-12 p40或IL-B30的物種變異體特別有用。
有效治療所需的試劑量將取決于許多不同的因素，包括給藥方法、靶部位、所述患者的生理狀況和給予的其它藥物。因此，應(yīng)該逐步增加治療劑量，以優(yōu)化安全性和效力。通常，體外所用的劑量可以在原位給予這些試劑有用的量方面提供有用的指南。治療特定病癥的有效劑量的動物試驗將提供進(jìn)一步的人用劑量的預(yù)測性指標(biāo)。例如在Gilman等，(1990編輯)Goodman and Gilman’sThe PharmacologicalBases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；和Remingon’sPharmaceutical Sciences，第17版，(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn中，描述了各種考慮。其中以及下文討論了給藥方法，例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)給藥、透皮擴(kuò)散和其它給藥方法。藥學(xué)上可接受的載體將包括水、鹽水、緩沖液和例如在Merck Index，Merck & Co.，Rahway，New Jersey中描述的其它化合物。通常預(yù)計具有合適載體的劑量范圍為低于1mM濃度的量，通常低于約10μM濃度，常常低于約100nM，優(yōu)選低于約10pM(皮摩爾濃度)，最優(yōu)選低于約1fM(費摩爾濃度)。緩釋制劑或緩釋裝置通常用于持續(xù)給藥或長期給藥。參見例如Langer，(1990)Science2491527-1533。
IL-12 p40、IL-B30、細(xì)胞因子復(fù)合物、融合蛋白、其片段、其抗體或抗體片段、拮抗劑和激動劑，可以直接給予待治療宿主，或根據(jù)所述化合物的大小，可能最好在給予它們之前，將它們綴合于諸如卵清蛋白或血清白蛋白的載體蛋白。治療制劑可以以許多常規(guī)劑量制劑給予。盡管有可能單獨給予所述有效成分，但最好將其作為藥用制劑存在。制劑通常包含至少一種以上定義的有效成分與其一種或多種可接受的載體。在與其它成分相容并且對所述患者無害的意義上，每種載體應(yīng)該是藥學(xué)上和生理上可接受的。制劑包括適用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))給藥的制劑。所述制劑可以方便地以單位劑型存在，并且可以用藥學(xué)領(lǐng)域熟知的許多方法制備。參見例如Gilman等，(1990編輯)Goodman and Gilman’sThePharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；和Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，(1990)，Mack PublishingCo.，Easton，Penn.；Avis等，(1993編輯)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Medications，Dekker，New York；Lieberman等，(1990編輯)Pharmaceutical Dosage FormsTablets，Dekker，New York；和Lieberman等，(1990編輯)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems，Dekker，New York。本發(fā)明的療法可以與其它藥劑結(jié)合使用，其它藥物諸如其它細(xì)胞因子，包括IL-6或G-CSF或其相應(yīng)的拮抗劑。
天然存在形式和重組形式的本發(fā)明IL-B30均尤其可用于能夠篩選對所述蛋白有結(jié)合活性的化合物的試劑盒和測定方法。最近數(shù)年來已經(jīng)開發(fā)了幾種自動測定方法，以便使得可以在短時間內(nèi)篩選數(shù)萬種化合物。參見例如Fodor等，(1991)Science251767-773，該文獻(xiàn)描述了用于測試在固相支持體上合成的多種限定聚合物的結(jié)合親和性的方法。如本發(fā)明提供的大量純化、可溶性IL-12 p40/IL-B30細(xì)胞因子復(fù)合物的可得性，可以大大促進(jìn)合適測定的開發(fā)。
可以用其它方法來確定IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物-受體相互作用中的關(guān)鍵殘基?？梢赃M(jìn)行突變分析，例如參見Somoza等，(1993)J.Exptl.Med.178549-558，以確定所述相互作用和/或信號中關(guān)鍵的具體殘基。PHD(Rost和Sander，(1994)Proteins1955-72)和DSC(King和Stemberg，(1996)Protein Sci.52298-2310)可以提供對α-螺旋(H)、β-鏈(E)或卷曲螺旋(coil)(L)的二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。螺旋A和D在受體相互作用中通常最為重要的，而D螺旋是更為重要的區(qū)域。
例如，一旦已經(jīng)例如通過四級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)確定了所述抗原和/或受體的結(jié)構(gòu)，則通?？梢园l(fā)現(xiàn)拮抗劑。采用純化的IL-12 p40/IL-B30復(fù)合物，由于高度自動化測定方法的開發(fā)，對潛在的互作類似物進(jìn)行測試現(xiàn)在是可能的。特別是，通過采用本文描述的篩選技術(shù)，將發(fā)現(xiàn)新的激動劑和拮抗劑。特別重要的是發(fā)現(xiàn)對一系列IL-12 p40/IL-B30分子具有組合結(jié)合親和性的化合物，例如，可以用作所述細(xì)胞因子復(fù)合物物種變異體的拮抗劑的化合物。
一種藥物篩選方法利用表達(dá)IL-20 p40/IL-B30的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞?？梢苑蛛x表達(dá)與其它分子分離的IL-12p40/IL-B30的細(xì)胞。這種有活力形式或固定形式的細(xì)胞，可以用于標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合配偶體的結(jié)合測定法。也參見Parce等，(1989)Science246243-247；和Owicki等，(1990)Proc.Natl Acad.Sci.USA874007-4011，該文獻(xiàn)描述了測定細(xì)胞應(yīng)答的靈敏方法。
用于藥物篩選的另一技術(shù)涉及提供對IL-12 p40/IL-B30具有合適結(jié)合親和性的化合物的高通量篩選的一種方法，該技術(shù)詳細(xì)描述于Geysen的歐洲專利申請84/03564，該專利申請公布于1984年9月13日。首先，在例如塑料釘或某些其它合適表面的固體基質(zhì)上合成大量的不同小肽測試化合物，參見Fodor等，(1991)。然后，使所有釘與溶解的未經(jīng)純化、或溶解的純化p40/IL-B30反應(yīng)，然后洗滌。下一步涉及測定結(jié)合的p40/IL-B30。
合理的藥物設(shè)計也可以基于所述p40/IL-B30和其它效應(yīng)物或類似物的分子形狀的結(jié)構(gòu)研究。效應(yīng)物可以是對結(jié)合應(yīng)答而介導(dǎo)其它功能的其它蛋白，或為通常與p40/IL-B30相互作用的其它蛋白，例如受體。用于確定哪些位點與特定的其它蛋白相互作用的一種方法是物理結(jié)構(gòu)測定，例如X射線晶體學(xué)或二維NMR技術(shù)。這些將為哪些氨基酸殘基形成分子接觸區(qū)(例如針對其它細(xì)胞因子-受體模型建模的)提供指南。有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的詳細(xì)描述，參見例如Blundell和Johnson，(1976)Protein Crystallography，Academic Press，New York。IX.試劑盒本發(fā)明也考慮了p40/IL-B30蛋白、其片段、肽和它們的融合產(chǎn)物在用于檢測另一p40/IL-B30或結(jié)合配偶體存在的多種診斷試劑盒和方法中的應(yīng)用。通常，所述試劑盒將具有含限定p40、p40/IL-B30或IL-B30肽或基因區(qū)段或者識別一種或另一種例如p40/IL-B30融合片段或抗體的試劑的區(qū)室。
用于測定測試化合物對IL-12 p40/IL-B30的結(jié)合親和性的試劑盒，通常包含一種測試化合物；一種標(biāo)記化合物，例如對p40/IL-B30具有已知結(jié)合親和性的一種結(jié)合配偶體或抗體；一種p40/IL-B30源(天然存在的或重組的)；和用于將結(jié)合的標(biāo)記化合物與游離標(biāo)記化合物分離的工具，例如用于將該分子固定化的固相。一旦篩選出化合物，則可以在本領(lǐng)域熟知的合適的生物測定中評估對該抗原具有合適結(jié)合親和性的那些化合物，以確定它們是作為p40/IL-B30信號途徑的激動劑還是作為拮抗劑起作用。重組IL-12 p40/IL-B30融合多肽的可得性也提供了很好確定的校準(zhǔn)這類測定的標(biāo)準(zhǔn)。
用于測定樣品中例如p40/IL-B30濃度的優(yōu)選試劑盒，通常包含一種對所述抗原具有已知結(jié)合親和性的標(biāo)記化合物，例如結(jié)合配偶體或抗體；一種細(xì)胞因子源(天然存在的或重組的)和一種將結(jié)合標(biāo)記化合物與游離標(biāo)記化合物分離的工具，例如用于將所述p40/IL-B30固定化的固相。通常提供含試劑的區(qū)室和說明。
包括抗原結(jié)合片段在內(nèi)的所述p40/IL-B30或片段的特異性抗體，可用于檢測水平提高的p40、IL-B30、p40/IL-B30和/或其片段存在的診斷應(yīng)用。這類診斷測定可以使用裂解液、活細(xì)胞、固定細(xì)胞、免疫熒光、細(xì)胞培養(yǎng)物、體液，還可以涉及血清中與所述抗原相關(guān)的抗原的檢測等。診斷測定可以是均相(在游離試劑和抗原結(jié)合配偶體復(fù)合物之間無分離步驟)或異相(有分離步驟)的。存在各種商業(yè)測定，諸如放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫測定(EIA)、酶倍增免疫測定(enzyme-multiplied immunoassay)技術(shù)(EMIT)、底物標(biāo)記熒光免疫測定(SLFIA)等。參見例如Van Vunakis等，(1980)MethEnzymol.701-525；Harlow和Lane，(1980)AntibodiesA LaboratoryManual，CSH Press，NY；和Coligan等，(1 993編輯)Current Protocols inImmunology，Greene and Wiley，NY。
抗獨特型抗體可以相似地用來診斷抗p40/IL-B30抗體的存在，因此可以診斷各種異常狀態(tài)。例如，p40/IL-B30的超量產(chǎn)生可能導(dǎo)致產(chǎn)生可能是異常生理狀況診斷標(biāo)志的各種免疫反應(yīng)，所述異常生理狀況特別是增生性細(xì)胞病癥(諸如癌癥)或異常活化或分化。
通常，用于診斷測定的試劑在試劑盒中供應(yīng)，以便使該測定的靈敏度最佳化。對于題述發(fā)明，根據(jù)所述測定的性質(zhì)，提供所述方案和所述標(biāo)記(或者標(biāo)記或未標(biāo)記的抗體或結(jié)合配偶體，或者標(biāo)記的p40/IL-B30)。這通常與其它添加劑結(jié)合，所述添加劑諸如緩沖液、穩(wěn)定劑、信號產(chǎn)生必需的物質(zhì)，諸如酶的底物等。所述試劑盒最好也含有正確使用和使用后正確處理內(nèi)容物的說明。所述試劑盒通常具有每種有用試劑的區(qū)室。當(dāng)所述試劑可以在水性介質(zhì)中重建，提供進(jìn)行該測定的合適試劑濃度時，所述試劑最好是作為干燥的凍干粉提供。
所述藥物篩選和所述診斷測定的許多上述組分可以不經(jīng)修飾而使用，或以多種方式進(jìn)行修飾。例如，通過共價或非共價結(jié)合直接或間接提供可檢測信號的部分，可以達(dá)到標(biāo)記。在這些測定中的許多測定中，可以或者直接或間接標(biāo)記所述結(jié)合配偶體、測試化合物、p40/IL-B30或其抗體。用于直接標(biāo)記的可能標(biāo)記包括標(biāo)記基團(tuán)諸如125I的放射性標(biāo)記；酶，諸如過氧化物酶和堿性磷酸酶；和能夠監(jiān)測熒光強(qiáng)度、波長變化或熒光偏振變化的熒光標(biāo)記(美國專利第3,940,475號)。用于間接標(biāo)記的可能標(biāo)記包括將一種組分生物素化，然后與偶聯(lián)于一種上述標(biāo)記基團(tuán)的抗生物素蛋白連接。
也有許多將結(jié)合p40/IL-B30與游離p40/IL-B30分離、或者將結(jié)合測試化合物與游離測試化合物分離的方法。所述p40/IL-B30可以固定化于各種基質(zhì)上，然后進(jìn)行洗滌。合適的基質(zhì)包括諸如ELISA板的塑料、濾膜和微珠。參見例如Coligan等，(1993編輯)Current Protocols inImmunology，第1卷，第2章，Greene and Wiley，NY。其它合適的分離技術(shù)包括但不限于Rattle等，(1984)Clin.Chem.301457-1461中描述的熒光素抗體可磁化微粒法、以及美國專利第4,659,678號中描述的雙抗體磁性微粒分離法。
在所述文獻(xiàn)中已經(jīng)廣泛報道了用于將蛋白或其片段與各種標(biāo)記交聯(lián)的方法，因此在此不需要詳細(xì)討論。許多這些技術(shù)涉及應(yīng)用活化羧基，或者通過碳二亞胺或者活性酯形成肽鍵；通過巰基與活化鹵素(諸如氯乙酰)或活化烯烴(諸如馬來酰亞胺)反應(yīng)形成硫醚，以用于交聯(lián)等。融合蛋白也可供這些應(yīng)用使用。
本發(fā)明的另一診斷方面涉及取自p40/IL-B30序列的寡核苷酸序列或多核苷酸序列的應(yīng)用。這些序列可以用作探針，以檢測懷疑患有異常病癥(例如炎癥或自身免疫病)的患者樣品中所述p40或IL-B30信息的水平。由于所述細(xì)胞因子可以是活化的標(biāo)記或中介體，所以可用來檢測多種活化細(xì)胞，以確定例如在所述效應(yīng)變顯著和進(jìn)展為顯著之前可能例如以預(yù)防方式需要其它療法的時間。RNA和DNA核苷酸序列的制備、所述序列的標(biāo)記和所述序列的優(yōu)選大小在所述文獻(xiàn)中有大量的描述和討論。參見例如Langer-Safer等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.794381-4385；Caskey，(1987)Science236962-967；和Wilchek等，(1988)Anal.Biochem.1711-32。
也考慮了也用于測試其它分子定性或定量表達(dá)的診斷試劑盒。診斷或預(yù)后可能取決于用作標(biāo)記的多種指標(biāo)的組合。因此，試劑盒可以測試標(biāo)記組合。參見例如Viallet等，(1989)Progress in Growth Factor Res.189-97。其它試劑盒可以用來評估其它細(xì)胞亞群。X.分離p40/IL-B30的受體由于已經(jīng)分離出特異性配體-受體相互作用的配體，因此存在分離所述受體的方法。參見Gearing等，(1989)EMBO J.83667-3676。例如，可以確定標(biāo)記所述IL-B30細(xì)胞因子、但不干擾與其受體結(jié)合的方法。例如，可以將親和標(biāo)記融合于所述配體的或者氨基末端或者羧基末端。這種標(biāo)記可以是FLAG附加表位，或例如Ig或Fc區(qū)。例如通過細(xì)胞分選，或測定表達(dá)這種結(jié)合組分的亞群的其它篩選，可以根據(jù)所述細(xì)胞因子的特異性結(jié)合來篩選表達(dá)文庫。參見例如Ho等，(1993)Proc.Natl Acad.Sci.USA9011267-11271；和Liu等，(1994)J.Immunol.1521821-29。或者，可以使用淘選法。參見例如Seed和Aruffo，(1987)Proc.Natl Acad.Sci.USA843365-3369。
可以應(yīng)用蛋白質(zhì)與標(biāo)記交聯(lián)的技術(shù)來分離所述p40/IL-B30細(xì)胞因子復(fù)合物的結(jié)合配偶體。這應(yīng)該使得可以鑒定與所述細(xì)胞因子例如以配體-受體樣方式特異性相互作用的蛋白質(zhì)。
將進(jìn)行早期試驗，以確定已知的IL-6或G-CSF受體組分是否參與對p40/IL-B30的應(yīng)答。這些功能受體復(fù)合物可能與p40/IL-B30受體復(fù)合物共享許多或所有組分的可能性也相當(dāng)大，其中所述組分或者為特定受體亞基或者為輔助受體亞基。
可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對本發(fā)明進(jìn)行許多修改和變化，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。提供本文描述的具體實施方案僅僅是舉例說明，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的條款以及這些權(quán)利要求賦予的等同條款的全部范圍限制。
實施例I.一般方法例如在Maniatis等，(1982)Molecular CloningA Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY；Sambrook等，(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第2版)第1-3卷，CSH Press，NY；Ausubel等，BiologyGreene Publishing Associates，Brooklyn，NY；Ausubel等，(1987和增補(bǔ)本)Current Protocols inMolecular BiologyWiley/Greene，NY；Innis等，(1990編輯)PCRProtocolsA Guide to Methods and ApplicationsAcademic Press，NY；Bonifacino等，Current Protocols in Cell BiologyWiley，NY；和Doyle等，Cell and Tissue CultureLaboratory ProtocolsWiley，NY中描述或引用了以下的許多標(biāo)準(zhǔn)方法。用于蛋白純化的方法包括諸如硫酸銨沉淀、柱層析、電泳、離心、結(jié)晶的方法和其它方法。參見例如Ausubel等，(1987和定期增補(bǔ)本)；Deutscher，(1990)“Guide to Protein Purification”，Methods in Enzymology第182卷和該系列中的其它卷；Coligan等，(1995和增補(bǔ)本)Current Protocols in Protein ScienceJohn Wiley and Sons，New York，NY；Matsudaira，(1993編輯)A.Practical Guide to Protein andPeptide Purification for Microsequencing，Academic Press，San Diego，CA；和例如Pharmacia，Piscataway，NJ或Bio-Rad，Richmond，CA的生產(chǎn)商關(guān)于蛋白純化產(chǎn)品使用的文獻(xiàn)。與重組技術(shù)結(jié)合，使得可以與合適區(qū)段(附加表位)融合，例如與FLAG序列融合或與可以例如通過蛋白酶可去除序列融合的等同序列融合。參見例如Hochuli(1990)“Purification ofRecombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent”，載于Setlow(編輯)Genetic Engineering，Principle and Methods1287-98，Plenum Press，NY；和Crowe等，(1992)QIAexpressThe High Level Expression & ProteinPurification SystemQUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
例如采用可得到的軟件程序進(jìn)行計算機(jī)序列分析，所述軟件程序包括得自University of Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI、NIH的NCBI以及GenBank、NCBI、EMBO和其它公共序列源的軟件程序。其它分析源包括例如RASMOL程序，參見Bazan等，(1996)Nature379591；Lodi等，(1994)Science2631762-1766；Sayle和Milner-White，(1995)TIBS20374-376；和Gronenberg等，(1991)Protein Engineering4263-269；和DSC，參見King和Stemberg，(1996)Protein Sci.52298-2310。也參見Wilkins等，(1997編輯)ProteomeResearchNew Frontiers in Functional GenomicsSpringer-Verlag，NY；Salzberg等，(1998編輯)Computational Methods in Molecular BiologyElsevier，NY；和Birren等，(1997編輯)Genome AnalysisA LaboratoryManualCold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY。
例如在Hertzenberg等，(1996編輯)Weir’s Handbook ofExperimental Immunology第1-4卷，Blackwell Science；Coligan，(1991及新版本)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；和Methodsin Enzymology第70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163卷中，描述了標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)。例如在Thomson，(1994編輯)The Cytokine Handbook(第2版)Academic Press，San Diego；Metcalf和Nicola，(1995)The Hematopoietic Colony Stimulating FactorsCambridge University Press；和Aggarwal和Gutterman，(1991)HumanCytokinesBlackwell Pub中，描述了細(xì)胞因子測定。
血管生物活性的測定是本領(lǐng)域熟知的。它們包括腫瘤或其它組織(例如動脈平滑肌)增生(參見例如Koyoma等，(1996)Cell871069-1078)、單核細(xì)胞粘著于血管上皮(參見McEvoy等，(1997)J.Exp.Med1852069-2077)等中的血管生成活性和血管抑制(angiostatic)活性。也參見Ross，(1993)Nature362801-809；Rekhter和Gordon，(1995)Am.J.Pathol.147668-677；Thyberg等，(1990)Atherosclerosis10966-990；和Gumbiner，(1996)Cell84345-357。
例如在Wouterlood，(1995編輯)Neuroscience Protocolsmodules 10，Elsevier；Methods in NeurosciencesAcademic Press；和NeuromethodsHumana Press，Totowa，NJ中，描述了神經(jīng)細(xì)胞生物活性的測定。例如在Meisami(編輯)Handbook of Human Growth and DevelopmentalBiologyCRC Press；和Chrispeels(編輯)Molecular Techniques andApproaches in Developmental BiologyInterscience中，描述了發(fā)育系統(tǒng)的方法學(xué)。
在Melamed等，(1990)Flow Cytometry and SortingWiley-Liss，Inc.，New York，NY；Shapiro，(1988)Practical Flow CytometryLiss，New York，NY；和Robinson等，(1993)Handbook of Flow Cytometry MethodsWiley-Liss，New York，NY中，描述了FACS分析。II.人p40和/或IL-B30的克隆所述IL-12 p40序列可得自各種序列數(shù)據(jù)庫，如以上描述的數(shù)據(jù)庫。表1提供了所述IL-B30基因的序列。所述序列得自基因組人序列。
這些序列使得可以制備PCR引物或探針，以測定所述基因的細(xì)胞分布。所述序列使得可以分離編碼所述信息的基因組DNA。
使用所述探針或PCR引物，可以探測各種組織或細(xì)胞類型，以確定細(xì)胞分布。用例如TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆PCR產(chǎn)物。在自動測序儀(Applied Biosystems)上，從兩個末端對所得的cDNA質(zhì)粒測序。III.p40和IL-B30的細(xì)胞表達(dá)制備對編碼相應(yīng)基因的cDNA特異性的合適探針或引物。通常，例如通過隨機(jī)引物標(biāo)記該探針。在感興趣的是所述p40/IL-B30復(fù)合物的情況下，兩種亞基的協(xié)同表達(dá)是最為重要的。IV.p40/IL-B30蛋白的純化對許多轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系篩選以高于其它細(xì)胞的水平表達(dá)所述細(xì)胞因子或復(fù)合物的細(xì)胞系?；蛘撸梢詷?gòu)建組合重組構(gòu)建體。對各種細(xì)胞系根據(jù)其適宜的操作特性進(jìn)行篩選和選擇。分別分離相應(yīng)的亞基以及其后的組合，可能導(dǎo)致某些二聚體形成。天然IL-B30可以從天然來源分離，或采用合適的表達(dá)載體通過表達(dá)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離?？梢杂孟俨《緲?gòu)建體進(jìn)行生產(chǎn)/表達(dá)。
用標(biāo)準(zhǔn)方法可以達(dá)到所表達(dá)亞基或復(fù)合物的純化，或可以結(jié)合工程改造方法，以高效率從細(xì)胞裂解液或上清液中有效地純化所表達(dá)的亞基或復(fù)合物。特別是，帶有或不帶有合適接頭的p40與IL-B30的融合，可以產(chǎn)生高效加工或純化方法。對于這類純化特征可以使用FLAG或His6區(qū)段?；蛘?，可以用特異性抗體，使用親和層析，參見下文。
根據(jù)需要，在大腸桿菌(coli)、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。V.p40/IL-B30特異性抗體的制備將合成肽或純化蛋白呈遞給免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。參見例如Coligan，(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene；和Harlow和Lane，(1989)AntibodiesA LaboratoryManualCold Spring Harbor Press?？梢詰?yīng)用免疫選擇法或耗竭法，以確保所得抗體對多肽復(fù)合物所呈遞的抗原決定簇是特異性的，而且所述抗原決定簇與各個組分自身所呈遞的抗原決定簇不同。可以制備多克隆血清或雜交瘤。在合適的情況下，所述結(jié)合試劑或者如上所述進(jìn)行標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記或其它標(biāo)記，或者固定化至基質(zhì)上用于淘選法。免疫選擇、免疫耗竭和相關(guān)技術(shù)可以根據(jù)需要用來制備選擇性試劑，例如所述兩種亞基間復(fù)合物的選擇性試劑。VI.IL-12 p40和IL-B30共沉淀在表達(dá)載體中制備小鼠IL-12 p40-Ig融合構(gòu)建體。所述Ig區(qū)與A蛋白結(jié)合，并且可以沉淀該多肽。也制備了IL-B30Etag(用FLAG基序在N末端附加的表位)構(gòu)建體，所述多肽可與M2抗體免疫沉淀。將僅帶有IL-12 p40-Ig構(gòu)建體、僅帶有IL-B30Etag構(gòu)建體或帶有這兩者的所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞中。細(xì)胞用35S甲硫氨酸標(biāo)記。僅帶有IL-12 p40構(gòu)建體，用A蛋白在細(xì)胞上清液中沒有檢測到可溶性蛋白。同樣，僅帶有FLAG-IL-B30構(gòu)建體，用M2抗體在細(xì)胞上清液中沒有檢測到可溶性蛋白。然而，用這兩種表達(dá)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染，細(xì)胞上清液產(chǎn)生可與或者A蛋白試劑或者M(jìn)2抗體沉淀的可溶性復(fù)合物。對該復(fù)合物的PAGE分析表明，A蛋白沉淀的復(fù)合物由對應(yīng)于所述兩種預(yù)期的多肽IL-12 p40-Ig融合體和FLAG-IL-B30多肽的多肽構(gòu)成。相應(yīng)的是，用M2抗體沉淀的復(fù)合物由FLAG-IL-B30多肽和IL-12 p40-Ig融合蛋白構(gòu)成。
用人IL-12 p40表達(dá)構(gòu)建體和人FLAG-IL-B30構(gòu)建體進(jìn)行的相似實驗提供了預(yù)期的結(jié)果。用FLAG-IL-B30構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，沒有產(chǎn)生顯著量的可溶性蛋白。將這兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到靈長類細(xì)胞中，導(dǎo)致有效地分泌可與M2抗體免疫沉淀的復(fù)合物。對所得復(fù)合物的PAGE分析確證了所述復(fù)合物由所述FLAG-IL-B30多肽和所述IL-12 p40多肽構(gòu)成。VII.受體的鑒定IL-12受體由IL-12受體亞基β1和β2構(gòu)成。P40/IL-B30的融合構(gòu)建體與表達(dá)受體亞基β1的細(xì)胞結(jié)合。
IL-12 p40亞基的同二聚體可以阻斷IL-12與小鼠亞基β1的結(jié)合，但不阻斷與亞基β2的結(jié)合。所述p40亞基是p40/IL-B30復(fù)合物的組分，因此測試IL-12受體亞基β1是否是p40/IL-B30融合構(gòu)建體受體的組分?？笽L-12受體亞基β1的抗體阻斷該融合構(gòu)建體與表達(dá)受體亞基β1的細(xì)胞的結(jié)合。針對p40/p70復(fù)合物的抗體主要識別所述p40亞基，可以阻斷p40/IL-B30組合物的效應(yīng)，提示所述p40組分在受體相互作用中是重要的。這些觀察結(jié)果提示，受體亞基β1與p40/IL-B30融合構(gòu)建體結(jié)合。測試是否涉及相關(guān)受體中共享的共同gp130亞基的類似實驗提示，gp130不是p40/IL-B30受體的相關(guān)亞基。
鑒定所述受體的一個亞基之后，已經(jīng)啟動了表達(dá)克隆工作。表達(dá)所述一種亞基、但未顯示結(jié)合的細(xì)胞用來表達(dá)克隆另一個亞基。正在篩選其它受體亞基β2的同系物?；蛘?，可以在標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)克隆方法中使用來自合適細(xì)胞的文庫。VIII.生物學(xué)功能廣度的評估例如根據(jù)IL-B30和IL-6和G-CSF之間的序列同源性和結(jié)構(gòu)同源性，測試p40/IL-B30復(fù)合物的生物活性。最初，檢查了已經(jīng)顯示IL-6或G-CSF生物活性的測定。對或者重組復(fù)合物或者融合構(gòu)建體進(jìn)行測定。融合構(gòu)建體由這樣的構(gòu)建體構(gòu)成，所述構(gòu)建體具有與N末端FLAG表位連接的IL-12 p40信號序列，末端FLAG表位與成熟IL-12 p40序列融合，成熟IL-12 p40序列與合適長度的富含ser/gly的接頭序列融合，所述接頭序列與成熟的IL-B30序列融合。該構(gòu)建體既可很好地表達(dá)和被分泌，所述附加表位又可使得能夠進(jìn)行純化和定位。產(chǎn)生小鼠序列和人序列兩種形式。既可獲得獨立的多肽的腺病毒表達(dá)構(gòu)建體，也可獲得融合蛋白的腺病毒表達(dá)構(gòu)建體。
靶細(xì)胞類型包括淋巴樣細(xì)胞類型、骨髓樣細(xì)胞類型、肥大細(xì)胞類型、前B細(xì)胞類型、前T細(xì)胞類型和成纖維細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞類型。例如，將評估巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記的改變，所述標(biāo)記例如II類MHC、B7、CD40和相關(guān)家族；細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生；和抗原呈遞能力。將測定CD4+T細(xì)胞-原初CD45Rb高和記憶CD45Rb低T細(xì)胞的例如生長和激活標(biāo)記以及效應(yīng)子功能，例如細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。將評估細(xì)胞毒性CD4+、CD8+和NK細(xì)胞對產(chǎn)生和功能的效應(yīng)。將例如在脾細(xì)胞和MLN B細(xì)胞上測試對抗體產(chǎn)生的效應(yīng)。將評估樹突細(xì)胞的產(chǎn)生、成熟和功能，包括因子的產(chǎn)生。也正在開發(fā)細(xì)胞凋亡測定。
將測試長期骨髓培養(yǎng)物對基質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞生成及分化調(diào)節(jié)的效應(yīng)(德克斯特培養(yǎng)法)、對基質(zhì)細(xì)胞和B細(xì)胞祖細(xì)胞生成及分化的調(diào)節(jié)(Whitlock-Witte培養(yǎng)法)和對調(diào)節(jié)原始骨髓樣群體和B淋巴樣群體潛力的評估。A.對細(xì)胞增殖的效應(yīng)用不同濃度的細(xì)胞因子，評估對各種細(xì)胞類型增殖的效應(yīng)。結(jié)合相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、G-CSF等進(jìn)行劑量反應(yīng)分析。可以使用檢測細(xì)胞代謝和生長的細(xì)胞傳感器(Mo1ecular Devices，Sunnyvale，CA)。
人p40/IL-B30融合蛋白增強(qiáng)用抗CD3或者用抗CD3和抗CD28刺激的人PHA未成熟細(xì)胞的增殖?？笴D3刺激看來是必不可少的。人p40/IL-B30融合蛋白也增強(qiáng)活化Th1或Th2細(xì)胞克隆的增殖，但不增強(qiáng)靜息Th1或Th2細(xì)胞克隆的增殖。
或者小鼠融合蛋白或者人融合蛋白作用于小鼠靶細(xì)胞上。融合蛋白支持用抗CD3刺激時的CD4+CD45Rb低CD62L低CD44高細(xì)胞(記憶/活化T細(xì)胞)的增殖。融合蛋白的刺激作用不為抗CD28共刺激所增強(qiáng)。這基本上不依賴于IL-2的存在。這提示p40/IL-B30對于具有記憶表型和/或產(chǎn)生或維持免疫記憶的細(xì)胞群體的擴(kuò)充可能是一個重要的因子。這種細(xì)胞因子看來選擇性地支持具有Th1表型的活化記憶細(xì)胞，例如產(chǎn)生IFNγ、但不產(chǎn)生IL-4或IL-5的細(xì)胞。B.對原初T細(xì)胞分化的效應(yīng)收集人臍帶血細(xì)胞，并且分離原初CD4+T細(xì)胞。在抗CD3和IL-2以及表達(dá)CD32、CD58 CD80的經(jīng)照射的成纖維細(xì)胞存在下，將這些細(xì)胞培養(yǎng)例如2周，由此激活T細(xì)胞并使其增殖。評估所述T細(xì)胞培養(yǎng)物的各種細(xì)胞因子對增殖或分化的效應(yīng)。通過FACS分析評估各種細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。所述p40/IL-B30融合蛋白支持產(chǎn)生IFNγ但不產(chǎn)生IL-4(一種Th1細(xì)胞特征性的細(xì)胞因子表達(dá)分布型)的T細(xì)胞的增殖和分化。C.對細(xì)胞表面分子表達(dá)的效應(yīng)通過負(fù)選擇，從正常健康供體的外周血單核細(xì)胞純化單核細(xì)胞。簡而言之，將3×108經(jīng)ficoll分帶分離的單核細(xì)胞與單克隆抗體混合物(Becton-Dickinson；Mountain View，CA)在冰上孵育，所述單克隆抗體混合物包含例如200μlαCD2(Leu-5A)、200μl oCD3(Leu-4)、100μlαCD8(Leu 2a)、100μlαCD19(Leu-12)、100μl αCD20(Leu-16)、100μloCD56(Leu-19)、100μlαCD67(IOM 67；Immunotech，Westbrook，ME)和抗血型糖蛋白抗體(10F7MN，ATCC，Rockville，MD)。洗滌抗體結(jié)合細(xì)胞，然后與羊抗小鼠IgG偶聯(lián)的磁珠(Dynal，Oslo，挪威)一起溫育，磁珠與細(xì)胞之比為20∶1。通過施加磁場，從單核細(xì)胞中分離抗體結(jié)合細(xì)胞。隨后，在缺乏或存在IL-B30、IL-6、G-CSF或組合的情況下，在含1％人AB血清的Yssel氏培養(yǎng)基(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)中培養(yǎng)人單核細(xì)胞。
通過直接免疫熒光，可以進(jìn)行細(xì)胞表面分子表達(dá)的分析。例如，將2×105純化的人單核細(xì)胞在含1％人血清的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中在冰上孵育20分鐘。以200×g沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞再懸浮于20ml PE或FITC標(biāo)記的mAb中。于冰上再孵育20分鐘后，細(xì)胞在含1％人血清的PBS中洗滌，然后在單獨的PBS中洗滌2次。將細(xì)胞在含1％低聚甲醛的PBS中固定，并在FACScan流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson；Mountain View，CA)上進(jìn)行分析。使用典型的mAb，例如得自Becton-Dickinson的CD11b(抗macl)、CD11c(一種gp150/95)、CD14(Leu-M3)、CD-54(Leu 54)、CD80(抗BB1/B7)、HLA-DR(L243)以及CD86(FUN1；Pharmingen)、CD64(32.2；Medarex)、CD40(mAb89；Schering-Plough法國)。D.對人細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的效應(yīng)如上所述分離人單核細(xì)胞，并在缺乏或存在IL-B30(1/100稀釋的桿狀病毒表達(dá)的物質(zhì))的情況下，在含1％人AB血清Yssel氏培養(yǎng)基(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)中培養(yǎng)。另外，在缺乏或存在IL-B30的情況下，用LPS(大腸桿菌0127B8 Difco)刺激單核細(xì)胞，并通過ELISA測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα、GM-CSF和IL-10)的濃度。
對于細(xì)胞因子的胞質(zhì)內(nèi)染色，在缺乏或存在IL-B30和LPS(大腸桿菌0127B8 Difco)和10mg/ml布雷菲德菌素A(Epicentre technologiesMadison WI)的情況下，在Yssel氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞(1×106/ml)12小時。在PBS中洗滌細(xì)胞，并在2％甲醛/PBS溶液中于室溫下孵育20分鐘。隨后將細(xì)胞洗滌，再懸浮于透化緩沖液(含0.5％皂苷(Sigma)的PBS/BSA(0.5％)/疊氮化物(1mM)溶液)中，于室溫下孵育20分鐘。將細(xì)胞(2×105)離心，于室溫下再懸浮于20ml直接綴合的抗細(xì)胞因子mAb中達(dá)20分鐘，所述mAb在透化緩沖液中以1∶10稀釋。可以使用以下抗體IL-1α-PE(364-3B3-14)；IL-6-PE(MQ2-13A5)；TNFα-PE(MAb11)；GM-CSF-PE(BVD2-21C11)；和IL-12-PE(C11.5.14；Pharmingen San Diego，CA)。隨后，將細(xì)胞在透化緩沖液中洗滌2次，在PBS/BSA/疊氮化物中洗滌1次，并在FACScan流式細(xì)胞儀(BectonDickinson；Mountain View，CA)上進(jìn)行分析。
人PHA未成熟細(xì)胞對與人p40/IL-B30融合構(gòu)建體接觸應(yīng)答而產(chǎn)生IFNγ。所述效應(yīng)與IL-2是協(xié)同的。融合產(chǎn)物增強(qiáng)活化T細(xì)胞的IFNγ產(chǎn)生，而不增強(qiáng)靜息T細(xì)胞-靜息Th1細(xì)胞克隆或靜息Th2細(xì)胞克隆的IFNγ產(chǎn)生。E.對人外周血單核細(xì)胞(PBMC)增殖的效應(yīng)如已描述的(Boyum等)，通過Ficoll-hypaque離心，從正常健康供體的血沉棕黃層分離總PBMC。在缺乏或存在IL-B30的情況下，將PBMC在96孔板(Falcon，Becton-Dickinson，NJ)中的200μl含1％人AB血清的Yssel氏培養(yǎng)基(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)中培養(yǎng)。將細(xì)胞在單獨的培養(yǎng)基中或結(jié)合100 U/ml IL-2(R&D Systems)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)120小時。在培養(yǎng)的最后6小時期間加入3H-胸苷(0.1 mCi)，通過液閃計數(shù)測定3H-胸苷的摻入。
可以在許多其它生物測定系統(tǒng)中，例如在T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、造血祖細(xì)胞等上，測試所述天然、重組和融合的蛋白的激動劑活性和拮抗劑活性。因為IL-6和G-CSF的結(jié)構(gòu)關(guān)系，應(yīng)該分析與那些活性相關(guān)的測定。
在表達(dá)IL-6或G-CSF受體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照上，評估p40/IL-B30的激動劑活性或拮抗劑活性。參見例如Ho等，(1993)Proc.Natl Acad.Sci.USA90，11267-11271；Ho等，(1995)Mol.Cell.Biol.155043-5053；和Liu等(1994)J.Immunol.1521821-1829。
評估p40/IL-B30在對抗原或同種異型刺激物應(yīng)答的巨噬細(xì)胞/樹突細(xì)胞活化和抗原呈遞測定、T細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生和增殖方面的效應(yīng)。參見例如de Waal Malefyt等，(1991)J.Exp.Med1741209-1220；deWaal Malefyt等，(1991)J.Exp.Med.174915-924；Fiorentino等，(1991)J.Immunol.147，3815-3822；Fiorentino等，(1991)J.Immunol.1463444-3451；和Groux等，(1996)J.Eep.Med.18419-29。
也將評估p40/IL-B30對NK細(xì)胞刺激的效應(yīng)。測定可以基于例如Hsu等，(1992)Internat.Immunol.4563-569；和Schwarz等，(1994)J.Immunother.1695-104。
將例如通過在Defrance等，(1992)J.Exp.Med.175671-682；Rousset等，(1992)Proc.Natl Acad.Sci.USA891890-1893中描述的方法，包括IgG2和IgA2開關(guān)因子測定，分析B細(xì)胞生長和分化效應(yīng)。IX.遺傳改變動物的產(chǎn)生和分析可以用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。這種動物可用來測定在特定組織或在整個所述生物中該基因過量表達(dá)的效應(yīng)。這種動物可以提供對該動物或特定組織在各個階段中發(fā)育的有趣的了解。此外，可以評估對生物脅迫的各種應(yīng)答的影響。參見例如Hogan等，(1995)Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual(第2版)Cold Spring HarborLaboratory Press。
可獲得用于在各種細(xì)胞和器官中表達(dá)所述基因的腺病毒技術(shù)。參見例如Hitt等，(1997)Adv.Pharmacol.40137-195；和來自QuantumBiotechnologies，Montreal，Canada的文獻(xiàn)。動物可以用來測定所述基因?qū)τ胁煌l(fā)育或生理功能的動物系統(tǒng)的效應(yīng)。
將編碼IL-B30的0.5 kb cDNA作為EcoRI片段克隆到先前由Niwa等，(1991)Gene108193-200描述的表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體含有CMV增強(qiáng)子β-肌動蛋白啟動子和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信號?？梢园凑誐ann等，(1993)“Factor Influencing Production Frequency ofTransgenic Mice”，Methods in Enzymology225771-781的描述，通過區(qū)帶蔗糖梯度離心，完成從載體序列分離所述轉(zhuǎn)基因。合并含有所述轉(zhuǎn)基因的部分，通過Microcon-100濾膜微量離心，然后用微注射緩沖液(5mM Tris-HCl，pH7.4，5mM NaCl，0.1mM EDTA)洗滌5次。
將轉(zhuǎn)基因重懸于微注射緩沖液(5mM Tris-HCl，pH7.4，5mM NaCl，0.1mM EDTA)，至終濃度1-5ng/ml，將其微注射到([C57BL/6J xDBA/2]F1；The Jackson Laboratory)卵中，然后按照Hogan等，(1994)Manipulation of the Mouse Embryo，Plainview，NY，Cold Spring HarborLaboratory Press公開的方法，將卵轉(zhuǎn)移到ICR(Sprague-Dawley)代母的輸卵管中。到10天大時，剪下所產(chǎn)動物的一段尾部用于DNA分析。如先前Lira等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，877215-7219的描述，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因建立者的鑒定。通過小鼠尾部DNA的擴(kuò)增完成IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定。使用內(nèi)源LDL基因的引物作為擴(kuò)增反應(yīng)的內(nèi)部對照。所述引物擴(kuò)增IL-B30轉(zhuǎn)基因的200bp區(qū)段和所述LDL基因的397bp區(qū)段。PCR條件是95℃30秒；60℃30秒；72℃60秒，進(jìn)行30個循環(huán)。將轉(zhuǎn)基因動物保持在無病原體的條件下。IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的分析用RNA STAT-60，按照生產(chǎn)商(TEL-TEST，Inc.Friendswood，TX)的說明，從組織提取RNA。將總RNA(20mg)變性，吸印到Biotrans膜(ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA)上。通過與隨機(jī)標(biāo)記的L-30 cDNA(Stratagene，La Jolla，CA)雜交，評價轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。通過總RNA與隨機(jī)標(biāo)記的鼠血紅素結(jié)合蛋白基因、鼠α-1酸性糖蛋白基因和鼠觸珠蛋白基因的PCR區(qū)段雜交，評價急性期肝基因表達(dá)。
從商業(yè)來源購買ELISA試劑盒，按照廠商的說明進(jìn)行ELISA。鼠IL-2(靈敏度＜3pg/ml)、鼠IL-1b(靈敏度＜3pg/ml)、鼠IFN-γ(靈敏度＜2 pg/ml)和鼠TNF-α(靈敏度＜5.1pg/ml)的ELISA試劑盒購自R&Dsystems(Minneapolis，MN)。鼠IL-6 ELISA試劑盒(靈敏度＜8pg/ml)購自Biosource Intemational(Camarillo，CA)。鼠IL-1αELISA試劑盒(靈敏度＜6pg/ml)購自Endogen(Cambridge，MA)。
用購自PharMingen(San Diego，CA)的抗體對，按照廠商的指南，進(jìn)行血清免疫球蛋白水平的ELISA分析?？剐∈驣gM(克隆11/41)、抗小鼠IgA(克隆R5-140)、抗小鼠IgG1(克隆A85-3)、抗小鼠IgG2a(克隆R11-89)和抗小鼠IgG2b(克隆R9-91)用作捕獲抗體。純化的小鼠IgM(克隆G155-228)、IgA(克隆M18-254)、IgG1(克隆107.3)、IgG2a(克隆G155-178)和IgG2b(克隆49.2)用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。生物素抗小鼠IgM(克隆R6-60.2)、生物素抗小鼠IgA(克隆R5-140)、生物素抗小鼠IgG1(克隆A85-1)、生物素抗小鼠IgG2a(克隆R19-15)和生物素抗小鼠IgG2b(克隆R12-3)用作檢測抗體。
采用用于人IGF-1、在用酸-乙醇提取血清樣品后也識別鼠IGF-1的市售放射免疫測定，按照廠商(Nichols Institute，San Juan Capistrano，CA)提供的說明，測定小鼠血清的IGF-1水平。
處死小鼠后，或者用冷凍切片的冷凍介質(zhì)將組織速凍，或者通過在10％磷酸緩沖福爾馬林中浸漬將組織固定。將福爾馬林固定組織按照常規(guī)以5mm加工，用蘇木精和曙紅(H&E)染色。為了進(jìn)行免疫染色，用丙酮固定速凍的切片并將其風(fēng)干。
從眶下靜脈竇將血液樣品收集到無菌、抽空的加有EDTA的試管(Vacutainer Systems，Becton Dickinson，Rutherford，NJ)中。用自動系統(tǒng)(Abbot Cell-Dyn 3500，Abbot Park，IL)測定血液學(xué)數(shù)值。當(dāng)由于血小板過于聚集或過大致使儀器不能提供精確的血小板計數(shù)時，人工進(jìn)行血小板計數(shù)。采用自動染色器(Bayer Hema-Tek 2000，Elkhart，IN)，將血涂片用Modified Wright-Giemsa stain(Hema-Tek Stain Pack，Bayer Corp.，Elkhart，IN)染色，然后人工檢查未成熟的細(xì)胞和血小板、紅細(xì)胞和白細(xì)胞形態(tài)。骨髓轉(zhuǎn)移清除股骨和脛骨的肌肉，通過用PBS沖洗骨頭排出骨髓。將骨髓細(xì)胞洗滌1次，靜脈注射到已經(jīng)過致死照射(1000 RAD)的受體小鼠體內(nèi)。IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的表型為了分析IL-B30的生物學(xué)功能，如Niwa等，(1991)Gene108193-200所述，將該基因在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)在CMV增強(qiáng)子/肌動蛋白啟動子控制之下表達(dá)。這種增強(qiáng)子/啟動子盒將高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)主要導(dǎo)向骨骼肌和胰腺，但該轉(zhuǎn)基因事實上可以在所有器官和細(xì)胞中表達(dá)。參見Lira等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA877215-7219。
與對照同窩小鼠相比，IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)育不良。IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的體重增重率變化大，但明顯低于在對照同窩小鼠中發(fā)現(xiàn)的增重率。從IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠和對照同窩小鼠的肌肉或皮膚提取的RNA與IL-B30 cDNA雜交的RNA印跡分析揭示，在所有IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉和皮膚中均檢測到IL-B30 mRNA，而在對照同窩小鼠中沒有檢測到IL-B30 mRNA。這證明生長緩慢總是與IL-B30的表達(dá)相關(guān)。
在所獲得的IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中，25％存活至成年，并且受IL-B30表達(dá)的影響，表現(xiàn)為生長減慢、腹脹、毛皮起皺、不育和突然死亡。因此，IL-B30的轉(zhuǎn)基因表達(dá)引起阻止IL-B30轉(zhuǎn)基因后代產(chǎn)生的表型。在此介紹的結(jié)果得自IL-B30轉(zhuǎn)基因建立者小鼠的初步分析。IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的組織學(xué)分析從IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠收集的組織的顯微鏡檢查表明在包括肺、皮膚、食管、小腸和肝(膽管)、大腸和胰臟在內(nèi)的多個部位中由輕度至中度的炎癥。炎性浸潤物由嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞組成。在某些小鼠中，皮膚炎癥與棘皮癥和/或潰瘍有關(guān)。在肺中，支氣管周單核細(xì)胞浸潤物有時是主要的，肺泡壁含有的白細(xì)胞數(shù)目增加，襯于氣道內(nèi)的上皮增生。在肝中也常見最小的門靜脈周單核細(xì)胞浸潤物。淋巴結(jié)皮質(zhì)有時細(xì)胞稀少并且缺乏卵泡發(fā)育。
在肝、脾和淋巴結(jié)中觀察到髓外造血(EMH)。EMH在脾中尤為顯著。在T細(xì)胞(抗CD3)、B細(xì)胞(抗B220)和巨噬細(xì)胞(抗F4/80)的免疫組織學(xué)染色后，檢查了得自三只轉(zhuǎn)基因小鼠和一只對照小鼠的脾。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，CD3、B220和F4/80陽性細(xì)胞出現(xiàn)在其正常的位置。然而，白髓被紅髓中的EMH分隔，紅髓中的陽性染色細(xì)胞中點綴有用所述各種抗體染色強(qiáng)度較弱或染色非陽性的造血細(xì)胞。這些觀察結(jié)果證明，IL-B30的轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)與EMH相關(guān)的系統(tǒng)炎癥。
為了分析IL-B30對外周血中淋巴細(xì)胞和血小板計數(shù)的影響，進(jìn)行了全血分析。與對照同窩小鼠中的最高嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)相比，IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠血液中的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目增加3-11倍。外周血嗜中性粒細(xì)胞的增加通常是炎癥，并且與各種組織中觀察到的嗜中性粒細(xì)胞的浸潤有關(guān)。因此，骨髓中骨髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)/紅細(xì)胞類比率增加。
另外，與對照同窩小鼠相比，在IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中循環(huán)血小板數(shù)目增加多達(dá)3倍。血小板數(shù)目增加可能源于或者巨核細(xì)胞數(shù)目增加，或者源于巨核細(xì)胞的血小板產(chǎn)生增加。為了測試任一種可能性，用顯微鏡分析了得自IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血、骨髓和脾。在外周血中，常常檢查到奇異形態(tài)的血小板，包括伸長的和紡錘形血小板。在某些小鼠的骨髓和脾中，巨核細(xì)胞由于胞質(zhì)量增加而變大。相反，在骨髓和脾中巨核細(xì)胞數(shù)目沒有增加。這提示，IL-B30通過促進(jìn)巨核細(xì)胞的血小板產(chǎn)生而增強(qiáng)血小板數(shù)目。
所檢查的所有IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠也都患有輕度至中度帶有裂紅細(xì)胞的低色小紅細(xì)胞性貧血和不同程度的再生證據(jù)。血細(xì)胞比容值比對照平均數(shù)低36-70％。低色小紅細(xì)胞性貧血的存在提示血紅蛋白產(chǎn)生缺乏。IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞因子分布型為了測試在IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的系統(tǒng)炎癥是否與促炎細(xì)胞因子表達(dá)的改變有關(guān)，我們測定了外周血中IL-1、TNFα、IL-6和IFNγ的濃度。在所測試的所有IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中，TNFα和IFNγ的水平均增加。另外，在所測試的25％的IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中，IL-1水平增加。在IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)的IL-1和TNFα的濃度所達(dá)到的水平與LPS對急性炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)相關(guān)。令人驚訝的是，在IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血中沒有檢測到IL-6，即使在炎癥條件下IL-6的表達(dá)被高度誘導(dǎo)(Reinecker等，(1993)Clin.Exp.Immunology94174-181；Stevens等，(1992)Dig.Dis.Sci.37818-826)，并且可以被TNFα、IL-1和IFNγ直接誘導(dǎo)(Helle等，(1988)Eur.J.Immunol.18957-959。IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠肝中的急性期基因機(jī)體對炎癥作出反應(yīng)，急性期反應(yīng)的特征為在肝中表達(dá)特定的血漿蛋白。由于IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出系統(tǒng)炎癥特征性的表型，因此我們檢查了IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠和對照同窩小鼠肝中的急性期基因表達(dá)。急性期肝基因α-1酸性糖蛋白、觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白在所測試的所有IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中均高度表達(dá)，而在對照同窩小鼠中沒有檢測到這些基因的表達(dá)。這證明急性期肝基因在IL-B30轉(zhuǎn)基因動物中為組成型表達(dá)。IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的血清免疫球蛋白在免疫應(yīng)答期間，某些細(xì)胞因子誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和后續(xù)的免疫球蛋白合成。為了在IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中測試免疫球蛋白合成是否改變，測定了外周血中免疫球蛋白同種型的濃度。在7只IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中的2只中，IgA的濃度與對照同窩小鼠相比增加6-9倍。此外，與對照同窩小鼠相比，在所測試的所有IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中IgG1、IgG2a和IgG2b的濃度增加2.5-6倍。相反，在所測試的任一只IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中，都沒有檢測到IgM或IgE效價的顯著增加。事實上，7只IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中的4只顯示出IgM合成水平顯著降低?？偠灾粋€亞群的IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出免疫球蛋白同種型IgA和IgG的濃度增加6-9倍，而沒有檢測到免疫球蛋白同種型IgM和IgE濃度的顯著增加。IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中血清IGF-1水平慢性炎癥(Kirschner和Sutton，(1986)Gastroenterology91830-836；Laursen等，(1995)Arch.Dis.Child.72494-497)或細(xì)胞因子在轉(zhuǎn)基因動物中過量表達(dá)(De Benedetti等，(1994)J.Clin.Invest.932114-2119)可以引起與胰島素樣生長因子-1(IGF-1)減少相關(guān)的生長減慢。為了測試IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的生長緩慢是否可以追蹤至IGF-1水平降低，分析了轉(zhuǎn)基因小鼠血清樣品的IGF-1。在所測試的所有IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中，血清中的IGF-1量是年齡相當(dāng)?shù)膶φ胀C小鼠水平的12-14％。這提示，IL-B30的轉(zhuǎn)基因表達(dá)以及后續(xù)所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的IGF-1減少，并且可能因此是生長緩慢和不育的原因(Gay等，(1997)Endocrinology137(7)2937-2947)。生物活性IL-B30在造血細(xì)胞中的表達(dá)細(xì)胞因子是局部調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)或介導(dǎo)遠(yuǎn)程效應(yīng)的分泌型蛋白。為了測試IL-B30是否作為細(xì)胞因子起作用以及是否可以誘導(dǎo)遠(yuǎn)距離多器官炎癥和急性期肝反應(yīng)，我們將IL-B30轉(zhuǎn)基因骨髓轉(zhuǎn)移到經(jīng)致死照射的野生型受體小鼠體內(nèi)。
每周監(jiān)測骨髓受體的急性期反應(yīng)的誘導(dǎo)。在IL-B30骨髓受體中早在轉(zhuǎn)移后35天時，可以檢測到急性期蛋白SAA濃度的增加，并且SAA水平隨時間而增加。在外周血SAA濃度增加的同時，根據(jù)出現(xiàn)毛皮起皺和鼻口部和咽喉周圍的皮膚發(fā)炎來判斷，IL-B30骨髓受體的健康狀況惡化。相反，野生型骨髓受體血液中的SAA水平?jīng)]有升高，它們看來也沒有病。
當(dāng)動物出現(xiàn)重病時，將其生命終結(jié)。在IL-B30轉(zhuǎn)基因骨髓受體的骨髓和脾中可以檢測到IL-B30的表達(dá)，但在野生型骨髓受體的器官中沒有檢測到所述表達(dá)。同在IL-B30轉(zhuǎn)基因供體中一樣，在IL-B30轉(zhuǎn)基因骨髓受體體內(nèi)，皮膚、肺、肝和胃腸道發(fā)炎，但在野生型骨髓受體中沒有發(fā)炎。在IL-B30轉(zhuǎn)基因骨髓受體中急性期肝基因(血紅素結(jié)合蛋白，AGP-1)又是高度表達(dá)，但在血清中不能檢測到IL-6。這些結(jié)果提示，IL-B30是真正的具有遠(yuǎn)程特性的細(xì)胞因子。
IL-B30的轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)顯著的表型，其特征為轉(zhuǎn)基因動物發(fā)育不良、系統(tǒng)炎癥、不育和死亡。IL-B30轉(zhuǎn)基因動物患有系統(tǒng)炎癥，炎性細(xì)胞浸潤到肺、肝、皮膚和消化道中。
IL-B30的體內(nèi)過量表達(dá)引起生長減慢和炎癥的表型，這明顯與IL-6轉(zhuǎn)基因表達(dá)的幾種模型的表型相似。與IL-6轉(zhuǎn)基因表達(dá)或?qū)⒅亟MIL-6給予小鼠后的效應(yīng)相似，由于IL-B30的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在動物中觀察到嗜中性粒細(xì)胞浸潤和貧血。同IL-6轉(zhuǎn)基因動物一樣，IL-B30轉(zhuǎn)基因建立者的生長減慢與IGF-1水平降低有關(guān)，IGF-1可能與在這些動物中觀察到的系統(tǒng)炎癥有關(guān)。
IL-B30轉(zhuǎn)基因動物的這種表型可以是由于或者IL-B30過量表達(dá)的直接效應(yīng)或者由于IL-B30介導(dǎo)的對IL-1和TNFα表達(dá)的正調(diào)節(jié)引起的對IL-6表達(dá)的正調(diào)節(jié)所致。IL-1和TNFα是已知的IL-6的誘導(dǎo)物，在IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血中發(fā)現(xiàn)了TNFα和IL-1的濃度增加。
然而，在IL-B30轉(zhuǎn)基因動物的血液中沒有檢測到IL-6，這提示IL-B30動物的表型與這種新細(xì)胞因子的過量表達(dá)直接相關(guān)，并且正如其序列同源性所暗示的，IL-B30具有與IL-6相似的生物活性。
IL-6是一種多效細(xì)胞因子，具有多種功能，它誘導(dǎo)血小板增多，急性期蛋白合成和B細(xì)胞分化。
實際上，IL-B30轉(zhuǎn)基因動物組成型地表達(dá)急性期肝基因，如AGP-1、觸珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白和血清淀粉狀蛋白A蛋白。在小鼠中由于IL-6轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)的效應(yīng)，或在給予重組IL-6之后，已經(jīng)顯示出相似的表型。另外，IL-B30的轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致不尋常的血小板增多，因為許多所述血小板具有奇異的形態(tài)(伸長的外觀、尺寸大和/或紡錘形)。我們猜想，IL-B30和/或其它被正調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子對正常的血小板產(chǎn)生有影響。這再次提示，IL-B30與IL-6及其相關(guān)物共享一種生物活性。
IL-6也已經(jīng)被鑒定為B細(xì)胞分化因子。IL-6的轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)引起漿細(xì)胞瘤，而缺乏IL-6的小鼠表現(xiàn)出IgG應(yīng)答降低。雖然我們在某些IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到IgG和IgA產(chǎn)生的增加，但這一觀察結(jié)果在不同的建立者之間是不一致的。因此，需要進(jìn)一步的分析，來進(jìn)一步鑒定IL-B30為潛力的B細(xì)胞分化因子。
在IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中，循環(huán)嗜中性粒細(xì)胞增加與各種組織中的炎癥證據(jù)一致，然而，不容易解釋紅細(xì)胞參數(shù)的改變。IL-1、TNF-α和IFN-γ是通常稱為慢性貧血癥(ACD)的綜合征的介質(zhì)，ACD通常表現(xiàn)為正常紅細(xì)胞性低色非再生性(或最低再生性)貧血癥，在多種慢性炎癥中可見到。慢性貧血癥在某些病人中也可以表現(xiàn)為低色小紅細(xì)胞。這種綜合征是由于鐵代謝改變和對紅細(xì)胞生成素應(yīng)答減弱所致。外周細(xì)胞因子濃度增加提示，在IL-B30小鼠中觀察到的低色小紅細(xì)胞性貧血可能是由于ACD所致。然而，低色小紅細(xì)胞性貧血的最常見的病因是鐵缺乏，這與IL-B30小鼠中觀察到的部分骨髓應(yīng)答(再生)和血小板增多更為一致。由于難以從受影響小鼠獲取合適的血液，因此尚未進(jìn)行進(jìn)一步的研究，包括對可能使得從鐵缺乏性貧血分化為ACD的血清鐵蛋白、鐵和總鐵結(jié)合能力的測量。
IL-1和TNF-α是已知的IL-6表達(dá)的誘導(dǎo)物，IL-6的表達(dá)通常在炎性反應(yīng)期間被正調(diào)節(jié)。因此，令人驚訝的是，在IL-B30轉(zhuǎn)基因動物的外周血中不能檢測到IL-6。這提示，IL-B30通過尚未鑒定的機(jī)制對IL-6表達(dá)具有負(fù)效應(yīng)。實際上，IL-B30轉(zhuǎn)基因動物中缺乏IL-6可能解釋了在這些動物中觀察到的高水平的IL-1和TNF-α，因為IL-6對小鼠體內(nèi)循環(huán)IL-1和TNF-α的濃度具有負(fù)效應(yīng)。在IL-B30轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的高濃度的循環(huán)TNF-α也可以是IFN-γ濃度增加的結(jié)果。IFN-γ由IL-2活化T細(xì)胞或IL-4活化B細(xì)胞產(chǎn)生，誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的TNF-α的表達(dá)。仍有待檢測IFN-γ的表達(dá)是否由IL-B30直接介導(dǎo)，或由IL-B30誘導(dǎo)的其它細(xì)胞因子直接介導(dǎo)。總之，我們的結(jié)果提示，IL-B30與IL-6共享許多生物活性。仍有待了解這些生物活性是否由與IL-6共享的一種共同受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件或轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)。這些問題有希望通過進(jìn)行之中的采用遺傳學(xué)方法和生物化學(xué)方法的實驗來闡明。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中，對于所有的目的，其程度與具體和單獨地表明每個單獨的出版物或?qū)＠暾埻ㄟ^引用結(jié)合到本文中的程度一樣。
在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行許多修改和變化，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。提供本文描述的具體實施方案僅僅是舉例說明，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的條款以及這些權(quán)利要求賦予的等同條款的全部范圍的限制。
權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包含a)以下兩者i)一種大致純的多肽，所述多肽包含得自IL-12 p40的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；和ii)一種大致純的多肽，所述多肽包含得自IL-B30的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；b)以下兩者i)一種大致純的多肽，所述多肽包含得自IL-12 p40的至少11個連續(xù)氨基酸；和ii)一種大致純的多肽，所述多肽包含得自IL-B30的至少11個連續(xù)氨基酸；c)一種大致純的多肽，所述多肽包含以下兩者i)IL-12 p40的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；和ii)IL-B30的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；或d)一種大致純的多肽，所述多肽包含以下兩者i)IL-12 p40的一個至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；和ii)IL-B30的一個至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段。
2.權(quán)利要求1的組合物a)其中所述多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段包括一個至少9個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；b)其中所述多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段是兩個至少9個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；c)其中所述IL-12 p40的至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段至少有15個連續(xù)氨基酸；d)其中所述IL-B30的至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段至少有15個連續(xù)氨基酸；e)還包含一種選自水性化合物的載體，包括水、鹽水和/或緩沖液；f)配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；或g)所述組合物是無菌組合物。
3.一種權(quán)利要求1的組合物a)其中所述多肽中的至少一種i)是可檢測標(biāo)記的；ii)是重組產(chǎn)生的；iii)未經(jīng)糖基化；iv)是變性的；v)連接于固體基質(zhì)；或vi)與另一化學(xué)部分綴合；b)包含以下兩者i)一種大致純的IL-12 p40多肽；和i)一種大致純的IL-B30多肽；c)包含一種大致純的含與IL-B30融合的IL-12 p40的多肽；或d)與IL-18、IL-12、放射或化學(xué)療法、免疫佐劑或抗病毒劑聯(lián)合。
4.一種試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1的組合物和a)一個包含所述多肽的區(qū)室；或b)關(guān)于所述試劑盒中試劑的使用或處理的說明。
5.一種分離的或重組的核酸，所述核酸編碼a)以下兩者i)一種大致純的多肽，所述多肽包含得自IL-12 p40的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；和ii)一種大致純的多肽，所述多肽包含得自IL-B30的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；b)以下兩者i)一種大致純的多肽，所述多肽包含得自IL-12 p40的至少11個連續(xù)氨基酸；和ii)一種大致純的多肽，所述多肽包含得自IL-B30的至少11個連續(xù)氨基酸；c)一種大致純的多肽，所述多肽包含以下兩者i)IL-12 p40的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；和ii)IL-B30的多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段；或d)一種大致純的多肽，所述多肽包含以下兩者i)IL-12 p40的一個至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；和ii)IL-B30的一個至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段。
6.權(quán)利要求5的核酸a)其中所述多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段包括一個至少9個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；b)其中所述多個至少7個連續(xù)氨基酸的不同區(qū)段是兩個至少9個連續(xù)氨基酸的區(qū)段；c)其中所述IL-12 p40的至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段至少有15個連續(xù)氨基酸；d)其中所述IL-B30的至少11個連續(xù)氨基酸的區(qū)段至少有15個連續(xù)氨基酸；e)其中所述IL-12 p40得自靈長類；f)其中所述IL-B30得自靈長類；g)所述核酸是一種表達(dá)載體；h)所述核酸還包含一個復(fù)制起點；i)所述核酸包含一個可檢測標(biāo)記；j)所述核酸包含合成核苷酸序列；k)所述核酸小于6kb，最好小于3kb；或l)所述核酸得自靈長類。
7.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求6的所述重組核酸。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是a)原核細(xì)胞；b)真核細(xì)胞；c)細(xì)菌細(xì)胞；d)酵母細(xì)胞；e)昆蟲細(xì)胞；f)哺乳動物細(xì)胞；g)小鼠細(xì)胞；h)靈長類細(xì)胞；或i)人類細(xì)胞。
9.一種試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求6的所述核酸和a)一個包含所述核酸的區(qū)室；b)一個還包含一種靈長類IL-12 p40多肽的區(qū)室；或c)一個還包含一種靈長類IL-B30多肽的區(qū)室；或d)關(guān)于所述試劑盒中試劑的使用或處理的說明。
10.一種核酸，所述核酸a)在50℃和低于1M鹽的30分鐘洗滌條件下與靈長類IL-12 p40的天然成熟編碼部分雜交；和b)在50℃和低于1M鹽的30分鐘洗滌條件下與靈長類IL-B30的天然成熟編碼部分雜交。
11.權(quán)利要求10的核酸，其中a)用于IL-12 p40的所述洗滌條件是60℃和低于400mM的鹽；b)用于IL-B30的所述洗滌條件是60℃和低于400mM的鹽；c)所述核酸在一個至少50個核苷酸的序列段內(nèi)表現(xiàn)出與編碼靈長類IL-12 p40的序列有同一性；和/或d)所述核酸在一個至少50個核苷酸的序列段內(nèi)表現(xiàn)出與編碼靈長類IL-B30的序列有同一性。
12.權(quán)利要求10的核酸，其中a)用于IL-12 p40的所述洗滌條件是65℃和低于150mM的鹽；b)用于IL-B30的所述洗滌條件是65℃和低于150mM的鹽；c)所述核酸在一個至少90個核苷酸的序列段內(nèi)表現(xiàn)出與編碼靈長類IL-12 p40的序列有同一性；和/或d)所述核酸在一個至少90個核苷酸的序列段內(nèi)表現(xiàn)出與編碼靈長類IL-B30的序列有同一性。
13.一種與以下物質(zhì)聯(lián)合的IL-12 p40/IL-B30的拮抗劑a)TNFα拮抗劑；b)IL-12拮抗劑；c)IL-10；或d)類固醇。
14.一種結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物包含來自抗體的抗原結(jié)合部位，所述結(jié)合化合物與權(quán)利要求1的組合物特異性地結(jié)合，但不與或者IL-12 p40或IL-B30多肽特異性地結(jié)合，所述組合物a)包含一種大致純的多肽，所述多肽包含以下兩者i)一種大致純的IL-12 p40多肽；和ii)一種大致純的IL-B30多肽；或b)包含一種大致純的多肽，所述多肽包含與IL-B30融合的IL-12p40。
15.權(quán)利要求14的結(jié)合化合物，其中a)所述結(jié)合化合物在一個容器中；b)所述結(jié)合化合物是Fv、Fab或Fab2片段；c)所述結(jié)合化合物與另一化學(xué)部分綴合；或e)所述抗體i)是針對權(quán)利要求1的組合物產(chǎn)生的；ii)是經(jīng)免疫選擇的；iii)是一種多克隆抗體；iv)表現(xiàn)出與抗原的Kd至少為30mM；v)連接于固體基質(zhì)，包括微珠或塑料膜；vi)處于無菌組合物中；或vii)是可檢測標(biāo)記的，包括放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。
16.一種試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求15的所述結(jié)合化合物和a)一個包含所述結(jié)合化合物的區(qū)室；或b)關(guān)于所述試劑盒中試劑的使用或處理的說明。
17.一種產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物的方法，所述方法包括在合適條件下使靈長類IL-12 p40/IL-B30組合物與一種權(quán)利要求14的抗體接觸，由此讓所述復(fù)合物形成。
18.權(quán)利要求17的方法，其中a)從其它細(xì)胞因子中純化所述復(fù)合物；b)從其它抗體中純化所述復(fù)合物；c)所述接觸是與包含一種細(xì)胞因子的樣品接觸；d)所述接觸使得可以定量檢測所述抗原；e)所述接觸是與包含所述抗體的樣品接觸；或f)所述接觸使得可以定量檢測所述抗體。
19.一種組合物，所述組合物包含a)一種權(quán)利要求14的無菌結(jié)合化合物；或b)所述權(quán)利要求14的結(jié)合化合物和一種載體，其中所述載體是i) 一種水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或ii)配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。
20.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織的生理學(xué)或發(fā)育的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與權(quán)利要求1的組合物或其拮抗劑接觸。
21.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理學(xué)或發(fā)育的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與權(quán)利要求1的組合物接觸，并且所述接觸導(dǎo)致IFNγ的產(chǎn)生增加。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)胞在宿主生物體內(nèi)，并且所述生物表現(xiàn)出Th1應(yīng)答增強(qiáng)。
23.權(quán)利要求22的方法，所述Th1應(yīng)答選自a)抗腫瘤效應(yīng)；b)佐劑效應(yīng)；c)抗病毒效應(yīng)；或d)拮抗過敏的效應(yīng)。
24.一種調(diào)節(jié)宿主生物體內(nèi)細(xì)胞的生理學(xué)或發(fā)育的方法，所述方法包括給予所述生物一種權(quán)利要求1的組合物，其中所述接觸導(dǎo)致a)抗腫瘤效應(yīng)；b)佐劑效應(yīng)；c)抗病毒效應(yīng)；或d)拮抗過敏的效應(yīng)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述接觸與以下聯(lián)合a)IL-18；b)IL-12；c)放射療法或化學(xué)療法；d)免疫佐劑；或e)抗病毒治療劑。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述拮抗劑是抗IL-12受體亞基β1的抗體。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述接觸是與拮抗劑接觸，并且所述接觸導(dǎo)致IFNγ的產(chǎn)生相對減少。
28.一種調(diào)節(jié)宿主生物體內(nèi)細(xì)胞的生理學(xué)或發(fā)育的方法，所述方法包括將所述拮抗劑給予所述生物，其中所述接觸導(dǎo)致以下病癥的緩解a)自身免疫??；或b)慢性炎癥。
29.一種增加以下物質(zhì)分泌的方法a)一種靈長類IL-B30，所述方法包括表達(dá)所述多肽與IL-12p40；或b)一種靈長類IL-12 p40，所述方法包括表達(dá)所述IL-12 p40與IL-B30。
30.權(quán)利要求28的方法，其中a)所述增加是至少3倍；或者b)所述表達(dá)是表達(dá)一種編碼IL-B30和IL-12 p40的重組核酸。
31.一種篩選結(jié)合權(quán)利要求3的所述組合物的受體的方法，所述方法包括使所述復(fù)合物與表達(dá)所述受體的細(xì)胞在允許所述復(fù)合物與所述受體結(jié)合的條件下接觸，由此形成可檢測的相互作用。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述相互作用導(dǎo)致所述細(xì)胞內(nèi)的一種生理學(xué)反應(yīng)。
33.一種調(diào)節(jié)動物體內(nèi)炎癥反應(yīng)的方法，所述方法包括使所述動物體內(nèi)的細(xì)胞與治療量的以下物質(zhì)接觸a)哺乳動物IL-B30蛋白的激動劑；或b)哺乳動物IL-B30蛋白的拮抗劑。
34.權(quán)利要求33的方法，其中a)所述哺乳動物IL-B30蛋白是一種靈長類蛋白質(zhì)；或b)所述拮抗劑是與所述哺乳動物IL-B30結(jié)合的抗體；c)所述拮抗劑是阻斷哺乳動物IL-B30所介導(dǎo)信號的抗體。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述動物表現(xiàn)出急性期炎癥反應(yīng)的體征或癥狀。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述體征或癥狀在皮膚組織、肺組織、胃腸組織或肝組織中發(fā)現(xiàn)。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述體征或癥狀在皮膚組織、肺組織、胃腸組織或肝組織中發(fā)現(xiàn)。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述調(diào)節(jié)是加速嗜中性粒細(xì)胞成熟為血小板。
39.權(quán)利要求33的方法，其中所述調(diào)節(jié)對IgA有影響。
40.權(quán)利要求33的方法，其中所述調(diào)節(jié)對IgG有影響。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述給藥是給予所述激動劑。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述給藥是給予所述激動劑。
43.權(quán)利要求40的方法，其中所述給藥是給予所述激動劑。
44.權(quán)利要求41的方法，其中a)所述激動劑是哺乳動物IL-B30蛋白；或b)所述動物正經(jīng)歷炎癥的體征或癥狀。
45.權(quán)利要求42的方法，其中a)所述激動劑是哺乳動物IL-B30蛋白；或b)所述動物正經(jīng)歷炎癥的體征或癥狀。
46.權(quán)利要求43的方法，其中a)所述激動劑是哺乳動物IL-B30蛋白；或b)所述動物正經(jīng)歷炎癥的體征或癥狀。
47.權(quán)利要求44的方法，其中所述給藥與以下藥物聯(lián)合a)抗炎細(xì)胞因子激動劑或拮抗劑；b)鎮(zhèn)痛藥；c)消炎藥；或d)類固醇。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述給藥與以下藥物聯(lián)合a)抗炎細(xì)胞因子激動劑或拮抗劑；b)鎮(zhèn)痛藥；c)消炎藥；或d)類固醇。
49.權(quán)利要求46的方法，其中所述給藥與以下藥物聯(lián)合a)抗炎細(xì)胞因子激動劑或拮抗劑；b)鎮(zhèn)痛藥；c)消炎藥；或d)類固醇。
50.一種誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括給予IL-B30或其激動劑。
全文摘要
提供得自哺乳動物的編碼細(xì)胞因子的純化基因、包括純化蛋白質(zhì)在內(nèi)的其相關(guān)試劑、特異性抗體和編碼該分子的核酸。也提供使用所述試劑的方法和診斷試劑盒。
文檔編號A61P35/00GK1387571SQ00815400
公開日2002年12月25日 申請日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月9日
發(fā)明者B·奧普曼, R·德瓦爾馬萊菲特, D·M·倫尼克, R·A·卡斯特萊恩, M·T·維科夫斯基, S·A·利拉, S·K·納魯拉 申請人:先靈公司