專利名稱：錳離子診斷/測定試劑盒及錳離子濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定 錳離子濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景錳作為一種微量元素在人體中是不可或缺的必需成分，同時也是對 人體有毒的物質(zhì)。在自然狀態(tài)下，以兩價、三價和四價的形式存在， 氧化程度越低，毒性越高。通常錳有八種不同的氧化狀態(tài)。錳的生物 學意義是作為人體中輔助因子有多種多樣的功能。然而，在許多酶激活反應(yīng)中，Mr產(chǎn)和Mg^可互相替代。常用石墨爐原子吸收分光光度測定法、原子發(fā)射ICP-OES。中子激 發(fā)分析(NAA)是最好的方法，但僅能在一些條件好的實驗室才能測 定。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴增法 (Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量通過酶聯(lián)反應(yīng)生成 吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導(dǎo)致 在400—700nm波長處吸光度的上升，得以測定錳離子濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的錳離子診斷/測定試劑盒，采 用該試劑不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行錳 離子濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得 到切實的推廣應(yīng)用。本發(fā)明錳離子濃度測定方法原理如下草酰乙酸草酰乙酸脫羧酶/Mr^丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+水+輔酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶剛嗒胺色原或醌亞胺色原+水這種方法應(yīng)用需要錳離子激活的草酰乙酸脫羧酶(oxaloacetate decarboxylase ; EC 4.1丄3 )酶(偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)及過氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11丄7)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān) 測法。草酰乙酸脫羧酶作為作用酶，在錳離子的激活下，功能為將草 酰乙酸酶解產(chǎn)生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶也作為作用酶，它的酶促作用 使丙酮酸變成丙氨酸。甘氨酸氧化酶作為循環(huán)酶將丙氨酸再次變回丙 酮酸，使草酰乙酸脫羧酶酶解草酰乙酸產(chǎn)生的丙酮酸不斷地被重復(fù)循 環(huán)利用。因此連續(xù)不斷地產(chǎn)生過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase ; EC Lll丄7)作為顯色酶，通過和過氧化氫的作用，使無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處測定染料一 吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye) —含量 高低的光吸收大小速度，得出錳離子濃度大小測定結(jié)果。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，如下成分關(guān)系的本發(fā)明錳離子診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液100 mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L還原型輔酶0.25 mmol/L氨離子2 mmol/L草酰乙酸20 mmol/L草酰乙酸脫羧酶10000 U/L丙氨酸脫氫酶10000U/L甘氨酸氧化酶10000U/L過氧化物酶30000 U/L還原型色原體組合0.1-20mmol/L所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任何一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4- 雙氯石碳酸 4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3.5- 雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-蔑基苯胺本發(fā)明的錳離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫羧酶、 丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。試 劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶、草酰乙酸、 氨離子。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、草酰乙酸 脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、 草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶、草酰乙酸、 氨離子。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、過氧化物酶、丙氨酸脫 氫酶、甘氨酸氧化酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、 草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的錳離子診斷/測定試劑為單試劑，包括:三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液10Ommol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L還原型輔酶0.25 mmol/L氨離子2 mmol/L草酰乙酸20 mmol/L草酰乙酸脫羧酶10000U/L丙氨酸脫氫酶10000U/L甘氨酸氧化酶10000 U/L過氧化物酶30000 U/L4-氨基抗砒2 mmol/L石碳酸10 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑; 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間IO分鐘，測 試主波長505nm，測試副波長600nm，被測錳離子樣品與試劑的體積 比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為速率法，延 遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。實施例二本實施例的錳離子診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶草酰乙酸2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑草酰乙酸脫羧酶甘氨酸氧化酶過氧化物酶4-氨基抗砒100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 2 mmol/L 20 mmol/L0.2 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L10000U/L10000U/L10000U/L25000 U/L 0.6 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長546nm，測試副波長600nm，被測錳離子樣品與試劑的體積比 例為1/20，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為速率法，延遲 時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的速度，從而測算出錳離子 的濃度大小。 實施例三本實施例的錳離子診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶草酰乙酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑甘氨酸氧化酶過氧化物酶雙甲基苯胺100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 2 mmol/L 20 mmol/L0.6 mmol/L100mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000 U/L 20000 U/L 2 mmol/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L草酰乙酸脫羧酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，測試 主波長578nm，測試副波長660nm，被測錳離子樣品與試劑的體積比 例為1/30，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為速率法，延遲 時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的速度，從而測算出錳離子 的濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉?？傊?，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源 物質(zhì)量污染。
權(quán)利要求
1.一種酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子濃度測定方法，其方法原理如下草酰乙酸 草酰乙酸脫羧酶/Mn2+ 丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+氨離子+還原型輔酶 丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+水+輔酶丙氨酸+水+氧 甘氨酸氧化酶 氨離子+丙酮酸+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度，得出錳離子濃度大小測定結(jié)果。
2. —種錳離子診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 草酰乙酸過氧化物酶 500——80000 U/L還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫 羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體 組合組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫 羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體 組合組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草 酰乙酸、氨離子、還原型色原體組合組成；試劑2,由緩沖液、穩(wěn) 定劑、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物 酶、還原型色原體組合組成。還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草 酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原 型色原體組合在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫 羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體 組合組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草 酰乙酸、氨離子、、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶、還原 型色原體組合組成。過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、 草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化 酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基"^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽.3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸.3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺.3-甲基-2-苯噻哇酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺.3-甲基-2-苯噻唑酮腙.2,2，-AZINO-雙G-乙基苯噻哇-6-磺酸).3- 甲基-2-苯噻唑酮腙.4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸.3-甲基-2-苯噻唑酮腙.3- 甲基-乙基-羥基苯胺.4- 氨基抗砒 石碳酸.4-氨基抗砒.^1-乙基__>}- (3-硫丙基)-m-噻啶胺.4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺.4-氨基抗砒 2,4-雙氯石碳酸.4-氨基抗砒.2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸.4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸.4-氨基抗砒.3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒.N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽.4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸.4-氨基抗砒雙甲基苯胺,4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 ,4-氨基抗砒,2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) ,4-氨基抗砒,4-羥基-3-甲氧基苯甲酸,4-氨基抗砒 ,3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定錳離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應(yīng)，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出錳離子濃度的大小。
文檔編號G01N33/84GK101324596SQ20071002320
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司