專利名稱：雙n－奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種奶牛隱性乳房炎的快速診斷試劑盒，定名為“雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒”，專用于奶牛隱性乳房炎診斷。
二、技術(shù)背景在一個(gè)牛群中，大多數(shù)乳房炎是隱性型的，由于無臨床癥狀，肉眼很難判斷。隱性乳房炎的危害主要體現(xiàn)為(1)隱性乳房炎造成的泌乳母牛產(chǎn)奶量的損失占總生產(chǎn)能力的10％～15％；(2)隱性乳房炎牛易于轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床乳房炎；(3)隱性乳房炎牛所產(chǎn)乳汁中含有大量的炎性因子、病原微生物及其產(chǎn)生的毒素，可能危害牛奶消費(fèi)者的身體健康。
目前，國(guó)內(nèi)外監(jiān)測(cè)隱性乳房炎的方法有(1)直接(牛奶)體細(xì)胞計(jì)數(shù)法，這是監(jiān)控奶牛隱性乳房炎的可靠手段。但是，測(cè)定牛奶體細(xì)胞數(shù)，如果用儀器測(cè)定，一臺(tái)體細(xì)胞測(cè)定儀的價(jià)格達(dá)40～60萬元左右；用顯微鏡(人工)測(cè)定，則要對(duì)牛奶進(jìn)行特殊處理，并對(duì)每個(gè)乳樣進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且可靠性不高。(2)間接體細(xì)胞計(jì)數(shù)法，現(xiàn)在大多采用“加州乳房炎檢測(cè)法”，該方法對(duì)于隱性乳房炎檢測(cè)具有較好的效果，便于早期發(fā)現(xiàn)，但該技術(shù)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)是國(guó)外的，且檢測(cè)費(fèi)用較高(每頭奶牛每次檢測(cè)材料費(fèi)用0.3～0.5元人民幣左右)；國(guó)內(nèi)在加州乳房炎檢測(cè)法的基礎(chǔ)上衍生了一些檢測(cè)方法，如蘭州乳房炎檢測(cè)法(LMT)、杭州乳房炎檢測(cè)法(HMT)和上海乳房炎檢測(cè)法(SMT)，但同樣存在檢測(cè)成本較大，且不適用于泌乳后期奶牛等問題，幾乎在奶牛場(chǎng)沒有應(yīng)用。(3)其他檢測(cè)方法，主要根據(jù)隱性乳房炎奶牛的乳汁中Na離子或Cl離子等濃度的變化，或根據(jù)乳汁酶含量的變化，而設(shè)計(jì)的乳汁pH檢測(cè)、乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)、乳汁酶檢測(cè)方法等，但這些檢測(cè)方法需要采集乳樣到實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，且需具備特定的儀器，而不能用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是提供一種新型的奶牛隱性乳房炎的診斷試劑盒，此診斷試劑盒檢測(cè)奶牛隱性乳房炎，符合率高，而且簡(jiǎn)便，成本低廉，測(cè)定結(jié)果不受季節(jié)、環(huán)境溫度、奶牛泌乳期、飼養(yǎng)地區(qū)及日糧中不同食鹽添加量的影響。
技術(shù)方案雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒，其特征在于，試劑A每10ml處方量含硝酸銀1.2920g，去離子水10ml試劑B每10ml處方量含鉻酸鉀0.9990g，去離子水10ml上述雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒還可含有試劑C100ml去離子水。
上述的雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒的制備方法，包括將1.2920g硝酸銀溶解于3～5ml去離子水中，并用去離子水定容至10ml，無菌密封包裝于棕色試劑瓶中，并用黑色紙包裹，此即為試劑A；將0.9990g鉻酸鉀溶解于去離子水中，并用去離子水定容至10ml，無菌密封包裝于棕色試劑瓶中，此即為試劑B；試劑A和試劑B組合成“雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒”，于陰涼干燥處保存，試劑C為去離子水，對(duì)于沒有去離子水的使用者選配，用于在測(cè)定前對(duì)試劑A進(jìn)行稀釋。
有益效果本發(fā)明為一種新型的奶牛隱性乳房炎的診斷試劑盒，定名為“雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒”，專用于奶牛隱性乳房炎診斷。本試劑盒不但達(dá)到了與國(guó)外“加州隱性乳房炎檢測(cè)法”有高的符合率(陽性符合率為90％以上)，而且經(jīng)與體細(xì)胞計(jì)數(shù)法比較，證明其可靠性更高，能準(zhǔn)確反應(yīng)牛奶體細(xì)胞含量，且具有不受季節(jié)、溫度、奶牛泌乳期、奶牛飼養(yǎng)地區(qū)及日糧中不同食鹽添加量的影響，并同時(shí)具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，每一個(gè)奶牛乳汁樣本的檢測(cè)試劑盒成本僅0.02元。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是一種用于奶牛隱性乳房炎診斷的新型快速檢測(cè)試劑盒組合。“雙N”的含義是技術(shù)發(fā)明者的單位名稱“南京農(nóng)業(yè)大學(xué)”中的英文首字母“N”和試劑盒的主要成分“硝酸銀”中的英文字母“N”的組合。
(一)試驗(yàn)盒研制1.牛奶中氯離子濃度與奶牛隱性乳房炎的關(guān)系實(shí)驗(yàn)方法分別以CMT和牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)(SCC，儀器法)檢測(cè)64頭奶牛共230個(gè)乳區(qū)。根據(jù)兩法測(cè)定的結(jié)果，將乳樣分為三組I組為健康乳(即為隱性乳房炎陰性乳，表明來源于健康乳區(qū))，其CMT檢測(cè)為陰性(-)、SCC＜200×103/ml；II組為可疑乳，CMT檢測(cè)為可疑(±)，200×103/ml＜SCC＜500×103/ml；III組為隱性乳房炎乳(即為隱性乳房炎陽性乳，表明來源于隱性乳房炎感染乳區(qū))，CMT檢測(cè)為陽性(+、++、+++)，SCC＞500×103/ml。
結(jié)果根據(jù)以上分組，用銀量法對(duì)牛奶中氯離子濃度檢測(cè)，結(jié)果如下隱性乳房炎陰性組乳汁中氯離子濃度為30～36mmol/l，可疑組為36～38mmol/l，陽性組為38～43mmol/l。氯離子濃度隨著隱性乳房炎程度的增加而升高。CMT檢測(cè)表明，健康乳與可疑乳氯離子濃度差異顯著(P＜0.05)，隱性乳房炎乳與健康乳和可疑乳比較差異極顯著(P＜0.01，見表1)；SCC檢測(cè)表明，健康乳與可疑乳、隱性乳房炎比較，氯離子濃度差異極顯著(P＜0.01)，隱性乳房炎乳與可疑乳氯離子濃度差異顯著(P＜0.05，見表2)。
上述結(jié)果證明，乳汁中氯離子濃度是反映乳區(qū)是否發(fā)生隱性乳房炎的敏感、可靠指標(biāo)。
表1 CMT檢測(cè)隱性乳房炎發(fā)生程度與牛奶中Cl-濃度的關(guān)系

表2 SCC檢測(cè)隱性乳房炎發(fā)生程度與牛奶中Cl-濃度的關(guān)系

2、試劑盒原理本課題組在比較了多種奶牛乳房炎檢測(cè)方法后，設(shè)計(jì)了“雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒”，其原理是隨著乳房炎程度的增加，血液向乳汁中滲透氯化物增加，導(dǎo)致乳汁氯離子濃度逐漸增加(這種增加亦與乳汁中體細(xì)胞數(shù)成正比)。正常牛奶中氯離子含量為32～38mmol/l，而隱性乳房炎牛奶中氯離子濃度遠(yuǎn)高于正常值。根據(jù)氯離子可與硝酸銀中的銀離子反應(yīng)生成白色的氯化銀沉淀，而銀離子可與鉻酸根離子反應(yīng)生成紅色的鉻酸銀沉淀的化學(xué)原理，以正常牛奶中氯離子含量為32～38mmol/l為閾值，在乳樣本中加入標(biāo)準(zhǔn)量的硝酸銀和鉻酸鉀當(dāng)乳汁中氯離子濃度高于其閾值時(shí)(隱性乳房炎牛)，可將硝酸銀中的銀離子完全中和，故銀離子不會(huì)過量而與鉻酸根離子反應(yīng)，反應(yīng)最終的溶液顏色是鉻酸鉀與牛奶混合的顏色(橙黃色、黃色或黃綠色)；正常乳汁中氯離子濃度低，故氯離子不能完全中和銀離子，過剩的銀離子與鉻酸根離子反應(yīng)，生成鉻酸銀沉淀，使最終的溶液顏色呈磚紅色、淺磚紅色或橙紅色。
(二)試劑盒應(yīng)用1.用法與用量測(cè)定前對(duì)試劑A進(jìn)行稀釋，方法如下取試劑A(全部10ml)，加試劑C(或自備去離子水)至100ml。測(cè)定時(shí)，備好5～10ml殺菌潔凈干燥試管，在一個(gè)乳區(qū)采取2ml乳樣于試管中，然后在試管中加入1ml稀釋后的試劑A，搖勻后加入0.1ml試劑B，再搖勻后在5分鐘內(nèi)觀察混合液顏色，判斷結(jié)果。
結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)隱性乳房炎陰性反應(yīng)混合液顏色呈磚紅色、淺磚紅色或橙紅色。
隱性乳房炎陽性反應(yīng)混合液顏色呈橙黃色、黃色或黃綠色。
注意事項(xiàng)此診斷試劑盒不適用于泌乳初期(產(chǎn)犢后2周內(nèi))奶牛(因?yàn)槌跞榈某煞峙c正常牛奶差別很大)。診斷試劑盒應(yīng)避光保存。
2.不同季節(jié)對(duì)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果的影響實(shí)驗(yàn)方法于江蘇境內(nèi)，分別在冬季(2004年12月-2005年2月)、春季(2005年3月-2005年5月)、夏季(2005年6月-2005年8月)和秋季(2005年9月-2005年11月)采樣。每季度采集40頭奶牛(160個(gè)乳區(qū))的奶樣。以本試劑盒檢測(cè)所有乳樣，并與CMT法和和SCC法進(jìn)行比較對(duì)照，計(jì)算本試劑盒測(cè)定結(jié)果與其他二法測(cè)定結(jié)果的符合率。
檢測(cè)結(jié)果各季度本試劑盒與CMT法和SCC法的符合率均大于90％(92％～100％，見表3)，說明不同季節(jié)對(duì)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果無明顯影響。
表3 不同季節(jié)樣本診斷符合率的比較

3.不同地區(qū)奶牛場(chǎng)對(duì)本試劑盒檢測(cè)效果的影響分別在江蘇蘇南(無錫)、蘇中(南京)、蘇北(徐州)三個(gè)奶牛場(chǎng)各采集30頭奶牛(120個(gè)乳區(qū))乳樣，分別用本試劑盒、CMT和SCC三種方法檢測(cè)。結(jié)果表明，三種方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，符合率均大于92％(見表4)，說明本試劑盒適用于不同地區(qū)(即不同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件)奶牛場(chǎng)。
表4 不同地區(qū)樣本診斷符合率的比較

4.不同泌乳階段對(duì)本試劑盒檢測(cè)效果的影響實(shí)驗(yàn)方法將泌乳期劃分為泌乳前期(14～100天，除產(chǎn)犢后兩周)、泌乳中期(100～200天)和泌乳后期(200～300天)，分別采取30頭奶牛(120個(gè)乳區(qū))乳樣，用上述三種方法檢測(cè)，比較其符合率。
結(jié)果泌乳前期隱性乳房炎發(fā)病率高于泌乳后期發(fā)病率，最低發(fā)病率為泌乳盛期，用三種方法診斷結(jié)果基本一致。本試劑盒與CMT檢測(cè)法和SCC法檢測(cè)相比，符合率均大于90％，見表5。說明泌乳階段不影響本試劑盒的測(cè)定結(jié)果。
表5 不同泌乳階段樣本診斷符合率的比較

5.不同溫度對(duì)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果的影響實(shí)驗(yàn)方法將30個(gè)乳樣分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃ 7個(gè)溫度梯度的水浴鍋中，用本試劑盒分別測(cè)定，比較其結(jié)果之間的重復(fù)率。
結(jié)果在5℃～35℃的溫度范圍內(nèi)，溫度對(duì)本試劑盒的測(cè)試結(jié)果無任何影響，檢測(cè)結(jié)果一致，重復(fù)率為100％。
6.飼料中不同食鹽添加量對(duì)牛奶中氯離子濃度及本試劑盒檢測(cè)結(jié)果的影響實(shí)驗(yàn)方法本試驗(yàn)?zāi)虡硬勺约s化奶牛場(chǎng)，奶牛年齡3～7歲，胎次1～5胎，均為中產(chǎn)奶牛。28頭試驗(yàn)牛分為兩組，14頭為對(duì)照組，14頭為試驗(yàn)組。對(duì)照組每日飼喂牛場(chǎng)原有精料，試驗(yàn)組除飼喂原有精料外，另添加不同比例的食鹽，食鹽占精料的比例為0.8％～1.5％，預(yù)飼期為8天，正飼期為20天。在第0、8、21、31天采集28頭牛共103個(gè)乳區(qū)的乳汁，每個(gè)乳區(qū)取20ml乳汁，進(jìn)行氯離子濃度檢測(cè)和SCC檢測(cè)，剩余奶樣用本試劑盒、CMT法、SCC法檢測(cè)。
結(jié)果試驗(yàn)組和對(duì)照組牛奶中氯離子濃度在第0、8、21、31天分別比較，差異均不顯著(p＞0.05，見表6)。試驗(yàn)組CMT與本試劑盒檢測(cè)符合率最低為91.1％；SCC與本試劑盒檢測(cè)符合率最低為89.3％；對(duì)照組CMT與本試劑盒檢測(cè)符合率最低為91.1％，SCC與本試劑盒檢測(cè)符合率最低為92.5％，見表7。結(jié)果證明，飼料中的不同氯離子濃度對(duì)本試劑盒的測(cè)定結(jié)果無明顯影響。
表6 牛奶氯離子濃度與SCC

表7 三種測(cè)定方法符合率比較

權(quán)利要求
1.雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒，其特征在于，試劑A每10ml處方量含硝酸銀1.2920g，去離子水10ml試劑B每10ml處方量含鉻酸鉀0.9990g，去離子水10ml
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒，其特征在于，該試劑盒還可含有試劑C100ml去離子水。
3.權(quán)利要求1或2所述的雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于將1.2920g硝酸銀溶解于3～5ml去離子水中，并用去離子水定容至10ml，無菌密封包裝于棕色試劑瓶中，并用黑色紙包裹，此即為試劑A；將0.9990g鉻酸鉀溶解于去離子水中，并用去離子水定容至10ml，無菌密封包裝于棕色試劑瓶中，此即為試劑B；試劑A和試劑B組合成“雙N-奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒”，于陰涼干燥處保存，試劑C為去離子水，對(duì)于沒有去離子水的使用者選配，用于在測(cè)定前對(duì)試劑A進(jìn)行稀釋。
全文摘要
本發(fā)明為一種新型的奶牛隱性乳房炎的診斷試劑盒，定名為“雙N－奶牛隱性乳房炎快速診斷試劑盒”，專用于奶牛隱性乳房炎診斷。其主要成分為硝酸銀、鉻酸鉀。與加州乳房炎檢測(cè)法(CMT)和體細(xì)胞計(jì)數(shù)法(SCC)比較，此診斷試劑盒檢測(cè)奶牛隱性乳房炎，不但具有符合率高(大于90％)，而且更簡(jiǎn)便，成本更低廉，試劑盒保質(zhì)期長(zhǎng)，測(cè)定結(jié)果不受季節(jié)、環(huán)境溫度、奶牛泌乳期、飼養(yǎng)地區(qū)及日糧中不同食鹽添加量的影響。
文檔編號(hào)G01N21/82GK101059444SQ20071002280
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2007年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日
發(fā)明者王根林, 宋維龍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)