專利名稱：免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒檢測的方法，尤其涉及免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒的 方法。
背景技術(shù)：
登革熱和登革出血熱(DF/DHF)是由黃病毒屬的4個型登革病毒引起的蟲媒 病毒病，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，以東南亞國家最為嚴重，我國自1978 年以來也在海南和廣東沿海一帶發(fā)生了較大的流行。目前檢測登革病毒感染的方法 仍離不開動物接種艦細胞培養(yǎng)接種分離，實驗結(jié)果表明，采用細胞接種培養(yǎng)分離 法檢測登革病毒是確診流行病菌病菌原較為可靠的方法，但費時、繁瑣，需要嚴 格的實驗割牛，并且至少l周時間內(nèi)能出結(jié)果，達不到早期、快速診斷的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)的不^處，^f共一種免疫熒光技術(shù)檢測蚊 蟲體內(nèi)登革病毒的方法，直接,AlfiL液標本或媒介蚊體內(nèi)檢測出登革病毒抗原，做到 早期診斷，早發(fā)現(xiàn)陽性蛟媒，從而控制登革熱的播散。
本發(fā)明戶欣免疫熒光技術(shù)檢須敝蟲體內(nèi)登革病毒的方法，采用AX經(jīng)口感染蚊 蟲DEN-2病毒，分別用細胞培養(yǎng)接種_^:頭部壓片免疫熒光法進行了檢測，確認 :^S伊蚊、白紋伊蛟和C6/36細胞成功感染了病毒。用蚊頭部壓片免疫熒光技術(shù), 可直接檢測出蛟體內(nèi)是否攜帶病毒，比細胞培養(yǎng)和乳鼠接種更為簡便、省時、敏感。 20天內(nèi)均能檢測出蛟體攜帶病毒的狀況。本發(fā)明所述方法為今后媒介蚊蟲現(xiàn)場監(jiān)測 打下了良女 S礎(chǔ)。本發(fā)明戶脫的免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，取單 只t恤感染的白紋伊蚊一20'C凍麻。在解剖鏡下用手術(shù)刀將蛟頭部切下，置于玻片 上用解剖針擠壓頭部，j鵬內(nèi)物質(zhì)流出、涂勻；晾干后用預(yù)冷丙酮固定10min;滴 加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG;放濕盒內(nèi);在37'C^f牛下孵育30 min， PBGS 洗滌3次，自然晾干后滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、 37。C孵育30min， PBS洗滌，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。
采用本發(fā)明戶誠免疫熒光駄檢觀敝蟲體內(nèi)登革病毒的方法，可以省去病毒分
離培養(yǎng)這一步，直接/她液標本纖介蚊體內(nèi)檢測出登革病毒抗原，無疑可做到早 期診斷或及早發(fā)現(xiàn)陽性蚊媒，從而控制登革熱的播散。 附圖
i兌明
附圖是本發(fā)明所述免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法步驟框圖。1—
取野外現(xiàn)場捕捉的艦伊蚊、白紋伊i^文在-2(TC凍麻2—取一只放在解剖鏡下用 手術(shù)刀將蚊頭部切下，置于載玻片上用解剖針擠壓頭部，使腦內(nèi)物質(zhì)流出，涂勻3 ^TP后用預(yù)冷丙酮固定10min;滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG放濕 盒內(nèi)；37-C孵育30min， PBGS洗滌3次4一自然晾干后滴加用伊文氏藍PBS稀 釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC，37。C孵育30min， PBS洗滌，自然晾干5—將 載玻片放于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果
具體實施例方式
現(xiàn)參照附圖，結(jié)合實施例說明如下
免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，采用人工經(jīng)口感染蚊蟲DEN-2 病毒，分別用細胞培養(yǎng)接種及蚊頭部壓片免疫熒光法進行了檢測，確認駄伊蚊、 白紋伊蚊和C6/36細胞成功感染了病毒。用蚊頭部壓片免疫熒光技術(shù)，可直接檢測 出蚊體內(nèi)是否攜帶病毒，比細胞培養(yǎng)和乳鼠接種更為簡便、省時、敏感。20天內(nèi)均 育g檢測出蚊體攜帶病毒的狀況。本發(fā)明戶服方法為今后媒介蚊蟲現(xiàn)場監(jiān)測打下了良 女M礎(chǔ)。本發(fā)明所述的免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，取單只t&lf[L感 染的白紋伊蚊一20°C凍麻。在解剖鏡下用手術(shù)刀將蚊頭部切下，置于玻片上用解剖 針擠壓頭部，使腦內(nèi)物質(zhì)流出、涂勻；晾干后用預(yù)冷丙酮固定10min;滴加用PBS 稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG;放濕盒內(nèi);在WC條件下孵育30min， PBGS洗滌3 次，自然晾干后滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、 37°(:孵 育30min， PBS洗滌，于熒光顯微鏡下觀察^結(jié)果。
免疫熒光技術(shù)檢測蛟蟲體內(nèi)登革病毒微用材料
1 .蚊蟲
,伊蚊、白紋伊蚊為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物學(xué)流行病學(xué)研究所昆蟲養(yǎng)殖室常 年飼養(yǎng)的敏感品系。以及野外現(xiàn)場捕捉的蚊蟲。
2 .病毒
試驗用的DEN-2為New Guinea B株由軍事醫(yī)學(xué)禾斗學(xué)院〗敫生物學(xué)流行病學(xué)研 究所劍共。乳鼠顱內(nèi)傳代，以細胞維持液研磨發(fā)病乳鼠腦組織帝喊10% (w/v)懸
液，5000 rpm離心15mir^取上清用作病毒液備用。
3. C6/36細胞
來自于白紋伊蚊幼蟲的傳代細胞，用DMEM培養(yǎng)液28-C C02 i咅養(yǎng)箱內(nèi)傳代 培養(yǎng)。
4. 抗體
DEN-2單克隆抗體，羊抗鼠IgG-FITC; 0.01%PH7.4伊文氏藍PBS液。
5. 鼠腦病毒懸液制備
給出生1-3天乳鼠腦內(nèi)接種DEN-2病毒液0.02ml/鼠后，逐日觀察，5-7天內(nèi) 乳鼠，出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，待乳鼠瀕死期無菌取出鼠腦，研磨，用無血清 DMEM培,制成20%病毒懸液，于液氮中凍存?zhèn)溆谩6/36細胞測定病毒滴度 TCID50 (細胞感染病毒半數(shù)感染量)為1089~1()5。
6. 蚊蟲經(jīng)口感染DEN-2病毒
,伊蚊、白紋伊蛟按常規(guī)室內(nèi)飼養(yǎng)，,后3-5天轉(zhuǎn)小蚊籠內(nèi)饑餓24h。將 新采肝素抗凝小鼠眼球血、用血清DMEM作10—i稀釋的DEN-2病毒鼠腦懸液和10% 蔗糖水作1:1:1混合，相當于病毒滴度1075TCID50，加于海綿上，置蚊籠內(nèi)， 蟲吸食，第2天開始對飽血雌蚊進行帶毒檢測。免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒方法步驟
第一步取野外現(xiàn)場捕捉的駄伊蚊、白紋伊^^在-2(TC凍麻；
第二步取一只放在解剖鏡下用手術(shù)刀將蛟頭部切下，置于載玻片上用解剖針 擠壓頭部，{ 內(nèi)物質(zhì)流出，涂勻；
第三步晾干后用預(yù)冷丙酮固定10min;滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒 IgG放濕盒內(nèi)；37。C孵育30min， PBGS洗滌3次；
第四部自然晾干后滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC， 37。C孵育30min， PBS洗滌，自然晾干；
第五步將載玻片放于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。帶有登革病毒蚊蟲會發(fā)生 特異性黃纟ffe熒光，陰性蚊蟲則無。
采用本發(fā)明戶脫免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，可以省去病毒分 離培養(yǎng)這一步，直接從血液標本或媒介蛟體內(nèi)檢測出登革病毒抗原，無疑可做到早 期診斷或及早發(fā)現(xiàn)陽性^^某，從而控制登革熱的播散。
權(quán)利要求
1、免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，其特征在于采用人工經(jīng)口感染蚊蟲DEN-2病毒，分別用細胞培養(yǎng)接種及蚊頭部壓片免疫熒光法進行了檢測，確認埃及伊蚊、白紋伊蚊和C6/36細胞成功感染了病毒，用蚊頭部壓片免疫熒光技術(shù)，可直接檢測出蚊體內(nèi)是否攜帶病毒，取單只飽血感染的白紋伊蚊-20℃凍麻，在解剖鏡下用手術(shù)刀將蚊頭部切下，置于玻片上用解剖針擠壓頭部，使腦內(nèi)物質(zhì)流出、涂勻；晾干后用預(yù)冷丙酮固定10min；滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG；放濕盒內(nèi)；在37℃條件下孵育30min，PBGS洗滌3次，自然晾干后滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、37℃孵育30min，PBS洗滌，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。
全文摘要
免疫熒光技術(shù)檢測蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，采用人工經(jīng)口感染蚊蟲DEN-2病毒，分別用細胞培養(yǎng)接種及蚊頭部壓片免疫熒光法進行了檢測，用蚊頭部壓片免疫熒光技術(shù)，檢測出蚊體內(nèi)是否攜帶病毒。本發(fā)明取單只飽血感染的白紋伊蚊-20℃凍麻，在解剖鏡下用手術(shù)刀將蚊頭部切下，置于玻片上用解剖針擠壓頭部，使腦內(nèi)物質(zhì)流出、涂勻；晾干后用預(yù)冷丙酮固定10min；滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG；放濕盒內(nèi)；在37℃條件下孵育30min，PBGS洗滌3次，自然晾干后滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、37℃孵育30min，PBS洗滌，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。采用本發(fā)明可做到早期診斷或及早發(fā)現(xiàn)陽性蚊媒，從而控制登革熱的播散。
文檔編號G01N21/00GK101109751SQ200710016328
公開日2008年1月23日 申請日期2007年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日
發(fā)明者趙玉強 申請人:山東省寄生蟲病防治研究所