專利名稱：檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒及其制備方法、檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測丙型肝炎病毒抗體的診斷試劑盒及其制備方法、檢測方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)屬于黃病毒科，是1989年發(fā)現(xiàn)的與輸血有關(guān)的非甲、非乙型肝炎病毒。丙型肝炎呈全球性流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為3％，估計約1.7億人感染了HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例。全國血清流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，我國一般人群抗-HCV陽性率為3.2％。HCV主要經(jīng)血液傳播，主要有(1)經(jīng)輸血和血制品傳播。(2)經(jīng)破損的皮膚和粘膜傳播。(3)母嬰傳播。HCV是肝硬化、肝功衰竭和肝細胞癌的常見病因。目前尚無有效方案治療丙型肝炎，預(yù)防丙型肝炎最有效的方法是切斷傳染源，特別是杜絕攜帶HCV的人員獻血，因此必須采用有效的檢測試劑。
現(xiàn)有檢測HCV的方法目前有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和HCV抗體檢測。其中HCV抗體檢測是獻血員篩查的主要方法。機體感染HCV后，會產(chǎn)生針對HCV的抗體，最早出現(xiàn)的抗體類型為IgM，約在7～30天內(nèi)出現(xiàn)，之后IgM消失IgG出現(xiàn)，約在30～60天出現(xiàn)。HCV感染機體后至出現(xiàn)可檢測出抗體時的一段時間被稱作窗口期。HCV抗體檢測試劑當(dāng)前已發(fā)展到第三代，窗口期約4～10周，但只能檢測血中的IgG抗體，檢測的靈敏度和特異性有待于進一步提高。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒及其制備方法、檢測方法，解決現(xiàn)有技術(shù)只能檢測IgG抗體的技術(shù)問題；還解決可同時檢測血中的所有抗HCV抗體，進一步縮短窗口期、進一步提高檢測靈敏度和特異性的問題。
本發(fā)明的技術(shù)方案這種檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒的組分包括(1)、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板；(2)、用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的HCV抗原結(jié)合物；(3)、含有吐溫的磷酸鹽緩沖液的洗滌液；(4)、含有過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液A；(5)、含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液B；(6)、含有硫酸溶液的終止液；
(7)、含有磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液；(8)、陰性對照正常人血清；(9)、陽性對照含有HCV抗體的人血清。
這種檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒的制備方法，其特征在于I、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備將包被用HCV重組抗原加至碳酸鹽緩沖液中混勻，加至酶聯(lián)板內(nèi)，每孔100微升，孵育過夜，用含有吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌酶聯(lián)板后，再加入含有酪蛋白的Tris緩沖液，37℃孵育2小時后，棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥酶聯(lián)板，完成用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備；II、用辣根過氧化物酶標(biāo)記的HCV抗原結(jié)合物的制備將標(biāo)記用HCV重組抗原和辣根過氧化物酶用改良過碘酸鈉法結(jié)合在一起，完成用辣根過氧化物酶標(biāo)記的HCV抗原結(jié)合物的制備；III、其它組分的制備洗滌液為含有吐溫的磷酸鹽緩沖液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B為含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液，終止液為2M硫酸，樣品稀釋液為含有酪蛋白的磷酸鹽緩沖液，陰性對照為正常人血清，陽性對照為含有HCV抗體的人血清。
這種用檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒檢測樣品中丙型肝炎病毒抗體存在的方法，其特征在于檢測步驟如下a、加樣取用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板，每次實驗設(shè)空白對照孔、陰性血清對照孔、陽性血清對照孔和樣品孔，在各孔先加樣品稀釋液50μl，再依次加入陰性血清對照、陽性血清對照和樣品各50μl，混勻，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；b、洗板棄去各孔內(nèi)液體，將洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后，注滿各孔，靜置10-20秒，甩掉洗滌液，重復(fù)洗板，最后拍干；c、加酶在各孔加酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物100祃，空白對照孔不加，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；d、洗板方法同b；e、顯色依次在各孔加顯色劑A液、B液各50μl，混勻，置37℃避光溫育10分鐘；f、終止依次在各孔加終止液50μl，混勻；g、測定用酶標(biāo)儀對空白孔調(diào)零，測定各孔的光吸收值(OD值)；h、結(jié)果判定根據(jù)測定OD值與臨界值的比值。若比值大于1，則為陽性反應(yīng)，說明樣品中含有HCV抗體；若比值小于1，則為陰性反應(yīng)，說明樣品中不含有HCV抗體。
有益效果本發(fā)明的試劑盒中采用雙抗原夾心法，具有更高的檢測活性，解決了現(xiàn)有技術(shù)只能檢測IgG抗體的缺點，一次檢測，可同時檢測血中的所有抗HCV抗體如IgG、IgM等，從而可進一步縮短窗口期最早至2周以內(nèi)。顯著提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確率，可進一步減小輸血后HCV感染的機率。
感染者血清中HCV標(biāo)志物出現(xiàn)順序參見圖1，本發(fā)明可同時檢測IgG和IgM類型抗體，較只能檢測IgG類型抗體的現(xiàn)有HCV抗體檢測試劑的窗口期約縮短20天。
本發(fā)明經(jīng)中國藥品生物制品檢定所用國家標(biāo)準(zhǔn)品檢定結(jié)果顯示外觀檢查、陰性標(biāo)準(zhǔn)品符合率、陽性標(biāo)準(zhǔn)品符合率、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明臨床考核結(jié)果分別委托中國人民解放軍第302醫(yī)院、河南省性病艾滋病防治研究所、北京市紅十字血液中心進行了臨床考核試驗，結(jié)果如下表
為了進一步考核本發(fā)明較現(xiàn)用技術(shù)的優(yōu)越性，委托中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)化研究中心進行臨床考核試驗，結(jié)果在5份早期感染HCV血清中，本發(fā)明檢出陽性1份，而現(xiàn)有技術(shù)沒有1份能夠檢出。結(jié)果如下
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)HCV抗體檢測法相比較，本發(fā)明臨床應(yīng)用敏感度和特異度較高，能夠完全符合臨床使用要求。本發(fā)明適用于檢測樣品中丙型肝炎病毒抗體是否存在?？奢^現(xiàn)用技術(shù)大大縮短窗口期。


圖1是證明本發(fā)明有益效果的實驗數(shù)據(jù)曲線圖。
用本發(fā)明一次檢測可同時檢測血中的IgG、IgM抗HCV抗體，并可進一步縮短窗口期最早至2周以內(nèi)。
具體實施方式
[1]、本發(fā)明檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒組份實施例(1)、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板；(2)、用辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物；(3)、含有吐溫的磷酸鹽緩沖液的洗滌液；(4)、含有過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液A；(5)、含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液B；(6)、含有2M硫酸溶液的終止液；(7)、含有酪蛋白的磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液；(8)、陰性對照正常人血清；(9)、陽性對照含有HCV抗體的人血清。、本發(fā)明檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒的制備方法實施例I、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備先制備用于包被酶聯(lián)板的HCV基因重組結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原；將包被用HCV重組抗原加至碳酸鹽緩沖液中混勻，加至酶聯(lián)板內(nèi)，每孔100微升，孵育過夜，用含有吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌酶聯(lián)板后，再加入含有酪蛋白的Tris緩沖液，37℃孵育2小時后，棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥酶聯(lián)板。此即將HCV抗原包被于酶聯(lián)板上。
II、用辣根過氧化物酶標(biāo)記的HCV抗原結(jié)合物的制備先制備用于辣根過氧化物酶標(biāo)記的HCV基因重組結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原，此即區(qū)別于其它檢測HCV抗體診斷試劑的酶標(biāo)記物特征所在；將標(biāo)記用HCV重組抗原和辣根過氧化物酶用改良過碘酸鈉法結(jié)合在一起，即為酶標(biāo)HCV抗原結(jié)合物。
改良過碘酸鈉法，具體步驟如下氧化辣根過氧化物酶(HRP)用純化水將HRP配成4mg/ml溶液，加入0.2ml含有6mg過碘酸鈉的溶液，室溫避光反應(yīng)20分鐘；透析將氧化后HRP溶液用pH4.5 1mmol/l乙酸鹽溶液透析，30分鐘1次，共8次；調(diào)節(jié)pH用0.1mol/1，pH9.5的碳酸鹽緩沖液將上述HRP溶液的pH調(diào)至9.0以上；準(zhǔn)備HCV抗原用0.01mol/l，pH9.5的碳酸鹽緩沖液將HCV抗原調(diào)配成8mg/ml濃度；與HCV抗原交聯(lián)將上述HRP溶液與HCV抗原溶液以等體積比例，將抗原溶液緩慢加入HRP溶液中，室溫攪拌2小時；
還原將新鮮配制的2mg/ml硼氫化鈉溶液，按0.2ml/4mgHRP的濃度加入上述HRP-HCV抗原溶液，4℃反應(yīng)2小時；透析將HRP-HCV抗原結(jié)合物溶液，用100倍以上體積的0.01mol/l，pH7.2磷酸鹽緩沖液透析過夜，至少換3次透析液；分裝保存加入等量甘油，分裝后低溫保存。
III、試劑盒其它組分包括洗滌液為含有吐溫的磷酸鹽緩沖液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B為含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液，終止液為2M硫酸，樣品稀釋液為含有酪蛋白的磷酸鹽緩沖液，陰性對照血清為正常人血清，陽性對照血清為含有HCV抗體的人血清。、用檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒檢測樣品中丙型肝炎病毒抗體存在的檢測步驟實施例a、加樣取用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板，每次實驗設(shè)空白對照孔、陰性血清對照孔、陽性血清對照孔和樣品孔，在各孔先加樣品稀釋液50祃，再依次加入陰性血清對照、陽性血清對照和樣品各50祃，混勻，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；b、洗板棄去各孔內(nèi)液體，將洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后，注滿各孔，靜置10-20秒，甩掉洗滌液，重復(fù)洗板，最后拍干；c、加酶在各孔加酶標(biāo)記HcV抗原結(jié)合物100μl，空白對照孔不加，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；d、洗板方法同b；e、顯色依次在各孔加顯色劑A液、B液各50μl，混勻，置37℃避光溫育10分鐘；f、終止依次在各孔加終止液50μl，混勻；g、測定用酶標(biāo)儀對空白孔調(diào)零，測定各孔的光吸收值(OD值)；h、結(jié)果判定根據(jù)測定OD值與臨界值的比值。若比值大于1，則為陽性反應(yīng)，說明樣品中含有HCV抗體；若比值小于1，則為陰性反應(yīng)，說明樣品中不含有HCV抗體。
權(quán)利要求
1.一種檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒的組分包括(1)、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板；(2)、用辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物；(3)、含有吐溫的磷酸鹽緩沖液的洗滌液；(4)、含有過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液A；(5)、含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液B；(6)、含有硫酸溶液的終止液；(7)、含有磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液；(8)、陰性對照正常人血清；(9)、陽性對照含有HCV抗體的人血清。
2.一種檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒的制備方法，其特征在于I、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備將包被用HCV重組抗原加至碳酸鹽緩沖液中混勻，加至酶聯(lián)板內(nèi)，每孔100微升，孵育過夜，用含有吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌酶聯(lián)板后，再加入含有酪蛋白的Tris緩沖液，37℃孵育2小時后，棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥酶聯(lián)板，完成用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備；II、用辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物的制備將標(biāo)記用HCV重組抗原和辣根過氧化物酶用改良過碘酸鈉法結(jié)合在一起，完成用辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物的制備；III、其它組分的制備洗滌液為含有吐溫的磷酸鹽緩沖液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B為含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液，終止液為2M硫酸，樣品稀釋液為含有酪蛋白的磷酸鹽緩沖液，陰性對照為正常人血清，陽性對照為含有HCV抗體的人血清。
3.一種用檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒檢測樣品中丙型肝炎病毒抗體存在的方法，其特征在于檢測步驟如下a、加樣取用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板，每次實驗設(shè)空白對照孔、陰性血清對照孔、陽性血清對照孔和樣品孔，在各孔先加樣品稀釋液50μl，再依次加入陰性血清對照、陽性血清對照和樣品各50μl，混勻，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；b、洗板棄去各孔內(nèi)液體，將洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后，注滿各孔，靜置10-20秒，甩掉洗滌液，重復(fù)洗板，最后拍干；c、加酶在各孔加酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物100μl，空白對照孔不加，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；洗板方法同b；e、顯色依次在各孔加顯色劑A液、B液各50μl，混勻，置37℃避光溫育10分鐘；f、終止依次在各孔加終止液50μl，混勻；g、測定用酶標(biāo)儀對空白孔調(diào)零，測定各孔的光吸收值(OD值)；h、結(jié)果判定根據(jù)測定OD值與臨界值的比值。若比值大于1，則為陽性反應(yīng)，說明樣品中含有HCV抗體；若比值小于1，則為陰性反應(yīng)，說明樣品中不含有HCV抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測丙肝病毒抗體診斷試劑盒及其制備方法、檢測方法，將包被用HCV重組抗原加至緩沖液中混勻，加至酶聯(lián)板內(nèi)，孵育過夜，用緩沖液洗滌酶聯(lián)板后，再加入緩沖液，孵育后，棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥酶聯(lián)板，完成預(yù)包被酶聯(lián)板的制備；將標(biāo)記用HCV重組抗原和辣根過氧化物酶用改良過碘酸鈉法結(jié)合在一起，完成酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物的制備；試劑盒中還含有顯色液A、顯色液B、終止液、樣品稀釋液、陰性對照為正常人血清、陽性對照為含有HCV抗體的人血清。本發(fā)明的試劑盒具有更高的檢測活性，一次檢測，可同時檢測血中的所有抗HCV抗體如IgG、IgM等，進一步縮短了窗口期，顯著提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確率。
文檔編號G01N33/543GK1670532SQ200510200158
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月23日
發(fā)明者王保君, 馮長訪, 馬曉暉 申請人:北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司