專利名稱：免疫檢測用樣本前處理液及其處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫層析檢測用的樣本前處理液，更詳細(xì)的，涉及用于流感病毒檢測的樣本的前處理液。
背景技術(shù)：
流感病毒是直徑為80～120nm的RNA病毒，有外殼，表面覆蓋有HA(紅細(xì)胞凝結(jié)素)和NA(神經(jīng)氨酸苷酶)這兩種酶蛋白的突起。HA為血細(xì)胞凝集性抗原，在吸附于人體細(xì)胞侵入人體時與細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合、病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部這個過程中起著重要的作用。而NA是用來在感染后期病毒粒子離開細(xì)胞表面時切斷唾液酸，起到獲得傳染性的作用?？乖允怯蒆A和NA一起來決定的，大致分為A、B、C三種類型。A型又已知有香港型等亞型。A型中，大約以十余年為周期會有不同的亞型出現(xiàn)，引起非連續(xù)變異大流行。而且，即使是同一亞型，抗原性每年也在不斷一點點變異。因此，在檢測流感病毒的時候，不管有無流感抗原的變異，必須對通用的可檢測區(qū)域進(jìn)行檢測。
還有，感染流感后數(shù)日即治愈的情況也很多，因此為了準(zhǔn)確診斷流感和提供正確的治療方法，人們希望能夠迅速得到檢測結(jié)果。目前實際使用的方法有檢測抗原的組織培養(yǎng)法、檢測抗體的紅細(xì)胞凝集抑制(HI)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(CF)以及間接熒光抗體法(IFA)等檢查方法。
長久以來，很多報告都提出了簡便利用抗原抗體反應(yīng)的方法。比如，有報告(特開昭61-145459號公開公報、特開平6-160388號公開公報)公開了只要將采集的樣本滲入含有目標(biāo)抗體的檢測器材中即可測知抗原的存在與否及其量的免疫層析法檢測方法。這種方法是指，在硝酸纖維素等多孔膜的一端含有與目標(biāo)特定抗原相應(yīng)的特異性抗體，在多孔膜的中部同樣只能和特定抗原相結(jié)合的另外的特異性抗體以帶狀固定于多孔膜上。將一端含有的特異性抗體先進(jìn)行著色，再將樣品液點在有特異性抗體存在的多孔膜的一端上，如果樣品液中含有與特異性抗體反應(yīng)的抗原，則此抗原與特異性抗體相結(jié)合后以附著有著色粒子的狀態(tài)通過毛細(xì)現(xiàn)象沿多孔膜向點有樣品液一端相對的另一端方向移動。移動過程中，當(dāng)通過以帶狀固定于膜上的另一種特異性抗體所處的地方時，抗原被多孔膜上的特異性抗體捕獲，在多孔膜上呈現(xiàn)帶狀染色。由此可以確定目標(biāo)抗原在樣品中存在與否以及它的量。
運(yùn)用此項技術(shù)，可以快速檢測流感，是一種有效的方法。流感檢測通常選取鼻涕、痰液或咽喉擦拭液作為樣本。理論上來說，能夠用于上述免疫層析方法的樣本一定要能夠在多孔膜中發(fā)生毛細(xì)現(xiàn)象，通過多孔膜。但是鼻涕或咽喉擦拭液中存在的高粘性物質(zhì)如粘蛋白會堵塞多孔膜的孔，粘蛋白還會使人體上脫落的上皮粘膜細(xì)胞凝結(jié)在一起，導(dǎo)致這些物質(zhì)堵塞多孔膜的孔，無法進(jìn)行檢測。
比如，有報告公開了在對人的唾液樣本中的變形鏈球菌用免疫層析法進(jìn)行定性、定量分析的時候采用唾液前處理試劑盒的方法(特開2002-357599號公開公報)，該試劑盒由含有氫氧化鈉的水溶液、含有酒石酸和/或檸檬酸的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑組成、表面活性劑或預(yù)先與水溶液和/或緩沖液混合好，或與水溶液和緩沖液分開放置。但是，關(guān)于流感檢測，未見有任何公開。
另外在WO02/10744號公報中公開了流感檢測樣本的前處理方法，即使用含有選自表面活性劑、還原性物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)、有機(jī)酸或其鹽的樣本前處理液進(jìn)行處理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了免疫層析法檢測流感病毒時為使檢測更準(zhǔn)確簡便而必要的樣本前處理液以及前處理方法。
附圖的簡要說明

圖1表示免疫層析用測試條的簡要示意圖。
附圖標(biāo)記1 加樣部件2 標(biāo)記部件(抗流感抗體標(biāo)記著色粒子保持區(qū))3 層析用膜載體4 檢測區(qū)(抗流感抗體固定區(qū))5 吸收部件具體實施方式
本發(fā)明人等著眼于表面活性劑破壞病毒膜這一點，經(jīng)過反復(fù)研究后發(fā)現(xiàn)，在用免疫層析法檢測流感時，如果將來自于生物體的樣本用至少含有非離子表面活性劑和0.3M以上的堿金屬離子以及硫氰酸類化合物的樣品前處理液進(jìn)行處理，那么就可以更加簡便而準(zhǔn)確地檢測流感。從而完成了本發(fā)明。
作為檢測對象的流感病毒，可以是通常定義下的流感病毒，沒有特別的限制。具體說來，可以是A型、B型、C型中的任意一種。另外，只要是屬于流感病毒的病毒，可以是已經(jīng)發(fā)生變異的病毒或?qū)砜赡艹霈F(xiàn)的變異病毒。
(樣本)作為檢測對象的樣本可以由生物體采集，只要是可能混入流感病毒的物質(zhì)即可，沒有特別的限制，但優(yōu)選如鼻涕、痰液和/或咽喉擦拭液等。對采集這些樣本所用方法沒有特別的限制，可以采用常規(guī)的方法。具體說來，可以是用棉簽采集鼻涕、痰液或咽喉擦拭液。
(樣本前處理液)第1種樣本前處理液中所含的非離子表面活性劑，雖然沒有特別的限制，但優(yōu)選使用聚氧乙烯類物質(zhì)，更加優(yōu)選使用醚型的聚氧乙烯類物質(zhì)。具體來說，優(yōu)選從使用聚氧化乙烯(9)辛基苯基醚、聚氧乙烯(10)辛基苯基醚、聚氧乙烯(9)壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯等聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯烷基醚中選出的任意一種或兩種以上的混合物。
非離子表面活性劑在樣本前處理液中的濃度可以是0.05～2(v/v)％，優(yōu)選0.1～0.5(v/v)％，更加優(yōu)選0.3(v/v)％左右的濃度。
第1種樣本前處理液中所含的堿金屬離子，可以舉出鋰離子(Li+)、鈉離子(Na+)、鉀離子(K+)、銣離子(Rb+)、銫離子(Cs+)、鈁離子(Fr+)等，優(yōu)選使用鈉、鉀。另外堿金屬離子可以使用一種或兩種以上?？梢陨缮鲜鲞@些堿金屬離子的化合物沒有特別的限制，比如可以使用氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、EDTA鈉鹽、疊氮化鈉中選出的任意一種化合物或兩種以上化合物的混合物。樣本前處理液中必須含有至少0.3M的堿金屬離子，優(yōu)選0.4M，更優(yōu)選0.45M以上。但是如果加入2M以上的堿金屬離子，則有可能給免疫層析的靈敏度帶來不好的影響。使用時濃度優(yōu)選1.5M以下，更加優(yōu)選1.0M以下。
第2種樣本前處理液中所含的硫氰酸類化合物除硫氰酸(HNCS)外，只要是硫氰酸酯和硫氰酸鹽等水溶性的也可，沒有特別的限制。構(gòu)成硫氰酸的鹽可以舉出含鈉、鉀等金屬的無機(jī)堿、或有機(jī)堿銨鹽等。也包括它們的鹽的水合物或溶劑化物。具體可以舉出硫氰酸鈉、硫氰酸鉀、硫氰酸銨、硫氰酸胍等。優(yōu)選使用硫氰酸鉀、硫氰酸胍。
樣本前處理液中所含硫氰酸類化合物的濃度可以是至少0.1M、優(yōu)選0.125～1.0M，更加優(yōu)選0.125～0.375M。
第1種樣本前處理液中，除以上成分以外可以含有使pH值保持在最適合反應(yīng)的5～9范圍內(nèi)的緩沖液或有機(jī)酸等。
第2種樣本前處理液中，除以上成分以外可以含有表面活性劑、能夠使pH值保持在最適合反應(yīng)的5～9范圍內(nèi)的緩沖液或有機(jī)酸等。
樣本的處理采用常規(guī)的方法即可，比如可以在樣本前處理液0.5～1.0mL中加入樣本0.1～0.2mL，充分振蕩混合進(jìn)行處理。也可以將采集有鼻涕等樣本的棉簽浸入樣本前處理液，使樣本前處理液和樣本充分混合來進(jìn)行處理。本說明書中將樣本用樣本前處理液處理后得到的物質(zhì)，簡便起見稱之為“樣品”。
對于樣本前處理液以及通過處理方法得到的樣品，可以用常規(guī)的免疫層析法通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行流感的鑒定/定量檢測。
(免疫層析)免疫層析的操作方法已經(jīng)是眾所周知的了，其原理模式圖如圖1所示。
在圖1的標(biāo)記部件(2)上保持抗流感抗體標(biāo)記著色粒子，在流感病毒檢測區(qū)(4)固定抗流感抗體。
將上述經(jīng)過處理的樣本作為樣品滴在圖1的加樣部件(1)上，借助于層析用膜載體(3)使樣品向吸收部件方向(5)展開。如果在樣本中混入了作為目標(biāo)對象的流感病毒，那么流感病毒和抗流感抗體標(biāo)記著色乳膠粒子發(fā)生反應(yīng)，它們的復(fù)合體就會被固定有抗流感抗體的流感病毒檢測區(qū)(4)捕獲，呈現(xiàn)出顯色區(qū)帶。通過(4)上出現(xiàn)的區(qū)帶的顏色深淺可以大致確定樣本中所含流感病毒的量。
用于標(biāo)記部件(2)以及流感病毒檢測區(qū)(4)的抗體，只要是識別流感不同區(qū)域的抗體即可。這些抗體可以通過常規(guī)的方法得到。比如，可以使用由Kohler和Milstein(Kohler G，C.Milstein，Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity，Nature，256495-497，1975)建立的通過細(xì)胞融合形成雜交瘤的方法。也可以單純用抗原給動物免疫，再精制其血清得到者。標(biāo)記部件(2)的標(biāo)記著色粒子，可以使用用于免疫層析法的常規(guī)物質(zhì)。比如，可以舉出膠體金和著色乳膠粒子等。層析用膜載體(3)可以是免疫層析法中普遍使用的膜，通常為多孔膜，具體來說可以使用硝酸纖維素。
(試劑盒)也可以將上述樣本前處理液與流感檢測用免疫層析裝置組合在一起成為檢測試劑盒。具體可以舉出由樣本前處理液和免疫層析裝置組成的檢測試劑盒，也可以包含采集樣本用的棉簽。
實施例為深入理解本發(fā)明，以下結(jié)合實施例加以說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
實施例1非離子表面活性劑(NP40)的效果實施本實施例，是為了確定樣本前處理液中各種濃度的非離子表面活性劑(NP40)給層析用膜載體上的背景所帶來的作用效果。
1)樣本前處理液的組成在含有100mM檸檬酸-0.4MNaCl、10mM二硫蘇糖醇的溶液(pH6.0)中，加入Nonidet P-40(NP40)(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚的商品名)使其濃度分別達(dá)到0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8(v/v)％，制成樣本前處理液。
2)樣本及其處理用棉簽采集鼻涕作為樣本。
將棉簽上含鼻涕部分浸入裝有0.8mL上述樣本前處理液的容器中，與樣本前處理液混合后制成樣品。然后，將靜置后的樣品液用濾膜(孔徑1μm)過濾，制成檢測樣品。鼻涕樣本使用的是通過MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法(J.Clin.Microb.28(5)1308-1313(1990))鑒定為流感A和B為陽性的樣本。
3)免疫層析作為免疫層析測試條(圖1)的材料，加樣部件(1)為玻璃纖維濾紙，標(biāo)記保持部件(2)為保持有致敏市售抗流感抗體、著色為藍(lán)色的乳膠的經(jīng)過聚乙烯處理的玻璃纖維濾紙，層析用膜載體(3)為硝酸纖維素膜，吸收部件(5)為玻璃纖維和纖維素的混合濾紙。而檢測區(qū)(4)用市售的抗流感抗體進(jìn)行致敏。對用培養(yǎng)法確認(rèn)為流感陽性的樣本，用常規(guī)方法進(jìn)行前處理，點于免疫層析裝置上，進(jìn)行層析。
用含有各種濃度的NP40的樣本前處理液進(jìn)行前處理得到檢測用樣品液，取0.20mL點于免疫層析裝置上，進(jìn)行20分鐘的層析。
結(jié)果如表1所示。完全不含NP40的情況下，由于層析用膜載體染成乳膠粒子的藍(lán)色，背景不良，未能用免疫層析對流感A和B進(jìn)行鑒定。而用NP40含量在0.05(v/v)％以上的樣本前處理液進(jìn)行處理的情況下，層析用膜載體未著色，背景良好，很容易就對流感A和B進(jìn)行了鑒定。
表1

實施例2各種非離子表面活性劑的效果(背景)實施本實施例，是為了確認(rèn)樣本前處理液中各種非離子表面活性劑對層析用膜載體上的背景所起的作用效果。
在含有100mM檸檬酸-0.4MNaCl、10mM二硫蘇糖醇的溶液(pH6.0)中加入如表2所示的各種非離子表面活性劑使其濃度達(dá)到0.1(v/v)％，制成樣本前處理液。
樣本及其處理、免疫層析的操作過程同實施例1。
結(jié)果表明，使用了如表2所示的各種非離子表面活性劑，則背景的顯色減弱，從而得以正確判定結(jié)果。
表2背景的檢測結(jié)果

良好到判定時間時層析用膜載體未著色，確認(rèn)有藍(lán)色的顯色區(qū)帶。
實施例3各種非離子表面活性劑的效果(流感檢測)本實施例與實施例2同樣，是為了確認(rèn)樣本前處理液中各種非離子表面活性劑對免疫層析所起的作用效果。
樣本前處理液、樣本及其處理、免疫層析的操作過程與實施例2相同。
結(jié)果表明，使用如表3所示的各種非離子表面活性劑后，所有表面活性劑下的結(jié)果均判定為陽性。
表3流感病毒的測定結(jié)果

實施例4添加各種濃度NaCl的效果(流感A和B的檢測)本實施例是為了確認(rèn)樣本前處理液中各種濃度NaCl對免疫層析所起的作用效果而實施的。
1)樣本前處理液的組成在含有0.1(v/v)％NP40、100mM檸檬酸、10mM二硫蘇糖醇和10mMEDTA的溶液(pH6.0)中，添加NaCl使其濃度分別達(dá)到如表4所示的各濃度，制成樣本前處理液。
2)樣本及其處理對樣本，用培養(yǎng)法鑒定為流感A和B陰性的3個鼻腔吸引液樣品和作為陽性對照的A型培養(yǎng)病毒、B型培養(yǎng)病毒，采用如實施例1記載的方法進(jìn)行前處理。
3)免疫層析免疫層析的實施同實施例1。
結(jié)果如表4和5所示。完全不含NaCl的情況下，即使是陰性樣品，也判定為了陽性，而添加了NaCl就抑制了非特異性反應(yīng)的進(jìn)行。而陽性對照中，即使添加了NaCl也還是呈陽性。
表4流感病毒A型的檢測結(jié)果

表5流感病毒B型的檢測結(jié)果

實施例5樣本前處理液中添加各種化合物時的效果1)樣本前處理液的組成在含有0.1(v/v)％NP40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)、100mM檸檬酸-0.15MNaCl的溶液(pH6.0)中，添加如表5所示的化合物使其濃度達(dá)到0.5M，制成樣本前處理液。
2)樣本及其處理對樣本，用培養(yǎng)法鑒定為流感A和B陰性的3個鼻腔吸引液樣品、作為陰性對照的生理鹽水和作為陽性對照的A型培養(yǎng)病毒、B型培養(yǎng)病毒，采用如實施例1記載的方法進(jìn)行前處理。
3)免疫層析免疫層析的實施同實施例1。
表6使用含有各種化合物的樣本前處理液處理后的非特異性反應(yīng)抑制效果

*各添加物的濃度為0.5M結(jié)果表明，用含有如表6所示化合物中硫氰酸胍和硫氰酸鉀的樣本前處理液進(jìn)行前處理，培養(yǎng)法判定為陰性的樣本全部顯示陰性。由此可知，如果使用含有硫氰酸類化合物的樣本前處理液對樣本進(jìn)行前處理，非特異性反應(yīng)就可以得到抑制。而陽性對照品即使添加了硫氰酸類化合物也還是全部顯示陽性。
實施例6硫氰酸鉀的效果本實施例是為了確認(rèn)樣本前處理液中各種濃度的硫氰酸鉀(KSCN)對免疫層析用膜載體上的背景所起的作用效果而實施的。
1)樣本前處理液的組成在含有0.1(v/v)％NP40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)、100mM檸檬酸-0.15MNaCl的溶液(pH6.0)中，添加硫氰酸鉀使其濃度分別達(dá)到0、0.100、0.125、0.250、0.375M，制成樣本前處理液。
樣本及其處理、免疫層析的操作過程與實施例5相同。
表7硫氰酸鉀(KSCN)的效果

結(jié)果表明，如表7所示完全不含KSCN的情況下發(fā)生了非特異性反應(yīng)，而添加了KSCN的情況下非特異性反應(yīng)得到了抑制。而陽性對照即使添加了KSCN也還是判定為陽性。
權(quán)利要求
1.通過免疫層析法檢測流感病毒用樣本的樣本前處理液，由非離子表面活性劑，和至少為0.3M的堿金屬離子組成。
2.如權(quán)利要求1記載的樣本前處理液，上述非離子表面活性劑為聚氧乙烯類表面活性劑。
3.如權(quán)利要求2記載的樣本前處理液，其中上述聚氧乙烯類表面活性劑是選自聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯以及聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物的一種。
4.如權(quán)利要求1記載的樣本前處理液，其中上述非離子表面活性劑的濃度為0.05～2(v/v)％。
5.如權(quán)利要求1記載的樣本前處理液，其中上述非離子表面活性劑的濃度為0.1～0.5(v/v)％。
6.如權(quán)利要求1記載的樣本前處理液，其中至少含有0.4M的上述堿金屬離子。
7.如權(quán)利要求1記載的樣本前處理液，其中含有硫氰酸類化合物。
8.如權(quán)利要求7記載的樣本前處理液，其中至少含有0.1M的上述硫氰酸類化合物。
9.如權(quán)利要求1記載的樣本前處理液，其中上述樣本為鼻涕、痰液或咽喉擦拭液。
10.通過免疫層析法檢測流感病毒用樣本的樣本前處理液，由硫氰酸類化合物組成。
11.如權(quán)利要求10記載的樣本前處理液，其中至少含有0.1M的上述硫氰酸類化合物。
12.如權(quán)利要求10記載的樣本前處理液，其中上述硫氰酸類化合物的濃度為0.125～1.0M。
13.如權(quán)利要求10記載的樣本前處理液，其中上述硫氰酸類化合物是選自硫氰酸、硫氰酸酯、硫氰酸鹽中的一種。
14.如權(quán)利要求10記載的樣本前處理液，其中上述硫氰酸類化合物是選自硫氰酸鈉、硫氰酸鉀、硫氰酸銨、硫氰酸胍中的一種。
15.如權(quán)利要求10記載的樣本前處理液，含有表面活性劑。
16.如權(quán)利要求10記載的樣本前處理液，其中上述樣本為鼻涕、痰液或咽喉擦拭液。
17.使用免疫層析法的流感病毒檢測方法，由樣本的準(zhǔn)備步驟、用權(quán)利要求1～16中任一項記載的樣本前處理液進(jìn)行處理的處理步驟組成。
18.流感檢測試劑盒，由權(quán)利要求1～16中任意一項記載的樣本前處理液和免疫層析裝置所組成。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過免疫層析法檢測流感病毒時使檢測更為準(zhǔn)確和簡便所必須的樣本前處理液和前處理方法。本發(fā)明的上述目的可以通過使用含有非離子表面活性劑和0.3M堿金屬離子以及硫氰酸類化合物的樣本前處理液，對樣本如鼻涕、痰液、咽喉擦拭液等進(jìn)行處理而實現(xiàn)。
文檔編號G01N33/558GK1576842SQ20041006192
公開日2005年2月9日 申請日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者一口毅, 古谷基, 安岐昌子 申請人:希森美康株式會社