專(zhuān)利名稱(chēng)：馬鈴薯pvx、pvy、plrv、pvs病毒診斷試劑制作工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及試劑，屬于馬鈴薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒診斷試劑制作工藝方法。
背景技術(shù)：
馬鈴薯是我國(guó)主要的糧、菜作物和食品加工原料，全國(guó)栽培面積460萬(wàn)公頃，居世界首位。但產(chǎn)量水平較低(11噸/公頃)不僅低于世界單產(chǎn)(15.5噸/公頃)，更不及世界發(fā)達(dá)國(guó)家(30-50噸/公頃)。影響我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)量的主要因素，是病毒病害，植物病毒為專(zhuān)性寄生物，只能在其寄主的活細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，馬鈴薯為營(yíng)養(yǎng)體繁殖，病毒隨馬鈴薯繁殖而逐年積累，導(dǎo)致馬鈴薯種性退化，研究證明馬鈴薯病毒引起馬鈴薯減產(chǎn)在30-35％。目前，在馬鈴薯作物上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并報(bào)導(dǎo)的病毒和病毒病有25種以上，所幸只有少數(shù)病毒對(duì)馬鈴薯危害較重，通常復(fù)合侵染比某一種病毒單獨(dú)侵染嚴(yán)重，馬鈴薯生產(chǎn)田中多數(shù)為復(fù)合侵染。本發(fā)明針對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)中危害較重的病毒PVX、PVY、PVS和PLRV進(jìn)行研究。
目前國(guó)際上對(duì)馬鈴薯病毒防治最佳辦法是利用免疫血清技術(shù)汰除病株，結(jié)合莖尖脫毒、組織培養(yǎng)，生產(chǎn)脫毒馬鈴薯種薯。酶聯(lián)(DAS-ELISA)法檢測(cè)馬鈴薯病毒，因其具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)而為國(guó)際、國(guó)內(nèi)普遍采用。
隨著我國(guó)加入WTO，國(guó)產(chǎn)脫毒馬鈴薯生產(chǎn)受到威脅，植物檢疫和病毒檢測(cè)必須與國(guó)際接軌，全國(guó)馬鈴薯栽培面積460萬(wàn)公頃，種薯田30.7萬(wàn)公頃，按標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)要求1公頃檢測(cè)200個(gè)樣品計(jì)算，全國(guó)共檢樣6000萬(wàn)個(gè)，年需試劑盒60萬(wàn)個(gè)。進(jìn)入WTO后，加之我國(guó)西部大開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略的實(shí)施，因此急需大批量的高質(zhì)量，低價(jià)格的國(guó)產(chǎn)馬鈴薯病毒抗血清。病毒血清是酶聯(lián)檢測(cè)中的關(guān)鍵內(nèi)容，國(guó)際上利用免疫技術(shù)制備馬鈴薯病毒高效價(jià)血清檢測(cè)試劑盒已有數(shù)年歷史，但能夠批量生產(chǎn)高質(zhì)量馬鈴薯病毒血清的只有少數(shù)國(guó)家，所以?xún)r(jià)格較高，例如全球最大植物病害診斷試劑生產(chǎn)商——美國(guó)agdia公司每病毒500反應(yīng)孔4200元；德國(guó)Loewe生化技術(shù)公司每病毒500反應(yīng)孔4000元……我國(guó)早在20世紀(jì)80年代就開(kāi)始了相關(guān)技術(shù)的研究，但存在試劑特異性差，檢測(cè)流程復(fù)雜，種類(lèi)不全等諸多問(wèn)題，一直沒(méi)能進(jìn)行批量生產(chǎn)開(kāi)發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低廉，抗馬鈴薯病毒效果顯著的馬鈴薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒診斷試劑制作工藝方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的病毒抗血清的制備如下實(shí)施路線(1)馬鈴薯病毒的指示植物是
表1 馬鈴薯主要病毒繁育植物

(2)毒源采集采集馬鈴薯生產(chǎn)田中具有典型馬鈴薯病毒癥狀的材料，經(jīng)ELISA鑒定篩選所需毒源材料，選鑒定結(jié)果陽(yáng)性，吸光值較高，再用透射電鏡作輔助檢驗(yàn)，確定毒源材料。
(3)馬鈴薯主要病毒的分離、繁殖將毒源材料分別接種于溫室種植的一系列健康的指示植物進(jìn)行病毒分離研究，接種后的指示植物須每隔2天調(diào)查一次，根據(jù)每組指示植物發(fā)病情況，篩選分離出需要的病毒，再經(jīng)過(guò)多次接種濾去其它病毒，純化病毒，然后用純化的病毒接種在繁毒材料上擴(kuò)繁病毒，供提純用。
將分離純化的馬鈴薯病毒一部分低溫貯存，作為日后試劑盒制備的病毒毒源繁殖病毒以供提純用。
病毒分離PVX汁液摩擦接種，千日紅——白花刺果曼陀羅——指尖椒——千日紅——黃苗榆煙PVY汁液摩擦接種或蚜蟲(chóng)非持久性接種，洋酸漿——黃苗榆煙PVS蚜蟲(chóng)非持久性接種，千日紅——毛曼陀羅——莧色藜——德伯尼煙PLRV蚜蟲(chóng)持久性接種，洋酸漿——白花刺果曼陀羅(4)馬鈴薯主要病毒的提純以差速離心為基礎(chǔ)，根據(jù)不同病毒特征，采用相應(yīng)方法進(jìn)行提純。
1)幾種病毒提純路線PVX病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨，離心3,000-4,000rpm，20min
↓ ↓棄沉淀上清，離心10,000-12,000rpm，20min↓ ↓棄上清沉淀+4％PEG緩沖液，攪拌60min，離心10,000rpm，20min↓ ↓上清4℃靜止60min，離心10,000-12,000rpm，20min棄沉淀↓ ↓棄上清 沉淀+4％PEG緩沖液，攪拌120min，離心10,000-12,000rpm，20min↓ ↓上清+提取液4℃過(guò)夜，離心10,000-12,000rpm，20min 棄沉淀↓ ↓上清40,000rpm離心90min棄沉淀↓↓棄上清 沉淀+提取緩沖液過(guò)夜↓純病毒pvy病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液，三層紗布過(guò)濾，離心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓棄沉淀 上清中加入1％Triton X-100，4℃，120min振蕩離心7,800-8,000rpm，20min↓↓上清中加入4％PEG緩沖液，4℃振蕩60min，棄沉淀室溫下?lián)嵊?0min，離心7,800-8,000rpm，20min↓↓沉淀用0.02M磷酸緩沖液懸浮，加入1％Triton X-100， 棄上清4℃過(guò)夜，離心5,100rpm，10min↓ ↓上清30％蔗糖墊層離心72，530rpm，150min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀，0.01MEDTA，棄上清4℃螯合240min，離心5,100rpm，10min↓ ↓棄沉淀上清與氯化色混合密度梯度，離心128,000rpm，180min↓ ↓分布收集病毒帶加入等體積磷酸緩沖液(含0.01MEDTA)↓↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃振蕩過(guò)夜，離心5,500rpm，10min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心114,500rpm，45min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜↓純病毒PLRV病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液液氮研磨，室溫下振蕩過(guò)夜↓三層紗布過(guò)濾，濾液與氯仿(1∶1)乳化5分鐘，離心9,600-12,000rpm，25min↓↓棄沉淀 上清中加入8％PEG緩沖液，室溫下攪拌120min離心9,600-12,000rpm，45min↓ ↓沉淀中+0.01M磷酸緩沖液，4℃過(guò)夜，離心6,200rpm，15min棄上清↓↓棄沉淀 上清離心11,290rpm，20min
↓ ↓上清蔗糖墊層離心72,530rpm，120min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜，離心7,840rpm，10min 棄上清↓ ↓棄沉淀 上清蔗糖墊層離心72,530rpm，120min↓ ↓沉淀+磷酸緩沖液，4℃過(guò)夜，離心5,000rpm，10min棄上清↓↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心114,500rpm，45min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心164,400rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃振蕩過(guò)夜，離心5,500rpm，10min↓ ↓棄沉淀蔗糖密度梯度，離心114,500rpm，45min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜↓純病毒PVS 病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨，三層紗布過(guò)濾，濾液離心5,000-6,000rpm，20min↓ ↓上清+4％PEG和1％Triton X-100，4℃振蕩 棄沉淀60min離心50,000rpm，10min↓ ↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀，離心10,000rpm，20min↓上清蔗糖墊層離心160,000rpm，180min↓↓棄上清0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀，離心5,100rpm，15min↓↓蔗糖密度梯度，離心100,000rpm，60min棄沉淀↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜，離心5,100rpm，15min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心128,500rpm，40min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm，60min↓ ↓棄上清 沉淀磷酸緩沖液懸浮，離心5,100rpm，10min↓↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心128,500rpm，40min↓純病毒2)病毒濃度測(cè)定取各病毒提純液用紫外分光光度計(jì)測(cè)得各病毒純度，具體情況如下表。
紫外分光光度計(jì)測(cè)病毒量

(5)免疫家兔取各病度稀釋后，用福氏佐劑與抗原1∶1混合乳化免疫家兔，每周注射一次，共注射3次，注射量為2ml，2ml，3ml。3周后每周耳頸脈取血20～30ml，測(cè)抗體濃度，抗體濃度降到最高峰一半時(shí)進(jìn)行第二次注射。
1)注射試fruend’adguent+生理鹽水+1mg/ml抗原2)提取血清取出的家兔粗血清塑料離心管中傾斜30度角放置，室溫下靜止過(guò)夜(或60～120分鐘，或冰浴30分鐘)，用巴士德吸管從邊緣剝離并取出析出血清(離心除去白細(xì)胞、紅細(xì)胞、獲得病毒抗血清)，血清用幾個(gè)玻璃管存放。一次取血可得病毒抗血清50ml左右。
(6)免疫球蛋白IgG制備1)免疫球蛋白IgG提取1ml血清加9ml水加10ml水飽和硫酸銨，混勻，室溫靜置30～45分鐘，4℃條件下，8000轉(zhuǎn)/秒，離心20分鐘，棄上清，留沉淀，用1ml 0.5×PBS緩沖液回溶。4℃0.5×PBS緩沖液500～1000ml中透析，2小時(shí)換一次透析液，共換4次。
2)病毒球蛋白IgG濃度測(cè)定取球蛋白稀釋200倍280nm下測(cè)吸收值病毒球蛋白IgG1mg/ml時(shí)OD280＝1.4[IgG]＝OD280×200/1.4

(7)免疫球蛋白IgG酶標(biāo)記1)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP制備標(biāo)記物堿性磷酸酶(AP)免疫球蛋白IgG濃度1mg/ml。
1mg/ml IgG+24ml AP+2.6ul 25％戊二醛溶液混勻，室溫放置2小時(shí)，4℃透析，透析步驟同上。
2)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP保存透析后液體加5mg牛血清白蛋白(BSA)，混合后放置4℃或-20℃保存半年～1年。
(8)免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP質(zhì)量測(cè)定
1)用已知成品免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP作對(duì)照，IgGOK＝1∶1000，IgG-APOK＝1∶5002)免疫球蛋白與酶標(biāo)免疫球蛋白的工作濃度的測(cè)定酶聯(lián)法測(cè)定免疫球蛋白和酶標(biāo)免疫球蛋白工作濃度，IgG用包被緩沖液稀釋1/500，1/1000，1/1500，1/2000；IgG-AP用酶標(biāo)緩沖液稀釋1/500，1/1000，DAS-ELISA法測(cè)定。確定IgG和IgG-AP的相應(yīng)工作濃度。
本發(fā)明的試劑已應(yīng)用于“農(nóng)業(yè)部脫毒馬鈴薯種薯質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(哈爾濱)”2003年和2004年農(nóng)業(yè)部田間普查任務(wù)，以及一些地方農(nóng)技推廣中心及種子生產(chǎn)單位的病毒檢測(cè)。因此，利用免疫技術(shù)制備馬鈴薯病毒抗血清檢測(cè)試劑，具有深遠(yuǎn)的社會(huì)價(jià)值和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)，對(duì)于完善我國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)質(zhì)量監(jiān)控體系，開(kāi)展病毒監(jiān)督，提高我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)量和質(zhì)量，贏得國(guó)際市場(chǎng)，具有重大意義。


圖1為本發(fā)明病毒抗血清的制備工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式病毒抗血清的制備如下病毒抗血清的制備如下實(shí)施路線(1)馬鈴薯病毒的指示植物是表1馬鈴薯主要病毒繁育植物

(2)毒源采集采集馬鈴薯生產(chǎn)田中具有典型馬鈴薯病毒癥狀的材料，經(jīng)ELISA鑒定篩選所需毒源材料，選鑒定結(jié)果陽(yáng)性，吸光值較高，再用透射電鏡作輔助檢驗(yàn)，確定毒源材料。
(3)馬鈴薯主要病毒的分離、繁殖將毒源材料分別接種于溫室種植的一系列健康的指示植物進(jìn)行病毒分離研究，接種后的指示植物須每隔2天調(diào)查一次，根據(jù)每組指示植物發(fā)病情況，篩選分離出需要的病毒，再經(jīng)過(guò)多次接種濾去其它病毒，純化病毒，然后用純化的病毒接種在繁毒材料上擴(kuò)繁病毒，供提純用。
將分離純化的馬鈴薯病毒一部分低溫貯存，作為日后試劑盒制備的病毒毒源繁殖病毒以供提純用。
病毒分離PVX汁液摩擦接種，千日紅——白花刺果曼陀羅——指尖椒——千日紅——黃苗榆煙。
PVY汁液摩擦接種或蚜蟲(chóng)非持久性接種，洋酸漿——黃苗榆煙。
PVS蚜蟲(chóng)非持久性接種，千日紅——毛曼陀羅——莧色藜——德伯尼煙。
PLRV蚜蟲(chóng)持久性接種，洋酸漿——白花刺果曼陀羅。
(4)馬鈴薯主要病毒的提純以差速離心為基礎(chǔ)，根據(jù)不同病毒特征，采用相應(yīng)方法進(jìn)行提純。
1)幾種病毒提純路線PVX病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨，離心3,000-4,000rpm，20min↓ ↓棄沉淀 上清，離心10,000-12,000rpm，20min↓↓棄上清沉淀+4％PEG緩沖液，攪拌60min，離心10,000rpm，20min↓↓上清4℃靜止60min，離心10,000-12,000rpm，20min棄沉淀↓ ↓棄上清 沉淀+4％PEG緩沖液，攪拌120min，離心10,000-12,000rpm，20min↓ ↓上清+提取液4℃過(guò)夜，離心10,000-12,000rpm，20min棄沉淀↓ ↓上清40,000rpm離心90min 棄沉淀↓↓
棄上清 沉淀+提取緩沖液過(guò)夜↓純病毒pvy病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液，三層紗布過(guò)濾，離心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓棄沉淀上清中加入1％Triton X-100，4℃，120min振蕩離心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓上清中加入4％PEG緩沖液，4℃振蕩60min， 棄沉淀室溫下?lián)嵊?0min，離心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓沉淀用0.02M磷酸緩沖液懸浮，加入1％Triton X-100， 棄上清4℃過(guò)夜，離心5,100rpm，10min↓ ↓上清30％蔗糖墊層離心72,530rpm，150min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀，0.01MEDTA， 棄上清4℃螯合240min，離心5,100rpm，10min↓ ↓棄沉淀 上清與氯化色混合密度梯度，離心128,000rpm，180min↓ ↓分布收集病毒帶加入等體積磷酸緩沖液(含0.01MEDTA)↓↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃振蕩過(guò)夜，離心5,500rpm，10min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心114,500rpm，45min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm，60min↓ ↓
棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜↓純病毒PLRV病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液液氮研磨，室溫下振蕩過(guò)夜↓三層紗布過(guò)濾，濾液與氯仿(1∶1)乳化5分鐘，離心9,600-12,000rpm，25min↓ ↓棄沉淀 上清中加入8％PEG緩沖液，室溫下攪拌120min離心9,600-12,000rpm，45min↓ ↓沉淀中+0.01M磷酸緩沖液，4℃過(guò)夜，離心6,200rpm，15min 棄上清↓ ↓棄沉淀 上清離心11,290rpm，20min↓ ↓上清蔗糖墊層離心72,530rpm，120min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜，離心7,840rpm，10min 棄上清↓ ↓棄沉淀 上清蔗糖墊層離心72,530rpm，120min↓↓沉淀+磷酸緩沖液，4℃過(guò)夜，離心5,000rpm，10min 棄上清↓ ↓棄沉淀蔗糖密度梯度，離心114,500rpm，45min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心164,400rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃振蕩過(guò)夜，離心5,500rpm，10min↓ ↓
棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心114,500rpm，45min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜↓純病毒PVS病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨，三層紗布過(guò)濾，濾液離心5,000-6,000rpm，20min↓↓上清+4％PEG和1％Triton X-100，4℃振蕩 棄沉淀60min離心50,000rpm，10min↓ ↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀，離心10,000rpm，20min↓上清蔗糖墊層離心160,000rpm，180min↓ ↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀，離心5,100rpm，15min↓↓蔗糖密度梯度，離心100,000rpm，60min 棄沉淀↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜，離心5,100rpm，15min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心128,500rpm，40min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm，60min
↓ ↓棄上清 沉淀磷酸緩沖液懸浮，離心5,100rpm，10min↓↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心128,500rpm，40min↓純病毒2)病毒濃度測(cè)定取各病毒提純液用紫外分光光度計(jì)測(cè)得各病毒純度，具體情況如下表。
紫外分光光度計(jì)測(cè)病毒量

(5)免疫家兔取各病度稀釋后，用福氏佐劑與抗原1∶1混合乳化免疫家兔，每周注射一次，共注射3次，注射量為2ml，2ml，3ml。3周后每周耳頸脈取血20～30ml，測(cè)抗體濃度，抗體濃度降到最高峰一半時(shí)進(jìn)行第二次注射。
1)注射試fruend’adguent+生理鹽水+1mg/ml抗原2)提取血清取出的家兔粗血清塑料離心管中傾斜30度角放置，室溫下靜止過(guò)夜(或60～120分鐘，或冰浴30分鐘)，用巴士德吸管從邊緣剝離并取出析出血清(離心除去白細(xì)胞、紅細(xì)胞、獲得病毒抗血清)，血清用幾個(gè)玻璃管存放。一次取血可得病毒抗血清50ml左右。
(6)免疫球蛋白IgG制備1)免疫球蛋白IgG提取1ml血清加9ml水加10ml水飽和硫酸銨，混勻，室溫靜置30～45分鐘，4℃條件下，8000轉(zhuǎn)/秒，離心20分鐘，棄上清，留沉淀，用1ml 0.5×PBS緩沖液回溶。4℃0.5×PBS緩沖液500～1000ml中透析，2小時(shí)換一次透析液，共換4次。
2)病毒球蛋白IgG濃度測(cè)定取球蛋白稀釋200倍280nm下測(cè)吸收值病毒球蛋白IgG1mg/ml時(shí)OD280＝1.4。
＝OD280×200/1.4

(7)免疫球蛋白IgG酶標(biāo)記1)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP制備標(biāo)記物堿性磷酸酶(AP)。
免疫球蛋白IgG濃度1mg/ml1mg/ml IgG+24ml AP+2.6ul 25％戊二醛溶液混勻，室溫放置2小時(shí)，4℃透析，透析步驟同上。
2)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP保存透析后液體加5mg牛血清白蛋白(BSA)，混合后放置4℃或-20℃保存半年～1年。
(8)免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP質(zhì)量測(cè)定1)用已知成品免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP作對(duì)照，IgGOK＝1∶1000，IgG-APOK＝1∶5002)免疫球蛋白與酶標(biāo)免疫球蛋白的工作濃度的測(cè)定酶聯(lián)法測(cè)定免疫球蛋白和酶標(biāo)免疫球蛋白工作濃度，IgG用包被緩沖液稀釋1/500，1/1000，1/1500，1/2000；IgG-AP用酶標(biāo)緩沖液稀釋1/500，1/1000，DAS-ELISA法測(cè)定。確定IgG和IgG-AP的相應(yīng)工作濃度。
權(quán)利要求
1.一種馬鈴薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒診斷試劑制作工藝方法，其特征是病毒抗血清的制備如下第一步搜集病毒分離用的指示植物；第二步采集病毒毒源，鑒定病毒種類(lèi)；第三步指示植物分離并純化病毒；第四步指示植物病毒擴(kuò)繁；第五步馬鈴薯主要病毒的提純；第六步病毒提純液免疫家兔獲得抗血清；第七步抗血清免疫球蛋白(IgG)的提取與濃度測(cè)定；第八步抗血清免疫球蛋的酶標(biāo)記；第九步馬鈴薯病毒檢測(cè)靈敏度測(cè)試；第十步免疫球蛋白與酶標(biāo)免疫球蛋白的工作濃度測(cè)定；實(shí)施路線(1)馬鈴薯病毒的指示植物是表1 馬鈴薯主要病毒繁育植物
(2)毒源采集采集馬鈴薯生產(chǎn)田中具有典型馬鈴薯病毒癥狀的材料，經(jīng)ELISA鑒定篩選所需毒源材料，選鑒定結(jié)果陽(yáng)性，吸光值較高，再用透射電鏡作輔助檢驗(yàn)，確定毒源材料。(3)馬鈴薯主要病毒的分離、繁殖將毒源材料分別接種于溫室種植的一系列健康的指示植物進(jìn)行病毒分離研究，接種后的指示植物須每隔2天調(diào)查一次，根據(jù)每組指示植物發(fā)病情況，篩選分離出需要的病毒，再經(jīng)過(guò)多次接種濾去其它病毒，純化病毒，然后用純化的病毒接種在繁毒材料上擴(kuò)繁病毒，供提純用。將分離純化的馬鈴薯病毒一部分低溫貯存，作為日后試劑盒制備的病毒毒源繁殖病毒以供提純用。病毒分離PVX汁液摩擦接種，千日紅——白花刺果曼陀羅——指尖椒——千日紅——黃苗榆煙PVY汁液摩擦接種或蚜蟲(chóng)非持久性接種，洋酸漿——黃苗榆煙PVS蚜蟲(chóng)非持久性接種，千日紅——毛曼陀羅——莧色藜——德伯尼煙PLRV蚜蟲(chóng)持久性接種，洋酸漿——白花刺果曼陀羅(4)馬鈴薯主要病毒的提純以差速離心為基礎(chǔ)，根據(jù)不同病毒特征，采用相應(yīng)方法進(jìn)行提純。1)幾種病毒提純路線PVX病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨，離心3,000-4,000rpm，20min↓ ↓棄沉淀 上清，離心10,000-12,000rpm，20min↓ ↓棄上清 沉淀+4％PEG緩沖液，攪拌60min，離心10,000rpm，20min↓↓上清4℃靜止60min，離心10,000-12,000rpm，20min棄沉淀↓ ↓棄上清沉淀+4％PEG緩沖液，攪拌120min，離心10,000-12,000rpm，20min↓↓上清+提取液4℃過(guò)夜，離心10,000-12,000rpm，20min 棄沉淀↓ ↓上清40,000rpm離心90min 棄沉淀↓ ↓棄上清 沉淀+提取緩沖液過(guò)夜↓純病毒pvy病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液，三層紗布過(guò)濾，離心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓棄沉淀上清中加入1％Triton X-100，4℃，120min振蕩離心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓上清中加入4％PEG緩沖液，4℃振蕩60min，棄沉淀室溫下?lián)嵊?0min，離心7,800-8,000rpm，20min↓↓沉淀用0.02M磷酸緩沖液懸浮，加入1％Triton X-100， 棄上清4℃過(guò)夜，離心5,100rpm，10min↓ ↓上清30％蔗糖墊層離心72,530rpm，150min 棄沉淀↓↓磷酸緩沖液懸浮沉淀，0.01MEDTA， 棄上清4℃螯合240min，離心5,100rpm，10min↓ ↓棄沉淀 上清與氯化色混合密度梯度，離心128,000rpm，180min↓ ↓分布收集病毒帶加入等體積磷酸緩沖液(含0.01MEDTA)↓↓棄上清磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃振蕩過(guò)夜，離心5,500rpm，10min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心114,500rpm，45min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜↓純病毒PLRV病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液液氮研磨，室溫下振蕩過(guò)夜↓三層紗布過(guò)濾，濾液與氯仿(1∶1)乳化5分鐘，離心9,600-12,000rpm，25min↓ ↓棄沉淀 上清中加入8％PEG緩沖液，室溫下攪拌120min離心9,600-12,000rpm，45min↓ ↓沉淀中+0.01M磷酸緩沖液，4℃過(guò)夜，離心6,200rpm，15min 棄上清↓ ↓棄沉淀上清離心11,290rpm，20min↓ ↓上清蔗糖墊層離心72,530rpm，120min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜，離心7,840rpm，10min 棄上清↓↓棄沉淀 上清蔗糖墊層離心72,530rpm，120min↓↓沉淀+磷酸緩沖液，4℃過(guò)夜，離心5,000rpm，10min 棄上清↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心114,500rpm，45min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心164,400rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃振蕩過(guò)夜，離心5,500rpm，10min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心114,500rpm，45min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜↓純病毒PVS病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨，三層紗布過(guò)濾，濾液離心5,000-6,000rpm，20min↓ ↓上清+4％PEG和1％Triton X-100，4℃振蕩棄沉淀
60min離心50,000rpm，10min↓ ↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀，離心10,000rpm，20min↓上清蔗糖墊層離心160,000rpm，180min↓↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀，離心5,100rpm，15min↓ ↓蔗糖密度梯度，離心100,000rpm，60min 棄沉淀↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm，60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀，4℃過(guò)夜，離心5,100rpm，15min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心128,500rpm，40min↓分布收集病毒帶，磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm，60min↓ ↓棄上清 沉淀磷酸緩沖液懸浮，離心5,100rpm，10min↓↓棄沉淀 蔗糖密度梯度，離心128,500rpm，40min↓純病毒2)病毒濃度測(cè)定取各病毒提純液用紫外分光光度計(jì)測(cè)得各病毒純度，具體情況如下表。紫外分光光度計(jì)測(cè)病毒量
(5)免疫家兔取各病度稀釋后，用福氏佐劑與抗原1∶1混合乳化免疫家兔，每周注射一次，共注射3次，注射量為2ml，2ml，3ml。3周后每周耳頸脈取血20～30ml，測(cè)抗體濃度，抗體濃度降到最高峰一半時(shí)進(jìn)行第二次注射。1)注射試fruend’adguent+生理鹽水+1mg/ml抗原2)提取血清取出的家兔粗血清塑料離心管中傾斜30度角放置，室溫下靜止過(guò)夜(或60～120分鐘，或冰浴30分鐘)，用巴士德吸管從邊緣剝離并取出析出血清(離心除去白細(xì)胞、紅細(xì)胞、獲得病毒抗血清)，血清用幾個(gè)玻璃管存放。一次取血可得病毒抗血清50ml左右。(6)免疫球蛋白IgG制備1)免疫球蛋白IgG提取1ml血清加9ml水加10ml水飽和硫酸銨，混勻，室溫靜置30～45分鐘，4℃條件下，8000轉(zhuǎn)/秒，離心20分鐘，棄上清，留沉淀，用1ml0.5×PBS緩沖液回溶。4℃0.5×PBS緩沖液500～1000ml中透析，2小時(shí)換一次透析液，共換4次。2)病毒球蛋白IgG濃度測(cè)定取球蛋白稀釋200倍280nm下測(cè)吸收值病毒球蛋白IgG1mg/ml時(shí)OD280＝1.4[IgG]＝OD280×200/1.4
(7)免疫球蛋白IgG酶標(biāo)記1)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP制備標(biāo)記物堿性磷酸酶(AP)免疫球蛋白IgG濃度1mg/ml1mg/ml IgG+24ml AP+2.6ul 25％戊二醛溶液混勻，室溫放置2小時(shí)，4℃透析，透析步驟同上2)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP保存透析后液體加5mg牛血清白蛋白(BSA)，混合后放置4℃或-20℃保存半年～1年(8)免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP質(zhì)量測(cè)定1)用已知成品免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP作對(duì)照，IgGOK＝1∶1000，IgG-APOK＝1∶5002)免疫球蛋白與酶標(biāo)免疫球蛋白的工作濃度的測(cè)定酶聯(lián)法測(cè)定免疫球蛋白和酶標(biāo)免疫球蛋白工作濃度，IgG用包被緩沖液稀釋1/500，1/1000，1/1500，1/2000；IgG-AP用酶標(biāo)緩沖液稀釋1/500，1/1000，DAS-ELISA法測(cè)定。確定IgG和IgG-AP的相應(yīng)工作濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及試劑，屬于馬鈴薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒診斷試劑制作工藝方法，其特點(diǎn)是采集馬鈴薯生產(chǎn)田中具有典型馬鈴薯病毒癥狀的材料，經(jīng)ELISA鑒定篩選所需毒源材料，選鑒定結(jié)果陽(yáng)性，吸光值較高，再用透射電鏡作輔助檢驗(yàn)，確定毒源材料。將毒源材料分別接種于溫室種植的一系列健康的指示植物進(jìn)行病毒分離研究，接種后的指示植物須每隔2天調(diào)查一次，根據(jù)每組指示植物發(fā)病情況，篩選分離出需要的病毒，再經(jīng)過(guò)多次接種濾去其它病毒，純化病毒，然后用純化的病毒接種在繁毒材料上擴(kuò)繁病毒，供提純用。
文檔編號(hào)G01N1/34GK1869698SQ200410044129
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者李學(xué)湛, 白艷菊, 呂典秋, 何云霞, 胡林雙, 于德才, 張儒喜, 馬紀(jì) 申請(qǐng)人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所