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馬鈴薯pvx、pvy、plrv、pvs病毒診斷試劑制作工藝方法

文檔序號(hào):5948452閱讀:375來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):馬鈴薯pvx、pvy、plrv、pvs病毒診斷試劑制作工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及試劑,屬于馬鈴薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒診斷試劑制作工藝方法。
背景技術(shù)
馬鈴薯是我國(guó)主要的糧、菜作物和食品加工原料,全國(guó)栽培面積460萬(wàn)公頃,居世界首位。但產(chǎn)量水平較低(11噸/公頃)不僅低于世界單產(chǎn)(15.5噸/公頃),更不及世界發(fā)達(dá)國(guó)家(30-50噸/公頃)。影響我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)量的主要因素,是病毒病害,植物病毒為專(zhuān)性寄生物,只能在其寄主的活細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,馬鈴薯為營(yíng)養(yǎng)體繁殖,病毒隨馬鈴薯繁殖而逐年積累,導(dǎo)致馬鈴薯種性退化,研究證明馬鈴薯病毒引起馬鈴薯減產(chǎn)在30-35%。目前,在馬鈴薯作物上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并報(bào)導(dǎo)的病毒和病毒病有25種以上,所幸只有少數(shù)病毒對(duì)馬鈴薯危害較重,通常復(fù)合侵染比某一種病毒單獨(dú)侵染嚴(yán)重,馬鈴薯生產(chǎn)田中多數(shù)為復(fù)合侵染。本發(fā)明針對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)中危害較重的病毒PVX、PVY、PVS和PLRV進(jìn)行研究。
目前國(guó)際上對(duì)馬鈴薯病毒防治最佳辦法是利用免疫血清技術(shù)汰除病株,結(jié)合莖尖脫毒、組織培養(yǎng),生產(chǎn)脫毒馬鈴薯種薯。酶聯(lián)(DAS-ELISA)法檢測(cè)馬鈴薯病毒,因其具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)而為國(guó)際、國(guó)內(nèi)普遍采用。
隨著我國(guó)加入WTO,國(guó)產(chǎn)脫毒馬鈴薯生產(chǎn)受到威脅,植物檢疫和病毒檢測(cè)必須與國(guó)際接軌,全國(guó)馬鈴薯栽培面積460萬(wàn)公頃,種薯田30.7萬(wàn)公頃,按標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)要求1公頃檢測(cè)200個(gè)樣品計(jì)算,全國(guó)共檢樣6000萬(wàn)個(gè),年需試劑盒60萬(wàn)個(gè)。進(jìn)入WTO后,加之我國(guó)西部大開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略的實(shí)施,因此急需大批量的高質(zhì)量,低價(jià)格的國(guó)產(chǎn)馬鈴薯病毒抗血清。病毒血清是酶聯(lián)檢測(cè)中的關(guān)鍵內(nèi)容,國(guó)際上利用免疫技術(shù)制備馬鈴薯病毒高效價(jià)血清檢測(cè)試劑盒已有數(shù)年歷史,但能夠批量生產(chǎn)高質(zhì)量馬鈴薯病毒血清的只有少數(shù)國(guó)家,所以?xún)r(jià)格較高,例如全球最大植物病害診斷試劑生產(chǎn)商——美國(guó)agdia公司每病毒500反應(yīng)孔4200元;德國(guó)Loewe生化技術(shù)公司每病毒500反應(yīng)孔4000元……我國(guó)早在20世紀(jì)80年代就開(kāi)始了相關(guān)技術(shù)的研究,但存在試劑特異性差,檢測(cè)流程復(fù)雜,種類(lèi)不全等諸多問(wèn)題,一直沒(méi)能進(jìn)行批量生產(chǎn)開(kāi)發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低廉,抗馬鈴薯病毒效果顯著的馬鈴薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒診斷試劑制作工藝方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的病毒抗血清的制備如下實(shí)施路線(1)馬鈴薯病毒的指示植物是
表1 馬鈴薯主要病毒繁育植物

(2)毒源采集采集馬鈴薯生產(chǎn)田中具有典型馬鈴薯病毒癥狀的材料,經(jīng)ELISA鑒定篩選所需毒源材料,選鑒定結(jié)果陽(yáng)性,吸光值較高,再用透射電鏡作輔助檢驗(yàn),確定毒源材料。
(3)馬鈴薯主要病毒的分離、繁殖將毒源材料分別接種于溫室種植的一系列健康的指示植物進(jìn)行病毒分離研究,接種后的指示植物須每隔2天調(diào)查一次,根據(jù)每組指示植物發(fā)病情況,篩選分離出需要的病毒,再經(jīng)過(guò)多次接種濾去其它病毒,純化病毒,然后用純化的病毒接種在繁毒材料上擴(kuò)繁病毒,供提純用。
將分離純化的馬鈴薯病毒一部分低溫貯存,作為日后試劑盒制備的病毒毒源繁殖病毒以供提純用。
病毒分離PVX汁液摩擦接種,千日紅——白花刺果曼陀羅——指尖椒——千日紅——黃苗榆煙PVY汁液摩擦接種或蚜蟲(chóng)非持久性接種,洋酸漿——黃苗榆煙PVS蚜蟲(chóng)非持久性接種,千日紅——毛曼陀羅——莧色藜——德伯尼煙PLRV蚜蟲(chóng)持久性接種,洋酸漿——白花刺果曼陀羅(4)馬鈴薯主要病毒的提純以差速離心為基礎(chǔ),根據(jù)不同病毒特征,采用相應(yīng)方法進(jìn)行提純。
1)幾種病毒提純路線PVX病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨,離心3,000-4,000rpm,20min
↓ ↓棄沉淀上清,離心10,000-12,000rpm,20min↓ ↓棄上清沉淀+4%PEG緩沖液,攪拌60min,離心10,000rpm,20min↓ ↓上清4℃靜止60min,離心10,000-12,000rpm,20min棄沉淀↓ ↓棄上清 沉淀+4%PEG緩沖液,攪拌120min,離心10,000-12,000rpm,20min↓ ↓上清+提取液4℃過(guò)夜,離心10,000-12,000rpm,20min 棄沉淀↓ ↓上清40,000rpm離心90min棄沉淀↓↓棄上清 沉淀+提取緩沖液過(guò)夜↓純病毒pvy病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液,三層紗布過(guò)濾,離心7,800-8,000rpm,20min↓ ↓棄沉淀 上清中加入1%Triton X-100,4℃,120min振蕩離心7,800-8,000rpm,20min↓↓上清中加入4%PEG緩沖液,4℃振蕩60min,棄沉淀室溫下?lián)嵊?0min,離心7,800-8,000rpm,20min↓↓沉淀用0.02M磷酸緩沖液懸浮,加入1%Triton X-100, 棄上清4℃過(guò)夜,離心5,100rpm,10min↓ ↓上清30%蔗糖墊層離心72,530rpm,150min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀,0.01MEDTA,棄上清4℃螯合240min,離心5,100rpm,10min↓ ↓棄沉淀上清與氯化色混合密度梯度,離心128,000rpm,180min↓ ↓分布收集病毒帶加入等體積磷酸緩沖液(含0.01MEDTA)↓↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃振蕩過(guò)夜,離心5,500rpm,10min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心114,500rpm,45min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜↓純病毒PLRV病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液液氮研磨,室溫下振蕩過(guò)夜↓三層紗布過(guò)濾,濾液與氯仿(1∶1)乳化5分鐘,離心9,600-12,000rpm,25min↓↓棄沉淀 上清中加入8%PEG緩沖液,室溫下攪拌120min離心9,600-12,000rpm,45min↓ ↓沉淀中+0.01M磷酸緩沖液,4℃過(guò)夜,離心6,200rpm,15min棄上清↓↓棄沉淀 上清離心11,290rpm,20min
↓ ↓上清蔗糖墊層離心72,530rpm,120min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜,離心7,840rpm,10min 棄上清↓ ↓棄沉淀 上清蔗糖墊層離心72,530rpm,120min↓ ↓沉淀+磷酸緩沖液,4℃過(guò)夜,離心5,000rpm,10min棄上清↓↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心114,500rpm,45min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心164,400rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃振蕩過(guò)夜,離心5,500rpm,10min↓ ↓棄沉淀蔗糖密度梯度,離心114,500rpm,45min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜↓純病毒PVS 病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨,三層紗布過(guò)濾,濾液離心5,000-6,000rpm,20min↓ ↓上清+4%PEG和1%Triton X-100,4℃振蕩 棄沉淀60min離心50,000rpm,10min↓ ↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀,離心10,000rpm,20min↓上清蔗糖墊層離心160,000rpm,180min↓↓棄上清0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀,離心5,100rpm,15min↓↓蔗糖密度梯度,離心100,000rpm,60min棄沉淀↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜,離心5,100rpm,15min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心128,500rpm,40min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm,60min↓ ↓棄上清 沉淀磷酸緩沖液懸浮,離心5,100rpm,10min↓↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心128,500rpm,40min↓純病毒2)病毒濃度測(cè)定取各病毒提純液用紫外分光光度計(jì)測(cè)得各病毒純度,具體情況如下表。
紫外分光光度計(jì)測(cè)病毒量

(5)免疫家兔取各病度稀釋后,用福氏佐劑與抗原1∶1混合乳化免疫家兔,每周注射一次,共注射3次,注射量為2ml,2ml,3ml。3周后每周耳頸脈取血20~30ml,測(cè)抗體濃度,抗體濃度降到最高峰一半時(shí)進(jìn)行第二次注射。
1)注射試fruend’adguent+生理鹽水+1mg/ml抗原2)提取血清取出的家兔粗血清塑料離心管中傾斜30度角放置,室溫下靜止過(guò)夜(或60~120分鐘,或冰浴30分鐘),用巴士德吸管從邊緣剝離并取出析出血清(離心除去白細(xì)胞、紅細(xì)胞、獲得病毒抗血清),血清用幾個(gè)玻璃管存放。一次取血可得病毒抗血清50ml左右。
(6)免疫球蛋白IgG制備1)免疫球蛋白IgG提取1ml血清加9ml水加10ml水飽和硫酸銨,混勻,室溫靜置30~45分鐘,4℃條件下,8000轉(zhuǎn)/秒,離心20分鐘,棄上清,留沉淀,用1ml 0.5×PBS緩沖液回溶。4℃0.5×PBS緩沖液500~1000ml中透析,2小時(shí)換一次透析液,共換4次。
2)病毒球蛋白IgG濃度測(cè)定取球蛋白稀釋200倍280nm下測(cè)吸收值病毒球蛋白IgG1mg/ml時(shí)OD280=1.4[IgG]=OD280×200/1.4

(7)免疫球蛋白IgG酶標(biāo)記1)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP制備標(biāo)記物堿性磷酸酶(AP)免疫球蛋白IgG濃度1mg/ml。
1mg/ml IgG+24ml AP+2.6ul 25%戊二醛溶液混勻,室溫放置2小時(shí),4℃透析,透析步驟同上。
2)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP保存透析后液體加5mg牛血清白蛋白(BSA),混合后放置4℃或-20℃保存半年~1年。
(8)免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP質(zhì)量測(cè)定
1)用已知成品免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP作對(duì)照,IgGOK=1∶1000,IgG-APOK=1∶5002)免疫球蛋白與酶標(biāo)免疫球蛋白的工作濃度的測(cè)定酶聯(lián)法測(cè)定免疫球蛋白和酶標(biāo)免疫球蛋白工作濃度,IgG用包被緩沖液稀釋1/500,1/1000,1/1500,1/2000;IgG-AP用酶標(biāo)緩沖液稀釋1/500,1/1000,DAS-ELISA法測(cè)定。確定IgG和IgG-AP的相應(yīng)工作濃度。
本發(fā)明的試劑已應(yīng)用于“農(nóng)業(yè)部脫毒馬鈴薯種薯質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(哈爾濱)”2003年和2004年農(nóng)業(yè)部田間普查任務(wù),以及一些地方農(nóng)技推廣中心及種子生產(chǎn)單位的病毒檢測(cè)。因此,利用免疫技術(shù)制備馬鈴薯病毒抗血清檢測(cè)試劑,具有深遠(yuǎn)的社會(huì)價(jià)值和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,同時(shí),對(duì)于完善我國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)質(zhì)量監(jiān)控體系,開(kāi)展病毒監(jiān)督,提高我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)量和質(zhì)量,贏得國(guó)際市場(chǎng),具有重大意義。


圖1為本發(fā)明病毒抗血清的制備工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式病毒抗血清的制備如下病毒抗血清的制備如下實(shí)施路線(1)馬鈴薯病毒的指示植物是表1馬鈴薯主要病毒繁育植物

(2)毒源采集采集馬鈴薯生產(chǎn)田中具有典型馬鈴薯病毒癥狀的材料,經(jīng)ELISA鑒定篩選所需毒源材料,選鑒定結(jié)果陽(yáng)性,吸光值較高,再用透射電鏡作輔助檢驗(yàn),確定毒源材料。
(3)馬鈴薯主要病毒的分離、繁殖將毒源材料分別接種于溫室種植的一系列健康的指示植物進(jìn)行病毒分離研究,接種后的指示植物須每隔2天調(diào)查一次,根據(jù)每組指示植物發(fā)病情況,篩選分離出需要的病毒,再經(jīng)過(guò)多次接種濾去其它病毒,純化病毒,然后用純化的病毒接種在繁毒材料上擴(kuò)繁病毒,供提純用。
將分離純化的馬鈴薯病毒一部分低溫貯存,作為日后試劑盒制備的病毒毒源繁殖病毒以供提純用。
病毒分離PVX汁液摩擦接種,千日紅——白花刺果曼陀羅——指尖椒——千日紅——黃苗榆煙。
PVY汁液摩擦接種或蚜蟲(chóng)非持久性接種,洋酸漿——黃苗榆煙。
PVS蚜蟲(chóng)非持久性接種,千日紅——毛曼陀羅——莧色藜——德伯尼煙。
PLRV蚜蟲(chóng)持久性接種,洋酸漿——白花刺果曼陀羅。
(4)馬鈴薯主要病毒的提純以差速離心為基礎(chǔ),根據(jù)不同病毒特征,采用相應(yīng)方法進(jìn)行提純。
1)幾種病毒提純路線PVX病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨,離心3,000-4,000rpm,20min↓ ↓棄沉淀 上清,離心10,000-12,000rpm,20min↓↓棄上清沉淀+4%PEG緩沖液,攪拌60min,離心10,000rpm,20min↓↓上清4℃靜止60min,離心10,000-12,000rpm,20min棄沉淀↓ ↓棄上清 沉淀+4%PEG緩沖液,攪拌120min,離心10,000-12,000rpm,20min↓ ↓上清+提取液4℃過(guò)夜,離心10,000-12,000rpm,20min棄沉淀↓ ↓上清40,000rpm離心90min 棄沉淀↓↓
棄上清 沉淀+提取緩沖液過(guò)夜↓純病毒pvy病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液,三層紗布過(guò)濾,離心7,800-8,000rpm,20min↓ ↓棄沉淀上清中加入1%Triton X-100,4℃,120min振蕩離心7,800-8,000rpm,20min↓ ↓上清中加入4%PEG緩沖液,4℃振蕩60min, 棄沉淀室溫下?lián)嵊?0min,離心7,800-8,000rpm,20min↓ ↓沉淀用0.02M磷酸緩沖液懸浮,加入1%Triton X-100, 棄上清4℃過(guò)夜,離心5,100rpm,10min↓ ↓上清30%蔗糖墊層離心72,530rpm,150min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀,0.01MEDTA, 棄上清4℃螯合240min,離心5,100rpm,10min↓ ↓棄沉淀 上清與氯化色混合密度梯度,離心128,000rpm,180min↓ ↓分布收集病毒帶加入等體積磷酸緩沖液(含0.01MEDTA)↓↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃振蕩過(guò)夜,離心5,500rpm,10min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心114,500rpm,45min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm,60min↓ ↓
棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜↓純病毒PLRV病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液液氮研磨,室溫下振蕩過(guò)夜↓三層紗布過(guò)濾,濾液與氯仿(1∶1)乳化5分鐘,離心9,600-12,000rpm,25min↓ ↓棄沉淀 上清中加入8%PEG緩沖液,室溫下攪拌120min離心9,600-12,000rpm,45min↓ ↓沉淀中+0.01M磷酸緩沖液,4℃過(guò)夜,離心6,200rpm,15min 棄上清↓ ↓棄沉淀 上清離心11,290rpm,20min↓ ↓上清蔗糖墊層離心72,530rpm,120min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜,離心7,840rpm,10min 棄上清↓ ↓棄沉淀 上清蔗糖墊層離心72,530rpm,120min↓↓沉淀+磷酸緩沖液,4℃過(guò)夜,離心5,000rpm,10min 棄上清↓ ↓棄沉淀蔗糖密度梯度,離心114,500rpm,45min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心164,400rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃振蕩過(guò)夜,離心5,500rpm,10min↓ ↓
棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心114,500rpm,45min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜↓純病毒PVS病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨,三層紗布過(guò)濾,濾液離心5,000-6,000rpm,20min↓↓上清+4%PEG和1%Triton X-100,4℃振蕩 棄沉淀60min離心50,000rpm,10min↓ ↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀,離心10,000rpm,20min↓上清蔗糖墊層離心160,000rpm,180min↓ ↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀,離心5,100rpm,15min↓↓蔗糖密度梯度,離心100,000rpm,60min 棄沉淀↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜,離心5,100rpm,15min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心128,500rpm,40min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm,60min
↓ ↓棄上清 沉淀磷酸緩沖液懸浮,離心5,100rpm,10min↓↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心128,500rpm,40min↓純病毒2)病毒濃度測(cè)定取各病毒提純液用紫外分光光度計(jì)測(cè)得各病毒純度,具體情況如下表。
紫外分光光度計(jì)測(cè)病毒量

(5)免疫家兔取各病度稀釋后,用福氏佐劑與抗原1∶1混合乳化免疫家兔,每周注射一次,共注射3次,注射量為2ml,2ml,3ml。3周后每周耳頸脈取血20~30ml,測(cè)抗體濃度,抗體濃度降到最高峰一半時(shí)進(jìn)行第二次注射。
1)注射試fruend’adguent+生理鹽水+1mg/ml抗原2)提取血清取出的家兔粗血清塑料離心管中傾斜30度角放置,室溫下靜止過(guò)夜(或60~120分鐘,或冰浴30分鐘),用巴士德吸管從邊緣剝離并取出析出血清(離心除去白細(xì)胞、紅細(xì)胞、獲得病毒抗血清),血清用幾個(gè)玻璃管存放。一次取血可得病毒抗血清50ml左右。
(6)免疫球蛋白IgG制備1)免疫球蛋白IgG提取1ml血清加9ml水加10ml水飽和硫酸銨,混勻,室溫靜置30~45分鐘,4℃條件下,8000轉(zhuǎn)/秒,離心20分鐘,棄上清,留沉淀,用1ml 0.5×PBS緩沖液回溶。4℃0.5×PBS緩沖液500~1000ml中透析,2小時(shí)換一次透析液,共換4次。
2)病毒球蛋白IgG濃度測(cè)定取球蛋白稀釋200倍280nm下測(cè)吸收值病毒球蛋白IgG1mg/ml時(shí)OD280=1.4。
=OD280×200/1.4

(7)免疫球蛋白IgG酶標(biāo)記1)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP制備標(biāo)記物堿性磷酸酶(AP)。
免疫球蛋白IgG濃度1mg/ml1mg/ml IgG+24ml AP+2.6ul 25%戊二醛溶液混勻,室溫放置2小時(shí),4℃透析,透析步驟同上。
2)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP保存透析后液體加5mg牛血清白蛋白(BSA),混合后放置4℃或-20℃保存半年~1年。
(8)免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP質(zhì)量測(cè)定1)用已知成品免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP作對(duì)照,IgGOK=1∶1000,IgG-APOK=1∶5002)免疫球蛋白與酶標(biāo)免疫球蛋白的工作濃度的測(cè)定酶聯(lián)法測(cè)定免疫球蛋白和酶標(biāo)免疫球蛋白工作濃度,IgG用包被緩沖液稀釋1/500,1/1000,1/1500,1/2000;IgG-AP用酶標(biāo)緩沖液稀釋1/500,1/1000,DAS-ELISA法測(cè)定。確定IgG和IgG-AP的相應(yīng)工作濃度。
權(quán)利要求
1.一種馬鈴薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒診斷試劑制作工藝方法,其特征是病毒抗血清的制備如下第一步搜集病毒分離用的指示植物;第二步采集病毒毒源,鑒定病毒種類(lèi);第三步指示植物分離并純化病毒;第四步指示植物病毒擴(kuò)繁;第五步馬鈴薯主要病毒的提純;第六步病毒提純液免疫家兔獲得抗血清;第七步抗血清免疫球蛋白(IgG)的提取與濃度測(cè)定;第八步抗血清免疫球蛋的酶標(biāo)記;第九步馬鈴薯病毒檢測(cè)靈敏度測(cè)試;第十步免疫球蛋白與酶標(biāo)免疫球蛋白的工作濃度測(cè)定;實(shí)施路線(1)馬鈴薯病毒的指示植物是表1 馬鈴薯主要病毒繁育植物
(2)毒源采集采集馬鈴薯生產(chǎn)田中具有典型馬鈴薯病毒癥狀的材料,經(jīng)ELISA鑒定篩選所需毒源材料,選鑒定結(jié)果陽(yáng)性,吸光值較高,再用透射電鏡作輔助檢驗(yàn),確定毒源材料。(3)馬鈴薯主要病毒的分離、繁殖將毒源材料分別接種于溫室種植的一系列健康的指示植物進(jìn)行病毒分離研究,接種后的指示植物須每隔2天調(diào)查一次,根據(jù)每組指示植物發(fā)病情況,篩選分離出需要的病毒,再經(jīng)過(guò)多次接種濾去其它病毒,純化病毒,然后用純化的病毒接種在繁毒材料上擴(kuò)繁病毒,供提純用。將分離純化的馬鈴薯病毒一部分低溫貯存,作為日后試劑盒制備的病毒毒源繁殖病毒以供提純用。病毒分離PVX汁液摩擦接種,千日紅——白花刺果曼陀羅——指尖椒——千日紅——黃苗榆煙PVY汁液摩擦接種或蚜蟲(chóng)非持久性接種,洋酸漿——黃苗榆煙PVS蚜蟲(chóng)非持久性接種,千日紅——毛曼陀羅——莧色藜——德伯尼煙PLRV蚜蟲(chóng)持久性接種,洋酸漿——白花刺果曼陀羅(4)馬鈴薯主要病毒的提純以差速離心為基礎(chǔ),根據(jù)不同病毒特征,采用相應(yīng)方法進(jìn)行提純。1)幾種病毒提純路線PVX病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨,離心3,000-4,000rpm,20min↓ ↓棄沉淀 上清,離心10,000-12,000rpm,20min↓ ↓棄上清 沉淀+4%PEG緩沖液,攪拌60min,離心10,000rpm,20min↓↓上清4℃靜止60min,離心10,000-12,000rpm,20min棄沉淀↓ ↓棄上清沉淀+4%PEG緩沖液,攪拌120min,離心10,000-12,000rpm,20min↓↓上清+提取液4℃過(guò)夜,離心10,000-12,000rpm,20min 棄沉淀↓ ↓上清40,000rpm離心90min 棄沉淀↓ ↓棄上清 沉淀+提取緩沖液過(guò)夜↓純病毒pvy病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液,三層紗布過(guò)濾,離心7,800-8,000rpm,20min↓ ↓棄沉淀上清中加入1%Triton X-100,4℃,120min振蕩離心7,800-8,000rpm,20min↓ ↓上清中加入4%PEG緩沖液,4℃振蕩60min,棄沉淀室溫下?lián)嵊?0min,離心7,800-8,000rpm,20min↓↓沉淀用0.02M磷酸緩沖液懸浮,加入1%Triton X-100, 棄上清4℃過(guò)夜,離心5,100rpm,10min↓ ↓上清30%蔗糖墊層離心72,530rpm,150min 棄沉淀↓↓磷酸緩沖液懸浮沉淀,0.01MEDTA, 棄上清4℃螯合240min,離心5,100rpm,10min↓ ↓棄沉淀 上清與氯化色混合密度梯度,離心128,000rpm,180min↓ ↓分布收集病毒帶加入等體積磷酸緩沖液(含0.01MEDTA)↓↓棄上清磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃振蕩過(guò)夜,離心5,500rpm,10min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心114,500rpm,45min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜↓純病毒PLRV病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液液氮研磨,室溫下振蕩過(guò)夜↓三層紗布過(guò)濾,濾液與氯仿(1∶1)乳化5分鐘,離心9,600-12,000rpm,25min↓ ↓棄沉淀 上清中加入8%PEG緩沖液,室溫下攪拌120min離心9,600-12,000rpm,45min↓ ↓沉淀中+0.01M磷酸緩沖液,4℃過(guò)夜,離心6,200rpm,15min 棄上清↓ ↓棄沉淀上清離心11,290rpm,20min↓ ↓上清蔗糖墊層離心72,530rpm,120min 棄沉淀↓ ↓磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜,離心7,840rpm,10min 棄上清↓↓棄沉淀 上清蔗糖墊層離心72,530rpm,120min↓↓沉淀+磷酸緩沖液,4℃過(guò)夜,離心5,000rpm,10min 棄上清↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心114,500rpm,45min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心164,400rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃振蕩過(guò)夜,離心5,500rpm,10min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心114,500rpm,45min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心160,400rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜↓純病毒PVS病毒↓寄主植物+2倍體積(w/v)提取緩沖液研磨,三層紗布過(guò)濾,濾液離心5,000-6,000rpm,20min↓ ↓上清+4%PEG和1%Triton X-100,4℃振蕩棄沉淀
60min離心50,000rpm,10min↓ ↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀,離心10,000rpm,20min↓上清蔗糖墊層離心160,000rpm,180min↓↓棄上清 0.05m磷酸緩沖液懸浮沉淀,離心5,100rpm,15min↓ ↓蔗糖密度梯度,離心100,000rpm,60min 棄沉淀↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm,60min↓ ↓棄上清 磷酸緩沖液懸浮沉淀,4℃過(guò)夜,離心5,100rpm,15min↓ ↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心128,500rpm,40min↓分布收集病毒帶,磷酸緩沖液稀釋?zhuān)x心102,700rpm,60min↓ ↓棄上清 沉淀磷酸緩沖液懸浮,離心5,100rpm,10min↓↓棄沉淀 蔗糖密度梯度,離心128,500rpm,40min↓純病毒2)病毒濃度測(cè)定取各病毒提純液用紫外分光光度計(jì)測(cè)得各病毒純度,具體情況如下表。紫外分光光度計(jì)測(cè)病毒量
(5)免疫家兔取各病度稀釋后,用福氏佐劑與抗原1∶1混合乳化免疫家兔,每周注射一次,共注射3次,注射量為2ml,2ml,3ml。3周后每周耳頸脈取血20~30ml,測(cè)抗體濃度,抗體濃度降到最高峰一半時(shí)進(jìn)行第二次注射。1)注射試fruend’adguent+生理鹽水+1mg/ml抗原2)提取血清取出的家兔粗血清塑料離心管中傾斜30度角放置,室溫下靜止過(guò)夜(或60~120分鐘,或冰浴30分鐘),用巴士德吸管從邊緣剝離并取出析出血清(離心除去白細(xì)胞、紅細(xì)胞、獲得病毒抗血清),血清用幾個(gè)玻璃管存放。一次取血可得病毒抗血清50ml左右。(6)免疫球蛋白IgG制備1)免疫球蛋白IgG提取1ml血清加9ml水加10ml水飽和硫酸銨,混勻,室溫靜置30~45分鐘,4℃條件下,8000轉(zhuǎn)/秒,離心20分鐘,棄上清,留沉淀,用1ml0.5×PBS緩沖液回溶。4℃0.5×PBS緩沖液500~1000ml中透析,2小時(shí)換一次透析液,共換4次。2)病毒球蛋白IgG濃度測(cè)定取球蛋白稀釋200倍280nm下測(cè)吸收值病毒球蛋白IgG1mg/ml時(shí)OD280=1.4[IgG]=OD280×200/1.4
(7)免疫球蛋白IgG酶標(biāo)記1)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP制備標(biāo)記物堿性磷酸酶(AP)免疫球蛋白IgG濃度1mg/ml1mg/ml IgG+24ml AP+2.6ul 25%戊二醛溶液混勻,室溫放置2小時(shí),4℃透析,透析步驟同上2)酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP保存透析后液體加5mg牛血清白蛋白(BSA),混合后放置4℃或-20℃保存半年~1年(8)免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP質(zhì)量測(cè)定1)用已知成品免疫球蛋白IgG與酶標(biāo)記免疫球蛋白IgG-AP作對(duì)照,IgGOK=1∶1000,IgG-APOK=1∶5002)免疫球蛋白與酶標(biāo)免疫球蛋白的工作濃度的測(cè)定酶聯(lián)法測(cè)定免疫球蛋白和酶標(biāo)免疫球蛋白工作濃度,IgG用包被緩沖液稀釋1/500,1/1000,1/1500,1/2000;IgG-AP用酶標(biāo)緩沖液稀釋1/500,1/1000,DAS-ELISA法測(cè)定。確定IgG和IgG-AP的相應(yīng)工作濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及試劑,屬于馬鈴薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒診斷試劑制作工藝方法,其特點(diǎn)是采集馬鈴薯生產(chǎn)田中具有典型馬鈴薯病毒癥狀的材料,經(jīng)ELISA鑒定篩選所需毒源材料,選鑒定結(jié)果陽(yáng)性,吸光值較高,再用透射電鏡作輔助檢驗(yàn),確定毒源材料。將毒源材料分別接種于溫室種植的一系列健康的指示植物進(jìn)行病毒分離研究,接種后的指示植物須每隔2天調(diào)查一次,根據(jù)每組指示植物發(fā)病情況,篩選分離出需要的病毒,再經(jīng)過(guò)多次接種濾去其它病毒,純化病毒,然后用純化的病毒接種在繁毒材料上擴(kuò)繁病毒,供提純用。
文檔編號(hào)G01N1/34GK1869698SQ200410044129
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者李學(xué)湛, 白艷菊, 呂典秋, 何云霞, 胡林雙, 于德才, 張儒喜, 馬紀(jì) 申請(qǐng)人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所
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