專利名稱：復(fù)制蛋白ciz1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)DNA復(fù)制蛋白活性的制劑的篩選方法，所述蛋白質(zhì)可作為癌癥治療中干預(yù)的靶標(biāo)，并包括調(diào)節(jié)所述活性的制劑。
本發(fā)明還涉及該DNA復(fù)制蛋白及其RNA轉(zhuǎn)錄物在增生性疾病，例如癌癥的預(yù)后和診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
DNA復(fù)制的起始是哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中的一個(gè)主要控制點(diǎn)，也是癌癥中許多不受調(diào)控的基因產(chǎn)物的作用點(diǎn)(Hanahan和Weinberg，2000)。起始過(guò)程涉及在細(xì)胞周期的G1期中在復(fù)制起始點(diǎn)上前復(fù)制復(fù)合物蛋白的組裝，其包括起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體(ORC)，Cdc6，Cdt1和Mcm蛋白質(zhì)。然后是第二組蛋白質(zhì)的作用，其促進(jìn)DNA聚合酶及其輔助因子，包括PCNA的裝載，并轉(zhuǎn)變?yōu)镾期。起始過(guò)程受細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴蛋白質(zhì)激酶2(Cdk2)，Cdc7-dbf4和Cdt1抑制劑geminin的調(diào)控(見(jiàn)Bell和Dutta的綜述，2002)。在S期細(xì)胞的細(xì)胞核中，復(fù)制叉聚集在一起形成幾百個(gè)復(fù)制｀聚點(diǎn)′或工廠(Cook，1999)。復(fù)制工廠(replication factory)似乎與細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)構(gòu)骨架相連，但形成連接的分子的性質(zhì)及其在復(fù)制叉活性中的作用仍不清楚。
酵母遺傳學(xué)已經(jīng)極大地推進(jìn)了鑒定參與真細(xì)胞核DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)和分析細(xì)胞周期中調(diào)節(jié)其活性的基本通路。在酵母至人中，這些蛋白質(zhì)和通路通常是保守的。在沿不同進(jìn)化通路分化的多細(xì)胞生物體中，仍然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)復(fù)雜性的其他層次。例如，在脊椎動(dòng)物中涉及神經(jīng)元分化的幾種蛋白質(zhì)也調(diào)控G1-S期的轉(zhuǎn)變(Ohnuma等人，2001)。這些蛋白質(zhì)包括cdk抑制子劑p21CIP1/Waf1/SDI1，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它參與生長(zhǎng)停止后少突角質(zhì)細(xì)胞的分化(Zezula等人，2001)，和其他細(xì)胞類型的終末分化(Parker等人，1995)。
DNA復(fù)制的起始可在體外用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分離細(xì)胞核和胞質(zhì)提取物重建(Krude，2000；Krude等人，1997；Laman等人，2001；Stoeber等人，1998)。而且，使用重組Cdk2與細(xì)胞周期蛋白質(zhì)E或A的組合物，DNA合成的復(fù)制復(fù)合體的組裝和活化可單獨(dú)重建(Coverley等人，2002)。我們已經(jīng)研究了活化步驟，用細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2體外催化，顯示一種未研究的蛋白質(zhì)，p21-Cip1相互作用鋅指蛋白質(zhì)(Ciz1)，在起始過(guò)程階段發(fā)揮作用。以前使用了一種細(xì)胞周期蛋白質(zhì)E-p21的改良的酵母雙雜交篩選鑒定了人Ciz1，生物化學(xué)分析證實(shí)了其與p21的相互作用(Mitsui等人，1999)。提出Ciz1在轉(zhuǎn)錄中的潛在作用，但其未被證明，也沒(méi)有確定有其他的任何功能。最近，該Ciz1基因使用一種體內(nèi)腫瘤發(fā)生模型從人成神經(jīng)管細(xì)胞瘤來(lái)源的cDNA文庫(kù)中分離出來(lái)(Warder和Keherly，2003)。我們的分析第一次顯示Ciz1在起始DNA復(fù)制中的陽(yáng)性作用。
當(dāng)重組細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2在體外活化DNA合成時(shí)，染色質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)發(fā)生許多變化。本發(fā)明涉及下列的發(fā)現(xiàn)，即cdc6-相關(guān)抗原、p85與DNA復(fù)制的起始相關(guān)，并被細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2調(diào)控。該蛋白質(zhì)從小鼠胚胎文庫(kù)中被克隆出，被鑒定為小鼠Ciz1。
體外分析顯示Ciz1蛋白質(zhì)陽(yáng)性調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的起始，其活性受蘇氨酸191/2上cdk的磷酸化調(diào)控，與控制起始的cdk-依賴性通路相連。與預(yù)測(cè)的和體細(xì)胞形式相比，胚胎形式的小鼠Ciz1是選擇性剪接。人Ciz1也是選擇性剪接，在與小鼠Ciz1相同的外顯子中有差異。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)重組胚胎形式的Ciz1可促進(jìn)哺乳動(dòng)物DNA復(fù)制的起始，小兒腫瘤可表達(dá)‘胚胎樣’形式的Ciz1。由于不想堅(jiān)持一種理論，本發(fā)明者提出在發(fā)育中不適當(dāng)次數(shù)的Ciz1錯(cuò)誤剪接產(chǎn)生了胚胎樣形式的Ciz1。這加速了不恰當(dāng)調(diào)控的DNA復(fù)制，引起癌細(xì)胞系的形成或發(fā)展。
近年來(lái)已經(jīng)發(fā)展出多種技術(shù)，其目的是特異地消除基因和/或基因產(chǎn)物。例如，使用反義核酸分子去結(jié)合并阻斷或滅活靶mRNA分子是抑制基因產(chǎn)物產(chǎn)生的有效手段。
特異消除基因功能的最近技術(shù)是通過(guò)在細(xì)胞中導(dǎo)入雙鏈RNA，也稱為抑制性RNA(RNAi)，引起與包含在該RNAi分子內(nèi)的序列互補(bǔ)的mRNA的破壞。這種RNAi分子含有RNA的兩條互補(bǔ)鏈(一條正義鏈和一條反義鏈)，退火后相互形成一條雙鏈RNA分子。RNAi分子一般來(lái)自要被消除的基因的外顯子或編碼序列。
核酸和蛋白質(zhì)都具有由其堿基或氨基酸序列決定的線性序列結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是一種三維結(jié)構(gòu)，這種三維結(jié)構(gòu)部分由其線性序列決定，也由這些分子所處的環(huán)境所決定。傳統(tǒng)的治療分子是小分子，例如，肽、多肽、或抗體，他們可結(jié)合靶分子，以產(chǎn)生促進(jìn)或拮抗效應(yīng)。很明顯地是核酸分子也具有關(guān)于提供必要的結(jié)合特性的制劑的潛在作用，這種制劑具有治療作用。這些核酸分子一般是指適配子(aptamer)。適配子是小的通常穩(wěn)定的核酸分子，含有靶分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)。
適配子至少含有一個(gè)修飾的核苷酸堿基。術(shù)語(yǔ)“修飾的核苷酸堿基”包括具有共價(jià)修飾的堿基和/或糖類的核苷酸。例如，修飾的核苷酸包括具有糖類的核苷酸，所述糖類共價(jià)結(jié)合在低分子量有機(jī)基團(tuán)上，而不是3’位置上的羥基基團(tuán)和5’位置上的磷酸基團(tuán)。因此修飾的核苷酸也包括2′取代糖類如2′-O-甲基-；2-O-烷基；2-O-烯丙基；2′-S-烷基；2′-S-烯丙基；2′-氟代-；2′-鹵代或2；疊氮基-細(xì)胞核糖、碳環(huán)糖類似物a-異頭糖；差向異構(gòu)體糖如阿拉伯糖。木糖或來(lái)蘇糖。吡喃糖。呋喃糖和景天庚酮糖。
修飾的核苷酸在本領(lǐng)域中是已知的，包括但不限于下面的實(shí)例烷基化嘌呤和/或嘧啶；?；堰屎?或嘧啶；或其他的雜環(huán)。這些類型的嘧啶和嘌呤在本領(lǐng)域中是已知的，包括，假異胞嘧啶(pseudoisocytosine)；N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶(ethanocytosine)；8-羥基-N6-甲基腺嘌呤；4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥甲基)尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿嘧啶；5-羧甲基氨甲基尿嘧啶；二氫尿嘧啶；次黃苷；N6-異戊基-腺嘌呤；1-甲基腺嘌呤；1-甲基假尿嘧啶；1-甲基鳥(niǎo)嘌呤；2，2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤；2-甲基腺嘌呤；2-甲基鳥(niǎo)嘌呤；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；7-甲基鳥(niǎo)嘌呤；5-甲基氨甲基尿嘧啶；5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶；β-D-mannosylqueosine；5-甲氧羰基甲基尿嘧啶；5-甲氧基尿嘧啶；2甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤；尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯；假尿嘧啶(psueouracil)；2-硫代胞嘧啶；5-甲基-2硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶；4-硫代尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；N-尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯；尿嘧啶5-羥基乙酸；queosine；2-硫代胞嘧啶；5-丙基尿嘧啶；5-丙基胞嘧啶；5-乙基尿嘧啶；5-乙基胞嘧啶；5-丁基尿嘧啶；5-戊基尿嘧啶；5-戊基胞嘧啶；和2，6，-二氨基嘌呤；甲基假尿嘧啶；1-甲基鳥(niǎo)嘌呤；1-甲基胞嘧啶；適配子可采用常規(guī)的磷酸二酯連接的核苷酸，使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)的固相或液相合成技術(shù)來(lái)合成。核苷酸之間的連接可使用其他連接分子。例如，連接基團(tuán)的分子式為P(O)S，(thioate)；P(S)S，(dithioate)；P(O)NR′2；P(O)R′；P(O)OR6；CO；或CONR′2，其中R是H(或一種鹽類)或烷基(1-12C)，R6是通過(guò)-O-或-S-與附近的核苷酸連接在一起的烷基(1-9C)。
用來(lái)特異消除基因和/或基因產(chǎn)物的其他技術(shù)集中在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子的功能或干擾其活性。通過(guò)例如從已有的小分子文庫(kù)中得到的化學(xué)抑制劑，可靶向蛋白質(zhì)。
針對(duì)不同的蛋白質(zhì)異形體，例如可在如小鼠或大鼠中產(chǎn)生抗體，優(yōu)選單克隆抗體?？贵w，也稱為免疫球蛋白質(zhì)，是對(duì)外源分子(抗原)有特異性的蛋白質(zhì)分子。免疫球蛋白質(zhì)(Ig)是一類結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括兩對(duì)多肽鏈，一對(duì)輕鏈(L)(低分子量)(κ或λ)，和一對(duì)重鏈(H)(γ，α，μ，δ和ε)，所有4條鏈通過(guò)二硫鍵連接在一起。H和L鏈都具有抗原結(jié)合區(qū)，其在不同的Ig分子之間是具有高度可變性的。另外，H和L鏈含有不可變或恒定的區(qū)域。
L鏈包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)。羧基末端結(jié)構(gòu)區(qū)實(shí)質(zhì)上在確定類型的L鏈之間是相同的，稱為“恒定”(C)區(qū)。氨基末端在L鏈之間是不同的，構(gòu)成抗體的結(jié)合位點(diǎn)。由于其具有可變性，因此稱為“可變”(V)區(qū)。
Ig分子的H鏈有幾種類型，α、μ、σ、α和γ(為幾種亞類)。組裝的Ig分子包括一個(gè)或多個(gè)單位的兩條相同的H和L鏈，其名稱由其所具有的H鏈派生而來(lái)。因此，有5種Ig同工型IgA、IgM、IgD、IgE和IgG(根據(jù)H鏈的不同具有4個(gè)亞類，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)及其各種功能的詳細(xì)描述可見(jiàn)，UsingAntibody(抗體應(yīng)用)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbour LaboratoryPress。
嵌合抗體是重組抗體，其中小鼠或大鼠抗體的所有V區(qū)與人抗體的C區(qū)組合在一起。人源化抗體是重組的雜合抗體，其融合了嚙齒類抗體V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)和人抗體V區(qū)的框架區(qū)。也可使用人抗體的C區(qū)?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)是位于抗體重鏈和輕鏈的N-末端結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)的區(qū)域，多數(shù)V區(qū)的變化受此區(qū)限制。這些區(qū)域在抗體分子的表面形成一些環(huán)。這些環(huán)為抗體和抗原之間提供了結(jié)合表面。
非人動(dòng)物的抗體可對(duì)外源抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并從循環(huán)中清除。當(dāng)注射入人受試者體內(nèi)時(shí)，嵌合和人源化抗體具有較小的抗原性，因?yàn)橹亟M雜合抗體內(nèi)嚙齒類(即外源)抗體的量較少，而人抗體區(qū)并不激發(fā)免疫反應(yīng)。這產(chǎn)生較輕微的免疫反應(yīng)，抗體的清除減少。當(dāng)使用治療性抗體治療人類疾病時(shí)，這是很明顯需要的。人源化抗體被設(shè)計(jì)為具有較少的“外源”抗體結(jié)構(gòu)區(qū)，因此被認(rèn)為和嵌合抗體相比免疫原性小。
在蛋白質(zhì)水平尋靶的其他技術(shù)包括使用隨機(jī)產(chǎn)生的可特異結(jié)合蛋白質(zhì)的肽，以及結(jié)合蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)變異體，并修飾其功能的任何其他分子。
了解DNA復(fù)制過(guò)程是癌癥治療領(lǐng)域中最關(guān)心的事情。已知癌細(xì)胞逐漸對(duì)化療制劑產(chǎn)生抗藥性，可逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)。對(duì)于癌癥治療一直需要鑒定一些靶標(biāo)以便識(shí)別新的制劑。DNA復(fù)制過(guò)程是癌癥治療中藥物干預(yù)的主要靶標(biāo)。需要識(shí)別調(diào)節(jié)DNA復(fù)制，并引起癌細(xì)胞系形成或發(fā)展的基因產(chǎn)物，以開(kāi)發(fā)影響其功能的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了應(yīng)用Ciz1核苷酸或多肽序列，或其任何片段或變異體，作為鑒定調(diào)節(jié)DNA復(fù)制藥物的靶標(biāo)。
如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“片段”或“變異體”是指從Ciz1的全長(zhǎng)核苷酸或氨基酸序列衍生或從其剪接變異體衍生的任何核酸或氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該片段具有足夠的長(zhǎng)度和/或與全長(zhǎng)Ciz1具有足夠同源性，以保持Ciz1的DNA復(fù)制活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用無(wú)活性的Ciz1片段。術(shù)語(yǔ)“片段”或“變異體”也涉及本文中的Ciz1RNA轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)異形體(或其的一部分)。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指在缺少特異制劑的情況下正常觀察到的水平之上和之下增加或減少DNA復(fù)制(即，與制劑的應(yīng)用直接或間接有關(guān)的DNA復(fù)制活性的任何變化)。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”也包括DNA復(fù)制空間或暫時(shí)結(jié)構(gòu)的改變。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種可鑒別調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的制劑的篩選方法，其特征在于所述的篩選方法包括應(yīng)用Ciz1核苷酸或多肽序列或其片段或變異體。
優(yōu)選的篩選方法包括檢測(cè)或測(cè)量制劑對(duì)核酸分子的作用，該分子選自a)含有

圖14、15或21任何一個(gè)中所示核酸序列的核酸分子；b)可與(a)中的核酸序列雜交，并具有Ciz1活性或其變異體的活性的核酸分子；c)由于a)和b)中序列的遺傳密碼和待測(cè)候選制劑而具有簡(jiǎn)并核酸序列的核酸分子；d)源于Ciz基因座上的基因組序列的核酸分子，或與該基因組序列雜交的核酸分子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該核酸分子通過(guò)刪除、取代或添加核酸序列中至少一個(gè)的核酸殘基而被修飾。
或者，篩選方法包括以下步驟(i)制備含有多肽分子，或其活性片段的制劑，該分子由選自下列的核酸分子編碼a)含有圖14、15或21所示核酸序列的核酸分子；b)可與(a)中的核酸序列雜交，并具有Ciz1活性或其變異體的活性的核酸分子；c)由于a)和b)中序列的遺傳密碼和待測(cè)候選制劑而具有簡(jiǎn)并核酸序列的核酸分子；d)源于Ciz基因座上的基因組序列的核酸分子，或與該基因組序列雜交的核酸分子；和ii)檢測(cè)或測(cè)量所述制劑對(duì)所述多肽活性的作用。
檢測(cè)DNA復(fù)制的測(cè)定方法在本領(lǐng)域中是已知的?？稍隗w外或體內(nèi)測(cè)定Ciz1，或其衍生的肽片段中存在的活性和潛在的治療性制劑對(duì)該活性的作用。
Ciz蛋白質(zhì)活性的體外測(cè)定方法包括同步化分離的G1期細(xì)胞核，補(bǔ)充了細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴性激酶的S期提取物或G1期提取物。在這些環(huán)境中Ciz1或其衍生肽片段的包含體可激發(fā)DNA復(fù)制的起始，可被可視化監(jiān)測(cè)(通過(guò)記錄在體外反應(yīng)中已經(jīng)摻入熒光核苷酸的細(xì)胞核)或測(cè)量放射性核苷酸的摻入。對(duì)干擾Ciz1蛋白功能的治療性制劑的測(cè)定包括在這些測(cè)定中尋找對(duì)DNA復(fù)制的抑制。制劑對(duì)Ciz1細(xì)胞核定位、染色質(zhì)結(jié)合、穩(wěn)定性、修飾和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的作用也可在這些測(cè)定中被監(jiān)測(cè)。
體內(nèi)測(cè)定將包含建立細(xì)胞和小鼠模型，這些細(xì)胞和小鼠模型可過(guò)度表達(dá)或較少表達(dá)Ciz1或衍生片段，引起細(xì)胞增殖的變化。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備在本領(lǐng)域中通常是已知的，在普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。治療性制劑的測(cè)定包括分析細(xì)胞周期時(shí)間、DNA復(fù)制的起始和在存在和缺少藥物時(shí)的癌癥發(fā)生率，這些藥物通過(guò)在RNA水平靶向Ciz1及其變異體而影響Ciz1蛋白活性或干擾Ciz1的產(chǎn)生。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，所述的雜交條件是嚴(yán)格的。
嚴(yán)格的雜交/洗滌條件在本領(lǐng)域中是為人所熟知的。例如，核酸雜合物在60℃用0.1xSSC，0.1％SDS洗滌后是穩(wěn)定的。在本領(lǐng)域中為人所熟知的是如果核酸序列已知，可計(jì)算出最佳的雜交條件。通常雜交條件使用了4-6x SSPE(20x SSPE含有175.3g NaCl，88.2g NaH2PO4H2O和7.4g EDTA，溶解在1升中，pH調(diào)整至7.4)；5-10x Denhardts溶液(50x Denhardts溶液含有5g Ficoll(400型，Pharmacia)，5g聚乙烯吡咯烷酮和5g小牛血清白蛋白質(zhì)；100μg-1.0mg/ml超聲波降解的鮭魚/鯡魚DNA；0.1-1.0％十二烷基磺酸鈉；可選擇40-60％去離子化甲酰胺。雜交溫度可根據(jù)核酸靶序列的GC含量而變化，但通常在42°-65℃之間。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，所述的多肽可通過(guò)刪除、取代或添加多肽序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基而被修飾。
通過(guò)一個(gè)或多個(gè)以任何組合形式存在的取代、添加、刪除、截?cái)嘈揎椀幕蜃儺惖亩嚯钠魏蛥⒄斩嚯模诎被嵝蛄猩嫌兴町?。?yōu)選的變異體中修飾是通過(guò)保守氨基酸取代從參照多肽中變化而來(lái)。這些取代作用是性質(zhì)類似的另一個(gè)氨基酸取代指定的氨基酸。下列非限制性列舉的氨基酸被認(rèn)為是保守替換(相似的)a)丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷胺酰胺；d)精氨酸和賴氨酸；e)異亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸和纈氨酸和f)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。優(yōu)選保留了與其變化來(lái)源的參照多肽有相同生物學(xué)功能和活性的變異體。或者變異體包括生物學(xué)功能改變的變異體，例如可作為拮抗劑的變異體，稱為“顯性失活”變異體。
另外，非保守取代可賦予所需的生物學(xué)活性，見(jiàn)Cain SA、WilliamsDM、Harris V、Monk PN。從全分子隨機(jī)突變的C5a文庫(kù)中選擇新的配體。Protein Eng.2001 Mar；14(3)189-93，引為參考文獻(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明功能相當(dāng)?shù)亩嚯男蛄惺且环N變異體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基取代，或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含一個(gè)取代基。保守的取代是在芳香族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之間一個(gè)替換另一個(gè)；羥基殘基Ser和Thr相互交換；酸性殘基Asp和Glu交換；酰胺殘基Asn和Gln之間的取代；堿性殘基Lys和Arg的交換；芳香族殘基Phe和Tyr之間的替換。
另外，本發(fā)明公開(kāi)了與本文公開(kāi)的核苷酸或多肽序列具有至少50％同源性的核苷酸序列，或其片段和功能相當(dāng)?shù)亩嚯?。在一個(gè)實(shí)施方式中，該核苷酸或多肽序列與本文圖示的核苷酸和氨基酸序列具有至少75％至85％的同源性，較優(yōu)選至少90％同源性，更為優(yōu)選的是至少95％同源性，更加優(yōu)選至少97％同源性，最優(yōu)選至少99％的同源性。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，所述的核酸分子包含編碼圖16或圖17中的，也包括那些在圖20A和20B中所描述的氨基酸序列的核酸序列，或其任何變異體。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選方法中，所述的核酸分子包含編碼圖16或圖17中Ciz1氨基酸序列或其變異體的核酸序列，包括在圖20A和20B中所述的那些序列。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的方法中，所述的多肽分子包含圖16或17中的Ciz1氨基酸序列或其變異體，包括在圖20A和20B中所述的那些序列。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的方法中，所述的多肽分子包含圖16或17中的Ciz1氨基酸序列或其變異體，包括圖20A和20B中所述的那些序列。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的方法中，所述的多肽被細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物表達(dá)，所述的篩選方法是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的篩選方法。
優(yōu)選上述細(xì)胞自然表達(dá)Ciz1多肽?；蛘咚黾?xì)胞被編碼Ciz1多肽(或其變異分子，例如癌細(xì)胞系中的那些)的核酸分子轉(zhuǎn)染。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的制劑。
優(yōu)選所述的制劑是介導(dǎo)DNA復(fù)制的Ciz1的拮抗劑?；蛘咚鲋苿┦墙閷?dǎo)DNA復(fù)制的Ciz1的促進(jìn)劑。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的方法中，所述的制劑選自多肽；肽；適配子；化學(xué)物質(zhì)；抗體；核酸；或多肽或核苷酸探針。
該制劑優(yōu)選含有的序列具有互補(bǔ)性或具有足夠同源性，提供與靶標(biāo)的特異結(jié)合，可用來(lái)為了診斷目的檢測(cè)核酸或蛋白質(zhì)水平。
或者通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的制劑是治療性制劑，可用于疾病的治療。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，制劑是抗體分子，可與圖16、17或20中所示的任何序列結(jié)合。
優(yōu)選所述的抗體是單克隆抗體。
或者所述制劑是反義核酸分子，其可結(jié)合并因此阻斷或使上述(i)中任何核酸序列編碼的mRNA失活。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述制劑是RNAi分子，其含有兩條互補(bǔ)的RNA鏈(正義鏈和反義鏈)，退火后相互結(jié)合形成一條雙鏈RNA分子。優(yōu)選RNAi分子來(lái)自Ciz1基因的外序列或來(lái)自另一條重疊基因。
在一個(gè)實(shí)施方式中，未剪接的mRNA被靶向定位，用RNAi抑制剪接變異體的產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方式中，剪接的變異mRNA被消除，不影響非變異的mRNA。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，所述的肽是寡肽。優(yōu)選，所述寡肽至少有10個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。優(yōu)選所述寡肽的長(zhǎng)度為至少20、30、40、50個(gè)氨基酸。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選方法中，所述肽是被修飾的肽。
對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很明顯的是，修飾的氨基酸包括但不限于例子4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、N6-乙酰賴氨酸、N6-甲基賴氨酸、N6，N6-二甲基賴氨酸、N6，N6，N6-三甲基賴氨酸、環(huán)己基丙氨酸、D-氨基酸、鳥(niǎo)氨酸。其他的修飾作用包括具有C2、C3或C4烷基R基團(tuán)的氨基酸，選擇性地被1，2或3個(gè)選自鹵素(例如F，Br，I)、羥基或C1-C4烷氧基的取代基取代。
或者所述肽被乙?；?或酰胺化作用修飾。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，多肽或肽被環(huán)化作用修飾。環(huán)化作用在本領(lǐng)域中是已知的，(見(jiàn)Scott等人，Chem Biol(2001)，8801-815；Gellerman等人，J.Peptide Res(2001)，57277-291；Dutta等人，J.PeptideRes(2000)，8398-412；Ngoka和Gross J Amer Soc Mass Spec(1999)，10360-363)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，為例如可抑制Ciz1或其變異體的反義或RNAi分子提供了一種載體作為輸送手段，因而使表達(dá)靶向蛋白質(zhì)的細(xì)胞可被靶向定位。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，病毒載體被用作輸送手段。
優(yōu)選載體包括含有選自下列核苷酸序列的表達(dá)基因盒a)如圖14、15和21中所示，編碼Ciz1氨基酸序列的核酸序列；b)與(a)的核酸序列雜交的核酸分子；c)由于a)和b)中序列和與上述任何序列的互補(bǔ)序列的遺傳密碼，具有簡(jiǎn)并核酸序列的核酸分子；d)編碼Ciz1mRNA前體(即，基因組序列)的核酸序列，其特征在于所述的表達(dá)基因盒轉(zhuǎn)錄連接于啟動(dòng)子序列。
優(yōu)選包括該表達(dá)基因盒的載體被改造以適合真細(xì)胞核細(xì)胞基因的表達(dá)。所述的適應(yīng)性作用(adaptation)一般包括的非限制性實(shí)例為，提供可介導(dǎo)細(xì)胞/組織特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動(dòng)子序列)。這些啟動(dòng)子序列是細(xì)胞/組織特異性，誘導(dǎo)性或結(jié)構(gòu)性的。
啟動(dòng)子元件一般也包括稱為TATA盒和RNA聚合酶起始選擇序列，其作用是選擇轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。這些序列也可結(jié)合多肽，其作用尤其是可以促進(jìn)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始選擇作用。
適應(yīng)性作用也包括提供可選擇標(biāo)記物和自主復(fù)制序列，其都可促進(jìn)所述載體在真細(xì)胞核細(xì)胞或原細(xì)胞核細(xì)胞宿主內(nèi)存在?？勺灾魃娴妮d體是指游離型載體?？纱龠M(jìn)編碼基因的載體表達(dá)的進(jìn)一步適應(yīng)性作用包括提供轉(zhuǎn)錄終止序列。
這些適應(yīng)性作用在本領(lǐng)域中是為人所熟知的。通常關(guān)于表達(dá)載體構(gòu)建和重組DNA技術(shù)已發(fā)表了大量的文獻(xiàn)。請(qǐng)見(jiàn)，Sambrook等人(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold SpringHarbour，NY和本文中的一些文獻(xiàn)；Marston，F(xiàn)(1987)DNA克隆技術(shù)應(yīng)用方法第III卷，IRL出版，Oxford UK；DNA克隆F M Ausubel等人，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種可鑒定增生性疾病的診斷方法，包括在其基因組或蛋白質(zhì)序列中檢測(cè)Ciz1基因、Ciz1剪接變異體和突變的存在或表達(dá)。
所述的診斷方法優(yōu)選包括下列的一個(gè)或多個(gè)步驟(i)將從待測(cè)受試者中分離的樣品與可特異結(jié)合具有Ciz1活性的多肽或編碼具有Ciz1活性的多肽的核酸的制劑接觸；和(ii)檢測(cè)或測(cè)量制劑在所述樣品中所述多肽或核酸上的結(jié)合；(iii)使用反轉(zhuǎn)錄PCR或?qū)崟r(shí)PCR監(jiān)測(cè)Ciz1同工型的表達(dá)并測(cè)定表達(dá)水平，(iv)根據(jù)該分子構(gòu)象特性的改變，測(cè)定核酸或氨基酸突變的存在。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的診斷方法在體內(nèi)實(shí)施。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的診斷方法先體外后體內(nèi)，或在體外實(shí)施。
優(yōu)選的診斷方法提供對(duì)樣品中Ciz1 RNA或蛋白質(zhì)變異體的定量檢測(cè)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了應(yīng)用調(diào)節(jié)Ciz1 RNA或蛋白質(zhì)或其變異體的制劑作為藥物的方法。
優(yōu)選所述的藥物含有本發(fā)明的篩選方法鑒定的制劑，結(jié)合或聯(lián)合了藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或稀釋液。
所述的藥物優(yōu)選可口服或局部給藥或注射給藥。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，藥物作為氣霧劑給藥。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的制劑制造用于治療增生性疾病的藥物。所述的增生性疾病優(yōu)選是癌癥。
所述的癌癥優(yōu)選是小兒癌癥，選自成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，非洲淋巴瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，尤文氏肉瘤家族腫瘤(ESFT)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，該癌癥是癌、腺癌、淋巴瘤或白血病。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，該疾病是肝、肺或皮膚癌或癌轉(zhuǎn)移。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了治療增生性疾病的方法，包括給予動(dòng)物，優(yōu)選人，一種根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的制劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的制劑制造一種藥物，其可減慢細(xì)胞的分裂或生長(zhǎng)。
本發(fā)明也包括在合理化藥物設(shè)計(jì)中應(yīng)用Ciz1氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Ciz1核苷酸和其氨基酸序列或變異體篩選化學(xué)文庫(kù)中可與Ciz1特異結(jié)合的制劑。
本發(fā)明也包括一種試劑盒，其含有通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的診斷性、預(yù)測(cè)性或治療性制劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，一種基于測(cè)序芯片的陣列用來(lái)檢測(cè)Ciz1的變化。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式現(xiàn)在僅通過(guò)實(shí)施例，并參考以下的圖表進(jìn)行描述圖1描述了細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2對(duì)晚G1期細(xì)胞核的作用。A)在3T全細(xì)胞提取物的Western印跡中抗Cdc6抗體VI可檢測(cè)小鼠Cdc6和第二抗原，其遷移率Mr大約為100kDa(基于Mcm3蛋白質(zhì)的遷移率，以前估計(jì)在接近85kDa處，因此該抗原被命名為p85-為了不引起混淆我們?cè)诖巳允褂孟嗤拿Q)。P85存在于可溶的部分和不溶的細(xì)胞核部分中(在體外復(fù)制條件下制備)。B)添加了重組細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2的G1期提取物起始“有復(fù)制能力的”晚G1期細(xì)胞核中的DNA合成。對(duì)照欄顯示了仍處于S期(無(wú)陰影)的部分細(xì)胞核，和那些來(lái)自S期細(xì)胞的提取物中起始復(fù)制的部分細(xì)胞核(陰影)。C)15分鐘后，在無(wú)細(xì)胞復(fù)制條件下，洗滌細(xì)胞核，重新分離染色質(zhì)部分，通過(guò)SDS-Page分離，進(jìn)行Mcm2和Mcm3的印跡。D)用抗體V1對(duì)相同的細(xì)胞核進(jìn)行印跡。在接觸誘導(dǎo)起始濃度的細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2的細(xì)胞核中p85抗原更為豐富?？贵wV1用來(lái)從小鼠胚表達(dá)文庫(kù)中克隆p85基因，后者被鑒定為Ciz1。
圖2小鼠Ciz1變異體的對(duì)比。預(yù)測(cè)的全長(zhǎng)Ciz1氨基酸序列(′Full′)與小鼠乳腺腫瘤cDNA的克隆(BCO18483)是相同的，而胚胎Ciz1(｀ECiz1′，AJ575057)和黑色素瘤來(lái)源的克隆(AK089986)缺少兩個(gè)不連續(xù)的內(nèi)序列。另外，ECiz1中第一個(gè)可獲得的蛋氨酸在外顯子3(Met84)的中間，將富聚谷氨酰胺區(qū)排除在N-末端以外。黑色素瘤來(lái)源的AK089986是不完整的，因?yàn)樗K止在所有小鼠和人的其他克隆C-末端之前的77個(gè)密碼子。星號(hào)表示在D中所示構(gòu)建物中被定點(diǎn)突變改變的氨基酸。與siRNA靶向的密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸有下劃線。B)小鼠Ciz1被至少17個(gè)外顯子編碼。編碼外顯子顯示為灰色，另外剪接區(qū)是黑色的，未翻譯區(qū)是白色的。兩個(gè)可交換的外顯子1序列包含在一些Ciz1轉(zhuǎn)錄物中(未顯示)，但在此所述的兩個(gè)翻譯起始位點(diǎn)上游的另外一個(gè)或者翻譯起始位點(diǎn)未被發(fā)現(xiàn)。C)在ECiz1中的序列特征和推測(cè)結(jié)構(gòu)區(qū)。顯示了預(yù)計(jì)的細(xì)胞核定位序列(NLS)，推計(jì)的細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴性激酶磷酸化位點(diǎn)，C2H2型鋅指和與細(xì)胞核基質(zhì)蛋白質(zhì)matrin3具有同源性的C末端結(jié)構(gòu)區(qū)(Nakayasu和Berezney，1991)。ECiz1缺乏的序列位置用三角表示。D)用于無(wú)細(xì)胞DNA復(fù)制實(shí)驗(yàn)中的ECiz1和得到的截?cái)嗪忘c(diǎn)突變。在A中顯示的括號(hào)內(nèi)的數(shù)目與全長(zhǎng)形式的小鼠Ciz1中的氨基酸位置有關(guān)。星號(hào)表示被定點(diǎn)突變消除的推測(cè)磷酸化位點(diǎn)。
圖3顯示了Ciz1蛋白和衍生片段在無(wú)細(xì)胞DNA復(fù)制實(shí)驗(yàn)中的作用，并舉例說(shuō)明了ECiz1可促進(jìn)哺乳動(dòng)物DNA復(fù)制的起始A)在S期提取物中孵育的過(guò)程中，重組ECiz1激發(fā)在“有復(fù)制能力的”晚G1期細(xì)胞核中DNA復(fù)制的起始。直方圖顯示了在存在或缺少異位ECiz1的情況下，體外(黑色)摻入生物素化核苷酸的細(xì)胞核的平均數(shù)目，4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)制備細(xì)胞核配方(preparation)時(shí)，已經(jīng)處于S期的細(xì)胞核有17％顯示是白色的。圖像顯示了使用或不使用1nMECiz1，細(xì)胞核在體外的復(fù)制。全部細(xì)胞核用二碘化丙錠(紅色)復(fù)染。B)對(duì)重組ECiz1的反應(yīng)是濃度依賴性的，在nM范圍是最靈敏、最適宜的。在本實(shí)驗(yàn)和在B-I中顯示的所有圖中，結(jié)果是以起始％來(lái)表示，而不是復(fù)制％?？蓮脑隗w外起始的細(xì)胞核的數(shù)目和“有能力”在體外起始(見(jiàn)方法)的細(xì)胞核的數(shù)目來(lái)計(jì)算。C)因?yàn)镋Ciz1 cdk位點(diǎn)突變體T(191/2)A在高濃度下可逃避抑制作用，蘇氨酸191/2參與調(diào)節(jié)Ciz1的DNA復(fù)制活性。D)Cdk位點(diǎn)突變體T(293)A可以類似ECiz1的作用曲線激發(fā)起始，但濃度較低。E)截?cái)嗟腅Ciz1(N末端442)缺少C-末端序列，但可在體外的起始與ECiz1相似。F)在本測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，C末端274沒(méi)有保留DNA復(fù)制活性。G，H，I)在ECiz1蛋白的N-末端三分之二處進(jìn)行的進(jìn)一步缺失分析顯示當(dāng)在體外測(cè)定時(shí)，外顯子8的3’的短區(qū)是Ciz1發(fā)揮功能所必需的。
圖4抗Ciz1多克隆抗體的特征和125kDa Ciz1相關(guān)條帶的鑒定A)考馬斯染色的SDS-聚丙烯凝膠顯示了純化的重組ECiz1片段N末端442，使用抗Cdc6抗體V1和抗Ciz1抗體1793和1794對(duì)重組N末端442進(jìn)行western印跡。B)3T3全細(xì)胞提取物的Western印跡。在用抗Ciz1抗體1793檢測(cè)的兩條條帶中，一條與p85-Ciz1(100kDa)具有相同的遷移率，被抗體V1識(shí)別，另一條的表觀Mr為125kDa?？笴iz1抗體1794僅識(shí)別Ciz1的125kDa形式(以及大約80kDa的第二抗原)。C)使用抗體V1或抗Ciz1 1793對(duì)3T3細(xì)胞核提取物的免疫沉淀。兩個(gè)抗體都可沉淀p85，后者在western印跡中可被相應(yīng)的抗體識(shí)別。P125可被抗體1793沉淀，抗體V1程度小一些，在western印跡中它們均可被1793識(shí)別。Mcm3作為對(duì)照。
圖5內(nèi)源性Ciz1的免疫熒光分析。Ciz1存在于亞細(xì)胞核聚點(diǎn)中，與DNA復(fù)制位點(diǎn)重疊A)接觸Triton X100之前(未處理)或之后(去垢劑處理)固定于3T3細(xì)胞中的內(nèi)源性Ciz1(紅色)，用抗Ciz1抗體1793檢測(cè)。細(xì)胞核用Hoescht33258(藍(lán)色)復(fù)染。為了進(jìn)行比較，用Cdc6特異性單克隆抗體檢測(cè)出Cdc6(綠色)。B)對(duì)于去垢劑處理的細(xì)胞核，重組Ciz1的加入可阻斷抗體1793的反應(yīng)性。C)去垢劑拮抗的Ciz1(紅色)存在于細(xì)胞周期群體中的所有細(xì)胞核內(nèi)，而去垢劑拮抗的PCNA(綠色)僅存在于S期細(xì)胞核中。D)去垢劑拮抗的Ciz和PCNA的高放大率共聚焦切片，和顯示共定位聚點(diǎn)(黃色)的合并圖像。E)在指示的位置處(i和ii)，在D的合并圖像上紅色和綠色熒光的線性圖。F)在D的整個(gè)合并圖像上綠色聚點(diǎn)與紅色相比的交叉相關(guān)作圖(Rubbi和Milner，2000；van Steensel等人，1996)，和Eii中顯示進(jìn)行thresh-holding熒光后的標(biāo)記切片(插圖)。對(duì)于PCNA，在F中插入的紅線顯示了當(dāng)Ciz1圖像被旋轉(zhuǎn)90°時(shí)相關(guān)性的消失。標(biāo)尺為10μM。
圖6RNA干擾。Ciz1的缺失可抑制S期A)在4個(gè)位點(diǎn)處可靶向Ciz1轉(zhuǎn)錄物的siRNA(見(jiàn)圖2A)被單獨(dú)加于周期中的3T3細(xì)胞，單次劑量為3nM，以指定的次數(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞數(shù)目。顯示了用siRNA8轉(zhuǎn)染后在16和40小時(shí)時(shí)細(xì)胞群(紅色輪廓)或假處理細(xì)胞(藍(lán)色輪廓)的圖像。B)在接觸Ciz1 siRNA(4和8)，或?qū)φ誈APDH siRNA后用抗Ciz1 1793(綠色)檢測(cè)的Ciz1蛋白質(zhì)。C)在與Ciz1 siRNA(4和8)，或?qū)φ誈APDHsiRNA接觸24小時(shí)后的細(xì)胞中Ciz1，GAPDH和β-肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄物的水平。括號(hào)中的數(shù)字反映了任意單位中的帶強(qiáng)度，Ciz1和GAPDH轉(zhuǎn)錄物(用β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化)的總體降低表示為百分比。D)用Ciz1 siRNA處理后48小時(shí)，將BrdU摻入進(jìn)DNA(綠色)中的細(xì)胞比例在Ciz1缺失的細(xì)胞中顯著降低。直方圖顯示4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果。E)在用Ciz1siRNA處理的群體中具有去垢劑拮抗性的Mcm3(綠色)的細(xì)胞核的數(shù)量是增加的。F)在這些條件下，具有去垢劑拈抗性的PCNA(綠色)的細(xì)胞核比例也是增加的。所有的細(xì)胞核被復(fù)染，并以偽彩顯示(紅色)。
圖7Ciz1外顯子3/4剪接變異體在小鼠原生殖細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中表達(dá)的RT-PCR分析。在這些細(xì)胞類型中，外顯子3和/或4是選擇性剪接的，但在新生動(dòng)物心臟中則不是。這些數(shù)據(jù)與下面的假設(shè)是一致的，即全長(zhǎng)的Ciz1在新生體細(xì)胞組織中是有特別優(yōu)勢(shì)的，變異體以更多的頻率出現(xiàn)在更早的發(fā)育過(guò)程和生殖系組織中。
圖8小鼠3T3細(xì)胞的暫時(shí)轉(zhuǎn)染。A.GFP-標(biāo)記的Ciz1構(gòu)建物被轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH3T3細(xì)胞中或B.在單細(xì)胞期被微注射進(jìn)小鼠受精卵的雄原細(xì)胞核中。24小時(shí)時(shí)，Ciz1和ECiz1定位在細(xì)胞核上，形成亞細(xì)胞核的斑點(diǎn)圖形，而GFP則單獨(dú)存在于細(xì)胞核和胞質(zhì)中。C.轉(zhuǎn)然后24小時(shí)活3T3細(xì)胞核的高放大率圖像顯示了EGFP標(biāo)記的Ciz1和ECiz1的亞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，以及去掉C-末端片段(相當(dāng)于C末端274)的衍生片段。在缺少C-末端結(jié)構(gòu)區(qū)的情況下，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)GFP-ECiz1分散的位于細(xì)胞核內(nèi)，而GFP-Ciz1則在一起在細(xì)胞核內(nèi)聚集，形成一個(gè)或兩個(gè)大的斑塊。D.直至細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂，C末端274結(jié)構(gòu)區(qū)一直單獨(dú)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(最可能是由于缺少細(xì)胞核定位序列和被動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞核的通道)，但一旦與細(xì)胞核結(jié)構(gòu)內(nèi)部結(jié)合，就與染色體凝聚在一起。E.顯示了在轉(zhuǎn)染后第一個(gè)12小時(shí)用BrdU標(biāo)記的群體中GFP-Ciz1(綠色)，BrdU(紅色)和全細(xì)胞核(藍(lán)色)的代表性圖像。直方圖顯示了三個(gè)單獨(dú)的標(biāo)記窗口中與未轉(zhuǎn)染(灰色)細(xì)胞的數(shù)目相比，摻入BrdU的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(綠色)的比例。在轉(zhuǎn)染后0-22小時(shí)的過(guò)程中，當(dāng)用Ciz1或ECiz1轉(zhuǎn)染時(shí)，在BrdU標(biāo)記的部分中快速周期中細(xì)胞表現(xiàn)一致性的增加。使用密集培養(yǎng)獲得了相似的結(jié)果，其中大多數(shù)細(xì)胞退出細(xì)胞周期，進(jìn)入靜止期。但當(dāng)轉(zhuǎn)染后22小時(shí)，快速周期中細(xì)胞與BrDu接觸很短的脈沖(20分鐘)時(shí)，與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照和單獨(dú)用GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在Ciz1和ECiz1轉(zhuǎn)染群體中參與DNA合成的細(xì)胞數(shù)目是減少的。這表明經(jīng)過(guò)22小時(shí)，在表達(dá)Ciz1的細(xì)胞中DNA合成中止。
圖9在轉(zhuǎn)染群體中增殖潛能和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。在轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞群中細(xì)胞簇增加。A.細(xì)胞用GFP標(biāo)記的Ciz1或ECiz1的N-末端三分之二處(N-末端442)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并用50μg/ml G418選擇下保持。選擇3周后，可見(jiàn)細(xì)胞聚集體，其中有GFP陽(yáng)性細(xì)胞。
圖10兒科癌癥中的人Ciz1剪接變異體。在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中有7個(gè)人Ciz1cDNA，但僅有1個(gè)來(lái)自正常成人組織(B細(xì)胞)，它含有所有預(yù)測(cè)的外顯子。其他6個(gè)來(lái)自胚細(xì)胞或兒科癌癥。其中的5個(gè)選擇性剪接，其變化在外顯子2、3、6和8中(類似小鼠ECiz1)，也可在外顯子4中(類似小鼠ES細(xì)胞，原生殖細(xì)胞和睪丸)。第6個(gè)(AF159025)缺少第一個(gè)蛋氨酸，含有單核苷酸多態(tài)性，可產(chǎn)生氨基酸取代。所有與預(yù)測(cè)序列的差異(AB030835)被標(biāo)記。
圖11EST序列分析。在每個(gè)圖上Ciz1蛋白的示意圖被引入作為參考，顯示選擇性剪接的外顯子(黑色)的位置，推測(cè)的染色質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)區(qū)(灰色)和預(yù)測(cè)的鋅指(黑色垂直線)。所有EST序列伴隨其Genbank登錄號(hào)，并顯示其來(lái)源的文庫(kù)，標(biāo)在括號(hào)中。由于選擇性剪接在Ciz1EST中缺少的序列以黃色顯示，移碼以紅色，推測(cè)的缺失以灰色顯示。產(chǎn)生氨基酸替換的單核苷酸多態(tài)性以黑點(diǎn)標(biāo)示，其中一些發(fā)生在共有cdk磷酸化位點(diǎn)中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對(duì)Ciz1活性(藍(lán)點(diǎn))的調(diào)節(jié)是很重要的。在癌細(xì)胞系MGC102中插入序列的位置用三角指示。
A)來(lái)自兒科癌癥(paediatric cancer)和成人神經(jīng)系統(tǒng)癌癥的已翻譯的EST。
B)來(lái)自多種非癌細(xì)胞和組織的已翻譯的EST。
C)來(lái)自白血病、淋巴瘤和正常造血干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的已翻譯的EST。
D)來(lái)自癌癥的已翻譯的EST。
E)來(lái)自其他一些癌癥的已翻譯的EST。
F)在人Ciz1中的選擇性剪接區(qū)的總結(jié)，顯示條件性包含序列。
圖12在尤文氏肉瘤家族腫瘤細(xì)胞系(ESFT)和成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的Ciz1剪接變異體的表達(dá)。A.來(lái)自6個(gè)獨(dú)立的ESFT細(xì)胞系，兩個(gè)成神經(jīng)細(xì)胞瘤和對(duì)照細(xì)胞系(HEK293細(xì)胞)的整個(gè)RNA樣品使用4條不同的引物組進(jìn)行RT-PCR分析。
ESFT細(xì)胞系是1)A673，2)RDES，3)SKES1，4)SKNMC，5)TC3，6)TTC466.
成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系是1)IMR32，2)SKNSH。
B.ESFT和成神經(jīng)細(xì)胞瘤Ciz1外顯子3/4/5PCR產(chǎn)物的分析。引物h.3和h4(跨越有潛在可變性的外顯子4和6)的產(chǎn)物更詳細(xì)地進(jìn)行分析。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的步驟，從瓊脂糖凝膠中純化PCR片段，亞克隆并測(cè)序鑒定片段大小變化的來(lái)源。7個(gè)細(xì)胞系的每個(gè)細(xì)胞系中1和11之間的克隆被測(cè)序，結(jié)果以表格形式進(jìn)行總結(jié)。來(lái)自ESFT細(xì)胞系的Ciz1在全部轉(zhuǎn)錄物的中31％缺少外顯子4，對(duì)于一些ESFT細(xì)胞系，這個(gè)數(shù)字接近50％。在這里檢測(cè)的兩個(gè)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中更普遍地缺乏DSSSQ。
圖13在正常人成纖維細(xì)胞(Wi38)和轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系(PC3和LNCAP)中的Ciz1同工型。A.與非癌細(xì)胞系相比，在細(xì)胞核部分中兩個(gè)前列腺癌細(xì)胞系含有過(guò)量的最大的p125Ciz1蛋白質(zhì)變異體。B.在DNA復(fù)制起始過(guò)程中通過(guò)蛋白質(zhì)加工從p125變異體中產(chǎn)生p85(100)模型。
圖14顯示小鼠mRNA序列的全長(zhǎng)。
圖15顯示人mRNA序列的全長(zhǎng)。
圖16顯示小鼠蛋白質(zhì)序列的全長(zhǎng)。
圖17顯示人蛋白質(zhì)序列的全長(zhǎng)。
圖18顯示選擇性剪接的人蛋白質(zhì)序列。在剪接的蛋白質(zhì)序列中顯示的序列是缺失的。
圖19顯示可被選擇性剪接的人mRNA序列。在剪接的蛋白質(zhì)序列中顯示的序列是缺失的。
圖20A和B顯示通過(guò)丟失外顯子在人Ciz蛋白質(zhì)中建立的單一交接序列。交界序列代表了本發(fā)明方法鑒定的治療性制劑靶標(biāo)的基本位點(diǎn)。
圖21A至H顯示在人Ciz1mRNA中建立的交接序列。
Ciz1的鑒定針對(duì)重組人Cdc6，我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種多克隆抗體(抗體V1)(Coverley等人，2000；Stoeber等人，1998；Williams等人，1998)，以便鑒定和研究一種未知的抗原，其行為與體外DNA復(fù)制的起始有關(guān)。該抗原的表觀Mr為100kDa(稱為p85)，很容易在3T3細(xì)胞的提取物中被檢測(cè)到(圖1A)。
在無(wú)細(xì)胞復(fù)制實(shí)驗(yàn)中使用“有復(fù)制能力”的晚G1期細(xì)胞核、G1提取物和重組細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2，DNA合成可被活化。在這些條件下，細(xì)胞核將標(biāo)記的核苷酸插入進(jìn)新生的DNA中，其方式嚴(yán)格依賴于活性蛋白質(zhì)激酶的濃度(圖1B)。在最佳濃度之上和之下，沒(méi)有DNA復(fù)制的起始發(fā)生。但是，可發(fā)生與起始作用負(fù)相關(guān)的其他事件(Coverley等人，2002)。在此我們使用了DNA合成的活化(圖1B)，和Mcm2的磷酸化(引起遷移率增加，圖1C)，以校正無(wú)細(xì)胞復(fù)制實(shí)驗(yàn)中重組細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2的作用，并將p85的行為與DNA合成的活化聯(lián)系起來(lái)。
在從含有復(fù)制起始誘導(dǎo)濃度的細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2的反應(yīng)中重新分離的G1細(xì)胞核中，與接觸更低或更高濃度激酶的細(xì)胞核相比，p85抗原更為普遍(圖1D)。這表明在一些水平上p85受細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2的調(diào)控，其方式與DNA合成的活化是一致的。在無(wú)細(xì)胞起始過(guò)程中沒(méi)有其他抗原與此階段密切相關(guān)，因此我們使用抗體V1來(lái)克隆小鼠p85基因。
當(dāng)用于來(lái)自11天小鼠胚胎的cDNA表達(dá)文庫(kù)時(shí)，抗體V1挑出的兩個(gè)克隆能夠在多輪篩選后仍然存活(見(jiàn)方法)。一個(gè)編碼小鼠Cdc6，而另一個(gè)編碼人Ciz1鼠同源物的716個(gè)氨基酸(Mitsui等人，1999)。全長(zhǎng)人和小鼠Ciz1在氨基酸水平大約具有70％總體同源性，在N和C末端區(qū)同源性最大(＞80％)。Ciz1在脊椎動(dòng)物中是保守的，因?yàn)樵诖笫蠛秃与嘀写嬖谕次?，但在低等真?xì)胞核細(xì)胞中沒(méi)有找到具有很高程度同源性或相似結(jié)構(gòu)區(qū)的蛋白質(zhì)，增加了進(jìn)化的Ciz1在脊椎動(dòng)物發(fā)育中發(fā)揮特殊作用的可能性。
以前關(guān)于人Ciz1的出版物(Mitsui等人，1999)證明了其與細(xì)胞周期蛋白質(zhì)p21-CIP1的相互作用，引起了對(duì)其作為轉(zhuǎn)錄因子，而不是DNA復(fù)制因子的可能作用的研究。在本專利申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)日后的第二篇發(fā)表的文章(Warder和Keherly 2003)指出Ciz1在腫瘤發(fā)生中的作用，但沒(méi)有證明其在DNA復(fù)制中的作用，或認(rèn)識(shí)到Ciz1剪接變異體表達(dá)的重要性。
多種Ciz1同工型預(yù)測(cè)的小鼠Ciz1開(kāi)放可讀框和來(lái)自小鼠乳腺腫瘤文庫(kù)(BC018483)的cDNA，含有三個(gè)不存在于我們的胚胎克隆(AJ575057)中的區(qū)域，此后稱為ECiz1(圖2A)。ECiz1中的三個(gè)可變區(qū)似乎是外顯子2/3，6和8選擇性剪接的結(jié)果(圖2B)。小鼠黑色素瘤克隆AK089986缺少與ECiz1相同的三個(gè)區(qū)域中的兩個(gè)(圖2A)，而第三個(gè)區(qū)域編碼N-末端聚谷胺酰胺的延伸，它在人細(xì)胞瘤來(lái)源的克隆中也是缺失的。來(lái)自外顯子3/4的第四條序列框在小鼠ES細(xì)胞來(lái)源的Ciz1轉(zhuǎn)錄物和小鼠原生殖細(xì)胞中的外顯子4中是缺失的(圖7)。人Ciz1也可在RNA水平被選擇性剪接，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物排除了與小鼠Ciz1相同的四條序列框的組合(見(jiàn)下)。實(shí)際上，小鼠Ciz1 cDNA中所有已知的變化與人有接近的規(guī)律，其中一些在氨基酸水平是相同的。這表明不同的Ciz1同工型具有功能顯著性。第五個(gè)可變區(qū)(在小鼠中仍未觀察到)在主要來(lái)源于癌癥的人Ciz1轉(zhuǎn)錄物中是選擇性剪接的。
數(shù)據(jù)表明更短形式的Ciz1(缺少選擇性剪接的外顯子)在發(fā)育早期和產(chǎn)生生殖系的細(xì)胞譜系中是最普遍的。圖7中顯示的分析中，僅有來(lái)自完全發(fā)育成新生心臟的Ciz1顯示沒(méi)有選擇性剪接，而所有的胚胎類型細(xì)胞均含有選擇性剪接形式。
而且，在公共數(shù)據(jù)庫(kù)(人或小鼠)中僅有完整Ciz1 cDNA來(lái)自非胚胎類型細(xì)胞，僅胚胎來(lái)源的是選擇性剪接的。因此，Ciz1剪接變異體表達(dá)似乎優(yōu)先發(fā)生在沒(méi)有完全分化的細(xì)胞類型中。
很顯著地，來(lái)自兒科癌癥的Ciz1 cDNA也是選擇性剪接的(見(jiàn)下)。這讓我們假設(shè)在發(fā)育中正常的時(shí)刻不能表達(dá)合適的Ciz1同工型會(huì)引起不當(dāng)調(diào)節(jié)Ciz1活性。這將引起沒(méi)有時(shí)間性的增殖和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
ECiz1在體外激發(fā)DNA的復(fù)制在與S期細(xì)胞的胞質(zhì)提取物接觸后，晚G1期細(xì)胞核可起始DNA的復(fù)制，并開(kāi)始合成新生DNA(Krude等人，1997)。我們使用這種無(wú)細(xì)胞測(cè)定來(lái)檢驗(yàn)ECiz1，和衍生重組片段對(duì)DNA合成的作用(圖3)。全長(zhǎng)ECiz1蛋白質(zhì)均可持續(xù)增加在體外復(fù)制的細(xì)胞核的數(shù)目，從30％(+/-0.9％)至46％(+/-5.5％)，這表明Ciz1限于在S期提取物中的起始作用(圖3A)。以前僅有兩種其他類型的蛋白質(zhì)(細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴性激酶，Coverley等人，2002；Krude等人，1997；Laman等人，2001，和Cdc6蛋白質(zhì)，Coverley等人，2002；Stoeber等人，1998)被發(fā)現(xiàn)可激發(fā)無(wú)細(xì)胞的起始作用。因此，ECiz1是第一個(gè)具有這種特性的蛋白質(zhì)，還未被認(rèn)為參與了復(fù)制過(guò)程。重組ECiz1對(duì)無(wú)細(xì)胞起始作用的正效應(yīng)說(shuō)明內(nèi)源性Ciz1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA復(fù)制起一定的陽(yáng)性作用。
無(wú)細(xì)胞起始作用的激發(fā)是濃度依賴性的，在S期提取物中大約1nMECiz1左右達(dá)到峰值活性(圖3B)。這就重復(fù)了以前用其他重組蛋白質(zhì)無(wú)細(xì)胞分析的結(jié)果(Coverley等人，2002；Krude等人，1997)，其中在高濃度時(shí)，一般起始的激發(fā)作用達(dá)到峰值，然后回落至未激發(fā)的水平。對(duì)ECiz1，在高濃度時(shí)活性下降的原因仍不清楚。但是，突變研究(見(jiàn)下)表明抑制機(jī)制可能是有活性和特異的，而不是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)復(fù)合體的更高序列組合物中出現(xiàn)的普遍失衡。
ECiz1的下調(diào)涉及蘇氨酸191/192體內(nèi)Ciz1可能是含磷蛋白質(zhì)，因?yàn)樗写罅客茰y(cè)的磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)3T3細(xì)胞提取物用λ磷酸酶(未顯示)處理時(shí)，顯示遷移率改變。鼠Ciz1含有兩個(gè)RXL細(xì)胞周期蛋白質(zhì)結(jié)合基序，和5個(gè)推測(cè)的cdk-磷酸化位點(diǎn)，它們存在于所有已知的變異體中。其中的4個(gè)位于含有體外復(fù)制活性的ECiz1的N-末端片段中(見(jiàn)下)，1個(gè)與外顯子6選擇性剪接的位點(diǎn)相鄰，以排除短DSSSQ序列基序(圖2A，C)。如果基序是100％相同的，并在小鼠和人中是選擇性剪接的，我們就有理由認(rèn)為條件性加入可能調(diào)節(jié)Ciz1活性，鑒定蛋白質(zhì)的這個(gè)區(qū)域被認(rèn)為是有潛在重要性的。我們因此通過(guò)遺傳手段結(jié)合無(wú)細(xì)胞復(fù)制測(cè)定，選擇集中于cdk位點(diǎn)，其是上游的4個(gè)殘基，在小鼠和人中也是保守的。以ECiz1開(kāi)始，191和192位的兩個(gè)蘇氨酸被改變?yōu)閮蓚€(gè)丙氨酸，產(chǎn)生ECiz1T(191/2)A(圖2D)。當(dāng)在體外檢測(cè)DNA復(fù)制活性時(shí)，ECiz1T(191/2)A在晚G1細(xì)胞核中激發(fā)的起始作用可達(dá)到與ECiz1相似的程度(圖3C)。但不像ECiz1，它在很大范圍濃度下可維持對(duì)起始作用的激發(fā)，可跨越至少3個(gè)數(shù)量級(jí)的幅度。因此，為限制過(guò)多ECiz1活性的機(jī)制在無(wú)細(xì)胞的環(huán)境中存在并進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)。在一個(gè)單獨(dú)的構(gòu)建物中，位點(diǎn)293的蘇氨酸也被改變?yōu)楸彼?，產(chǎn)生ECiz1T(293)A(圖2D)，但這種改變?cè)隗w外測(cè)定中對(duì)ECiz1活性的影響很小(圖3D)。
這些結(jié)果證明ECiz1活性的下調(diào)涉及蘇氨酸191/2，可能由此位點(diǎn)磷酸化介導(dǎo)的，細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴性激酶所引起的。這將Ciz1活性與cdk依賴性通路聯(lián)系起來(lái)，該通路控制所有主要的細(xì)胞周期事件，包括DNA復(fù)制的起始。
大多數(shù)復(fù)制復(fù)合體蛋白質(zhì)前體和許多復(fù)制叉蛋白質(zhì)在體內(nèi)被磷酸化，這通常是通過(guò)細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴性激酶(Bell和Dutta，2002；Fujita，1999)。我們的數(shù)據(jù)表明p85-Ciz1抗原在細(xì)胞核內(nèi)的積累被細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2調(diào)控(直接或間接)，并顯示在蘇氨酸191/192上的一個(gè)特異共有cdk磷酸化位點(diǎn)參與了Ciz1活性的控制。在無(wú)細(xì)胞測(cè)定中當(dāng)這個(gè)位點(diǎn)被去磷酸化，在很大范圍的濃度下Ciz1的活性可維持。因此，正常情況下在此位點(diǎn)的修飾可下調(diào)Ciz1的活性。其他保守的cdk磷酸化位點(diǎn)的功能，RXL細(xì)胞周期蛋白質(zhì)結(jié)合基序的條件性加入(inclusion)對(duì)Ciz1選擇性剪接的N-末端部分中的作用仍需要被確定。因此，本文沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Ciz1活性和cdk依賴性磷酸化之間簡(jiǎn)單負(fù)相關(guān)的關(guān)系，這種簡(jiǎn)單的關(guān)系不可能解釋整個(gè)事件的始末。但到目前為止我們的分析將Ciz1和可控制所有主要的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變的cdk依賴性通路聯(lián)系在一起，因此與我們的主要結(jié)論是一致的，即Ciz1參與了DNA復(fù)制的起始。
體外復(fù)制活性存在于N-術(shù)端Ciz1具有一些C-末端的特征，可將蛋白質(zhì)錨定在細(xì)胞核內(nèi)。matrin3結(jié)構(gòu)區(qū)表明了與細(xì)胞核基質(zhì)之間的相互作用，3個(gè)鋅指顯示了與核酸之間的相互作用。實(shí)際上，最近的證據(jù)表明人Ciz1可以一種很弱的序列特異方式與DNA結(jié)合(Warder和Keherley，2003)。為了確定C-末端結(jié)構(gòu)區(qū)對(duì)ECiz1復(fù)制活性是否很重要，我們將該蛋白質(zhì)分為兩個(gè)片段(圖2D)。N末端442(含有NLS，兩個(gè)保守的cdk位點(diǎn)，1個(gè)鋅指和所有已知的已經(jīng)觀察到可變剪接的位點(diǎn))可在與ECiz1相同的濃度下激發(fā)相似程度的起始作用(圖3E)。相反，C-末端部分(C末端274)不含一點(diǎn)復(fù)制活性(圖3F)。因此，當(dāng)在體外測(cè)定時(shí)，matrin3結(jié)構(gòu)區(qū)，一個(gè)細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴性激酶磷酸化位點(diǎn)和兩個(gè)鋅指不是ECiz1的DNA復(fù)制活性所必需的。但應(yīng)該注意的是在一定條件下這種分析可反向測(cè)定ECiz1的活性，其中定位錯(cuò)誤的結(jié)果是不可能被檢測(cè)到的。因此，在體內(nèi)matrin3結(jié)構(gòu)區(qū)和鋅指的作用是將Ciz1活性引至細(xì)胞核中的特異位點(diǎn)，因而限制了Ciz1活性的范圍，這仍然是可能的。
內(nèi)源件Ciz1抗體V1可識(shí)別Cdc6以及P85-Ciz1(圖1A)，因此它不適合用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，這種實(shí)驗(yàn)的目的是顯示內(nèi)源性Ciz1的亞細(xì)胞定位。因此我們將構(gòu)建兩種重組ECiz1片段N末端442的新的兔多克隆抗血清，稱為抗Ciz1 1793和1794。如所期望的那樣，純化的N末端442在Western印跡上可被抗Ciz1抗體1793和1794識(shí)別，但也可被抗體V1識(shí)別(圖4A)，這支持了下面的結(jié)論，即p85(p100)實(shí)際上就是Ciz1。
當(dāng)用于來(lái)自生長(zhǎng)的3T3細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物時(shí)，抗-Ciz1 1793可識(shí)別兩個(gè)抗原，具有125和100kDa的Mr(圖4B)，其相應(yīng)的部分在配方之間是不同的。100kDa區(qū)帶與被抗體V1識(shí)別的細(xì)胞周期蛋白質(zhì)-A反應(yīng)性抗原共同遷移(圖1和4B)，這表明兩個(gè)抗體在體內(nèi)識(shí)別相同的蛋白質(zhì)。我們通過(guò)免疫沉淀證實(shí)可被抗體V1和1793識(shí)別的p100-Ciz1區(qū)帶是相同的蛋白質(zhì)(圖4C)?？贵wV1可沉淀一個(gè)100kDa的區(qū)帶，在western印跡上被1793識(shí)別，反之亦然。而且，在相同的實(shí)驗(yàn)中，1793和抗體V1可沉淀一個(gè)125kDa的抗原，抗體V1的程度弱一些，該抗原在western印跡上可被1793識(shí)別。我們的觀察結(jié)合在一起顯示100kDa區(qū)帶實(shí)際上是Ciz1(以前認(rèn)為是p85)，并表明Ciz1蛋白質(zhì)至少以兩種形式存在于細(xì)胞周期中細(xì)胞中。
除了上述免疫沉淀的證據(jù)，其他的幾個(gè)觀察得出的結(jié)論是p125也是Ciz1的一種形式。首先，我們的抗Ciz1抗體(1793和1794)共同擁有此帶。在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)抗體產(chǎn)生相同的細(xì)胞核染色圖形，在用Ciz1siRNA處理的細(xì)胞中這種圖形被破壞(見(jiàn)下)。第二，p100和p125的相應(yīng)部分在配方之間是不同的，因此這是蛋白酶剪切的結(jié)果。第三，我們的結(jié)果與Mitsui等人(1999)的結(jié)果驚人地相似，其抗人Ciz1單克隆抗體在HEK293細(xì)胞中檢測(cè)到的兩個(gè)抗原具有的表觀Mr為120和95kDa。他們認(rèn)為人Ciz1蛋白的120kDa形式被加工產(chǎn)生95kDa形式，我們的結(jié)果與這種觀點(diǎn)是一致的。
在小鼠和人類細(xì)胞中被抗體1793識(shí)別的125kDa區(qū)帶在來(lái)自未轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞(Wi38-見(jiàn)后)和小鼠細(xì)胞(NIH3T3-未顯示)的物質(zhì)的高分辨率電泳過(guò)程中分解成三個(gè)Ciz1相關(guān)區(qū)帶。這可能是Ciz1蛋白翻譯后修飾或Ciz1轉(zhuǎn)錄物選擇性剪接的結(jié)果。
Ciz1的亞細(xì)胞分布抗Ciz1 1793用來(lái)顯示3T3細(xì)胞和HeLa細(xì)胞(未顯示)中Ciz1蛋白(p85和p125)的亞細(xì)胞分布(圖5A)。在兩種類型細(xì)胞中，1793可與細(xì)胞核特異抗原反應(yīng)，可通過(guò)加入重組N末端442片段而被阻斷(圖5B)。不像Cdc6，為了對(duì)比而被顯示(圖5A)，在這個(gè)細(xì)胞周期群體中的所有3T3細(xì)胞中Ciz1可被清晰地檢測(cè)到。因此，在整個(gè)細(xì)胞分裂間期Ciz1都存在于細(xì)胞核中，盡管數(shù)量上有很小的變化，或本方法不能檢測(cè)到同工型。在去垢劑處理后，在所有細(xì)胞核中全細(xì)胞核Ciz1染色減弱，這表明Ciz1存在于細(xì)胞核中，可作為一種可溶的部分，也可與不溶的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)結(jié)合。
當(dāng)可溶性蛋白質(zhì)被洗滌掉時(shí)，不溶的被固定的抗原在高放大率下成為點(diǎn)狀的亞細(xì)胞散斑圖(圖5C，D)。Ciz1斑點(diǎn)顯示了相似的大小范圍，并分布為復(fù)制“聚點(diǎn)”或“場(chǎng)所”，在此位點(diǎn)DNA的合成在S期發(fā)生。為了明確是否Ciz1與復(fù)制場(chǎng)所的位點(diǎn)是一致的，我們比較了Ciz斑點(diǎn)與PCNA的位置，后者是S期細(xì)胞中的一種復(fù)制復(fù)合體成分(圖5C)。在共聚焦切片中，PCNA聚點(diǎn)的豐度較Ciz1聚點(diǎn)低，但它們幾乎所有都與Ciz1是相吻合的(圖5D，E，F(xiàn))。這對(duì)于中等大小范圍的聚點(diǎn)是特別驚人的。在合并的圖像中，PCNA和Ciz1聚點(diǎn)位置之間的重疊產(chǎn)生了黃色的點(diǎn)，而剩余的不與PCNA相吻合的Ciz1聚點(diǎn)是紅色的。綠色(單獨(dú)PCNA)聚點(diǎn)實(shí)際上是沒(méi)有的，這表明Ciz1存在于所有形成DNA復(fù)制場(chǎng)所的位點(diǎn)上。
Ciz1也存在于不含PCNA的位點(diǎn)上(圖5D)，不像PCNA，在整個(gè)細(xì)胞分裂間期Ciz1聚點(diǎn)均存在(圖5A)。這些觀察的一個(gè)解釋是Ciz1標(biāo)記了細(xì)胞核中的一些位置，在這些位置上含PCNA的復(fù)制場(chǎng)所可在S期中形成的，但不是所有這些位點(diǎn)在相同的時(shí)間都被使用。仍然要被確定的是在S期Ciz1聚點(diǎn)是否以不同的次數(shù)形成DNA復(fù)制的活性位點(diǎn)，或其他細(xì)胞核的活性也發(fā)生在Ciz1結(jié)合的位點(diǎn)上。實(shí)際上，在這個(gè)期，也可能，形成具有不同的活性的Ciz1的100kDa形式和125kDa變異體，它們駐留在具有不同功能的細(xì)胞核位點(diǎn)上。
Ciz1對(duì)于細(xì)胞的增殖是非常重要的至今我們已經(jīng)闡明了在無(wú)細(xì)胞測(cè)定中p85(p100)-Ciz1的行為與DNA復(fù)制的起始有關(guān)，重組的Ciz1激發(fā)起始的頻率，以及Ciz1駐留在與DNA復(fù)制場(chǎng)所(machinery)相同的細(xì)胞核位點(diǎn)上。但是，這些數(shù)據(jù)并沒(méi)有顯示Ciz1在增殖細(xì)胞中具有很重要的功能。為了驗(yàn)證此問(wèn)題，我們使用RNA干擾(RNAi)來(lái)選擇性降低NIH3T3細(xì)胞中的Ciz1轉(zhuǎn)錄水平。選擇了Ciz1內(nèi)的4個(gè)靶序列(見(jiàn)圖2A)，在體外產(chǎn)生短的干擾(si)RNA分子。當(dāng)用于細(xì)胞時(shí)，48小時(shí)后，所有4個(gè)Ciz1 siRNA都可限制生長(zhǎng)(圖6A)，并引起Ciz1蛋白水平的顯著降低(圖6B)。Ciz1缺失對(duì)增殖的作用在轉(zhuǎn)染后23和40小時(shí)之間逐漸明顯，表明沒(méi)有Ciz1RNA的第一個(gè)細(xì)胞周期相對(duì)未受影響。在40小時(shí)后，對(duì)照和Ciz1siRNA處理的細(xì)胞差異明顯，在Ciz1缺失的群體中沒(méi)有進(jìn)一步的增殖。為了證實(shí)Ciz1缺失的特異性，在增殖被顯著抑制之前24小時(shí)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)錄水平(圖6C)。在這個(gè)點(diǎn)上，在Ciz1轉(zhuǎn)錄物的水平降低至GAPDH siRNA處理的對(duì)照細(xì)胞的42％。這些實(shí)驗(yàn)顯示Ciz1是細(xì)胞增殖所必需的，與DNA復(fù)制的基本功能是一致的。
為進(jìn)一步驗(yàn)證，在siRNA處理后48小時(shí)用BrdU脈沖標(biāo)記細(xì)胞以確定參與DNA合成的細(xì)胞部分(圖6D)。當(dāng)Ciz1水平降低時(shí)，BrdU標(biāo)記的部分也減少，表明在這些條件下DNA合成是被抑制的。而且，在Ciz1缺失群體中摻入BrdU(大約群體的15％)的細(xì)胞被標(biāo)記的強(qiáng)度較低。因此，在一些Ciz1siRNA處理的細(xì)胞中，S期被延緩而不是被完全抑制，其原因可能是不完全的缺失。
DNA的合成被Ciz1siRNA抑制可能是細(xì)胞核功能普遍破壞的繼發(fā)結(jié)果。因此，我們仔細(xì)觀察了一定范圍的其他復(fù)制蛋白，其水平是以細(xì)胞周期依賴性方式被調(diào)節(jié)的，以了解Ciz1缺失的細(xì)胞是否在特殊的點(diǎn)隨機(jī)停滯或增長(zhǎng)。
在真細(xì)胞核細(xì)胞DNA復(fù)制的起始過(guò)程中，Mem復(fù)合體蛋白質(zhì)在晚G1期以Cdc6依賴性的方式在復(fù)制起始點(diǎn)進(jìn)行裝配。一些時(shí)間后，DNA聚合酶及其輔助因子(包括PCNA)逐漸與染色質(zhì)結(jié)合，啟始點(diǎn)被活化。這與細(xì)胞核輸出和大多數(shù)Cdc6的蛋白質(zhì)水解有關(guān)，隨著DNA合成的延續(xù)，Mcm復(fù)合體逐漸從染色質(zhì)上被置換出來(lái)(Bell和Dutta，2002)。為了鑒定Ciz1的作用點(diǎn)，我們使用了免疫熒光來(lái)監(jiān)測(cè)Mcm3和PCNA。在Ciz1缺失的細(xì)胞中(圖6E，F(xiàn))，兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)都是可檢測(cè)到的，結(jié)合于去垢劑拮抗的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)上。因此，這些因子不可能直接與Ciz1結(jié)合，或?yàn)槠浣M裝依賴于Ciz1。事實(shí)上，在4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，含有去垢劑拮抗染色質(zhì)結(jié)合的Mcm3的細(xì)胞平均數(shù)目實(shí)際上從31％(+/-6％)增加至51％(+/-5％)(圖6E)。Mcm3的增加表明Ciz1依賴性步驟發(fā)生在復(fù)制復(fù)合體前體組裝后(但在S期完成之前)。在相同的細(xì)胞群中，PCNA陽(yáng)性部分也增加，從32％(+/-5％)至49％(+/-6％)(圖6F)，將Ciz作用點(diǎn)的范圍縮小至PCNA組裝后。因此，Ciz1最可能的作用是在起始過(guò)程的后期加速DNA的復(fù)制，而不是在S期整個(gè)過(guò)程中抑制，使Mcm3和PCNA保留在原地。
綜合在一起，關(guān)于Ciz1的基本功能，我們的無(wú)細(xì)胞和細(xì)胞為基礎(chǔ)的研究繪制了一幅相吻合的作用圖。它們都表明Ciz1是DNA復(fù)制場(chǎng)所的一個(gè)新成分，并顯示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中Ciz1具有陽(yáng)性作用，其作用可促進(jìn)DNA復(fù)制的起始。
我們系列研究中的三個(gè)研究表明在復(fù)制復(fù)合體前體形成后，Ciz1在起始過(guò)程晚期是必需的。首先，p85(p100)-Ciz1抗原在與可活化DNA合成濃度的細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2接觸的細(xì)胞核中積累，其意義是Ciz1在此步驟過(guò)程中發(fā)揮作用，而不是在更早一些的復(fù)制復(fù)合體組裝步驟中發(fā)揮作用(Coverley等人，2002)。第二，對(duì)晚G1期細(xì)胞核的功能學(xué)研究顯示重組ECiz1可增加體外摻入標(biāo)記核苷酸的細(xì)胞核的數(shù)量。因此Ciz1在將準(zhǔn)備開(kāi)始DNA合成的細(xì)胞核轉(zhuǎn)變?yōu)檎诨钴S地合成DNA的細(xì)胞核的步驟中必須是有活性的。第三，RNA干擾研究針對(duì)Mcm復(fù)合體形成后和PCNA被組裝至DNA上之后，但在這些蛋白質(zhì)被置換之前的Ciz1依賴性步驟。這些不同系列的研究得到了驚人相似的結(jié)論，即Ciz1的作用點(diǎn)將其置于起始作用的后期。
抗-Ciz1 siRNA的治療策略我們的分析顯示Ciz1對(duì)細(xì)胞增殖是非常重要的，靶向Ciz1是一種可行的限制增殖的策略。我們?cè)谠S多癌癥中觀察到的Ciz1的選擇性剪接形式(見(jiàn)下)意味著Ciz1可能以一種選擇性的方式被靶向，以限制一個(gè)群體中一個(gè)細(xì)胞亞類的增殖。
舉例來(lái)說(shuō)，在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，當(dāng)缺少C-末端序列GTTGAGGAGGAACTCTGCAAGCAG時(shí)，可將siRNA靶向至在Ciz1轉(zhuǎn)錄物中建立的交接序列，或通過(guò)使用缺少相應(yīng)VEEELCKQ序列的Ciz1蛋白來(lái)選擇特異的化學(xué)抑制劑，從而達(dá)到這種目的。
因此，本發(fā)明也提供了當(dāng)不存在選擇性剪接序列時(shí)，在Ciz1轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)中建立的交接序列作為診斷標(biāo)記物，預(yù)后指標(biāo)或治療性標(biāo)靶的應(yīng)用。
胚胎形式Ciz1定位在細(xì)胞核上 跨越潛在可變的外顯子的RT-PCR分析表明3T3細(xì)胞主要表達(dá)全長(zhǎng)的Ciz1，因此我們對(duì)內(nèi)源性Ciz1的免疫定位工作(圖5)就沒(méi)有必要反映ECiz1的行為，后者缺少幾個(gè)序列框，因此可能缺少一些用來(lái)定位蛋白質(zhì)的信息。為了直接比較Eciz1和全長(zhǎng)Ciz1的定位，被擴(kuò)增的GFP標(biāo)記構(gòu)建物被轉(zhuǎn)染進(jìn)3T3細(xì)胞中(圖8A)，并被微注射進(jìn)小鼠的原細(xì)胞核中(圖8B)。在所有的實(shí)例中，標(biāo)記的Ciz1和ECiz1都完全在細(xì)胞核內(nèi)，而單獨(dú)表達(dá)GFP的對(duì)照構(gòu)建物則存在于細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)。GFP-Ciz1和GFP-ECiz1在活細(xì)胞內(nèi)都是可見(jiàn)到的，以亞細(xì)胞核聚點(diǎn)的形式，類似于通過(guò)免疫熒光在固定細(xì)胞中所見(jiàn)到的復(fù)制聚點(diǎn)。因此，ECiz1缺少的三個(gè)序列框似乎對(duì)于Ciz1的細(xì)胞核定位并不起作用。
在轉(zhuǎn)染后三天的時(shí)間中，在GFP-Ciz1和GFP-ECiz1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒(méi)有觀察到細(xì)胞分裂。這些數(shù)據(jù)表明功能性Ciz1的過(guò)度表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期有抑制作用(在具有完整調(diào)控通路的細(xì)胞中)。
合并(coalescence)當(dāng)Ciz1 C-末端的三分之一已經(jīng)被去除的GFP-標(biāo)記構(gòu)建物被轉(zhuǎn)染進(jìn)3T3細(xì)胞時(shí)，觀察到ECiz1和全長(zhǎng)Ciz1之間的差異(圖8C)。48小時(shí)時(shí)，F(xiàn)L Ciz1 N-末端(相當(dāng)于442)已經(jīng)被合并進(jìn)大的細(xì)胞核內(nèi)斑點(diǎn)中，其在ECiz1 N-term442轉(zhuǎn)染的群體中僅在第3天后以后逐漸明顯。在此時(shí)間之前，ECiz1 N-末端442的定位是具有細(xì)胞核特異性但分散的圖形。因此在Ciz1和ECiz1之間合并能力的差異是可定量的，并受三個(gè)選擇性剪接外顯子(2/3，6或8)其中之一的影響。
像全長(zhǎng)Ciz1和ECiz1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用去除C末端三分之一的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在三天監(jiān)測(cè)期內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)繁殖發(fā)生。
C-末端結(jié)構(gòu)區(qū)將Ciz1錨定在細(xì)胞核結(jié)構(gòu)上如上所述，當(dāng)C-末端也存在時(shí)，Ciz1和ECiz1 N-末端之間的差異被掩蓋了(圖8A)。而且，僅C-末端片段就可將GFP標(biāo)記引入染色質(zhì)中，形成與Ciz1或ECiz1的點(diǎn)狀(焦點(diǎn))不一樣的不規(guī)則圖形，但在有絲分裂過(guò)程中仍然附著在染色體上(圖8D)。這表明C-末端結(jié)構(gòu)區(qū)參與了Ciz1在細(xì)胞核結(jié)構(gòu)骨架上的固定。值得注意的是，暫時(shí)用C-末端片段轉(zhuǎn)染的細(xì)胞持續(xù)分裂，引起綠色熒光逐漸變淡。
異位Ciz1促進(jìn)過(guò)早進(jìn)入S期我們觀察了在轉(zhuǎn)染后第一天發(fā)生的事件。通過(guò)在不同間期用BrdU標(biāo)記，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞(綠色)的S期部分與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的S期部分進(jìn)行比較。在包括0-22小時(shí)(圖8E)0-12小時(shí)和0-7小時(shí)(未顯示)的長(zhǎng)標(biāo)記期限中，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，始終有更多的Ciz1和ECiz1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞參與至DNA合成中。這表明Ciz1和ECiz1對(duì)G1-S期的轉(zhuǎn)變有陽(yáng)性作用，可不按照規(guī)定時(shí)間促進(jìn)進(jìn)入S期。用細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前以高密度接種的3T3細(xì)胞群中獲得相似的結(jié)果。這樣做的目的是盡量減少未轉(zhuǎn)染群體中處于正常細(xì)胞周期中S期部分的部分。在這些條件下，轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染群體之間的差異被最大化，很明顯地證明了異位Ciz1對(duì)DNA復(fù)制起始的作用。
相反，當(dāng)在轉(zhuǎn)染后22小時(shí)(圖8E)，或10小時(shí)或12小時(shí)(未顯示)時(shí)給予短脈沖用BrdU標(biāo)記的細(xì)胞時(shí)，在Ciz1和ECiz1轉(zhuǎn)染群體中標(biāo)記的部分一直在減少。這表明被異位Ciz1或ECiz1誘導(dǎo)的S期是異常的，DNA合成緩慢或終止，在短時(shí)間接觸BrdU的過(guò)程中不足以標(biāo)記細(xì)胞。
因此，異位Ciz1和ECiz1對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的S期有兩種作用。它們可促進(jìn)DNA的復(fù)制，但這種作用卻引起了DNA合成的緩慢或終止。
增殖潛能變化的克隆我們也在3周的時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)了轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞群體。在用GFP-N末端442或非選擇性剪接的相當(dāng)物轉(zhuǎn)染，在G418選擇下生存的細(xì)胞中，觀察到幾百個(gè)含有大聚點(diǎn)的細(xì)胞(圖9A)。這些聚簇含有很大數(shù)量的GFP表達(dá)細(xì)胞，證明了ECiz1 N-末端部分(在此存在復(fù)制活性)的過(guò)度表達(dá)是非致死性的，并表明與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，過(guò)度表達(dá)可引起增殖表現(xiàn)型發(fā)生改變，包括喪失了接觸抑制，不能形成單細(xì)胞層。這種Ciz1依賴性變化的行為可引起腫瘤形成。以前從小鼠黑色素瘤中分離了缺少推測(cè)的染色質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)區(qū)的類似截?cái)嘈问降男∈驝iz1(圖2)。
人Ciz1和癌癥公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的Ciz1 cDNA如上所述人Ciz1在RNA水平被選擇性的剪接，以產(chǎn)生缺少與小鼠胚胎Ciz1相同的外顯子中的三個(gè)轉(zhuǎn)錄物。在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)記錄7個(gè)人Ciz1 cDNA(圖10)，由Mitsui等人(1999)、Warder和Keherly(2003)以及大規(guī)?；蚪M分析項(xiàng)目(NIH-MGC項(xiàng)目，NEDO人cDNA測(cè)序項(xiàng)目)提供。僅有1個(gè)來(lái)自正常的成人組織，它含有所有預(yù)測(cè)的外顯子(AB030835)。其他的來(lái)自胚胎細(xì)胞(AK027287)，或特別地來(lái)自4種不同類型的兒科癌癥(成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，AF159025，AF0234161，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，AK023978，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，BC004119和非洲淋巴瘤，BC021163)。胚胎形式和癌癥來(lái)源的形式缺少來(lái)自與我們的小鼠胚胎克隆相同的三個(gè)區(qū)，和與外顯子4對(duì)應(yīng)的第4個(gè)區(qū)的序列框。因此，有限的數(shù)據(jù)表明選擇性剪接形式更主要存在于發(fā)育早期。這種相關(guān)性以前在科學(xué)文獻(xiàn)中并沒(méi)有被注意。在兒科癌癥中選擇性剪接的Ciz1的存在增加了下面的可能性，即Ciz1錯(cuò)誤剪接可能與不合適的細(xì)胞增殖有關(guān)。
例如，一種可變的外顯子編碼一個(gè)短的保守DSSSQ序列基序，它在小鼠ECiz1和人成神經(jīng)管細(xì)胞瘤中是缺失的。它直接與共有cdk磷酸化位點(diǎn)相鄰接，該位點(diǎn)我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)參與了ECiz1功能的調(diào)節(jié)。DSSSQ序列的條件性加入可能使Ciz1成為蛋白質(zhì)激酶的ATM/ATR家族調(diào)控的目標(biāo)，可在SQ序列上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化，因此限制了對(duì)DNA損傷應(yīng)答引起的Ciz1起始功能。
已表達(dá)的序列標(biāo)記的分析兒科癌癥中選擇性剪接Ciz1的存在促進(jìn)了對(duì)Ciz1 EST的詳細(xì)分析。有567個(gè)已表達(dá)的序列標(biāo)記(EST)包括在NCBI unigene集合Hs.23476(人Ciz1)中。它們來(lái)自很大的正常范圍和患病組織和細(xì)胞系。序列已經(jīng)被翻譯，并根據(jù)預(yù)測(cè)的全長(zhǎng)人Ciz1氨基酸序列被制圖。產(chǎn)生氨基酸取代、缺失、移碼和超前翻譯終結(jié)的序列變化已經(jīng)被記錄。
選擇性剪接的Ciz1變異體可見(jiàn)于這個(gè)EST數(shù)據(jù)集中，并被記錄在此。我們以前報(bào)道在人和小鼠Ciz1中選擇性剪接的4個(gè)序列框(圖2)在EST序列中，以及以前未被檢測(cè)到的缺少來(lái)源于序列VEEELCKQ的外顯子14的變異體中被觀察到。所有這些變異體序列框被合適的剪接位點(diǎn)周而復(fù)始地結(jié)合。在一個(gè)癌來(lái)源的數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了第6個(gè)可變序列框，是通過(guò)加入GCCACCCACACCACGAAGAGATGTGTTTGCCCACGTTCCAGTGCAGGGGTGGAGCACAGCCCGGCTTGTTACAGATAT而產(chǎn)生的。
根據(jù)來(lái)源的細(xì)胞類型對(duì)EST進(jìn)行分組，根據(jù)在成人，兒童或胚胎來(lái)源的腫瘤細(xì)胞之中發(fā)生的情況進(jìn)行基本的劃分。為了比較，來(lái)自胚胎或成體來(lái)源的正常組織的EST包括在內(nèi)。EST-來(lái)源的Ciz1蛋白圖譜顯示在圖11A-E，選擇性剪接的外顯子總結(jié)在圖11F中。
人Ciz1N-末端中的三個(gè)序列框在成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)錄物中是缺失的(圖11A)，并偶爾在其他癌癥的Ciz1轉(zhuǎn)錄物中缺失。我們已經(jīng)在第三種癌癥，尤因氏肉瘤(見(jiàn)下)中發(fā)現(xiàn)了類似的選擇性剪接。兒科癌癥相關(guān)的選擇性剪接序列來(lái)自外顯子2/3(至少兩種形式)，外顯子4和外顯子6。
已經(jīng)注意到在來(lái)自正常細(xì)胞(胚胎或成體神經(jīng)來(lái)源)和多種癌癥的轉(zhuǎn)錄物中有外顯子8變異體，其中缺少一個(gè)或多個(gè)拷貝的富Q-簡(jiǎn)并重復(fù)區(qū)。此區(qū)中的選擇性剪接可產(chǎn)生具有異?；钚缘腃iz1，因此外顯子8變異體的表達(dá)或點(diǎn)突變的出現(xiàn)影響此區(qū)內(nèi)剪接，可用作癌癥的診斷或預(yù)后標(biāo)志物。外顯子8中選擇性剪接的簡(jiǎn)并重復(fù)區(qū)在下面詳述，并概括在圖11F中。
在人Ciz1蛋白的C-末端一半，兩個(gè)序列框被可變性地剪接。其中之一在來(lái)源于5個(gè)肺癌和肺類癌數(shù)據(jù)庫(kù)中的三個(gè)，和三個(gè)其他的癌數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄物中是缺失的(但很少在來(lái)自其他類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物)。
第二個(gè)變異體序列框是由于不正常的加入了來(lái)自表皮樣癌數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄物中的額外序列而產(chǎn)生的(MGC102)。
當(dāng)這些片段被排除或加入時(shí)，在Ciz1蛋白和Ciz1轉(zhuǎn)錄物中形成的這些序列和交接序列是在很大范圍的各種癌癥中選擇性抑制細(xì)胞增殖的潛在靶標(biāo)。其他的非變異序列是非選擇性抑制細(xì)胞增殖的潛在靶標(biāo)。
除了剪接變異，其他一些非典型的Ciz1轉(zhuǎn)錄被發(fā)現(xiàn)優(yōu)先發(fā)生在一些癌癥中。在橫紋肌肉瘤中，Ciz1被超前終止，產(chǎn)生的預(yù)計(jì)蛋白質(zhì)缺少C-末端細(xì)胞核結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)。這將引起不正常的DNA復(fù)制，可能是這種類型癌癥的治療性靶標(biāo)或標(biāo)志物。
幾種轉(zhuǎn)錄物含有的點(diǎn)突變可在推測(cè)的細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴性激酶(cdk)磷酸化位點(diǎn)中產(chǎn)生氨基酸取代。在宮頸癌文庫(kù)MGC12中，這樣的情況發(fā)生兩次。我們已經(jīng)顯示兩個(gè)cdk磷酸化位點(diǎn)參與了Ciz1活性的限制(圖3C和D)，暗示了這些突變?cè)诎┘?xì)胞增殖放松管制(deregulation)中的作用。其中之一與上面提到的癌來(lái)源的突變體是相同的(圖11E)。在Ciz1中具有點(diǎn)突變的癌來(lái)源轉(zhuǎn)錄物也可被RNA干擾所靶向，或具有作為診斷或預(yù)后指標(biāo)的價(jià)值。
在兒科癌癥中研究Ciz1變異體的表達(dá)在6個(gè)尤文氏肉瘤家族腫瘤細(xì)胞系(ESFT)和兩個(gè)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，使用RTPCR研究Ciz1變異體的表達(dá)，使用的引物組跨越已知的Ciz1可變性的三個(gè)區(qū)(圖12A)。這個(gè)分析顯示與成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞相比，與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，Ciz1變異體表達(dá)的模式在ESFT細(xì)胞中是不同的，但很顯然在來(lái)自相同腫瘤的一組細(xì)胞系中是非常相似的。因此，Ciz1變異體的表達(dá)對(duì)于這些癌癥具有預(yù)后或診斷的潛在作用。來(lái)自相同類型腫瘤的一組細(xì)胞系內(nèi)的小變化可能在預(yù)后方面具有價(jià)值。
通過(guò)亞克隆和測(cè)序擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄物，我們發(fā)現(xiàn)所有6個(gè)被檢測(cè)的ESFT系表達(dá)Ciz1的一種外顯子4遞減形式。因?yàn)镃iz1對(duì)細(xì)胞增殖是很重要的(見(jiàn)下)，這為ESFT細(xì)胞的選擇性抑制提供了一個(gè)可能的路線。檢測(cè)的來(lái)自兩個(gè)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄物很少缺乏外顯子4，但經(jīng)常缺少外顯子6編碼的序列DSSSQ基序(圖12B)。
這個(gè)實(shí)驗(yàn)性分析證實(shí)了兒科癌癥表達(dá)幾種形式的Ciz1，可變化的加入外顯子4、6和可能的外顯子2/3。
在ESFT、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和對(duì)照中檢測(cè)到兩種形式的含有外顯子8的序列和一種形式的含有VEEELCKQ編碼序列的序列，表明這些區(qū)對(duì)這些兒科癌癥中Ciz1的放松管制不起作用。
在所有實(shí)例中，與對(duì)照(Wi38，HEK293，NIH3T3細(xì)胞和原代人成骨細(xì)胞)相比，Ciz1RT-PCR產(chǎn)物大多數(shù)富集于使用癌細(xì)胞系的RNA樣品進(jìn)行的反應(yīng)中。這與在腫瘤中Ciz1變異體的表達(dá)增加使一致的。
在前列腺癌細(xì)胞系中分析Ciz1蛋白質(zhì)的表達(dá)正常未轉(zhuǎn)化的人肺成纖維細(xì)胞(和小鼠NIH3T3細(xì)胞)表達(dá)兩種主要形式的Ciz1，在western印跡中通過(guò)抗Ciz1多克隆抗體1793可被檢測(cè)到(圖13A)。較大的(大約125kDa)區(qū)帶可分解為三個(gè)不同的區(qū)帶，以相同的比例存在于Wi38細(xì)胞中，但在前列腺癌細(xì)胞系PC3和LNCAP中的比例非常不平均(ESFT細(xì)胞系的數(shù)據(jù)未顯示)。我們認(rèn)為這些蛋白質(zhì)同工型是通過(guò)表達(dá)可變剪接的外顯子而產(chǎn)生的。兩種腫瘤細(xì)胞系也較Wi38細(xì)胞含有更多的Ciz1抗原，與這些癌細(xì)胞系中Ciz1的過(guò)度表達(dá)是一致的。
我們的結(jié)果綜合在一起(實(shí)驗(yàn)和基因組數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析)支持下面的結(jié)論，即Ciz1在很大范圍的人類癌癥中是失調(diào)的。我們已經(jīng)表明Ciz1蛋白在DNA復(fù)制過(guò)程中具有陽(yáng)性作用，因此突變體Ciz1可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而不是轉(zhuǎn)化的結(jié)果。如果Ciz1的放松管制是此過(guò)程中的一個(gè)普遍步驟，則它就成為開(kāi)發(fā)治療性藥物的一個(gè)非常吸引人的靶標(biāo)。
我們也將這些相關(guān)的具體變化與具體的癌癥聯(lián)系在一起，使其成為一種真正的可能，即Ciz1可用作診斷或預(yù)后標(biāo)記。
它們包括·在兒科癌癥中的該蛋白質(zhì)N-末端部分(體外含有復(fù)制活性)的選擇性剪接。
·在已知參與限制Ciz1復(fù)制活性的細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴性激酶磷酸化位點(diǎn)中的點(diǎn)突變。
·在前列腺癌細(xì)胞系中Ciz1-p125形式的非典型表達(dá)和細(xì)胞核結(jié)合特性，可能是由于在外顯子8或其他外顯子中簡(jiǎn)并重復(fù)區(qū)的失調(diào)性剪接引起的。
·小細(xì)胞肺癌和其他癌癥中Ciz1的C-末端(可能參與細(xì)胞核內(nèi)Ciz1蛋白的定位)不連續(xù)基序(VEEELCKQ)的條件性加入。
·與Wi38正常胚胎肺成纖維細(xì)胞、人成骨細(xì)胞RNA和小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞相比，至今在所有被測(cè)的癌癥來(lái)源細(xì)胞系中，Ciz1蛋白和RNA的水平增加(通過(guò)Western印跡和RT-PCR檢測(cè))。
在圖14至21中顯示的序列可用來(lái)開(kāi)發(fā)治療性、診斷性或預(yù)后性試劑。
材料和方法克隆根據(jù)推薦的方法(Clonetech)，用來(lái)自11天齡小鼠胚胎的一個(gè)λtriplEx 5′-延伸、全長(zhǎng)富集cDNA表達(dá)文庫(kù)(Clonetech ML5015t)感染大腸桿菌XI1 blue。將菌斑轉(zhuǎn)移至在10mM IPTG(Sigma)預(yù)浸的0.45微米的硝化纖維素濾膜上。親和性純化的抗體V1在PBS中稀釋為1/1000，10％脫脂奶粉，0.4％Tween20用于大約3×106菌斑上，之前在缺少抗體的情況下封閉30分鐘。兩小時(shí)后，用相同的緩沖液洗滌濾膜三次，反應(yīng)斑用辣根過(guò)氧化物酶(Sigma)交聯(lián)的抗兔二抗和強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光法(ECL，Amersham)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的步驟進(jìn)行顯影。43個(gè)獨(dú)立的斑塊被挑出，但僅2株噬菌體在進(jìn)一步的3輪篩選中存活下來(lái)。它們轉(zhuǎn)化進(jìn)BM25.8中被轉(zhuǎn)變?yōu)閜TriplEx，并進(jìn)行測(cè)序。一個(gè)編碼小鼠Cdc6(克隆P)和另一個(gè)編碼一個(gè)未知的與人Ciz1同源的小鼠蛋白質(zhì)(克隆L)。我們稱此為胚胎Ciz1(ECiz1)，提交給EMBL，登記號(hào)為AJ575057。
細(xì)菌表達(dá)基于pGEX的細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建物(Amersham)用來(lái)為體外分析產(chǎn)生ECiz1蛋白質(zhì)。通過(guò)將一個(gè)來(lái)自克隆L的2.3kb SmaI-XbaI(鈍末端)片段插入進(jìn)pGEX-6P-3的SmaI位點(diǎn)中產(chǎn)生pGEX-ECiz1。通過(guò)將1.35kb XmaI-XhoI片段插入進(jìn)XmaI-XhoI消化的pGEX-6P-3中產(chǎn)生pGEX-N末端442，通過(guò)將0.95kb XhoI片段插入進(jìn)XhoI消化的pGEX-6P-3產(chǎn)生pGEX-C末端274。通過(guò)定點(diǎn)突變(StratageneQuikchange)使用引物AACCCCCTCTTCCGCCGCCCCCAATCGCAAGA和TCTTGCGATTGGGGGCGGCGGAAGAGGGGGTT，從pGEX-ECiz1產(chǎn)生pGEX-T(191/2)A。使用引物AAGCAGACACAGGCCCCGGATCGGCTGCCT和AGGCAGCCGATCCGGGGCCTGTGTCTGCTT從pGEX-ECiz1產(chǎn)生pGEX-T(293)A。所有克隆的完整性和可讀框通過(guò)序列證實(shí)。
在BL21-pLysS(Stratagene)中產(chǎn)生重組Ciz1、Ciz1片段和點(diǎn)突變作為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記蛋白質(zhì)。它可通過(guò)與谷胱甘肽瓊脂糖4B(Amersham)的結(jié)合從超聲破碎和去除雜質(zhì)的細(xì)菌溶解產(chǎn)物中純化。使用精確蛋白質(zhì)酶(由制造商推薦，Amersham)從GST標(biāo)記裂解，重組蛋白質(zhì)被洗脫進(jìn)入緩沖液(50mM Tris-HC pH7.0，150mM NaCl，1mMDTT)中。這樣產(chǎn)生了在0.2和2.0mg/ml之間濃度的蛋白質(zhì)配方。為了進(jìn)行復(fù)制測(cè)定，在100mM Hepes pH7.8，1mM DTT，50％甘油中制備系列稀釋液，這樣將不超過(guò)1ml蛋白質(zhì)溶液加入至10ml復(fù)制檢測(cè)液中，得到了所顯示的濃度。與以前的觀察是一致的(Mitsui等人，1999；Warder和Keherly，2003)，重組Ciz1和衍生片段N-末端442通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行遷移，具有異常的高分子量。如以前所述，在細(xì)菌中產(chǎn)生細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2(Coverley等人，2002)。
抗Ciz1抗體針對(duì)細(xì)菌表達(dá)人Cdc6的對(duì)應(yīng)于氨基酸145-360的的內(nèi)部片段產(chǎn)生兔多克隆抗體V1(Coverley等人，2000；Stoeber等人，1998；Williams等人，1998)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的步驟進(jìn)行親和純化(Harlow和Lane，1988)。這種抗體可與內(nèi)源性p100-Ciz1強(qiáng)烈反應(yīng)，也與ECiz1 N末端442片段反應(yīng)。N末端442與Cdc6氨基酸145-360的比對(duì)表明共享的抗原決定簇位于小鼠Ciz1的294-298或304-312位。重組N末端442用來(lái)產(chǎn)生兩個(gè)Ciz1特異性多克隆抗血清，稱為1793和1794(Abeam)。1793已經(jīng)被常規(guī)用于本文所述的實(shí)驗(yàn)中。其特異性的驗(yàn)證可通過(guò)交互免疫沉淀和使用抗體V的western印跡分析，加入N末端442(25μg/ml抗體緩沖液，10mg/ml BSA，0.02％SDS，0.1％Triton X100PBS液)，可阻斷與內(nèi)源性抗原決定簇的反應(yīng)性，siRNA介導(dǎo)消除Ciz1可特異性減少1793細(xì)胞核染色。
免疫沉淀非同步化生長(zhǎng)的3T3細(xì)胞在PBS中洗滌，在添加了無(wú)EDTA的蛋白質(zhì)酶抑制劑混合物(cocktail)(Roche)的提取緩沖液(20mMHepes pH7.8，5mM醋酸鉀，0.5mM氯化鎂)中漂洗，刮除收集復(fù)制提取物。用0.1％Triton X 100溶解細(xì)胞，用0.3M NaCl的提取緩沖液提取去垢劑拮抗的沉淀部分。每100μl提取物使用5μl1793或2μl抗體V，4℃孵育1小時(shí)。抗原抗體復(fù)合物用100μl蛋白質(zhì)G-瓊脂糖(Sigma)提取，珠子用50mM Tris pH7.8，1mM EDTA，0.1％NP40，150mM NaCl洗滌5次。在緩沖液(100mM DTT，2％SDS，60mM TrispH6.8，0.001％溴酚蘭)中將復(fù)合體煮沸，用6.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。
免疫熒光細(xì)胞生長(zhǎng)在蓋玻片上，并固定在4％多聚甲醛中，需要或不需要簡(jiǎn)單地預(yù)先用0.05％Triton X100PBS處理。內(nèi)源性Ciz1用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟在抗體緩沖液中稀釋1/2000的1793血清進(jìn)行檢測(cè)。Mcm3用單克隆抗體sc9850(1/1000)檢測(cè)，Cdc6用單克隆抗體sc9964(1/100)檢測(cè)，PCNA用單克隆抗體PC10(1/100，所有均來(lái)自Santa CruzBiotechnology)檢測(cè)。雙重染色的熒光共聚焦圖像的共定位分析根據(jù)文獻(xiàn)描述進(jìn)行(Rubbi和Milner，2000；van Steensel等人，1996)。
小鼠3T3細(xì)胞如以前所述通過(guò)解除靜息期而被同步化(Coverley等人，2002)。從解除后17小時(shí)(稱為“晚G1”期)收集的細(xì)胞制備的細(xì)胞核用于本文所述的所有無(wú)細(xì)胞復(fù)制實(shí)驗(yàn)。這就產(chǎn)生了含有不同比例的S期細(xì)胞核，有復(fù)制能力的晚G1期細(xì)胞核和無(wú)反應(yīng)性的早G1/G0期細(xì)胞核的群體。在15小時(shí)時(shí)制備易感的G1中期3T3提取物(它們一般含有大約5％的S期細(xì)胞)。在此描述的無(wú)細(xì)胞復(fù)制實(shí)驗(yàn)系列需要大量的標(biāo)準(zhǔn)化提取物，因此使用HeLa細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冊(cè)诖笈康那闆r下很容易被同步化。從兩次連續(xù)胸腺嘧啶細(xì)胞核苷誘導(dǎo)的S期中斷2小時(shí)而解除的細(xì)胞中制備S期HeLa提取物，其描述見(jiàn)Krude等人，1997。
無(wú)細(xì)胞DNA復(fù)制如文獻(xiàn)所述進(jìn)行DNA復(fù)制測(cè)定(Coverley等人，2002；Krude等人，1997)。簡(jiǎn)言之，10μl G1中期或S期提取物(補(bǔ)充了能量再生系統(tǒng)，核苷酸和生物素化dUTP)，和5×104晚G1期細(xì)胞核在37℃孵育60分鐘。反應(yīng)中補(bǔ)充了含有細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A-cdk2的桿狀病毒裂解產(chǎn)物(圖B和C)，其中0.1μl裂解產(chǎn)物與1nM純化的激酶具有相同的特異活性(Coverley等人，2002)。所有重組蛋白質(zhì)在100mM Hepes pH7.8，1mM DTT，50％甘油中被連續(xù)稀釋，這樣不超過(guò)1μl加入至10μl復(fù)制測(cè)定液中，得到指定的濃度。用50μl 0.5％ TritonX100中止反應(yīng)，添加50μl 8％多聚甲醛固定5分鐘。轉(zhuǎn)移至蓋玻片上后，用鏈霉抗生物素-FITC(Amersham)對(duì)細(xì)胞核染色，用Toto-3-碘化物(Molecular Probes)復(fù)染。在1000X放大倍數(shù)下觀察定量被標(biāo)記細(xì)胞核的比例，所有具有熒光聚點(diǎn)或高密度均勻標(biāo)記的細(xì)胞核被記為陽(yáng)性。通過(guò)共聚焦顯微鏡在600X放大倍數(shù)下得到體外復(fù)制細(xì)胞核和二碘化丙錠復(fù)染樣品的圖像。為分析細(xì)胞核蛋白質(zhì)，在與起始條件接觸15分鐘后，用冷PBS稀釋反應(yīng)液兩倍，并輕柔離心而重新分離細(xì)胞核。
數(shù)據(jù)分析和說(shuō)明在起始測(cè)定中應(yīng)用前，檢測(cè)同步化G1期細(xì)胞核的每個(gè)配方，這樣就已經(jīng)確定了處于S期的細(xì)胞核的比例(′％S′)。為了達(dá)到此目的，在不能誘導(dǎo)DNA合成起始(來(lái)自靜息期解除后15小時(shí)收獲的G1中期細(xì)胞)，但可有效地支持DNA合成從其體內(nèi)起始的起始點(diǎn)延伸的提取物中孵育細(xì)胞核。在體外的起始測(cè)定過(guò)程中細(xì)胞核的延伸部分有效地?fù)饺肓藰?biāo)記的核苷酸，但不提供過(guò)多的信息。一般這個(gè)部分被預(yù)先確定并從原始數(shù)據(jù)中減去。20％或更少處于S期的同步化群體用來(lái)進(jìn)行起始測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)3T3細(xì)胞從靜息期通過(guò)本文所使用的方法解除后，不超過(guò)總?cè)后w的70％進(jìn)入S期(Coverley等人，2002)。但在體外觀察到的通常通過(guò)與ECiz1孵育獲得的最高復(fù)制頻率接近50％。對(duì)于在此使用的3T3細(xì)胞核的G1群，17％處于S期(S％)，在體外任何測(cè)定中復(fù)制的最大數(shù)目為51％(復(fù)制％)。因此，34％的群體有能力在體外起始復(fù)制(C％)。因此對(duì)于圖3B-F中的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，起始％＝(復(fù)制％-S％)/C％×100。
RNA干擾使用體外轉(zhuǎn)錄的siRNA(Ambion Silencer kit)在增殖的NIH3T3細(xì)胞靶向內(nèi)源性Ciz1，直接針對(duì)小鼠Ciz1的4個(gè)區(qū)。用來(lái)產(chǎn)生siRNA的寡核苷酸序列是siRNA4為AAGCACAGTCACAGGAGCAGACCTGT CTC和AATCTGCTCCTGTGACTGTGCCCTGTCTC，siRNA 8為AATCTGTCACAAGTTCTACGACCTGTCTC 和AATCGTAGAACTTGTGACAGACCTGTCTC，siRNA 9為AATCGCAAGG ATTCTTCTTCTCCTGTCTC和AAAGAAGAAGAATCCTTGCGACCTGTCTC ，siRNA 11為AATCTGCAGCAGTTCTTTCCCCCTGTCTC和AAGGGAAAGAACTGCTGCAGACCTGTCTC。根據(jù)低級(jí)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和所有已知Ciz1形式(序列4，8，11)表達(dá)一致的外顯子內(nèi)的位置選擇分布于整個(gè)Ciz1轉(zhuǎn)錄物中的靶序列，除了已知可被選擇性剪接的一個(gè)以外(siRNA9)。陰性對(duì)照是未處理，假處理(轉(zhuǎn)染試劑，但沒(méi)有siRNA)和用GAPDH siRNA(Ambion)處理的細(xì)胞。Cy3標(biāo)記siRNAs(Ambion)用來(lái)估計(jì)轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)超過(guò)95％。RNA干擾實(shí)驗(yàn)在24孔板中進(jìn)行，以每孔2×104細(xì)胞，500μl培養(yǎng)基(DMEM含有g(shù)lutamax添加4％FCS)開(kāi)始。在使用oligofectamine試劑(Invitrogen)涂板傳遞后12小時(shí)加入siRNA。如果在此沒(méi)有另外說(shuō)明，成對(duì)使用siRNA(在培養(yǎng)基中以2nM總濃度)，分兩次給藥，首次用藥后24小時(shí)以新鮮培養(yǎng)基傳遞第二次。在首次用藥后48小時(shí)，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、S期標(biāo)記和免疫染色評(píng)價(jià)結(jié)果。在給予單次劑量siRNA 24小時(shí)處理的細(xì)胞中分離的RNA上，在按比例放大5倍的反應(yīng)中進(jìn)行Northern印跡。使用Trizol試劑(Invitrogen)制備RNA，樣品通過(guò)1％瓊脂糖進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至Hybond N+尼龍膜(Amersham)上，遵照生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書在50℃與cDNA探針使用NorthernMax試劑盒試劑(Ambion)按順序雜交。在每次雜交作用之間，使用0.5％SDS溶液在90℃將膜剝下，緩慢冷卻至室溫。探針為用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Gibco BRL)標(biāo)記[32P]-dCTP，以下列的順序應(yīng)用i.A來(lái)自ECiz1的1.35kb Xmal-Xhol片段。ii.人β-肌動(dòng)蛋白cDNA(Clontech)和iii.小鼠GAPDH cDNA(RNWAYlaboratories)。膜用2X SSC 0.2％ SDS洗滌兩次，每次30-60分鐘，然后在0.2X SSC，0.2％SDS中洗滌1次，30分鐘，根據(jù)所使用的探針，溫度為55-65℃。使用Amersham Biosciences Typhoon 9410可變模式成像儀和Image Quant TL軟件(v2002)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行定量。區(qū)帶強(qiáng)度以任意單位表示(括號(hào)內(nèi))，Ciz1和GAPDH的結(jié)果用β-肌動(dòng)蛋白的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，并表示為a％。
S期標(biāo)記通過(guò)向培養(yǎng)基中補(bǔ)充20μM溴脫氧尿苷(BrdU，Sigma)20分鐘，監(jiān)測(cè)體內(nèi)經(jīng)歷DNA合成的細(xì)胞核部分。在用FITC交聯(lián)的抗BrdU單克隆抗體(Alexis Biochemicals)根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書進(jìn)行酸處理后對(duì)摻入的BrdU進(jìn)行顯影。細(xì)胞核用Hoescht 33258復(fù)染，并在高放大率(1000X)下評(píng)分。
綠熒光蛋白質(zhì)標(biāo)記的Ciz1從UK HGMP Resource Centre(MGC克隆27988)獲得全長(zhǎng)的小鼠Ciz1cDNA，序列被完全確認(rèn)。來(lái)自這個(gè)克隆的一個(gè)2.8kb Smal-Xbal(鈍端)全長(zhǎng)Ciz1片段和來(lái)自pTriplEx-克隆L的一個(gè)2.3kb Smal-Xbal(鈍端)ECiz1片段在框內(nèi)與強(qiáng)化綠熒光蛋白質(zhì)(EGFP)被連接進(jìn)pEGFP-C3的Smal位點(diǎn)(Clontech)中。沒(méi)有插入物的pEGFP-C3用作對(duì)照。使用TransIT-293(Mirus)將構(gòu)建物轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH3T3細(xì)胞中，遵循生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書或微注射進(jìn)單細(xì)胞期小鼠受精卵的雄原細(xì)胞核中。用全長(zhǎng)EGFP-Ciz1或EGFP-ECiz1轉(zhuǎn)染的正在生長(zhǎng)的3T3細(xì)胞通過(guò)活細(xì)胞熒光顯微鏡分析至轉(zhuǎn)染后三天。通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入核苷酸類似物BrdU，持續(xù)如圖表圖例中所標(biāo)注的不同時(shí)間周期，在轉(zhuǎn)染后第一個(gè)24小時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的合成。如上所述，任何經(jīng)歷DNA合成，同時(shí)與BrdU接觸的細(xì)胞用抗BrdU單克隆抗體染色，產(chǎn)生紅色的細(xì)胞核。
Ciz1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也培養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(DMEM Glutamax加10％胎牛血清)中，用50μg/ml G418進(jìn)行選擇，直至1月，產(chǎn)生形態(tài)學(xué)變化的細(xì)胞群。
EST序列分析制圖成為NCBI unigene cluster Hs.23476(人Ciz1)的個(gè)體表達(dá)序列標(biāo)記(EST)使用Genejockey翻譯，預(yù)測(cè)的氨基酸序列與預(yù)測(cè)的全長(zhǎng)Ciz1進(jìn)行序列比較，目的是在癌細(xì)胞中鑒定復(fù)發(fā)性改變。為了排除反映低質(zhì)量DNA序列的錯(cuò)誤，如發(fā)生在長(zhǎng)測(cè)序輪次(long sequencing rub)的結(jié)尾，僅距離連續(xù)序列末端超過(guò)8個(gè)氨基酸以上位置的改變才被包含進(jìn)本分析中。如果后面跟隨連續(xù)序列，僅包含讀碼中被后面的第二次變化恢復(fù)的移碼，和后面跟隨終止密碼子的移碼。因此大多數(shù)測(cè)序錯(cuò)誤被本分析排除。但期望保留許多點(diǎn)突變(包括移碼和中止)，導(dǎo)致測(cè)序過(guò)程中導(dǎo)入錯(cuò)誤。因此，本分析的目的是未揭示的一些趨勢(shì)，重點(diǎn)放在出現(xiàn)不止一次時(shí)的點(diǎn)突變。
在567個(gè)制圖成為Ciz1unigene cluster的序列中，我們已經(jīng)分析了大多數(shù)序列(所有的兒科癌癥、前列腺和肺癌、白血病和淋巴瘤，以及很大范圍的未患病組織)。一些沒(méi)有被制圖，因?yàn)樗鼈兪菢O短的讀碼或在翻譯過(guò)程中產(chǎn)生非常短的氨基酸序列，對(duì)于一些小量的序列，我們檢測(cè)與Ciz1編碼序列沒(méi)有同源性。小量的EST被分析排除，因?yàn)樵谒腥齻€(gè)框架中有多個(gè)產(chǎn)生同源性延伸的移碼，沒(méi)有表明有體內(nèi)使用的可讀框。它們均來(lái)自癌來(lái)源物質(zhì)，通常是腺癌。
Ciz1同工型表達(dá)的RT-PCR分析使用trizol試劑，根據(jù)推薦的步驟分離RNA，DNAse處理，并使用隨機(jī)六聚物和superscriptII進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用Ciz1特異引物擴(kuò)增-h/m5 CAGTCCCCACCACAGGCCh/m2 GGCTTCCTCAGACCCCTCTGH/m3 ACACAGACCTCTCCAGAGCACTTAGH/m4 ATGGTGACCTTCAGGGAGCH4 TCCTTGGCGA TGTCCTCTGG GCAGGH3 TCCCTCCTCA ACGGCTCCAT GCTGCH6 CGTGGGGGCGAC TTGAGCGTTG AGOH1 GATGCCAGGGGT ATGGGGCGCC GGGH2 TCCGAGCCCT TCCACTCCTC TCTGG在癌細(xì)胞系中分析Ciz1蛋白質(zhì)異形體細(xì)胞生長(zhǎng)在含有10％FCS的DMEM中至亞融合，在添加無(wú)EDTA蛋白質(zhì)酶抑制劑混合物(Roche)的冷hepes緩沖鹽水中漂洗，然后刮除收獲，并補(bǔ)充0.1％Triton X100。去垢劑不溶的物質(zhì)(包括細(xì)胞核)通過(guò)輕柔的離心沉淀，產(chǎn)生上清液(SN)和沉淀部分(P)。這些物質(zhì)在還原性SDA-PAGE樣品緩沖液中被煮沸，蛋白質(zhì)通過(guò)8％SDS-PAGE通過(guò)電泳分離。轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上后，用抗Ciz1抗體1793檢測(cè)Ciz1同工型。在本分析中使用的所有方法在其他地方已經(jīng)被詳細(xì)成文發(fā)表。
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權(quán)利要求
1.Cizl核苷酸或多肽序列，或其任何片段或變異體作為鑒定可調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的制劑的靶標(biāo)的應(yīng)用。
2.鑒定可調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的制劑的篩選方法，其特征在于所述的篩選方法包括Cizl核苷酸或多肽序列，或其任何片段或變異體的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的篩選方法，其特征在于所述的方法包括檢測(cè)或測(cè)量制劑對(duì)選自下列的核酸分子的作用a)含有圖14、15或21任何一個(gè)中所示的核酸序列的核酸分子；b)可與(a)中的核酸序列雜交的核酸分子，其具有Cizl活性或其變異體的活性；c)由于a)和b)中序列的遺傳密碼和待測(cè)候選制劑而具有簡(jiǎn)并核酸序列的核酸分子；d)源于Ciz基因座上的基因組序列的核酸分子，或與所述基因組序列雜交的核酸分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，其特征在于所述的核酸分子通過(guò)缺失、取代或添加所述核酸序列中的至少一個(gè)核酸殘基來(lái)修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的篩選方法，其特征在于所述的方法包括一個(gè)或多個(gè)以下的步驟(i)制備含有多肽分子或其活性片段的配方，該配方由選自下列的核酸分子編碼a)含有圖14、15或21中任何一項(xiàng)所示的核酸序列的核酸分子；b)可與(a)中的核酸序列雜交，其具有Cizl活性或其變異體的活性的核酸分子；c)由于a)和b)中序列的遺傳密碼和待測(cè)候選制劑而具有簡(jiǎn)并核酸序列的核酸分子；d)源于Ciz基因座上的基因組序列的核酸分子，或與所述基因組序列雜交的核酸分子；和ii)檢測(cè)或測(cè)量所述制劑對(duì)所述多肽活性的作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，其特征在于所述的多肽通過(guò)缺失、取代或添加所述多肽序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任何一項(xiàng)中所述的方法，其特征在于所述的篩選方法是基于細(xì)胞的篩選方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，其特征在于所述的細(xì)胞天然表達(dá)Cizl多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，其特征在于所述的細(xì)胞用編碼Cizl，或其片段或變異體的核酸分子轉(zhuǎn)染。
10.通過(guò)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的方法鑒定的制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的制劑，其特征在于所述的制劑是介導(dǎo)DNA復(fù)制的Cizl的拮抗劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的制劑，其特征在于所述的制劑是介導(dǎo)DNA復(fù)制的Cizl的促進(jìn)劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任何一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于所述的制劑選自多肽或核酸探針；多肽；肽；適配子；化學(xué)物質(zhì)；抗體；核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的制劑，其特征在于所述的制劑是抗體分子，其可與圖16、17或20中所示的任何一條序列結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的制劑，其特征在于所述的制劑是反義核酸分子或RNAi，其可結(jié)合并因此阻斷或使Cizl或其任何變異體的mRNA序列失活。
15.根據(jù)權(quán)利要求14中所述的制劑，其特征在于所述的制劑可與圖14、15或21或權(quán)利要求3的(i)b-d部分中所示序列的任何部分結(jié)合。
16.作為傳遞手段，將反義或RNAi分子傳遞至細(xì)胞的載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的載體，其特征在于所述的載體包括含有選自下列的核苷酸序列的表達(dá)基因盒a)如圖14、15和21中所示的編碼Cizl氨基酸序列的核酸序列；b)與(a)的核酸序列雜交的核酸分子；c)由于a)和b)中的序列和與上述任何序列互補(bǔ)的序列的遺傳密碼，具有簡(jiǎn)并核酸序列的核酸分子；d)編碼Cizl mRNA前體(即，所述的基因組序列)的核酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的載體，其特征在于所述的表達(dá)基因盒與啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄性連接。
19.鑒定增生性疾病的診斷方法，其特征在于包括在所述基因組或其蛋白質(zhì)序列中檢測(cè)Cizl基因、Cizl剪接變異體和突變的存在或表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19中所述的診斷方法，其特征在于所述的方法包括一個(gè)或多個(gè)以下的步驟(i)將從待測(cè)受試者中分離的樣品與可特異結(jié)合具有Cizl活性的多肽或編碼具有Cizl活性的多肽的核酸分子的制劑接觸；和(ii)檢測(cè)或測(cè)量該制劑在所述樣品中的所述多肽或核酸上的結(jié)合；(iii)使用反轉(zhuǎn)錄PCR或?qū)崟r(shí)PCR監(jiān)測(cè)Cizl和Cizl同工型的表達(dá)并測(cè)定表達(dá)水平，(iv)根據(jù)所述分子的構(gòu)象特性改變，測(cè)定核酸或氨基酸突變的存在。
21.權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)中所述的方法鑒定的制劑和制藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或稀釋液成為藥物的應(yīng)用。
22.權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)中所述的方法鑒定的藥物制造可用于增生性疾病治療中的藥物的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22中所述的應(yīng)用，其特征在于所述的增生性疾病是癌癥。
24.根據(jù)權(quán)利要求23中所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌癥是兒科癌癥，選自成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、非洲淋巴瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、尤文氏肉瘤家族腫瘤(ESFT)。
25.根據(jù)權(quán)利要求23中所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌癥是癌、腺癌、淋巴瘤或白血病。
26.根據(jù)權(quán)利要求22中所述的應(yīng)用，其特征在于所述的疾病是肝、肺或皮膚癌或轉(zhuǎn)移癌。
27.治療增生性疾病的一種方法，其特征在于包括給予動(dòng)物根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的方法鑒定的制劑。
28.權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的方法鑒定的制劑制造可延緩細(xì)胞分裂或生長(zhǎng)的藥物的應(yīng)用。
29.一種試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的方法鑒定的診斷性、預(yù)后性或治療性制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選方法，這種方法可鑒定調(diào)節(jié)DNA復(fù)制蛋白CIZ1活性的制劑，該蛋白質(zhì)可作為癌癥治療中干預(yù)的靶標(biāo)，并包括調(diào)節(jié)所述活性的制劑。本發(fā)明也涉及DNA復(fù)制蛋白及其RNA轉(zhuǎn)錄物在增生性疾病，例如癌癥的預(yù)后和診斷中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1720442SQ200380105255
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者C·道 申請(qǐng)人:約克舍癌病研究所