專利名稱：一種檢測脂質(zhì)過氧化物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測脂質(zhì)過氧化物的方法。
背景技術：
氧自由基是人體白細胞用來抵御外來入侵的有力工具，但在某些狀態(tài)下，它也可以導致人體的病理性改變，包括動脈粥樣硬化、肺纖維化、腎小球硬化、肝硬化、衰老等。這些病理改變往往是由于體內(nèi)過量的自由基導致脂質(zhì)過氧化物在體內(nèi)聚集所致。最常見的脂質(zhì)過氧化物有氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和丙二醛氧化型低密度脂蛋白(MDA-LDL)。這些過氧化脂蛋白的形成可導致1)低密度脂蛋白出現(xiàn)自體抗原性；2)對正常低密度脂蛋白(LDL)受體的親和力降低或消失；3)過多的脂質(zhì)過氧化物被細胞攝取，而形成泡沫樣細胞；4)刺激細胞增值。這些改變的最終結(jié)果表現(xiàn)為動脈粥樣硬化、肺纖維化、肝硬化等。目前，已有許多臨床研究報道證實oxLDL和MDA-LDL在冠心病人血液中的濃度明顯高于正常人，同時在個別腎病病人、肝臟疾患、長期大量飲酒者血液中的濃度也高于正常人。部分結(jié)締組織系統(tǒng)疾病患者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血液中的濃度也有升高。血液脂質(zhì)過氧化物的測定既有助于疾病的診斷，也是人群健康控制的一種良好檢測手段。
酶聯(lián)免疫法和免疫紙層析法是目前用于樣品中oxLDL和MDA-LDL濃度的檢測方法。一般采用雙抗體夾心法，即選用不同的單克隆抗體，對樣品抗原進行夾心測定，所用的抗體均為過氧化結(jié)構(gòu)特異性的，即檢測oxLDL水平，用抗oxLDL抗體，配對抗oxLDL抗體，檢測MDA-LDL水平用抗MDA-LDL抗體配對抗MDA-LDL抗體。這些方法需要選配兩個同時對抗脂質(zhì)過氧化位點，但具有不同的抗原決定簇的抗體，工作量很大，比較復雜，并帶有很大程度的偶然性，影響了血液脂質(zhì)過氧化物水平檢測的臨床應用。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有較高穩(wěn)定性、靈敏度及特異性的檢測脂質(zhì)過氧化物的方法。
檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，是利用抗脂質(zhì)過氧化物和抗非過氧化脂質(zhì)的單克隆或多克隆抗體配對進行樣品中脂質(zhì)過氧化物oxLDL和MDA-LDL的測定。
利用本發(fā)明的方法檢測脂質(zhì)過氧化物既可以基于酶聯(lián)免疫法的原理，又可以基于免疫紙層析法的原理。
在酶聯(lián)免疫法的測定中包括以下步驟
1)用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL或抗人LDL的單克隆或多克隆抗體包板；2)加入待測樣品；3)加入相應的第二抗體，當采用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL單克隆或多克隆抗體包板時，加入的第二抗體為抗人LDL單克隆或多克隆抗體；當采用抗人LDL單克隆或多克隆抗體包板時，加入的第二抗體為抗人oxLDL或MDA-LDL單克隆或多克隆抗體；4)加入與第二抗體對應的酶標抗體進行反應；5)加入底物進行反應；6)確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
所述與第二抗體對應的酶標抗體是以制造第二抗體的動物的IgG為抗原得到的抗體。
所述酶標抗體的標記物優(yōu)選為辣根過氧化物酶；所述底物優(yōu)選為過氧化氫。
優(yōu)選用酶免測定儀讀取450nm波長處吸光率來確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
以酶聯(lián)免疫法為基礎的測定樣品中脂質(zhì)過氧化物oxLDL和MDA-LDL含量的具體步驟為1)包被；2)洗板；3)封閉；4)洗板；5)加樣；6)洗板；7)加入第二抗體；8)洗板；9)加入酶標抗體；10)洗板；11)加入底物；12)加入終止液；13)用酶免測定儀讀取450nm波長處吸光率。
在免疫紙層析法的測定中包括以下步驟1)標記抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或標記抗人LDL的單克隆或多克隆抗體，作為顯色抗體；2)用對應的非標記抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或非標記抗人LDL的單克隆或多克隆抗體包被檢測膜，作為捕獲抗體；當采用標記抗人oxLDL和抗人MDA-LDL作為顯色抗體時，捕獲抗體為非標記抗人LDL抗體，當采用非標記抗人LDL作為顯色抗體時，捕獲抗體為標記抗人oxLDL和抗人MDA-LDL抗體；3)組裝檢測試紙條4)向顯色抗體中加入待測樣品，使樣品中的抗原oxLDL和抗人MDA-LDL分別與標記的抗人oxLDL和抗人MDA-LDL抗體結(jié)合或樣品中的抗原LDL與標記的抗人LDL抗體結(jié)合并向捕獲抗體泳動；5)確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
其中，結(jié)合有抗原的顯色抗體與捕獲抗體結(jié)合而顯色，其顯色強度與結(jié)合量相關。通過顯色反應確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
一般采用膠體金屬顯色法進行所述顯色抗體標記，其中優(yōu)選的為膠體金法。
所述顯色反應確定可采用目測法，即為定性法，或顯色密度檢測法來確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平，也可以用色卡等來確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
顯色反應確定可采用目測法，即為定性法，或顯色密度檢測法來確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平，也可以用色卡等來確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
本發(fā)明中的抗人oxLDL、抗人MDA-LDL及抗人LDL的單克隆或多克隆抗體均可以按照常規(guī)生物學及生物工程學方法制得。
本發(fā)明巧妙地利用抗脂質(zhì)過氧化物和抗非過氧化脂質(zhì)的單克隆或多克隆抗體配對進行樣品中脂質(zhì)過氧化物oxLDL和MDA-LDL的測定，實現(xiàn)了利用只有一個抗脂質(zhì)過氧化位點的單克隆或多克隆抗體配以一抗LDL的單克隆或多克隆抗體，就可夾心測定樣品中脂質(zhì)過氧化物oxLDL和MDA-LDL的水平，提高了對血液和脂質(zhì)樣品中過氧化物檢測的可行性，并大大降低了該檢測中的配對抗體篩選的復雜性，具有重要的實際應用意義。


圖1為酶聯(lián)免疫檢測法不同樣品吸收光度的直方圖。
具體實施例方式
實施例1、用脂質(zhì)過氧化物包板的酶聯(lián)免疫檢測方法檢測樣品中的脂質(zhì)過氧化物一、實驗材料1、樣品制備MDA-LDL的制備取0.2ml 12M HCl，加入0.165ml四甲氧基丙烷，混合，室溫靜置30分鐘，然后加入4.8ml 0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.4)(用10M NaOH調(diào)pH)，再與等體積2mg/ml LDL(SIGMA)水溶液混合，37℃水浴2小時。
用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)透析過夜(4℃)，終止反應，離心，-20℃保存。
oxLDL的制備分別配制1mg/ml LDL(SIGMA)和10mg/ml硫酸銅溶液，按1∶1體積混合，37℃水浴通氧氣反應24小時，用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)透析過夜(4℃)，終止反應，離心，-20℃保存。
2、酶聯(lián)反應板96孔板；3、試劑配制試劑來源兔抗人oxLDL多克隆抗體，羊抗人MDA-LDL多克隆抗體，購自美國Biodesign公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔和兔抗羊IgG多克隆抗體購自北京中山生物技術公司，其它試劑均購自北京化學試劑總公司。
抗人非過氧化低密度脂蛋白單克隆抗體的制備過程是采用非過氧化低密度脂蛋白免疫Balb/c小鼠，收集免疫Balb/c小鼠脾細胞，與瘤細胞融合，經(jīng)篩選和3-5次亞克隆化而獲得抗人非過氧化低密度脂蛋白單克隆抗體細胞株，在將該細胞株接種于小鼠腹腔內(nèi)，使其產(chǎn)生腹水，收集腹水，經(jīng)蛋白A法純化而得。
包被緩沖液50mM碳酸鹽緩沖液，pH9.6；洗滌緩沖液10mM PBS，0.05％Twecn20，pH7.4；底物緩沖液24.3mM檸檬酸，51.4mM磷酸氫二鈉，0.015％雙氧水鄰苯二胺1mg/ml；封閉緩沖液1×磷酸鹽緩沖液，1％牛血清白蛋白，pH7.4；稀釋緩沖液1×磷酸鹽緩沖液，0.25％牛血清白蛋白，0.05％Tween，-20℃，pH7.4；終止液2M H2S04；二、操作方法1、包被取兔抗人oxLDL或MDA-LDL多克隆抗體，用稀釋緩沖液配制4ug/ml液體，按100ul/孔加入反應板，37℃包被2小時。
2、洗板用洗滌緩沖液按100ul/孔洗滌三次；3、封閉用封閉緩沖液按100ul/孔，室溫封閉2小時；4、洗板用洗滌緩沖液按100ul/孔洗滌三次；5、加樣將MDA-LDL、oxLDL及LDL樣品用稀釋液稀釋至1ug/ml，然后每孔加入100ul，37℃反應2小時；6、洗板用洗滌緩沖液按100ul/孔洗滌三次；7、加入第二抗體用稀釋緩沖液對鼠抗人非過氧化低密度脂蛋白單克隆抗體進行1∶1000倍稀釋，每孔加入100ul，37℃反應2小時；8、洗板用洗滌緩沖液按100ul/孔洗滌三次；9、檢測用稀釋緩沖液對HRP標記羊抗鼠IgG多克隆抗體進行1∶3000稀釋，每孔加入100ul，37℃反應1小時；10、洗板用洗滌緩沖液按100ul/孔洗滌三次；11、底物加入底物緩沖液200ul/孔，室溫放置15-20分鐘；12、加入終止液50ul/孔；
13、用酶免測定儀讀取450nm波長處吸光率。
三、結(jié)果如圖1所示，MDA-LDL與oxLDL的反應明顯比LDL強，表明用本發(fā)明的方法檢測脂質(zhì)過氧化物具有較高的穩(wěn)定性和靈敏度。
實施例2、用標記非過氧化脂質(zhì)的免疫紙層析法檢測樣品中的脂質(zhì)過氧化物1、樣品制備oxLDL和MDA-LDL樣品制備同實施例1。
2、試劑配制試劑來源同實施例1，膠體金溶液的制備采用如下方法，取500ml 0.01％氯金酸(HAUCl4)溶液，在1000ml燒杯中加熱至沸騰，加入3.5ml 1％檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)沸騰15分鐘，溶液的顏色由無色變?yōu)樗{色，再變?yōu)樽霞t色，待冷卻至室溫后，分光光度計比色為OD536＝1.153、鼠抗人LDL單克隆抗體膠體金標記取膠體金溶液100ml，調(diào)pH至8.4，加入抗體10mg/ml，室溫攪拌30分鐘，再緩慢加入至10％終濃度，室溫攪拌30分鐘。12000g離心10分鐘，棄去上清液，沉淀用含10％BSA的50mM磷酸緩沖液混懸，再離心一次，沉淀用同樣液體混懸。
4、紙層析檢測條制備在涂有不干膠的PVC板上，順序粘貼多聚酯纖維素膜，硝酸纖維素檢測膜，吸水濾紙，然后向多聚酯纖維素膜印制含有20％蔗糖的膠體金標記抗體，向硝酸纖維素檢測膜印制兔抗人oxLDL或MDA-LDL多克隆抗體，同時印制羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線，37℃干燥6小時。然后在切條機上切成3.5mg寬的試紙檢測條，干燥箱保存?zhèn)溆谩?br> 5、待測樣品中oxLDL或MDA-LDL濃度測定用正常血清配制的濃度為1ug/ml oxLDL或MDA-LDL溶液和正常血清，分別向不同的試紙條點樣，15分鐘后觀察并記錄檢測膜上檢測線的顯色反應。
6、檢測結(jié)果oxLDL或MDA-LDL溶液呈明顯的顯色反應，正常血清則未見顯色(見表1)。
表1、標記非過氧化脂質(zhì)的免疫紙層析法檢測結(jié)果測試條 樣品 濃度(ug/ml) 檢測片顯色強度oxLDL oxLDL 0 -oxLDL 1.0+++LDL1.0-MDA-LDLMDA-LDL0 -MDA-LDL1.0+++LDL1.0-
權利要求
1.檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，是利用抗脂質(zhì)過氧化物和抗非過氧化脂質(zhì)的單克隆或多克隆抗體配對進行樣品中脂質(zhì)過氧化物oxLDL和MDA-LDL的測定。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，其特征在于在酶聯(lián)免疫法的測定中包括以下步驟1)用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL或抗人LDL的單克隆或多克隆抗體包板；2)加入待測樣品；3)加入相應的第二抗體，當采用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL單克隆或多克隆抗體包板時，加入的第二抗體為抗人LDL單克隆或多克隆抗體；當采用抗人LDL單克隆或多克隆抗體包板時，加入的第二抗體為抗人oxLDL或MDA-LDL單克隆或多克隆抗體；4)加入與第二抗體對應的酶標抗體進行反應；5)加入底物進行反應；6)確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，其特征在于所述與第二抗體對應的酶標抗體是以制造第二抗體的動物的IgG為抗原得到的抗體。
4.根據(jù)權利要求2所述的檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，其特征在于所述酶標抗體的標記物為辣根過氧化物酶；所述底物為過氧化氫。
5.根據(jù)權利要求2或3或4所述的檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，其特征在于所述方法的步驟為1)包被；2)洗板；3)封閉；4)洗板；5)加樣；6)洗板；7)加入第二抗體；8)洗板；9)加入酶標抗體；10)洗板；11)加入底物；12)加入終止液；13)用酶免測定儀讀取450nm波長處吸光率。
6.根據(jù)權利要求1所述的檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，其特征在于在免疫紙層析法的測定中包括以下步驟1)標記抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或標記抗人LDL的單克隆或多克隆抗體，作為顯色抗體；2)用對應的非標記抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或非標記抗人LDL的單克隆或多克隆抗體包被檢測膜，作為捕獲抗體；3)組裝檢測試紙條；4)向顯色抗體中加入待測樣品；5)確定樣品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
7.根據(jù)權利要求6所述的檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，其特征在于用膠體金屬顯色法進行所述顯色抗體標記。
8.根據(jù)權利要求7所述的檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，其特征在于所述膠體金屬顯色法為膠體金法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，目的是提供一種具有較高穩(wěn)定性、靈敏度及特異性的檢測脂質(zhì)過氧化物的方法。本發(fā)明檢測脂質(zhì)過氧化物的方法，是利用抗脂質(zhì)過氧化物和抗非過氧化脂質(zhì)的單克隆或多克隆抗體配對進行樣品中脂質(zhì)過氧化物oxLDL和MDA－LDL的測定。利用本發(fā)明的方法檢測脂質(zhì)過氧化物既可以基于酶聯(lián)免疫法的原理，又可以基于免疫紙層析法的原理。本發(fā)明的方法提高了對血液和脂質(zhì)樣品中過氧化物檢測的可行性，并大大降低了該檢測中的配對抗體篩選的復雜性，具有重要的實際應用意義。
文檔編號G01N33/53GK1523355SQ0310466
公開日2004年8月25日 申請日期2003年2月20日 優(yōu)先權日2003年2月20日
發(fā)明者劉鳳鳴 申請人:劉鳳鳴