專利名稱：用于受體激動(dòng)劑激活的功能性分析的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種新的用于激動(dòng)劑-激活的受體的高通量功能性分析。
本發(fā)明的新分析可用于篩選對(duì)神經(jīng)受體激活相關(guān)的失調(diào)的治療有效的化合物，所述受體包括α2A、H1、5HT1A、5HT2A、D2和D3受體。調(diào)節(jié)這些受體功能的分子為多種精神疾病的潛在治療藥物。盡管配體結(jié)合分析已經(jīng)用于這些分子的發(fā)現(xiàn)，測(cè)定受體配體的功能性分析通常能夠提供更多的信息。用于這些受體激活的高通量功能性分析法的開發(fā)目前仍存在問題。
本發(fā)明的分析方法使用升高的溫度以及Fluorometric Imaging PlateReader(FLIPR384)用于測(cè)量這些受體的激動(dòng)劑激活。例如，本發(fā)明涉及一種用于D3多巴胺受體，一種G蛋白-偶聯(lián)受體(GPCR)的改良的分析方法，其激活G-蛋白的G/Go亞型，并優(yōu)選地在邊緣區(qū)例如隔膜區(qū)和扁桃體結(jié)構(gòu)處表達(dá)，并被認(rèn)為對(duì)認(rèn)知、動(dòng)機(jī)形成和情緒的調(diào)節(jié)很重要。與其他受體一樣可通過本發(fā)明的方法進(jìn)行分析的D3受體，顯示出偶聯(lián)數(shù)個(gè)信號(hào)通路包括環(huán)AMP的產(chǎn)生、有絲分裂發(fā)生以及c-fos表達(dá)。對(duì)這些信號(hào)的分析已經(jīng)用來判斷這些受體配體的作用；但是，這些分析的通量方面依然受到限制。利用混雜和嵌合的G蛋白以及Fluorometric Imaging Plate Reader Systems(FLIPR)可以開發(fā)出一種單一功能性分析平臺(tái)，可用來測(cè)量受體的激活。因此本發(fā)明提供了一種新型的通用的適用于受體的功能性分析，所述受體包括D3受體，利用穩(wěn)定表達(dá)特定受體以及混雜G蛋白的細(xì)胞系，例如HEK293-Gα15細(xì)胞系以FLIPR384測(cè)量體系以判斷所述配體的功能性。與在先的FLIPR方法不同的是，本發(fā)明提供的分析方法基于溫度-依賴性激動(dòng)劑-誘導(dǎo)的受體激活，并提供了比現(xiàn)有分析方法顯著提高的信號(hào)。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了一種分析方法，用于測(cè)定G-蛋白連接受體例如神經(jīng)受體的激動(dòng)劑化合物的激活，所述的方法使用Fluorometric Imaging PlateReader，該方法包括
(a)得到一種具有至少一種合適的篩選因子的細(xì)胞系，所述篩選因子選自藥物抗性標(biāo)記物，選自HEK293-Gα15，所述的細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)選自Gα15的混雜G蛋白，并在將編碼選擇的G-連接受體的cDNA轉(zhuǎn)染到所述的細(xì)胞系中后，在所述的細(xì)胞系中共表達(dá)所述的G-蛋白連接的受體；(b)將共表達(dá)的細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中生長；(c)將所述的細(xì)胞鋪板約1天；(d)使鋪板的細(xì)胞荷載適合所述目的量的熒光染料；(e)將荷載染料的細(xì)胞在從約室溫到約37℃的溫度范圍培養(yǎng)約1小時(shí)；(f)用合適的緩沖液洗板以除去過量的染料并用近似體積的新鮮緩沖液替換去除的緩沖液體積；(g)在約30℃～約37℃培養(yǎng)；(h)在從約30℃～約37℃的恒定溫度條件加入激動(dòng)劑；并且(i)在從約30℃～約37℃的恒定溫度條件在Fluorometric Imaging PlateReader中測(cè)定熒光發(fā)射，從而判斷激動(dòng)劑化合物對(duì)所選受體的激活水平。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，G-蛋白連接受體為多巴胺或組胺受體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，G-蛋白連接受體選自D2、D3、α1A、α2A、M1、H1、5HT1A以及5HT2A受體。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述的G-蛋白連接受體為多巴胺D3受體。
在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，選自藥物抗性標(biāo)記物的篩選因子為嘌呤霉素(puromycin)-抗性標(biāo)記物。在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，選自藥物的抗性標(biāo)記物的篩選因子為殺稻瘟素(blastocidin)-抗性標(biāo)記物。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法的優(yōu)選熒光染料為Fluo-3TM或Fluo-4TM。優(yōu)選地，鋪板的細(xì)胞密度為約12,000～約30,000細(xì)胞/平方厘米。
在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，培養(yǎng)步驟(g)進(jìn)行約15分鐘～約60分鐘。優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)步驟(g)進(jìn)行約30分鐘。
附圖簡述

圖1顯示了溫度對(duì)多巴胺D3受體的激動(dòng)劑-依賴性激活的影響。
圖2顯示了GR218231，一種D3-特異拮抗劑在37℃和25℃(插圖)對(duì)多巴胺-依賴性細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的拮抗作用。用FLIPR監(jiān)測(cè)多巴胺-誘導(dǎo)的從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+釋放。
圖3顯示[5S]-GTPγS結(jié)合分析測(cè)量的D3受體-介導(dǎo)的G蛋白激活的激動(dòng)劑的刺激作用。該實(shí)驗(yàn)在25℃、30℃以及37℃下進(jìn)行，如標(biāo)明所示。顯示了在各溫度下的受體密度(Bmax)。
圖4顯示了溫度對(duì)組胺H1、5HT1A、5HT2A、多巴胺D2、α-腎上腺素能1A、α-腎上腺素能2A以及毒蕈堿M1受體的激動(dòng)劑-依賴的激活的影響，如用FLIPR測(cè)定。顯示了37℃和25℃的測(cè)定結(jié)果。
發(fā)明詳述正如附圖中所顯示，本發(fā)明提供了一種分析方法，其使用穩(wěn)定表達(dá)所述受體和混雜G蛋白G＜15的細(xì)胞系或者替代性地，使用存在細(xì)胞中的G蛋白亞基。利用Fluorometric Imaging Plate Reader監(jiān)測(cè)激動(dòng)劑-誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放。與在先基于FLIPR分析方法在25℃進(jìn)行分析不同的是，通過在升高的溫度優(yōu)選地在37℃進(jìn)行分析，激動(dòng)劑-誘導(dǎo)的反應(yīng)的強(qiáng)度顯著地提高。盡管FLIPR分析測(cè)定的激動(dòng)劑激活的EC50高于其他功能性受體分析的EC50值，表征拮抗劑的抑制作用的功能性Ki類似。在[35S]GTP|S結(jié)合分析中，其為另一種功能性分析，受體的激動(dòng)劑-誘導(dǎo)的激活作用在升高的溫度的時(shí)候也提高。升高的溫度不影響本發(fā)明方法使用的受體的Bmax，也不影響受體-表達(dá)細(xì)胞中由離子載運(yùn)體以及內(nèi)源性嘌呤能受體誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放。
可以激活特定受體的藥理有用化合物可通過利用本發(fā)明的分析方法而發(fā)現(xiàn)。在用本分析方法篩選的化合物的藥理作用為，例如，人體中的焦慮癥狀、抑郁以及其他精神病癥的改善，這些藥理作用可通過這些化合物激活多巴胺受體的能力識(shí)別出來。
本發(fā)明參照下列實(shí)施例進(jìn)行說明，但不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例利用FLIPR384進(jìn)行的HEK細(xì)胞D3方案細(xì)胞系的描述穩(wěn)定表達(dá)Gα15的HEK293-Gα15.D3細(xì)胞系，其通過將D3 cDNA轉(zhuǎn)染到表達(dá)G-α的HEK293細(xì)胞系中而得到。D3受體的表達(dá)在篩選因子如嘌呤霉素和殺稻瘟素的存在下得到保持。該細(xì)胞系對(duì)典型的組織培養(yǎng)瓶附著較差。為了得到強(qiáng)的附著表型，將細(xì)胞在Matrigel(Becton Dickinson，用無血清的DMEM按1∶200稀釋)-包被的培養(yǎng)瓶中生長。
將細(xì)胞按照如下的步驟進(jìn)行荷載(a)將20,000細(xì)胞以50μl/孔在384孔板中進(jìn)行鋪板，或在96孔板中以每孔60,000細(xì)胞進(jìn)行鋪板，多孔板包被聚D賴氨酸。將板返回到37℃培養(yǎng)箱中。
(b)16-24小時(shí)后去除生長培養(yǎng)基，然后用無血清培養(yǎng)基在鈣敏熒光染料，fluo-4(4pM)以及活性轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑丙磺舒(2.5mM)存在下替換生長培養(yǎng)基。
(c)將板在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。
(d)吸出培養(yǎng)基并用緩沖液洗板(3次，用包含2.5mM的丙磺舒的HEPES-緩沖鹽)以去除過量的染料。
(e)將板在37℃培養(yǎng)15-45分鐘。
(f)將要用藥物荷載的板在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱15分鐘。
(g)在FLIPR中進(jìn)行分析并連續(xù)90秒鐘監(jiān)測(cè)熒光水平。
在基線記錄20秒后，同時(shí)向所有的96或384孔中加入激動(dòng)劑/拮抗劑(15ul體積)。拮抗劑預(yù)處理15分鐘。
方法FLIPR分析將穩(wěn)定表達(dá)D3受體的HEK293-Gα15細(xì)胞系用來發(fā)展基于Ca2+的分析，利用基于FLIPR的方法。在分析前，將細(xì)胞在96或384孔聚-D賴氨酸-包被的FLIPR板中鋪板16-24小時(shí)。將細(xì)胞在細(xì)胞染料-培養(yǎng)基溶液(培養(yǎng)基-11ml，染料-4μM Fluo-4AM，Pluronic acid 22μl，丙磺舒-110μl的260mM溶液)在37℃荷載1小時(shí)。將板在Skatron EmblaTM板清洗機(jī)中用分析緩沖液(NaCl-0.145M，葡萄糖-0.01M，KCl-0.005M，MgSO4-0.001M，HEPES-0.01M和CaCl2-0.002M)洗滌，并分別在開始實(shí)驗(yàn)前在25℃和37℃穩(wěn)定30分鐘。在加入激動(dòng)劑前15分鐘加入拮抗劑。分別用488nm和520nm的激發(fā)和發(fā)射波長測(cè)定熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)記錄為四次重復(fù)的平均值±S.D.。
GTPγS結(jié)合分析將表達(dá)人D3受體的CHO細(xì)胞在T175培養(yǎng)瓶中用包含DMEM和10％胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。利用20mM Hepes/10mM EDTA并用221/2號(hào)針頭進(jìn)行破壞使細(xì)胞與培養(yǎng)瓶分離。在40,000×g離心后，將膜重新懸浮在20mMHepes/0.1mM EDTA中并再離心。將膜再懸浮于分析緩沖液(20mMHepes，100mM NaCl，10mM MgCl2)并在冰上與1μM GDP培養(yǎng)10分鐘。將受試化合物按照下述方案進(jìn)行分析將膜和受試化合物在25℃、30℃和37℃預(yù)孵育20分鐘，然后在冰上孵育15分鐘。在一些孔中加入10μM GTPγS以確定非特異性結(jié)合。為了啟動(dòng)反應(yīng)，加入[35S]-GTPγS，終濃度為0.1nM。將分析板在25℃、30℃和37℃孵育30分鐘。然后向分析孔中加入小麥-胚芽凝集素(WGA)SPA珠(1mg/孔)，并將分析板在平臺(tái)搖床上室溫振蕩30分鐘。然后將板在桌面離心機(jī)中離心5分鐘并在Wallac Microbeta計(jì)數(shù)器中測(cè)量。數(shù)據(jù)記錄為四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±S.D.。
用于D3 FLIPR分析的分析緩沖液Hepes鹽緩沖液 用于配制化合物稀釋液以及洗板液，并包含″Buffr，M″NaCl 0.145葡萄糖0.01KCl 0.005MgSO40.001HEPES 0.01Ca(anhyd) 0.002丙磺舒溶液(260mM)丙磺舒0.74g5N NaOH 1mlHepes鹽緩沖液 9ml″Fluo-3或Fluo-4，AM Dye″通過將50μg小瓶的樣品溶解在22μl DMSO中而進(jìn)行配制。
Cell培養(yǎng)基溶液細(xì)胞與該溶液一起培養(yǎng)以荷載染料無血清DMEM 11ml染料溶液 0.022ml20％Pluronic acid 0.022ml丙磺舒溶液 0.110ml
放射配體結(jié)合分析將表達(dá)D3受體的CHO細(xì)胞進(jìn)行勻漿，使用Poltron在20ml的分析緩沖液(50mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2，5Mm MgCl2pH7.4)中進(jìn)行。將勻漿液在20,000RPM 4℃離心10分鐘，兩次。將沉淀再懸浮于分析緩沖液中，濃度為5.0mg/ml。用多種濃度的[3H]7-OH-DPAT、終體積為250μl建立Scatchard分析。將板在25℃孵育60分鐘、在30℃孵育30分鐘以及37℃孵育15分鐘。將反應(yīng)通過快速過濾而終止，通過GF/B濾器(預(yù)先在0.5％PEI浸沒2小時(shí)并干燥)，在Skatron捕集器中使用冰冷的pH7.4的50mM Tris緩沖液。將濾器在Beta計(jì)數(shù)器中使用Betaplate Scint進(jìn)行測(cè)量。
結(jié)果D3激動(dòng)劑-刺激的細(xì)胞內(nèi)Ca2+反應(yīng)是溫度-敏感的FLIPR分析圖1顯示了從穩(wěn)定表達(dá)D3受體的HEK293-Gα15細(xì)胞系的激動(dòng)劑-刺激的細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放。該分析在標(biāo)明濃度的多巴胺和7-OH-DPAT存在下進(jìn)行，并且激動(dòng)劑誘導(dǎo)的Ca2+釋放用FLIPR進(jìn)行測(cè)定。
與25℃相比，在37℃熒光信號(hào)存在顯著的溫度-依賴性增加。由于7-OH-DPAT是選擇性的D3激動(dòng)劑，因此激動(dòng)劑-介導(dǎo)的反應(yīng)是D3受體-特異性的。該分析快速、可重復(fù)并且靈敏，因此可用于檢測(cè)D3激動(dòng)劑的高通量篩選。
圖2顯示了一種D3特異性拮抗劑GR218231對(duì)多巴胺-誘導(dǎo)的Ca2+釋放的影響，利用FLIPR監(jiān)測(cè)。穩(wěn)定表達(dá)D3受體的HEK293-Gα15細(xì)胞系與標(biāo)明濃度的GR218231預(yù)先孵育15分鐘，然后在37℃和25℃(插圖)加入100nM多巴胺。多巴胺-誘導(dǎo)的FLIPR反應(yīng)是D3-介導(dǎo)的。在兩個(gè)溫度下都觀測(cè)到類似的功能性IC50值，暗示升高的溫度不影響拮抗劑結(jié)合。GR218231的功能性Ki值與發(fā)表的數(shù)值類似，暗示該分析可用來測(cè)定D3拮抗劑的功能性Ki。
D3受體激動(dòng)劑的G-蛋白激活[35S]-GTPγS結(jié)合分析圖3顯示了D3受體激動(dòng)劑-介導(dǎo)的激活的溫度-依賴性效果，也在[35S]-GTPγS分析中觀測(cè)到，后者為另一種D3功能性分析。結(jié)合到G-蛋白的[35S]-GTPγS量為激動(dòng)劑激活的量度。在插入表部分，將各溫度的D3結(jié)合位點(diǎn)的Bmax制成了表格。與FLIPR中觀察到的結(jié)果類似，在升高的溫度的時(shí)候，觀察到的激動(dòng)劑-誘導(dǎo)的信號(hào)較高，盡管效果不太顯著。升高的溫度看起來不影響膜制劑中D3的Bmax。
激動(dòng)劑EC50和拮抗劑功能性Ki的總結(jié)表1顯示了在多個(gè)溫度下用FLIPR和[35S]-GTPγS分析測(cè)定的激動(dòng)劑和拮抗劑數(shù)值的比較。與GTP|S分析相比，在FLIPR分析中的多巴胺的EC50有10倍的增加，其可能是所用的兩種不同細(xì)胞系的緣故。用于GTP|S分析的CHO-D3細(xì)胞系利用了內(nèi)源性G蛋白，而用于FLIPR分析的HEK293細(xì)胞系利用Gα15。用兩種分析方法測(cè)定的拮抗劑的功能性Ki數(shù)值類似，暗示FLIPR分析可用來測(cè)定D3拮抗劑的功能性Ki。
表1在FLIPR和GTPγS分析中的激動(dòng)劑和拮抗劑藥理活性
在許多GPCR中觀察到溫度-依賴性細(xì)胞內(nèi)鈣釋放。
表2顯示了細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，用FLIPR分析方法在D3-Gα15細(xì)胞中測(cè)量得到。使用了為或高于EC90的濃度多巴胺(100nM)、ATP(12.5mM)、離子霉素(10mM)。顯示了在37℃分別預(yù)孵育5分鐘和15分鐘的FLIPR信號(hào)的上升值(以百分比的形式)。
表2溫度對(duì)其他激動(dòng)劑誘導(dǎo)的Ca2+反應(yīng)的影響
盡管在升高的溫度下，存在D3激動(dòng)劑導(dǎo)致的激動(dòng)劑反應(yīng)的升高，ATP(通過內(nèi)源性嘌呤能受體)以及離子霉素(離子載體)誘導(dǎo)的反應(yīng)不受延長的37℃預(yù)孵育影響。上述結(jié)果顯示G蛋白-偶聯(lián)受體(GPCRs)的溫度-依賴性激活只在D3觀察到，對(duì)嘌呤能受體而言沒有觀察到，并且Ca2+的細(xì)胞內(nèi)釋放不受升高的溫度所影響。不受理論的局限，提高的激動(dòng)劑反應(yīng)可能與D3受體偶聯(lián)到G蛋白有關(guān)，并延伸為許多GPCRs激活的一般性機(jī)制。
圖4顯示了在FLIPR中多種GPCRs的激動(dòng)劑-依賴性激活α-腎上腺素能1A、α-腎上腺素能2A、組胺H1、5HT1A、5HT2A、多巴胺D2和毒蕈堿M1。在GPCRs的該亞集中，這些GPCRs大多數(shù)(＞70％)的激動(dòng)劑-依賴性反應(yīng)的強(qiáng)度在升高的溫度時(shí)候會(huì)增加。所有這些受體通過存在細(xì)胞(Gq或Gi)中的G蛋白亞基激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放。這些數(shù)據(jù)提供了證據(jù)，表明對(duì)許多GPCRs可以觀察到上述現(xiàn)象，在升高的溫度的分析性能將能更好地檢測(cè)激動(dòng)劑-依賴性反應(yīng)。
因此本發(fā)明提供了一種基于FLIPR、新型、快速并且可重復(fù)的多種受體功能性分析。證實(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣釋放(FLIPR)和GPCR激活((GTP|S結(jié)合)的功能性分析，與25℃相比，在37℃有增加的信號(hào)。用兩種功能性分析得到的拮抗劑的功能性Ki數(shù)值不受升高的溫度的影響。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定G-蛋白連接受體激動(dòng)劑激活的分析方法，所述的方法使用Fluorometric Imaging Plate Reader，所述方法包括(a)得到一種具有至少一種合適的篩選因子的細(xì)胞系，所述篩選因子選自藥物抗性標(biāo)記物，選自HEK293-Gα15，所述的細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)選自Gα15的混雜G蛋白，并在將編碼選擇的G-連接受體的cDNA轉(zhuǎn)染到所述的細(xì)胞系中后，在所述的細(xì)胞系中共表達(dá)所述的G-連接的受體；(b)將共表達(dá)的細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中生長；(c)將所述的細(xì)胞鋪板約1天；(d)使鋪板的細(xì)胞荷載適合所述目的量的熒光染料；(e)將荷載染料的細(xì)胞在從約室溫到約37℃的溫度范圍培養(yǎng)合適的一段時(shí)間；(f)用合適的緩沖液洗板以除去過量的染料并用近似體積的新鮮緩沖液替換去除的緩沖液體積；(g)在約30℃～約37℃培養(yǎng)；(h)在從約30℃～約37℃的恒定溫度條件加入激動(dòng)劑；并且(i)在從約30℃～約37℃的恒定溫度條件在Fluorometric Imaging PlateReader中測(cè)定熒光發(fā)射，從而判斷激動(dòng)劑化合物對(duì)所選受體的激活水平。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的G-蛋白連接受體為多巴胺或組胺受體。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的G-蛋白連接受體選自D2、D3、α1A、α2A、M1、H1、5HT1A和5HT2A受體。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的G-蛋白連接受體為多巴胺D3受體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的選自藥物抗性標(biāo)記物的篩選因子為嘌呤霉素-抗性標(biāo)記物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的選自藥物抗性標(biāo)記物的篩選因子為殺稻瘟素-抗性標(biāo)記物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的熒光染料為Fluo-3TM或Fluo-4TM。
8.權(quán)利要求1的方法，其中鋪板細(xì)胞的密度為約12,000～約30,000細(xì)胞/平方厘米。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的培養(yǎng)步驟(e)進(jìn)行約1小時(shí)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的培養(yǎng)步驟(g)進(jìn)行約15分鐘～約60分鐘。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的培養(yǎng)步驟(g)進(jìn)行約30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的用于激動(dòng)劑激活受體的高通量功能分析，所述受體包括α1A、α2A、H1、5HT1A、5HT2A、D2和D3受體。本發(fā)明的分析方法使用提高的溫度以及穩(wěn)定表達(dá)所述受體和混雜G蛋白G1S的細(xì)胞系，其中用Fluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)監(jiān)測(cè)激動(dòng)劑－誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca
文檔編號(hào)G01N33/68GK1774630SQ02826850
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2002年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月9日
發(fā)明者王國風(fēng), 阿爾卡·V·施里克漢德 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司