專利名稱：通過在分子復制期間前體吸收的拉曼監(jiān)測實施的核酸測序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方法、組合物和裝置涉及分子生物學和基因組學領(lǐng)域。更具體地說，被公開的方法、組合物和裝置涉及核酸測序。
背景技術(shù)：
人類基因組計劃的出現(xiàn)要求開發(fā)出用于核酸，例如DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)測序的改善的方法。遺傳信息以組織為染色體的非常長的DNA分子的形式儲存。人類基因組的23對染色體含有大約30億個堿基組成的DNA序列。該DNA序列信息決定了每個個體的多種特征，例如身高、眼睛顏色和種族。許多常見的疾病，例如癌癥、纖維囊泡癥、鐮刀狀細胞貧血癥和肌肉萎縮癥都至少部分地基于DNA序列中的變異。
人類基因組整個序列的測定已經(jīng)為判定這些疾病的遺傳基礎(chǔ)提供了一個基礎(chǔ)。然而，為了確定與每一種疾病相聯(lián)系的遺傳變異，仍有大量的工作需要去做。為了確定在DNA序列中促發(fā)疾病的特定變化，就要求對表現(xiàn)有每一種這樣的疾病的個體或家族的染色體相應部分進行DNA測序。RNA是加工遺傳信息時所需要的中間分子，在一些情況下RNA也能被測序以確定各種疾病的遺傳基礎(chǔ)。
核酸測序的已有方法基于按大小分離開的熒光標記核酸的檢測，它受到了所能測定的核酸長度的限制。一般來說，一次只能測定500到1000個堿基的核酸序列。這比DNA的功能單位，即基因的長度短得多，后者可能有上萬個，甚至十萬個堿基長。使用目前的方法來測定一個完整基因的序列，就需要制備該基因的若干拷貝，把它們切為相互重疊的片段然后再測序，之后再把相互重疊的DNA序列組合為完整的基因序列。這個過程費力、昂貴、低效而且耗時。
附圖簡述下面的附圖構(gòu)成了本說明書的一部分，它們被引入是為了進一步說明某些實施方案。通過參考這些附圖中的一個或者多個，并結(jié)合在這里提出的特定實施方案的詳細描述，可以更好的理解這些實施方案。


圖1顯示了用于DNA測序的一個典型裝置10(未按比例作圖)和方法，其中，通過監(jiān)測在核酸合成過程中核苷酸前體17從溶液中的吸收來對一個核酸13進行測序。
示例性的實施方案的描述此處公開的方法、組合物和裝置用于核酸13的快速、自動的測序。在特定的實施方案中，本方法、組合物和裝置適用于獲得非常長的核酸分子13的序列，大于1000、大于2000、大于5000、大于10000、大于20000、大于50000、大于100000或者甚至有更多堿基的分子也可以。在各種實施方案中，在一次單獨的測序操作過程中，使用模板核酸13的一個分子便可以獲得這樣的序列信息。在其他實施方案中，該模板核酸分子13的多個拷貝可以平行或順序地被測序，從而確證核酸13的序列或獲得完整的序列數(shù)據(jù)。在可選擇的實施方案中，模板鏈13和它的互補鏈可以被測序以確證序列信息的精確性。與核酸13測序的已有方法相比，優(yōu)點包括能夠在一次單獨的測序操作中讀出長的核酸13序列，獲得序列數(shù)據(jù)的速度更快，并且，就產(chǎn)生每單位的序列數(shù)據(jù)所需要的操作時間而言，測序的花費降低，效率提高。
在某些實施方案中，要被測序的核酸13是DNA，盡管其他核酸13，包括RNA或合成的核酸類似物也被認為可以被測序。下面的詳細描述包含了大量特定細節(jié)以提供對公開的實施方案的更全面的理解。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，沒有這些特定的細節(jié)，也能夠?qū)嵤┻@些實施方案。在其他方面，那些在本領(lǐng)域廣為人知的裝置、方法、步驟和個別的組分沒有在這里詳細描述。
某些實施方案如圖1所示。圖1顯示了一個用于核酸13測序的裝置10，包括一個反應室11和一個檢測單元12。反應室11包括連接到一個固定化表面14的一個核酸(模板)分子13和一種合成試劑15，如一種DNA聚合酶。與模板分子13序列互補的引物分子16可以與模板分子13雜交。在反應室11里的溶液中存在著核苷酸前體17。為了合成一條新生DNA鏈16，核苷酸前體17必須包括脫氧腺苷-5’-三磷酸(dATP)、脫氧鳥苷-5’-三磷酸(dGTP)、脫氧胞苷-5’-三磷酸(dCTP)和脫氧胸苷-5’-三磷酸(dTTP)中的每一種的至少一個分子。為了合成新生RNA鏈16，核苷酸前體17必須包括ATP、CTP、GTP和尿苷-5’-三磷酸(UTP)。
為了啟動一個測序反應，聚合酶15每一次將一個核苷酸前體分子17增加到引物16的3’端，從而延伸引物分子16。當引物分子16被延伸時，它便被稱為新生鏈16。在每一輪延伸過程中，都有一個核苷酸前體17被摻入該新生鏈16。因為核苷酸前體17的加入是由與模板鏈13之間的沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對作用決定的，所以不斷增長的新生鏈16的序列與模板鏈13的序列互補。在Watson-Crick堿基配對中，一條鏈上的腺苷(A)殘基總是與另一條鏈上的胸苷(T)殘基配對，如果這條鏈是RNA，則是與尿苷(U)殘基配對；類似的，一條鏈上的鳥苷(G)殘基總是與另一條鏈上的胞苷(C)配對。因此，模板鏈13的序列可以由新生鏈16的序列來確定。
在圖1顯示的實施方案中，一個反應室11里含有一個核酸分子13。在可選擇的實施方案中，將每一個核酸分子13分別置于一個獨立的反應室11里，可以對多個核酸分子13同時測序。在這種情況里，各個反應室11中的核酸模板13可以是相同的或者不同的。在其他可以選擇的實施方案中，兩個或者更多的模板核酸分子13可以放在同一個反應室11里。在這樣的實施例中，核酸分子13的序列相同。當多于一個模板核酸13存在于反應室11時，拉曼發(fā)射信號將代表反應室11中整合進入所有新生鏈16的核苷酸前體17的平均值。熟練的技術(shù)人員能夠使用已知的數(shù)據(jù)分析技術(shù)，校正在合成反應的任何給定時間獲得的信號，這些信號或者落后于發(fā)生在反應室11中的反應的主體(majority)，或者先于反應的主體。
熟練的技術(shù)人員會意識到，取決于所使用的聚合酶分子15，新生鏈16可能包含一定比例的錯配堿基，在那里新?lián)饺氲膲A基沒有和模板鏈13里的對應堿基正確地氫鍵結(jié)合。在各種實施方案中，至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％、至少99.9％或者更高的準確率都可能觀察到。熟練的技術(shù)人員會知道某些聚合酶15具有錯誤糾正活性(也被稱為3’-外切核酸酶活性或校正活性)，這種活性能夠移去新被摻入且與模板鏈13錯誤堿基配對的核苷酸前體17。在不同的實施方案中，可以使用具有或不具有校正活性的聚合酶15。熟練的技術(shù)人員也知道，某些聚合酶15，例如反轉(zhuǎn)錄酶，有固有的高錯配率，它允許錯配堿基的頻繁摻入。取決于具體的實施方案，可以選擇有著較高或較低的固有錯配率的聚合酶15。在某些實施方案中，可以使用具有最低可能錯配率的聚合酶15。聚合酶15的錯配率在本領(lǐng)域是已知的。
檢測單元12包括一個激發(fā)光源18，如激光，以及一個拉曼光譜檢測器19。激發(fā)光源18用激發(fā)光束20照射反應室11。該激發(fā)光束20作用于核苷酸前體17，致使電子激發(fā)到更高能態(tài)。當電子回到較低能態(tài)時，它們發(fā)出拉曼發(fā)射信號，該信號由拉曼檢測器19檢測。由于四種核苷酸前體17的拉曼發(fā)射信號各不相同，檢測單元12能夠測定反應室11中每種核苷酸前體17的量。
核苷酸前體17整合進入不斷增長的新生鏈16會導致反應室11中核苷酸前體17的消耗。為了使合成反應能夠持續(xù)進行，需要有新核苷酸前體17的來源。該來源如圖1中所示的一個分子分配器21。在可選擇的實施方案中，分子分配器21可以是也可以不是該測序裝置10的一部分。
在某些實施方案中，分子分配器21被設(shè)計成等量地釋放每種核苷酸前體17，被釋放的量根據(jù)新生鏈16合成速率進行校準。然而，核酸13不一定具有A、T、G、C殘基的平均分布。特別地，DNA分子的某些區(qū)域可能富集AT或富集GC，這取決于DNA來源的物種和DNA分子被測序的特定區(qū)域。在可選擇的實施方案中，可以控制分子分配器21對核苷酸前體17的釋放，以便將反應室11中每一種核苷酸前體17維持在相對恒定的濃度。這些實施方案可以在檢測單元12和分子分配器21的接口處使用信息處理和控制系統(tǒng)。
在涉及一個信息處理和控制系統(tǒng)的實施方案中，例如一臺連接或整合一個數(shù)據(jù)存貯單元的計算機或微處理器，數(shù)據(jù)可以從一個檢測器19，例如光度計或單色陣列那里收集。該信息處理和控制系統(tǒng)可以包含一個能將特定拉曼信號與特定核苷酸前體17聯(lián)系起來的數(shù)據(jù)庫。該信息處理和控制系統(tǒng)可以記錄由檢測器19檢測到的信號，并用已知核苷酸前體17的信號來校正那些信號。該信息處理和控制系統(tǒng)也能保存關(guān)于核苷酸前體17吸收的一份記錄，該記錄表示了模板分子13的序列。該信息處理和控制系統(tǒng)也能實施本領(lǐng)域所知的標準操作，例如扣除背景信號。
在涉及分子分配器21的實施方案中，核苷酸前體17加入到反應室11中，同時又有核苷酸前體17摻入到新生鏈16中，這會產(chǎn)生復雜的拉曼信號。在特定的實施方案中，在額外的核苷酸前體17加入到反應室11之前，合成反應可以進行完全或接近完全。在可選擇的實施方案中，可以在核苷酸前體17摻入新生鏈16的同時，將核苷酸前體17補充到反應室11中。在這樣的實施方案中，可以使用信息處理和控制系統(tǒng)來校正由拉曼發(fā)射光譜獲得的核苷酸前體17濃度的數(shù)據(jù)，以確定由分子分配器21增加的核苷酸前體17的量。
在某些實施方案中，反應室11可能只含有每種核苷酸前體17的一個分子。在這些實施方案中，核苷酸前體17自分子分配器21的釋放與核苷酸前體17整合進入新生鏈16緊密聯(lián)系，以避免由所需核苷酸前體17的缺乏引起的合成反應的延擱。
某些實施方案涉及新生DNA鏈16的合成。模板鏈13可以是RNA或DNA。如果是RNA模板鏈13，合成試劑15可以是反轉(zhuǎn)錄酶，它的例子在本領(lǐng)域是已知的。在模板鏈13是DNA分子的實施方案中，合成試劑15可以是DNA聚合酶，它的例子在本領(lǐng)域是已知的。
在其他的實施方案中，新生鏈16是RNA分子。這就要求合成試劑15是一種RNA聚合酶。在這些實施方案中，不需要引物16。然而，模板鏈13必須含有一個啟動子序列，它能有效地結(jié)合RNA聚合酶15，并啟動RNA新生鏈16的轉(zhuǎn)錄。啟動子序列的精確結(jié)構(gòu)取決于所使用的RNA聚合酶15的類型。為了實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的有效起始而做的啟動子序列優(yōu)化屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。實施方案并不限制所用模板分子13的類型、合成的新生鏈16的類型或使用的聚合酶15的類型。事實上，能夠支持與模板鏈13序列互補的核酸分子16的合成的任何模板13和任何聚合酶15都可以使用。
在一些可選擇的實施方案中，核苷酸前體17可以用一個標記加以化學修飾。該標記有一個獨特的和高度可見的光學信號，該信號能夠區(qū)分每種常用核苷酸前體17。在一些實施方案中，該標記可用于增加拉曼發(fā)射信號的強度，或者以另外的方式提高拉曼檢測器19檢測核苷酸前體17的靈敏度或特異性。對于涉及拉曼光譜的實施方案來說，能夠使用的標記分子的非限制性的例子包括TRIT(四甲基若丹明異硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅和氨基吖啶。用于特定實施方案的其他標記部分可以包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。在某些實施方案中，碳納米管也可作為拉曼標記被使用。在拉曼光譜中標記的使用在本領(lǐng)域是已知的(例如，美國專利號5,306,403和6,174,677)。熟練的技術(shù)人員明白，當拉曼標記結(jié)合到不同的核苷酸前體17時，將產(chǎn)生可區(qū)分的拉曼光譜，或者對于每一種核苷酸前體17，設(shè)計不同的標記與之相連。
在一些實施方案中，標記表現(xiàn)出增強的拉曼信號。在可選擇的實施例中，表現(xiàn)為其他類型信號的標記也可使用，如熒光或發(fā)光(luminescent)信號?？梢酝茢啵谶@些實施方案中可以使用其他的檢測方法，如熒光光譜法或發(fā)光光譜法。檢測溶液中核苷酸前體17的許多可選擇的方法在本領(lǐng)域是已知的，并可以被使用。對于這些方法，拉曼光譜檢測器19可以被設(shè)計成用于檢測熒光、發(fā)光(luminescence)或本領(lǐng)域已知的其他信號的檢測器19代替。
在一些實施方案中，模板分子13可以連接到一個表面14上，例如功能化玻璃、硅、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、銀或其他金屬涂蓋的表面、石英、塑料、PTFE(聚四氟乙烯)、PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、橡膠、尼龍、硝酸纖維素、玻璃珠、磁珠或者本領(lǐng)域已知的能在其表面整合上氨基、羧基、硫醇、羥基或第爾斯-阿爾德(Diels-Alder)反應劑等功能性基團的其他任何材料。
在一些實施方案中，功能性基團可以共價連接到交聯(lián)劑上，以便模板鏈13與聚合酶15之間的結(jié)合反應能夠在沒有位阻的情況下發(fā)生。典型的交聯(lián)基團包括乙二醇寡聚物和二胺。連接可以是共價或非共價的結(jié)合。將核酸分子13連接到表面14的各種方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。
定義在這里所使用的“一個(‘a(chǎn)’或‘a(chǎn)n’)”可以表示某個物件(item)的一個或者多于一個。
“核酸”13可以是DNA或RNA，可以是單鏈的、雙鏈的或三鏈的，也可以是它們經(jīng)過化學修飾的任意形式，盡管單鏈核酸13是優(yōu)選的。事實上，可以考慮對核酸13作出任何修飾。正如這里所使用的，單鏈核酸13可以用前綴“ss”表示，雙鏈核酸可以用前綴“ds”表示，三鏈核酸可以用前綴“ts”表示。
“核酸”13幾乎可以是任意長度，它的堿基數(shù)可以是10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、500000、1000000、1500000、2000000、5000000或者甚至更多，直到全長染色體DNA分子13。
“核苷”是含有一個堿基(A、T、G、C或U)的分子，這些堿基共價連接到戊糖如脫氧核糖、核糖、或者戊糖的衍生物或同型物(analogs)。
“核苷酸”是指進一步包括至少一個磷酸基團共價連接到其戊糖上的核苷。在一些實施方案中，核苷酸前體17是核糖核苷三磷酸或脫氧核糖核苷三磷酸。可以期望對核苷酸前體17的結(jié)構(gòu)作各種取代和修飾，只要它們?nèi)匀荒軌虮痪酆厦?5整合進入新生鏈16。例如，在某些實施方案中，核糖或脫氧核糖部分可以用其他的戊糖或戊糖同型物(analog)取代。在其他的實施方案中，磷酸基團可以用各種基團取代，如磷酸鹽(酯)、硫酸鹽(酯)或磺酸鹽(酯)。仍然在其他的實施方案中，嘌呤或嘧啶堿基可以用其他嘌呤或嘧啶或它們的同型物取代，只要整合進新生鏈16的核苷酸前體17的順序能反映出模板鏈13的序列。
核酸模板分子13可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何技術(shù)來制備。在一些實施方案中，模板分子13是自然發(fā)生的DNA或RNA分子，例如染色體DNA或信使RNA(mRNA)。事實上，可以使用已公開的方法來制備和序列測定任何自然發(fā)生的核酸13，包括但不限于染色體DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA，或核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA、不均一核RNA或信使RNA。將被測序的核酸13可以用本領(lǐng)域已知的標準方法從原核或真核來源獲得。
用于制備和分離各種形式的細胞內(nèi)核酸13的方法是已知的。(見，例如，Guide to Molecular Cloning Techniques，eds.Berger and Kimmel，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular CloningA LaboratoryManual，2ndEd.，eds.Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)。一般地，含有將用于測序的核酸13的細胞、組織或其他源材料首先要被勻漿化，例如在液氮中冷凍，然后在研缽里用磨棒研磨。一些組織可以用韋林氏攪切器(Waringblender)、維爾第斯勻漿器(Virtis homogenizer)、杜恩斯勻漿器(Douncehomogenizer)或其他勻漿器勻漿化。粗制的勻漿可以用去污劑提取，如十二烷基磺酸鈉(SDS)、Triton X-100、CHAPS(3-[(3-膽胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸酯)、辛基葡糖苷(octylglucoside)或本領(lǐng)域已知的其他去污劑。可選擇或者可作為補充的是，可以使用促溶劑如異硫氰酸胍或有機溶劑如苯酚進行提取。在一些實施方案中，可以通過蛋白酶處理來降解細胞蛋白，例如使用蛋白酶K。微粒污染物可以通過離心或超高速離心來去除(例如，大約5000到10000×g離心10到30分鐘，或者約50000到100000×g離心30到60分鐘)。在低離子強度的含水緩沖液中進行透析可以除去鹽或其他可溶性污染物。在-20℃加入乙醇，或者加入醋酸鈉(pH6.5，約0.3M)和0.8倍體積的2-丙醇，可以將核酸13沉淀。沉淀的核酸13可以通過離心被收集，或者，對于沉淀下來的染色體DNA，可以將其纏繞在玻璃吸管或其它探頭上。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，上面所列的步驟僅僅是示例性的。可以作出許多變化，這取決于將被測序的核酸的特定類型。例如，線粒體DNA常常是通過采用不連續(xù)梯度的氯化銫密度梯度離心來制備，而mRNA則常常是用商業(yè)來源的制備柱來制備，這些商業(yè)來源例如Promega(Madison，WI)或Clontech(Palo Alto，CA)。這些變化在本領(lǐng)域是已知的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，取決于將被制備的模板核酸13的類型，可以使用各種核酸酶抑制物。例如，通過用焦碳酸二乙酯(DEPC)進行處理，可以去除儲液中的核糖核酸酶(RNase)污染，而商業(yè)上可獲得的核酸酶抑制物可以從標準的來源獲得，如Promega(Madison，WI)或BRL(Gaithersburg，MD)。純化的核酸13可以溶解在含水緩沖液中，如TE(Tris-EDTA)(乙二胺四乙酸)，然后在使用前貯存在-20℃或液氮中。
如果將被測序的是單鏈DNA(ssDNA)13，可以按標準方法由雙鏈DNA(dsDNA)制備ssDNA 13。最簡單的是，加熱dsDNA至它的退火溫度(在該溫度，dsDNA自發(fā)分離為ssDNA 13)以上。典型的條件可能涉及在92到95℃加熱5分鐘或更長時間。用于確定分離dsDNA的條件的公式，例如那些基于GC含量和分子長度的公式，在本領(lǐng)域是已知的。作為選擇，單鏈DNA 13可以用本領(lǐng)域已知的標準擴增技術(shù)由雙鏈DNA制得，使用僅結(jié)合雙鏈DNA中的一條鏈的引物。制備單鏈DNA 13的其他方法在本領(lǐng)域是已知的，例如將待測序的雙鏈核酸插入復制態(tài)的噬菌體如M13，然后讓噬菌體產(chǎn)生模板13的單鏈拷貝。
盡管某些實施方案涉及自然發(fā)生的核酸13的制備，而事實上，能夠用作RNA或DNA聚合酶15的模板的任何類型核酸13都可以被測序。例如，用各種擴增技術(shù)如聚合酶鏈式反應(PCRTM)擴增制得的核酸13可以被測序。(見美國專利號4,683,195、4,683,202和4,800,159)。作為選擇，待測序的核酸13可以用標準載體克隆，標準載體如質(zhì)粒、粘粒、BACs(細菌人工染色體)或YACs(酵母人工染色體)。(見，例如，Berger and Kimmel，1987；Sambrook et al.，1989。)核酸插入物13可以從載體DNA中分離，例如，用合適的限制性內(nèi)切核酸酶切割，然后進行瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色。將具有所需大小的核酸13片段從膠中取出，例如，使用低熔點瓊脂糖，或從膠塊中電洗脫。插入片段的分離方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
單個核酸分子的分離在某些實施方案中，待測序的核酸分子13是ssDNA或ssRNA的單個分子。為了選擇和操作單個ssDNA或ssRNA分子，可以使用各種方法，如流力聚焦(hydrodynamic focusing)、微操縱器偶聯(lián)(micro-manipulator coupling)、光捕獲、或這些方法的組合和類似的方法。(見，例如，Goodwin et al.，1996，Acc.Chem.Res.29607-619；美國專利號4,962,037；5,405,747；5,776,674；6,136,543；6,225,068。)在某些實施方案中，可以應用微流體學或超微流體學來分選和分離模板核酸13。可以運用流體動力學來操縱核酸13的運動，使其進入一個微通道、微毛細管或微孔。在一個實施方案中，可以使用液體動力來移動核酸分子13通過一個梳狀結(jié)構(gòu)，從而分離出單個核酸分子13。一旦核酸分子13被分離開，就可以使用流力聚焦來定位這些分子13。熱學或電學上的勢差、一定的壓力或真空也都可用來提供用于操作核酸13所需的驅(qū)動力。在典型的實施方案中，為了測序而對模板核酸13進行的操作包括使用一種砌塊(channel block)設(shè)計，它整合了微構(gòu)造的通道和一體化的膠質(zhì)材料。這個設(shè)計公開在美國專利號5,867,266和6,214,246。
在另一個實施方案中，含有核酸模板13的樣品可以在偶聯(lián)到固定化表面14之前被稀釋。在典型的實施方案中，固定化表面14可以是磁性或非磁性微珠(beads)的形式，或是其他離散的結(jié)構(gòu)單元。經(jīng)過適當?shù)南♂專總€微珠具有結(jié)合零個或一個核酸分子13的統(tǒng)計概率。連接有一個核酸分子13的微珠可以用例如熒光染料和流式細胞儀篩選或磁性篩選的方法來判定。取決于微珠和核酸13的相對大小和均一性，可以使用磁過濾器和質(zhì)量分離法來分離含有一個結(jié)合核酸分子13的微珠。在其他實施方案中，連接到單個微珠或其他固定化表面14的多個核酸13可以被測序。
在可選擇的實施方案中，可以使用有涂層的光纖末梢(coated fibertip)14以獲得用于測序的核酸模板13的單個分子(例如，美國專利號6,225,068)。在其他可選擇的實施方案中，可以制備含有抗生物素蛋白或其他交聯(lián)劑的單個分子的固定化表面14。這樣的表面14能夠連接單個生物素化的引物16，而該引物又能與待測序的單個模板核酸13雜交。這個實施方案不限于抗生物素蛋白-生物素結(jié)合體系，而且適用于本領(lǐng)域已知的任何偶聯(lián)體系。
在其他可選擇的實施方案中，可以使用光捕獲來操縱用于測序的核酸模板13的單個分子。(例如，美國專利號5,776,674)。典型的光捕獲系統(tǒng)可以在商業(yè)上從Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)、S+LGmbH(Heidelberg，Germany)和P.A.L.M Gmbh(Wolfratshausen，Germany)獲得。
固定化的方法在各種實施方案中，待測序的核酸分子13可以連接(或固定)到固體表面14。核酸分子13的固定化可以用各種方法來實現(xiàn)，這些方法涉及核酸分子13和表面14之間的非共價或共價連接。在一個典型的實施方案中，固定化可以通過這樣的方法完成，即用鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆表面14，接著進行生物素化多聚核苷酸13的連接(Holmstrom et al.，Anal.Biochem.209278-283，1993)。固定化亦可這樣實現(xiàn)，即用聚-L-Lys(賴氨酸)或聚L-Lys-Phe(苯丙氨酸)包覆硅、玻璃或其他表面14，接著用雙功能交聯(lián)劑共價連接氨基或巰基修飾的核酸13(Running et al.，BioTechniques 8276-277，1990；Newton et al.，Nucleic Acids Res.211155-62，1993)。可以通過使用氨基硅烷將胺基引入到表面14上以供交聯(lián)使用。
通過將5’-磷酸化核酸13直接共價連接到化學修飾的表面14，實現(xiàn)固定化(Rasmussen et al.，Anal.Biochem.198138-142，1991)。核酸13與表面14之間的共價鍵通過與水溶性碳二亞胺的縮合而形成。這種方法促使核酸13通過其5’-磷酸基團進行有效的5’-連接。
將DNA 13結(jié)合到玻璃上，通常要先使玻璃表面14進行硅烷化，然后用碳二亞胺或戊二醛活化。在作為選擇的步驟中可以使用的試劑例如3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，DNA 13通過整合到其3’或5’端的氨基接頭(linkers)來聯(lián)接。應用紫外輻射可以將DNA 13直接結(jié)合到膜表面14上。核酸13固定化技術(shù)的其他非限制性實例公開在美國專利號5,610,287，5,776,674和6,225,068。
用于固定核酸13所使用的表面14的類型是不受限的。在各種實施方案中，固定化表面14可以是磁性珠、非磁性珠、平表面、點狀表面，或其他包含幾乎任何材料的任何形狀的固體表面14，只要該材料是足夠持久耐用的，并且是惰性的，能夠允許核酸13的測序反應發(fā)生?？梢允褂玫谋砻?4的非限制性的例子包括玻璃、硅土、硅酸鹽、PDMS、銀或其他金屬涂覆的表面、硝酸纖維素、尼龍、活化的石英、活化的玻璃、聚二氟偏二乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、其他聚合物如聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或聚二甲基硅氧烷和光敏聚合物，包含光反應物質(zhì)的光敏聚合物，光反應物質(zhì)如氮賓、卡賓和能與核酸分子13形成共價連接的羰自由基(見美國專利號5,405,766和5,986,076)。
雙功能交聯(lián)劑可以在各種實施方案中被使用，例如將核酸分子13連接到表面14上。根據(jù)雙功能交聯(lián)劑的功能基團的特異性將它們劃分，例如氨基、胍基、吲哚或羧基特異性基團。其中，針對自由氨基的試劑更受歡迎，因為它們在商業(yè)上可以獲得、合成簡便，而且能夠在溫和的反應條件下應用它們。用于交聯(lián)分子的典型方法公開在美國專利號5,603,872和5,401,511中。交聯(lián)劑包括戊二醛(GAD)、雙功能環(huán)氧乙烷(OXR)、乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)和碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)。
合成試劑在一些實施例中，測序反應涉及一種合成試劑15如DNA聚合酶15結(jié)合到引物分子16上，以及核苷酸前體17被催化加入到引物16的3’端?？梢允褂玫暮铣稍噭?5的非限制性的例子包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶和依賴于RNA的RNA聚合酶。在“校正”活性和是否需要引物和啟動子序列方面，這些合成試劑15間的區(qū)別在這里被討論，并且它們是本領(lǐng)域已知的。當RNA聚合酶被用作合成試劑15時，需要測序的模板分子13可以是雙鏈DNA。
在應用具有校正功能的合成試劑15的實施方案中，用檢測單元12檢測被錯誤地摻入的核苷酸前體17的釋放，于是序列數(shù)據(jù)被糾正。在使用無校正功能的合成試劑15的實施方案中，錯誤沒有糾正。通過對原模板13的兩條鏈進行測序，或通過對同一條鏈13的多個拷貝進行測序，來減少這些錯誤。能被使用的聚合酶15的非限制性的例子包括Thermatoga maritime DNA聚合酶、AmplitaqFSTMDNA聚合酶、TaquenaseTMDNA聚合酶、ThermoSequenaseTM、Taq DNA聚合酶、QbetaTM復制酶、T4 DNA聚合酶、Thermus thermophilus DNA聚合酶、依賴于RNA的RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
許多合成試劑15可以從商業(yè)上獲得，包括Boehringer MannheimBiochemicals(Indianapolis，IN)的Pwo DNA聚合酶；Bio-RadLaboratori es(Hercules，CA)的Bst聚合酶；Epicentre Technologies(Madison，WI)的IsoThemTMDNA聚合酶；Promega(Madison，WI)的莫洛尼鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶、Pfu DNA聚合酶、禽類成髓細胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶、黃棲熱菌(Thermus flavus)(Tfl)DNA聚合酶和海濱熱球菌(Thermococcus litoralis)(Tli)DNA聚合酶；Amersham PharmaciaBiotech(Piscataway，NJ)的RAV2反轉(zhuǎn)錄酶、HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、RNA聚合酶E.coli、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶+/-3’→5’外切核酸酶、DNA聚合酶I的Klenow片段酶、Thermus‘ubiquitous’DNA聚合酶和DNA聚合酶I。然而，本領(lǐng)域已知的可用于核苷酸前體17的依賴于模板的聚合反應的任何合成試劑15都可以被使用。(見，例如，Goodman and Tippin，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1(2)101-9，2000；美國專利號6,090,589。)本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，可以操縱聚合酶15的活力，以與檢測單元12對核苷酸前體17的最佳分析速率相吻合。用于調(diào)整聚合酶15的活力的各種方法是已知的，包括調(diào)節(jié)反應室11中的溫度、壓力、pH、鹽濃度、二價陽離子濃度或核苷酸前體17的濃度。優(yōu)化聚合酶15活性的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
標記某些實施方案可以涉及將一標記整合進入核苷酸前體17，以方便檢測單元12對它們的測定?？梢允褂迷S多的不同標記，如拉曼標記、熒光團、生色團、放射性同位素、酶標記、抗體、化學發(fā)光劑、電發(fā)光劑、親和標記，等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員會承認，這些標記及其他這里未提到的標記成分可以在該公開方法中使用。
在涉及拉曼光譜的實施方案中使用的標記如上所述。在其他實施方案中，可以使用的標記體可以是熒光團，如Alexa 350、Alexa 430、AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)、BODIPY(5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸)630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL(熒光素)、BODIPY-R6G(6-羧基若丹明)、BODIPY-TMR(四甲基若丹明)、BODIPY-TRX(德克薩斯紅-X)、瀑布藍(CascadeBlue)、Cy2(青色素)、Cy3、Cy5，6-FAM(5-羧基熒光素)、熒光素、6-JOE(2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基熒光素)、俄勒岡綠(OregonGreen)488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍(Pacific Blue)、若丹明綠、若丹明紅、ROX(6-羧基-X-若丹明)、TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明)、四甲基若丹明和德克薩斯紅。熒光或發(fā)光標記可以由標準的商業(yè)來源獲得，例如Molecular Probes(Eugene，OR)。
引物引物16可以用本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。一般地，引物16長度在10到20個堿基之間，盡管更長的引物16也可以使用。在某些實施方案中，所設(shè)計的引物16在序列上與模板核酸分子13的已知的某部分精確互補，優(yōu)選靠近模板13與固定化表面14的連接位點。用于合成具有任一序列的引物16的方法是已知的，例如使用應用了亞磷酰胺化學的自動核酸合成儀。這樣的儀器可以從標準的來源獲得，如Applied Biosystems(Foster City，CA)或Millipore Corp.(Bedford，MA)。
其他實施方案涉及到在缺少已知的引物結(jié)合位點的情況下對核酸13測序。在這些情況下，可以使用隨機引物16來起始新生鏈16的聚合，例如使用隨機六聚體或包括7、8、9、10、11、12、13、14、15個堿基或更多堿基的隨機寡聚物。為了避免在單個模板鏈13上產(chǎn)生多個聚合位點，除了那些在固定化表面14的連接位點附近雜交到模板分子13上的引物外，其他引物16可以在起始合成反應之前被移去。
例如，通過使用由一種結(jié)合試劑，如鏈霉抗生物素蛋白，包覆的一個固定化表面14來實現(xiàn)。一種互補的結(jié)合試劑，如生物素，可以連接到引物分子16的5’端。在引物16與模板13之間的雜交發(fā)生之后，那些不能結(jié)合到固定化表面14的引物分子16被移去。只有那些與模板鏈13雜交的引物16能夠用作依賴于模板的DNA合成的引物16。在其他可選擇的實施方案中，多個引物分子16可以連接到固定化表面14。一個模板分子13被加入并與互補的引物16形成氫鍵。然后，依賴于模板的聚合酶15起始新生鏈16的合成。
可以使用其他類型的交聯(lián)劑以選擇性地針對每個模板鏈13保留一個引物16，例如使用光活化交聯(lián)劑。正如上所討論，許多交聯(lián)劑在本領(lǐng)域是已知的，并可加以使用。交聯(lián)劑也可以通過連接臂(linker arms)連接到固定化表面14上，以避免可能出現(xiàn)的與固定化表面14形成的立體位阻干擾引物16與模板13之間的氫鍵結(jié)合。
反應室反應室11被設(shè)計用來盛放水溶液中的固定化表面14、核酸模板13、引物16、合成試劑15和核苷酸前體17。在一些實施方案中，反應室11被設(shè)計成溫度可控的，例如整合進帕爾帖元件(Pelletierelements)或使用本領(lǐng)域已知的其他方法。用于控制核酸聚合反應中使用的小體積液體的溫度的方法是本領(lǐng)域所熟知的。(見，例如，美國專利號5,038,853，5,919,622，6,054,263和6,180,372。)在一些實施例中，反應室11和任何與之聯(lián)系的液體通道都可以用批量制造工藝來制造，如同在計算機芯片制造或微毛細管芯片制造領(lǐng)域中已知的情況。上述液體通道可提供與一個分子分配器21、一個廢物口、一個模板13加載口或一個合成試劑15的來源的連接。在一些實施例中，反應室11和該裝置10的其他組分如分子分配器21可以制造為一個集成芯片。這樣的芯片可以用本領(lǐng)域已知的方法制造，如使用光刻法和蝕刻。然而，制造方法是不受限制的，可以使用本領(lǐng)域已知的其他方法，如激光切割、注塑、澆鑄或印刻技術(shù)。對于某些實施方案，如采用分子分配器21的實施方案，可以使用用于超微機電系統(tǒng)制造的方法。(見，例如，Craighead，Science 2901532-36，2000.)。精密加工的芯片可以在商業(yè)上獲得，來源如Caliper Technologies Inc.(Mountain View，CA)和ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
在一個非限制性的實施例中，可將Borofloat玻璃片(Precision Glass& Opitics，Santa Ana，CA)在濃HF(氫氟酸)中預蝕刻一小段時間，然后在等離子體增強化學氣相淀積(PECVD)系統(tǒng)(PEII-A，TechnicsWest，San Jose，CA)中無定形硅犧牲層沉積之前清洗。晶片可以用六甲基二硅氮烷(HMDS)涂底，然后用感光性樹脂(Shipley 1818，Marlborough，MA)旋涂并烘烤軟化?？梢允褂媒佑|掩模對準器(QuintelCorp.San Jose，CA)將感光性樹脂層曝光于一種或多種掩模圖案，然后將曝光的感光性樹脂用Microposit developer concentrate(Shipley)和水的混合物除去。得到的晶片可以被烘烤硬化，然后在PECVD反應器中用CF4(四氟甲烷)等離子體除去曝光的無定形硅?？梢杂脻釮F對晶片進行化學蝕刻以制造出反應室11和任何通道。剩余的感光樹脂可被剝?nèi)ィ⒊o定形硅。
可以用金剛石打孔鉆頭(Crystalite，Westerville，OH)在蝕刻的晶片上鉆打出接入孔洞。在一個可編程的真空爐(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中，將經(jīng)蝕刻和鉆孔的平板熱鍵接到同樣尺寸的平晶片上，就制備了一個成品芯片。在某些實施方案中，芯片可以通過將兩塊經(jīng)蝕刻的平板結(jié)合在一起而制得。制造反應室11芯片的可選擇的典型方法公開在美國專利號5,867,266和6,214,246中。
為了便于檢測單元12對核苷酸前體17進行檢測，構(gòu)成反應室11的材料可選為對于檢測單元12使用的激發(fā)和發(fā)射頻率處的電磁輻射是可透過的。玻璃、硅以及在被拉曼光譜、熒光光譜、發(fā)光光譜或其他形式的光譜使用的頻率范圍內(nèi)通常是具有可透性的其他任何材料都可用于反應室11的構(gòu)造。在一些實施方案中，與檢測單元12相背的反應室11的表面可以用銀、金、鉑、銅、鋁或?qū)τ跈z測單元12相對不透明的其他材料覆蓋。在那種情況下，不透明材料可以用來增強拉曼或其他信號，例如使用表面增強拉曼光譜，而同時不會干擾檢測單元12的功能。在可選擇的實施方案中，包含有銀、金、鉑、銅或鋁的網(wǎng)格可以放置在反應室內(nèi)。
在各種實施方案中，反應室11的內(nèi)部體積可以是約1皮升、約2皮升、約5皮升、約10皮升、約20皮升、約50皮升、約100皮升、約250皮升、約500皮升、約1納升、約2納升、約5納升、約10納升、約20納升、約50納升、約100納升、約250納升、約500納升、約1微升、約2微升、約5微升、約10微升、約20微升、約50微升、約1 00微升、約250微升、約500微升或約1毫升。
分子分配器分子分配器21被設(shè)計成將核苷酸前體17釋放到反應室11內(nèi)。在某些實施方案中，分子分配器21可以等量的釋放出每種核苷酸前體17。在這些實施例中，可以使用一個單獨的分子分配器21將所有四種核苷酸前體17釋放到反應室11中。其他實施方案可能要求獨立地控制四種核苷酸前體17的釋放速率。在這些實施方案中，可以使用多個分子分配器21。在一個非限制性的實施例中，可以使用四個獨立的分子分配器21，每一個分子分配器將一種單一類型的核苷酸前體17釋放到反應室11中。
在各種實施方案中，分子分配器21可以是泵式裝置的形式?？梢允褂玫谋檬窖b置包括本領(lǐng)域已知的各種微型機械泵。例如，帶有一個凸出的橫膈膜、由一個壓電塊和兩個止回閥提供動力的泵，它們公開在美國專利號5,277,556，5,271,724和5,171,132。由熱氣元件提供動力的泵公布在美國專利號5,126,022中。使用多個串連膜的壓電蠕動泵或由外加電壓提供動力的蠕動泵公開在美國專利號5,705,018中。公布的PCT申請?zhí)朩O 94/05414公開了蘭姆波(lamb-wave)泵在微米級通道中的液體傳送方面的應用。技術(shù)人員會明白，分子分配器21不限于在此公開的泵，而是包括了本領(lǐng)域內(nèi)所知道的用于微小體積液體的定量支出的任何設(shè)計。
在其他實施方案中，分子分配器21可采用電流體動力泵的形式(如，Richter等，Sensors and Actuators 29159-165 1991；美國專利號5,126,022)。典型地，這些泵使用了一系列電極，這些電極分布在通道或反應/泵送室的表面上。在整個電極上施加電場導致樣品中的帶電物質(zhì)進行電泳運動。銦-錫氧化物膜特別適于將電極在襯底表面上排布成型，襯底表面如玻璃或硅襯底。也可使用這些方法將核苷酸前體17引入反應室11中。例如，電極可以在分子分配器21的表面排布成型，并用合適的功能基團加以修飾，從而將核苷酸前體17偶聯(lián)到電極表面上。在分子分配器21表面上的電極與一個相對電極之間施加電流導致核苷酸前體17電泳移動進入反應室11中。
在一些實施方案中，分子分配器21可以設(shè)計成一次分配一個核苷酸前體17。在其他實施方案中，分子分配器21可以設(shè)計成按體積分配核苷酸前體17，其體積可以是約1皮升、約2皮升、約5皮升、約10皮升、約20皮升、約50皮升、約100皮升、約250皮升、約500皮升、約1納升、約2納升、約5納升、約10納升、約20納升、約50納升、約100納升、約250納升、約500納升、約1微升、約2微升、約5微升、約10微升、約20微升或約50微升。
檢測單元涉及拉曼光譜的實施方案在一些實施方案中，檢測單元12被設(shè)計成通過拉曼光譜對核苷酸前體17進行檢測和定量。利用拉曼光譜檢測核苷酸前體17的各種方法在本領(lǐng)域是已知的。(見，例如，美國專利號5,306,403；6,002,471；6,174,677)。關(guān)于表面增強拉曼光譜(SERS)或表面增強共振拉曼光譜(SERRS)的變化已經(jīng)公開。在SERS和SERRS中，對于吸附在粗糙金屬表面，如銀、金、鉑、銅或鋁表面上的分子，拉曼檢測的靈敏度可提高106或更多倍數(shù)。
檢測單元12的一個非限制性的例子公開在美國專利號6,002,471中。在這個實施方案中，激發(fā)光束20由釹:釔鋁石榴石(Nd:YAG)激光器18產(chǎn)生，波長為532nm；或者由鈦:藍寶石(Ti:sapphire)激光器18產(chǎn)生，波長為365nm。可以使用脈沖激光束20或連續(xù)激光束20。激發(fā)光束20經(jīng)過共聚焦光學元件和顯微物鏡，然后聚焦在反應室11上。來自核苷酸前體17的拉曼發(fā)射光由顯微物鏡和共聚焦光學元件收集，然后偶聯(lián)到單色儀19上進行光譜分離。共聚焦光學元件用作降低背景信號，包括分色濾片、二次濾片、共聚焦孔、透鏡和平面鏡的組合。標準的全視場光學元件可以同共聚焦光學元件一起使用。拉曼發(fā)射信號由拉曼檢測器19檢測。該檢測器19包括與一臺用于信號計數(shù)和數(shù)字化的計算機相連接的雪崩光電二極管。在某些實施方案中，在反應室11中放置了包含有銀、金、鉑、銅或鋁的網(wǎng)格，這樣由于表面增強拉曼或表面增強拉曼共振而得到增強的信號。
已公開了可供選擇的檢測單元12的實施方案如美國專利號5,306,403，其中包括Spex Model 1403雙柵分光光度計19，并配有砷化鎵光電倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries ModelC3103402)，它以單光子計數(shù)模式運作。激發(fā)源18是來自SpectraPhysics的514.5nm線氬離子激光器，Model 166，和氪離子激光器(Innova 70，Coherent)的647.1nm線。
作為選擇的激發(fā)源18包括337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm的氦-鎘激光器(Liconox)(美國專利號6,174,677)。激發(fā)光束20經(jīng)過帶通濾波器(Corion)處理成為單色光，然后該光束可以用6×物鏡(Newport，Model L6×)聚焦到反應室11上?？梢杂梦镧R來激發(fā)核苷酸前體17和收集拉曼信號，其中使用到全息光束分離器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，以對激發(fā)光束20和發(fā)射的拉曼信號進行直角解析?？梢允褂萌㈦A式濾波器(KaiserOptical Systems，Inc.)來減少瑞利散射。作為選擇的拉曼檢測器19包括ISA HR-320光譜攝制儀，配有紅增強放大電荷耦合器件(RE-ICCD)檢測系統(tǒng)(Princeton Instruments)?？梢允褂闷渌愋偷臋z測器19，如電荷注入元件、光電二極管陣列或光電晶體管陣列。
本領(lǐng)域已知的任何具有適當形式或結(jié)構(gòu)的拉曼光譜或相關(guān)技術(shù)都可以用來檢測核苷酸16，包括但不限于常規(guī)拉曼散射、共振拉曼散射、表面增強拉曼散射、表面增強共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)、受激拉曼散射、反拉曼光譜學、受激獲得拉曼光譜學、超拉曼散射、分子光學激光檢測器(MOLE)或拉曼顯微探針或拉曼顯微鏡或共聚焦拉曼顯微光譜學、三維或掃描拉曼、拉曼飽和光譜學、時間分辨共振拉曼、拉曼退耦光譜學或紫外-拉曼顯微鏡方法。
涉及FRET的實施方案在某些可選擇的實施方案中，核苷酸前體17可以用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)來確定和定量。FRET是一種用來檢測一個供體分子(donormolecule)和一個受體分子(acceptor molecule)之間距離的光譜學現(xiàn)象。所選擇的供體和受體對應該滿足供體的熒光發(fā)射與受體的激發(fā)光譜有重疊。當這兩個分子結(jié)合在一起時(距離少于100埃)，供體的激發(fā)態(tài)能量非輻射地轉(zhuǎn)移給受體，同時供體的發(fā)射淬滅。假如受體分子是一個熒光團，那么它的發(fā)射會增強。用于寡聚核苷酸的FRET的組合物和方法在本領(lǐng)域是已知的(例如，美國專利號5,866,366)。
常被用作FRET標記的分子包括熒光素、5-羧基熒光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、若丹明、6-羧基若丹明(R6G)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、4-(4’-二甲氨基苯偶氮基)安息香酸(DABCYL)和5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酰酸(EDANS)。其他可能的FRET供體和受體分子在本領(lǐng)域是已知的(見美國專利號5,866,336，表1)。技術(shù)人員能熟悉地選擇用于FRET的成對標記分子(美國專利號5,866,336)。
在涉及FRET的實施方案中，供體和受體分子可以共價或非共價地連接到測序裝置10的各種組分上。在某些實施方案中，供體和受體分子可以連接到核苷酸前體17、模板鏈13或聚合酶15上。
在一些實施方案中，供體分子可以連接到模板鏈13上，而受體分子連接到核苷酸前體17上。在這種情況下，每種核苷酸前體17應該連接到具有可區(qū)分的發(fā)射光譜的一種受體分子上，而選擇的供體分子應該具有寬范圍的發(fā)射光譜，該光譜范圍能夠覆蓋所有四種受體分子的激發(fā)光譜。在模板鏈13上會有多個供體分子，例如以插入到雙鏈核酸的熒光嵌入試劑的形式存在。在可選擇的實施方案中，供體分子可以共價連接到模板鏈13上，而且在那個位置并不會干擾堿基配對形成。一受到激發(fā)，多個供體分子將把它們的能量轉(zhuǎn)移給連接在核苷酸前體17上的受體標記分子，從而使受體分子產(chǎn)生增強的發(fā)射信號。因為信號增強的程度會隨距離增大迅速降低，所以對于整合進入新生鏈16的核苷酸前體17，會有最大的信號增強出現(xiàn)，而對于反應室11內(nèi)溶液中的自由核苷酸前體17，出現(xiàn)的信號增強相對較弱?？梢赃x擇激發(fā)光束20的波長來最大程度地激發(fā)供體分子，而較弱地激發(fā)受體分子。在這種情況下，只有整合進入新生鏈16的核苷酸前體17會產(chǎn)生可檢測到的熒光信號。當每個核苷酸前體17被整合進入新生鏈16時，來自它的供體標記的信號可被檢測到。
在某些實施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將待測序的模板核酸13放置在熒光顯微鏡的視場內(nèi)，例如通過使用光捕獲(例如，美國專利號6,136,543)。可以使用的熒光顯微鏡的非限制性的實例是反式相襯和入射光熒光顯微鏡(IMT2-RFC，Olympus Co.，Ltd.)，其中使用了100倍油鏡(Plan.Multidot.Apochromat.Times.100，1.40 NA，Olympus Co.，Ltd.)。如上所述，激發(fā)光束20可由激光器18發(fā)出。熒光發(fā)射可以通過物鏡并使用合適的濾片來收集，然后使用靈敏的熒光檢測器19檢測，例如CCD器件、光電二極管、光電倍增管或等效物。
在可選擇的實施方案中，供體分子可以連接到聚合酶15上。如上所述，每種核苷酸前體17應該有一種可區(qū)分的受體分子，并且供體分子的發(fā)射光譜應該覆蓋每一種受體分子的激發(fā)光譜?？梢园凑赵谏婕肮w標記的模板核酸13的實施方案中所討論的，來進行熒光檢測。因為供體分子的數(shù)目遠小于采用模板13標記方法時的數(shù)目，所以受體分子信號增強的數(shù)量級會低一些。然而，在這個實施方案中，熒光共振轉(zhuǎn)移被限制在位于或接近于聚合酶15的催化位點的核苷酸前體17。供體分子應該連接到靠近催化位點的位置，但是在這個位置它不能干擾合成試劑15的聚合酶活性。在這個實施方案中，一個復雜程度小得多的FRET信號應該被檢測到。
信息處理和控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)分析在某些實施方案中，測序裝置10可以包含一個信息處理和控制系統(tǒng)。這些實施方案并不限制所使用的信息處理和控制系統(tǒng)的類型。典型的信息處理和控制系統(tǒng)可以整合一臺含有用于信息交流的總線的計算機和一個用于信息處理的處理器。在一個實施方案中，處理器可以選自Pentium系列處理器，包括但不局限于Pentium II系列、Pentium III系列和Pentium 4系列處理器，它們可以從Intel Corp.(Santa Clara，CA)獲得。在可選擇的實施方案中，處理器可以是Celeron、Itanium或Pentium Xeon 處理器(Santa Clara，CA)。在各種其他實施方案中，處理器可以基于Intel 結(jié)構(gòu)，如Intel IA-32或Intel IA-64結(jié)構(gòu)。作為選擇，可以使用其他處理器。
該計算機可以進一步包含一個隨機存取存儲器(RAM)或其他動態(tài)存儲器件、一個只讀存儲器(ROM)和/或其他靜態(tài)存儲器，以及一個數(shù)據(jù)存儲器件如磁盤或光盤和它們對應的驅(qū)動。該信息處理和控制系統(tǒng)也可包含本領(lǐng)域已知的其他外圍設(shè)備，如一個顯示器(如陰極射線管或液晶顯示器)、一個文字數(shù)字輸入設(shè)備(如鍵盤)、一個光標控制設(shè)備(如鼠標、跟蹤球或光標方向鍵)和一個通信轉(zhuǎn)換設(shè)備(如調(diào)制解調(diào)器、網(wǎng)絡(luò)接口卡或用于連接以太網(wǎng)、令牌網(wǎng)或其他類型網(wǎng)絡(luò)的接口設(shè)備)。
在特定的實施方案中，檢測單元12也可與總線連接。來自檢測單元12的數(shù)據(jù)可由處理器處理，然后數(shù)據(jù)儲存在主存儲器中。標準核苷酸前體17的發(fā)射剖圖的數(shù)據(jù)也可儲存在主存儲器或ROM中。處理器可以比較來自反應室11中核苷酸前體17的發(fā)射光譜，以確定整合進入新生鏈16的核苷酸前體17的類型。主存儲器也可以儲存從反應室11中消失的核苷酸前體17的順序。處理器可以分析檢測單元12的數(shù)據(jù)，以確定模板核酸13的序列。
可以考慮在某些實施過程中使用一個不同于上面所述實例的配置的信息處理和控制系統(tǒng)。所以，在不同的實施例中系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)可以不同。也應該注意到，在作為選擇的實施方案中，當這里所述的處理過程是在一個程序控制的處理器的控制下進行時，該處理可以完全或部分的由可編程或硬編碼邏輯來實施，例如現(xiàn)場可編程門陣列(FPGAs)、TTL邏輯或?qū)Ｓ眉呻娐?ASICs)。另外，可以通過程序控制的通用計算機組分和/或客戶硬件組分的任意組合來實施該方法。
在數(shù)據(jù)收集操作之后，數(shù)據(jù)通常會被報告給一個數(shù)據(jù)分析操作。為了方便該分析操作，由檢測單元12獲得的數(shù)據(jù)通常是使用一臺數(shù)字計算機來分析。典型地，計算機被恰當?shù)鼐幊桃越邮芎痛鎯τ蓹z測單元12獲得的數(shù)據(jù)，以及分析和報告收集到的數(shù)據(jù)。在某些實施方案中，這可能涉及由拉曼數(shù)據(jù)確定反應室11中核苷酸前體17的濃度，以及扣除背景拉曼信號。
在某些實施方案中，信息處理和控制系統(tǒng)可以控制分配到反應室11的核苷酸前體17的量。在這些實施方案中，信息處理和控制系統(tǒng)可以作為檢測單元12和分子分配器21之間的接口，從而控制分子分配器21對核苷酸前體17的釋放，以使其基本匹配核苷酸前體17整合進入新生鏈16的速率。
在某些實施方案中，可以使用客戶定制軟件包來分析由檢測單元12獲得的數(shù)據(jù)。在可選擇的實施方案中，可以使用信息處理和控制系統(tǒng)及可公開利用的軟件包實施數(shù)據(jù)分析。用于DNA序列分析的可利用的軟件的非限制性例子包括但不限于PRISMTMDNA測序分析軟件(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)、SequencherTM軟件包(GeneCodes，Ann Arbor，MI)和通過國家生物技術(shù)信息機構(gòu)獲得的各種軟件包，網(wǎng)址為www.nbif.org/links/1.4.1.php。
權(quán)利要求
1.一種裝置，包括a)反應室，該反應室含有一個或多個連接到固定化表面上的核酸分子；和b)檢測單元，該檢測單元含有激發(fā)源和拉曼檢測器。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中所述的反應室含有連接到固定化表面的單個核酸分子。
3.權(quán)利要求1的裝置，其中所述的反應室含有銀、金、鉑、銅或鋁網(wǎng)格。
4.權(quán)利要求1的裝置，進一步包括分子分配器。
5.權(quán)利要求1的裝置，進一步包括信息處理和控制系統(tǒng)。
6.權(quán)利要求5的裝置，進一步包括數(shù)據(jù)存儲單元。
7.權(quán)利要求4的裝置，其中所述的反應室和分子分配器是集成芯片的一部分。
8.權(quán)利要求2的裝置，進一步包括(i)核苷酸前體；(ii)合成試劑；和(iii)一個或多個引物。
9.權(quán)利要求1的裝置，其中所述的激發(fā)源是激光器。
10.權(quán)利要求1的裝置，其中所述的拉曼檢測器是分光計或單色儀。
11.一種裝置，包括a)反應室，該反應室含有合成試劑、核苷酸前體和連接到固定化表面的單個模板核酸分子；和b)檢測單元，該檢測單元包括激發(fā)源和拉曼檢測器。
12.權(quán)利要求11的裝置，進一步包括引物。
13.權(quán)利要求11的裝置，進一步包括分子分配器。
14.權(quán)利要求11的裝置，進一步包括信息處理和控制系統(tǒng)。
15.權(quán)利要求11的裝置，其中所述的反應室含有銀、金、鉑、銅或鋁網(wǎng)格。
16.權(quán)利要求13的裝置，其中所述的反應室和分子分配器是集成芯片的一部分。
17.權(quán)利要求11的裝置，其中所述的激發(fā)源是激光器。
18.權(quán)利要求11的裝置，其中所述的拉曼檢測器是分光計或單色儀。
19.一種測定核酸分子序列的方法，包括a)制備單個模板核酸分子；b)將模板核酸分子插入到反應室中；c)用合成試劑由核苷酸前體合成互補的核酸分子；d)利用拉曼光譜學監(jiān)測核苷酸前體摻入互補核酸分子的順序。
20.權(quán)利要求19的方法，其中一個標記分子連接到每個核苷酸前體上。
21.權(quán)利要求19的方法，其中利用表面增強拉曼散射、表面增強共振拉曼散射、受激拉曼散射、反拉曼散射、受激獲得拉曼光譜學、超拉曼散射或相干反斯托克斯拉曼散射監(jiān)測所述的核苷酸。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述的合成試劑是DNA聚合酶。
23.權(quán)利要求22的方法，進一步包括加入引物，其中該引物在序列上與模板核酸分子的一部分互補。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的引物與模板核酸分子的5’端互補。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述的模板核酸分子連接到固定化表面上。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述的模板核酸分子通過連接臂連接到固定化表面上。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述的引物連接到固定化表面上。
28.一種測定核酸分子序列的方法，包括a)制備單個模板核酸分子；b)將模板核酸分子插入到反應室中；c)用合成試劑由核苷酸前體合成互補的核酸分子；d)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)光譜學監(jiān)測核苷酸前體摻入互補核酸分子的順序。
29.權(quán)利要求28的方法，其中供體標記分子連接到合成試劑上，可區(qū)分的受體標記分子連接到每一種核苷酸前體上。
30.權(quán)利要求28的方法，其中一個或多個供體標記分子連接到模板核酸分子上，可區(qū)分的受體標記分子連接到每一種核苷酸前體上。
全文摘要
在這里公開的方法、組合物和裝置是用于核酸序列測定。本方法涉及一個或多個核酸模板分子的分離和使用一種DNA或RNA聚合酶或類似的合成試劑來實現(xiàn)核酸的新生互補鏈的聚合。新生鏈每一次延伸一個核苷酸的同時，核苷酸前體從溶液中的消失通過拉曼光譜或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)被監(jiān)測。新生鏈的核酸序列，同時也是模板鏈的互補序列，可以通過追蹤在聚合反應過程中核苷酸前體的摻入順序來測定。某些實施方案涉及在實施要求保護的方法時所用到的裝置，包括一個反應室和檢測單元。這些方法、組合物和裝置被用于在一次單獨的測序反應中對非常長的核酸模板進行測序。
文檔編號G01J3/44GK1556862SQ02818651
公開日2004年12月22日 申請日期2002年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月24日
發(fā)明者V·拉奧, G·紐鮑爾, S·柯奇, M·山川, A·伯林, V 拉奧 申請人:英特爾公司