一種端粒酶敏感的納米藥物載體粒子及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種端粒酶敏感的納米藥物載體粒子及其制備方法，其中納米藥物載體粒子，具有四層核殼結構：內核為拉曼分子標記的金納米棒，在拉曼分子標記的金納米棒外包裹一薄層實心二氧化硅殼層，在二氧化硅殼層外包裹一層介孔二氧化硅殼層，在介孔二氧化硅殼層外包裹一層對端粒酶敏感的單鏈DNA；所述介孔二氧化硅殼層的孔道中裝載有藥物分子。該納米藥物載體粒子能實現細胞內端粒酶觸發(fā)的藥物釋放，解決目前癌癥治療藥效低、毒副作用大的難題；同時該納米藥物載體粒子上集成了SERS信號可以實現對其精確的光學示蹤。該納米藥物載體粒子制備方法簡單、可重復性高，并且藥物釋放特性好，同時SERS信號強易于跟蹤。
【專利說明】一種端粒酶敏感的納米藥物載體粒子及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料制備技術，尤其涉及一種端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子及其制備方法，該納米藥物載體粒子能實現細胞內端粒酶觸發(fā)的藥物釋放，同時該納米藥物載體粒子上集成了表面增強拉曼散射(SERS)信號可以實現對其精確的光學示蹤。
【背景技術】
[0002]受激敏感的納米藥物 載體粒子在提高癌癥化學治療效率方面具有獨特的優(yōu)勢:在遇到刺激物之前，這些納米藥物載體粒子能將藥物密封在其中，避免藥物提前泄露；進入病變組織細胞后，在特定物質或環(huán)境條件的刺激下，這些納米藥物載體粒子可以釋放出裝載的藥物。常用的刺激物質或環(huán)境條件包括溫度、光照、PH值以及氧化還原作用等；此外，端粒酶也是一種潛在的觸發(fā)劑。85-90%的腫瘤細胞過度表達端粒酶，而正常細胞抑制端粒酶的表達。在構筑這類受激敏感的納米藥物載體粒子時(這里只是為了講介孔二氧化硅這種材料，之前未有關于以端粒酶為刺激物質的藥物載體粒子的報道)，常用的材料是介孔二氧化硅，因為它具有很強的藥物裝載能力和靈活的表面修飾方法。
[0003]除了在腫瘤細胞中特異性釋放藥物的功能外，若能在這類納米藥物載體粒子上同時集成光學信號用以跟蹤納米載體粒子，則將極大地方便對其給藥行為的研究。熒光是一種常用的光學示蹤信號；然而，熒光光譜較寬，容易與藥物或組織自發(fā)熒光產生光譜重疊，影響跟蹤的準確性。表面增強拉曼散射(SERS)譜線窄，使用SERS作為載體粒子的示蹤信號，將獲得更聞的跟蹤準確性。

【發(fā)明內容】

[0004]發(fā)明目的:為了克服現有技術中存在的不足，本發(fā)明提供一種端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子及其制備方法；該納米藥物載體粒子能實現細胞內端粒酶觸發(fā)的藥物釋放，解決目前癌癥治療藥效低、毒副作用大的難題；同時該納米藥物載體粒子上集成了 SERS信號可以實現對其精確的光學示蹤。該納米藥物載體粒子制備方法簡單、可重復性高，并且藥物釋放特性好，同時SERS信號強易于跟蹤。
[0005]技術方案:為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:
[0006]一種端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子，具有四層核殼結構:內核為拉曼分子標記的金納米棒，在拉曼分子標記的金納米棒外包裹一薄層實心二氧化娃殼層，在二氧化娃殼層外包裹一層介孔二氧化娃殼層，在介孔二氧化娃殼層外包裹一層對端粒酶敏感的單鏈DNA ;所述介孔二氧化硅殼層的孔道中裝載有藥物分子。
[0007]優(yōu)選的，所述藥物分子通過物理擴散或者吸附的方式裝載在孔道內。
[0008]優(yōu)選的，所述單鏈DNA通過靜電力作用吸附在介孔二氧化硅殼層外表面，并將孔道密封住。
[0009]優(yōu)選的，所述單鏈DNA 具體為(5 ’ - (CCCTAA) 6AATCCGTCGAGCAGAGTT_3 ’)，即其5’端含有六個與端粒重復序列互補的(5’ -CCCTAA-3’)序列，3’端為端粒酶底物序列(5’ -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)。
[0010]當有端粒酶和dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)存在時，端粒酶能在單鏈DNA3’端的端粒酶底物上合成并延伸出若干個端粒重復序列(5’ -TTAGGG-3’)。延伸出的端粒重復序列能和單鏈DNA5’端的端粒互補序列雜交,使單鏈DNA折疊成發(fā)卡狀(hairpin)的結構并從介孔二氧化硅殼層表面脫落，則介孔二氧化硅殼層中裝載的藥物分子被釋放出來。當沒有端粒酶存在時，單鏈DNA始終覆蓋在介孔二氧化硅殼層的表面，阻止孔道內部藥物分子的釋放。
[0011]一種端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子的制備方法，包括如下步驟:
[0012](I)制備金納米棒；
[0013](2)在金納米棒表面修飾用于信號檢測的拉曼分子，形成拉曼分子標記的金納米棒⑴；
[0014](3)在拉曼分子標記的金納米棒表面包裹一薄層實心二氧化硅殼層，形成二氧化硅包裹的金納米棒；
[0015](4)在二氧化硅包裹的金納米棒表面生長介孔二氧化硅殼層，形成介孔二氧化硅包裹的金納米棒；
[0016](5)在介孔二氧化硅殼層的孔道內裝載藥物分子，形成裝載了藥物分子的介孔二氧化硅包裹的金納米棒；
[0017](6)在裝載了藥物分子的介孔二氧化硅包裹的金納米棒表面吸附對端粒酶敏感的單鏈DNA,得到端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子。
[0018]優(yōu)選的，所述步驟(1)中，使用種子生長方法制備金納米棒；
[0019]優(yōu)選的，所述步驟(2)中，拉曼分子通過化學鍵吸附到金納米棒的表面，此種方式修飾的拉曼分子具有較大的拉曼散射截面；
[0020]優(yōu)選的，所述步驟(3)中，采用改進的Stdbcr法包裹一薄層實心二氧化硅殼層；
[0021]優(yōu)選的，所述步驟(4)中，以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為軟模板生長介孔二
氧化娃殼層；
[0022]優(yōu)選的，所述步驟(5)中，藥物分子通過物理擴散或者吸附的方式裝載在孔道內；
[0023]優(yōu)選的，所述步驟(6 )中，單鏈DNA通過靜電力作用吸附在介孔二氧化硅殼層外表面，并將孔道密封住；所述單鏈DNA序列為(5’ -(CCCTAA)6AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)。
[0024]有益效果:本發(fā)明提供的端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子及其制備方法，相對于現有技術，具有如下優(yōu)點:
[0025]1、將藥物分子裝載在介孔二氧化硅殼層的孔道中，并用單鏈DNA密封住孔道，能有效地避免藥物提前泄露；
[0026]2、利用對端粒酶敏感的單鏈DNA密封介孔二氧化硅殼層的孔道，使納米藥物載體粒子具有端粒酶敏感性，能特異性地在高表達端粒酶的腫瘤細胞中釋放出藥物分子，而在低表達端粒酶的正常細胞中不釋放藥物分子 ，有效降低對正常組織細胞的毒副作用，提高癌癥治療的藥效；
[0027]3、納米藥物載體粒子利用SERS信號進行示蹤，比傳統(tǒng)熒光示蹤更精確?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明的納米藥物載體粒子的結構示意圖；
[0029]圖2為以4-巰基苯甲酸(4MBA)分子為拉曼分子的納米藥物載體粒子的SERS光譜，激發(fā)波長為633nm ；
[0030]圖3為以端粒酶觸發(fā)納米藥物載體粒子釋放藥物的熒光光譜。
【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0032]如圖1所示為一種端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子，其特征在于:具有四層核殼結構:內核為拉曼分子標記的金納米棒1，在拉曼分子標記的金納米棒I外包裹一薄層實心二氧化娃殼層2,在二氧化娃殼層2外包裹一層介孔二氧化娃殼層3,在介孔二氧化硅殼層3外包裹一層對端粒酶敏感的單鏈DNA4 ;所述介孔二氧化硅殼層3的孔道3-1中裝載有藥物分子3-2。
[0033]其中，所述藥物分子3-2通過物理擴散或者吸附的方式裝載在孔道3-1內；所述單鏈DNA4通過靜電力作用吸附在介孔二氧化硅殼層3外表面，并將孔道3-1密封?。凰鰡捂淒NA4具體為(5 ’ - (CCCTAA) 6AATCCGTCGAGCAGAGTT_3 ’)，即其5 ’端含有六個與端粒重復序列互補的(5’ -CCCTAA-3’ )序列，3’端為端粒酶底物序列(5’ -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’ )。
[0034]納米藥物載體粒子進入細胞前，單鏈DNA4密封介孔二氧化硅殼層3的孔道3_1，從而將藥物分子3-2保留在納米藥物載體粒子內，避免藥物分子3-2提前泄露；納米藥物載體粒子進入腫瘤細胞后`，在腫瘤細胞內端粒酶的作用下，單鏈DNA4的3’端延伸出若干個端粒重復序列(5’ -TTAGGG-3’ )并與5’端的端?；パa序列雜交，使單鏈DNA4折疊成發(fā)卡狀(hairpin)結構并從介孔二氧化硅殼層3表面脫落，介孔二氧化硅殼層3的孔道3_1被打開從而釋放出藥物分子。
[0035]下面以4-巰基苯甲酸(4MBA)分子為拉曼分子、以多柔比星(DOX)為藥物分子制備上述結構的納米藥物載體粒子，具體制備方法如下(注:下述步驟中的單位M為物質的量濃度單位，lM=lmol/L):
[0036](I)制備金納米棒:
[0037]首先制備金種子，在室溫下將2.5mL、0.2M的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液與1.5mL、1.0mM的四氯金酸溶液混合，劇烈攪拌并加入0.6mL、0.01M的冰鎮(zhèn)硼氫化鈉溶液，2分鐘后停止攪拌即得棕黃色的種子溶液，作為A溶液。
[0038]然后配制生長溶液，在室溫下向50mL、0.2M的CTAB溶液中依次加入如下試劑并緩慢攪拌均勻:2~4mL、4mM的硝酸銀溶液，5mL、15mM的四氯金酸溶液，45mL的去離子水；隨后加入1.5mL~3mL、0.08M抗壞血酸至溶液變?yōu)闊o色；最后加入ImL的A溶液，靜置10~20min即得含有金納米棒的溶液,作為B溶液；所得金納米棒尺寸約15nmX45nm。
[0039](2)在金納米棒表面修飾4MBA分子:
[0040]取5mL的B溶液以10000rpm、30min離心一次去除過量的反應物，將離心沉淀分散至5mL的去離子水中，再加入10~50 μ LUOmM的4ΜΒΑ溶液(溶劑為乙醇)，劇烈攪拌12h以上即得標記了 4MBA的金納米棒，作為C溶液。[0041](3)在拉曼分子標記的金納米棒表面包裹一薄層實心二氧化硅殼層:
[0042]采用改進的St6ber法包裹，具體為C溶液中加入I~2mL、25mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量8000)水溶液，緩慢攪拌12h以上，之后以8000rpm、30min離心一次去除過量的反應物，將離心沉淀分散至5mL的無水乙醇中，再加入300~500μ L、25%的氨水，15~30 μ L的正硅酸四乙酯(TEOS)并攪拌6h以上，離心清洗并收集反應液中的納米粒子即得二氧化硅包裹的金納米棒；最后再將二氧化硅包裹的金納米棒分散在1.875mL去離子水中，作為D溶液。
[0043](4)在二氧化硅包裹的金納米棒表面生長介孔二氧化硅殼層:
[0044]二氧化硅包裹的金納米棒表面以CTAB為軟模版，包裹介孔二氧化硅殼層，具體為將全部的D溶液加入到3.125mL的含有30~50mg CTAB的酒精溶液中，攪拌30~40min后加入30~60yL、25%的氨水，6~8yL TEOS并攪拌6h以上；離心并用酒精反復清洗以收集反應液中的納米粒子，即得介孔二氧化硅包裹的金納米棒；最后將介孔二氧化硅包裹的金納米棒分散在2mL去離子水中，作為E溶液。
[0045](5)在介孔二氧化硅殼層的孔道內裝載藥物分子:
[0046]將全部的E溶液加入到100~400 μ L、10mg/mL的DOX水溶液，攪拌48h以上；過量的DOX通過離心去除，即獲得裝載了藥物的納米藥物載體粒子；最后將裝載了藥物的納米藥物載體粒子分散至2mL去離子水中，作為F溶液。
[0047](6)在裝載了藥物分子的介孔二氧化硅包裹的金納米棒表面吸附對端粒酶敏感的單鏈DNA:
[0048]將全部的F溶液中加入800~1200 μ L、10 μ M單鏈DNA溶液(溶劑為PBS緩沖液)，搖晃混合均勻后靜置2h以上；過量的單鏈DNA通過離心去除，得到的最終產物即端粒酶敏感的納米藥物載體粒子。
[0049]下面結合實施例對上述方法制備的納米藥物載體粒子進行相關實驗，對本發(fā)明作出進一步說明。
[0050]實施例1
[0051]將步驟(6)得到的最終產物分散至2mL的TRAP緩沖液中(20mMTris-HCl, ρΗ8.3，1.5mM MgCl2, 63mM KCl, 0.005%Tween20, ImM EGTA, 0.lmg/mL BSA) 4°C保存待用，作為G溶液。
[0052]以人子宮頸癌細胞(HeLa)為腫瘤細胞模型，從HeLa細胞中提取出端粒酶，并以該端粒酶觸發(fā)納米藥物載體粒子進行藥物釋放。
[0053]利用CHAPS法提取細胞中的端粒酶:1 X 1O6個對數生長期的HeLa細胞用冰PBS緩沖液離心清洗2次后分散至100 μ L的RNA酶抑制劑處理過的冰鎮(zhèn)CHAPS裂解液中(IOmMTris-HCl, ρΗ7.5，1mM MgCl2, ImM EGTA,0.1mM PMSF，5mMP -巰基乙醇，0.5%CHAPS, 10% 甘油)，冰上孵育30min后，將裂解液以12000rpm、20min離心，取出上清即得端粒酶提取物，端粒酶提取物于_75°C保存待用，作為H溶液。 [0054]取兩份100 μ L的G溶液，一份加入1~2 μ L RNase抑制劑、5~15 μ L dNTPs和10~20 μ LH溶液；一份只加入1~2 μ L RNase抑制劑和5~15 μ L dNTPs。搖晃混合均勻后將兩份混合溶液30°C靜置3h，隨后分別進行離心處理并收集離心的上清液，測試兩份上清液的熒光信號。[0055]該實施例中制備出的載體粒子的SERS光譜如圖2所示，其SERS信號強，容易對其進行SERS示蹤。圖3為獲得的兩份上清液的熒光光譜，可以看出:有端粒酶存在時，離心上清液中藥物DOX的熒光信號十分明顯；而沒有端粒酶時，上清液中幾乎沒有藥物的熒光信號。說明有端粒酶存在時，DOX被釋放出來了；沒有端粒酶時，DOX不能被釋放。因此，該納米藥物載體粒子能實現端粒酶觸發(fā)的藥物釋放。
[0056]實施例2
[0057]將步驟(6)得到的最終產物分散至2mL的去離子水中4°C保存待用，作為M溶液。
[0058]以人子宮頸癌細胞(HeLa)為腫瘤細胞模型，以人胚肺成纖維細胞(MRC-5)為正常細胞模型，觀察納米藥物載體粒子在HeLa和MRC-5中的釋藥行為；其中HeLa細胞高度表達端粒酶而MRC-5細胞無顯著端粒酶活性。
[0059]將HeLa細胞、MRC-5細胞分別接種在細胞培養(yǎng)皿中，分別加入M溶液(體積比載體粒子:細胞培養(yǎng)液=1: 10)，培養(yǎng)IOh后將培養(yǎng)液棄除，細胞用PBS緩沖液沖洗三次，分別測試兩種細胞中的熒光信號及SERS信號。熒光信號源自DOX分子，以488nm激發(fā)；SERS信號源自載體粒子，以633nm激發(fā)。
[0060]當DOX分子被裝載在介孔二氧化硅殼層的孔道中時，DOX分子產生自淬滅作用，熒光信號很弱。只有當DOX分子從介孔二氧化硅殼層中釋放出來時，其熒光信號才會恢復。利用這一特點，可以通過觀察細胞中的熒光強度，判斷DOX是否被釋放出來。
[0061]實驗中發(fā)現，在HeLa和MRC-5細胞中均測到了顯著的SERS信號，且強度幾乎相等。表明HeLa細胞和MRC-5細胞吞入的納米藥物載體粒子數量相當。但只在HeLa細胞中觀察到了 DOX的熒光信號，而MRC-5中無明顯的熒光信號。表明DOX在HeLa中被釋放，而在MRC-5中未被釋放。這一結果與兩株細胞的端粒酶表達水平相符合，即HeLa高表達端粒酶而MRC-5無顯著端粒酶活性。因此，該納米藥物載體粒子能在腫瘤細胞內特異性地進行端粒酶觸發(fā)的藥物釋放。
[0062]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出:對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子，其特征在于:具有四層核殼結構:內核為拉曼分子標記的金納米棒(I )，在拉曼分子標記的金納米棒(I)外包裹一層實心二氧化硅殼層(2)，在二氧化硅殼層(2)外包裹一層介孔二氧化硅殼層(3)，在介孔二氧化硅殼層(3)外包裹一層對端粒酶敏感的單鏈DNA (4);所述介孔二氧化硅殼層(3)的孔道(3-1)中裝載有藥物分子(3-2)。
2.根據權利要求1所述的端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子，其特征在于:所述藥物分子(3-2)通過物理擴散或者吸附的方式裝載在孔道(3-1)內。
3.根據權利要求1所述的端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子，其特征在于:所述單鏈DNA (4 )通過靜電力作用吸附在介孔二氧化硅殼層(3 )外表面，并將孔道(3-1)密封住。
4.根據權利要求1所述的端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子，其特征在于:所述單鏈 DNA (4)具體為 5’ -(CCCTAA)6AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’，即其5’端含有六個與端粒重復序列互補的5’-CCCTAA-3’序列，3’端為端粒酶底物序列5’ -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’。
5.一種端粒酶敏感的 、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)制備金納米棒； (2)在金納米棒表面修飾用于信號檢測的拉曼分子，形成拉曼分子標記的金納米棒(O; (3 )在拉曼分子標記的金納米棒(I)表面包裹一層實心二氧化硅殼層(2 )，形成二氧化硅包裹的金納米棒； (4 )在二氧化硅包裹的金納米棒表面生長介孔二氧化硅殼層(3 )，形成介孔二氧化硅包裹的金納米棒； (5)在介孔二氧化硅殼層(3)的孔道(3-1)內裝載藥物分子(3-2)，形成裝載了藥物分子的介孔二氧化硅包裹的金納米棒； (6)在裝載了藥物分子的介孔二氧化硅包裹的金納米棒表面吸附對端粒酶敏感的單鏈DNA (4),得到端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子。
6.根據權利要求5所述的端粒酶敏感的、SERS可示蹤的納米藥物載體粒子的制備方法，其特征在于: 所述步驟(1)中，使用種子生長方法制備金納米棒； 所述步驟(2)中，拉曼分子通過化學鍵吸附到金納米棒的表面； 所述步驟(3)中，采用改進的StSber法包裹一薄層實心二氧化硅殼層(2)； 所述步驟(4)中，以十六烷基三甲基溴化銨為軟模板生長介孔二氧化硅殼層(3)； 所述步驟(5)中，藥物分子(3-2)通過物理擴散或者吸附的方式裝載在孔道(3-1)內； 所述步驟(6)中，單鏈DNA (6)通過靜電力作用吸附在介孔二氧化硅殼層(3)外表面，并將孔道(3-1)密封??；所述單鏈 DNA (4)序列為 5’ -(CCCTAA)6AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’。
【文檔編號】A61P35/00GK103751110SQ201410012910
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權日:2014年1月13日
【發(fā)明者】宗慎飛, 王著元, 崔一平 申請人:東南大學