蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體及其制備方法，所述高分子通過連接到所述蛋白質(zhì)的引發(fā)劑而結(jié)合到所述蛋白質(zhì)上。所述引發(fā)劑可連接到所述蛋白質(zhì)的N-或C-端以及其它遠離蛋白質(zhì)活性位點和/或不影響蛋白質(zhì)活性的任何位置。這種方法制備的位點特異的干擾素-高分子結(jié)合體不僅較好地保留了體外生物活性，而且極大地改善了干擾素在體內(nèi)的半衰期、生物分布和抗腫瘤效果，從而為強效干擾素向臨床轉(zhuǎn)化打下堅實的技術基礎。此外，這種原位定點聚合法也可廣泛應用于其它的蛋白或小肽藥物來提高其藥理學特征。
【專利說明】蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 蛋白質(zhì)（例如抗體）已經(jīng)廣泛應用于生物醫(yī)藥顯影、靶向治療以及臨床診斷等多 個領域。單獨使用蛋白質(zhì)存在半衰期短、溶解性差等問題。將蛋白質(zhì)與高分子相連制備蛋 白質(zhì)-高分子結(jié)合體，可以有效的提高蛋白質(zhì)的溶解性、穩(wěn)定性、藥代動力學和治療功效并 降低其免疫原性。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的合成方法是將預先制備好的高分子與蛋 白質(zhì)相連，往往存在著偶聯(lián)位點不確定、效率低、產(chǎn)率差、產(chǎn)物難以分離、質(zhì)量控制差、活性 難以保持等諸多難題。因此，迫切需要設計一種通用的方法，以有效的解決上述難題。
[0003] 為解決上述問題，提出了一些蛋白修飾修飾方法，例如設計緩釋給藥系統(tǒng)，如制備 脂質(zhì)體和微球、白蛋白融合，基因突變引入對蛋白酶不敏感氨基酸等，但均存在一些問題。 脂質(zhì)體包封率低，突釋和釋放不完全產(chǎn)生不良反應，并且在制備過程強烈的物理、化學變化 導致的蛋白變性失活。此外，白蛋白融合需在真核體系中表達，產(chǎn)率低，成本高。引入特殊 氨基酸可能降低蛋白活性，并且無法解決腎臟的排空問題。
[0004] 干擾素 - a 2(IFN-a 2)是病毒復制和腫瘤細胞生長的強效抑制劑，已被成功用于 治療病毒性肝炎和癌癥等疾病。但是，IFN經(jīng)系統(tǒng)注射給藥后循環(huán)半衰期非常短，需要頻繁 給藥且在高濃度下才能達到預期的療效，從而導致一些毒副作用，同時給患者帶來沉重的 經(jīng)濟負擔。用聚乙二醇（PEG)修飾IFN，是改善其藥代動力學和提高其療效的有效措施，被 稱為長效干擾素。然而，目前的PEG化干擾素存在如反應產(chǎn)率低、結(jié)合位點和偶聯(lián)化學計量 難以控制、生物活性嚴重降低等弊端。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了提高蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體中蛋白質(zhì)與高分子偶聯(lián)的穩(wěn)定性和效率，促進 產(chǎn)物的分離、質(zhì)量的控制和蛋白質(zhì)活性的保持，本發(fā)明提供了一種制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié) 合體的方法，其中，所述高分子通過連接到所述蛋白質(zhì)的引發(fā)劑而結(jié)合到所述蛋白質(zhì)上，其 中，所述蛋白質(zhì)選自醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、科研以及其它工業(yè)領域相關的蛋白、小肽和抗體，優(yōu)選粒細 胞集落刺激因子、胰高血糖素樣肽-1及其類似物或水蛭素。
[0006] 所述高分子連接到所述蛋白質(zhì)的N-或C-端及其它任何遠離所述蛋白質(zhì)的活性 的位點和/或不干擾所述蛋白質(zhì)的活性的位點。例如，利用粒細胞集落刺激因子唯一不配 對半胱氨酸Cysl7與帶有馬來酰亞胺基團引發(fā)劑特異性反應，通過活性聚合原位生長高分 子。通過基因工程手段在胰高血糖素樣肽-1類似物C端引入半胱氨酸或非自然氨基酸與 引發(fā)劑特異性結(jié)合并生長高分子。
[0007] 根據(jù)一個實施方式，所述方法可包括：al)制備蛋白質(zhì)-引發(fā)劑的結(jié)合體；bl)所 述蛋白質(zhì)-引發(fā)劑結(jié)合體在緩沖液中與高分子單體混合，在催化劑作用下引發(fā)所述高分子 的單體聚合而制備出所述蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體。
[0008] 根據(jù)另一個實施方式，所述方法可包括：a2)所述引發(fā)劑在催化劑作用下引發(fā)所 述高分子單體的聚合，生成所述高分子；b2)所述高分子通過所述引發(fā)劑與所述蛋白偶聯(lián)， 制備所述蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體。
[0009] 根據(jù)一個實施方式，通過選自基因突變、引入非天然氨基酸、氧化還原、酶催化、正 交化學的化學或生物修飾方法在所述蛋白質(zhì)上引入的引發(fā)劑的結(jié)合位點。
[0010] 根據(jù)一個實施方式，所述高分子由單體通過聚合反應生成，所述聚合反應可選 自原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應（ATRP)、可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合（RAFT)、開環(huán)異位聚合 (ROMP)、開環(huán)加成聚合以及它們的組合。
[0011] 根據(jù)一個實施方式，引發(fā)所述原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應的催化劑選自銅離子、二 聯(lián)吡啶及其衍生物配體、η受體衍生物配體、氮原子螯合配體以及脂肪多胺類配體。引發(fā)所 述可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合反應的催化劑選自4,4'-偶氮（4-氰基戊酸）、2,2'-偶 氮[2_(2_咪唑啉_2_基）丙燒]二鹽酸鹽、2, 2'-偶氮[2_(2_咪唑啉_2_yl)丙燒]-無 水焦硫酸鹽、2,2'-偶氮（2-乙基丙脒）二鹽酸鹽的水溶性的自由基引發(fā)劑。引發(fā)所述開 環(huán)異位聚合的催化劑選自水溶性的Grubbs催化劑。
[0012] 根據(jù)一個實施方式，所述聚合反應可在低氧或者惰性氣體氛圍下進行。所述聚 合反應的反應時間可為5分鐘至24小時，具體地，5、15、30、45、60分鐘，或1、2、3、4、5、6、 8、10、12、16、24小時等。所述聚合反應的反應溫度可為0?80°C，具體地0、4、10、15、20、 25、30、35、40、50、60、70、80°〇等。根據(jù)一個實施方式，所述引發(fā)劑選自原子轉(zhuǎn)移自由基聚 合反應的引發(fā)劑、可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的引發(fā)劑、開環(huán)異位聚合的引發(fā)劑和開環(huán)加 成聚合的引發(fā)劑。所述原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應的引發(fā)劑可為2-(2-(2-(3,4_二溴代馬 來酰亞胺-N-乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙基2-溴代-2-甲基丙酸酯。所述原子轉(zhuǎn)移自 由基聚合反應的引發(fā)劑可含有選自N-(2-氨乙基）-2-溴代-2-甲基丙酰胺、N-(2-氨乙 基）_2_氯代-2-甲基丙酰胺、2-溴代-N-(2_(2-肼基乙酰氨基）乙基）_2_甲基丙酰胺、 2_氯代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基）乙基）-2-甲基丙酰胺的官能團；所述可逆加成-斷裂 鏈轉(zhuǎn)移聚合的引發(fā)劑可含有官能團ZC( = S)SR，其中R基團可以是半胱氨酸、肼、羥胺，Z基 團選自苯基、烷基、酞酰亞氨甲基；所述開環(huán)異位聚合的引發(fā)劑可含有A-B型官能團，其中A 為半胱氨酸、肼、羥胺，B為烯烴。
[0013] 根據(jù)一個實施方式，所述高分子由單體通過聚合反應生成，所述單體可選自乳酸、 表氯醇、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、降冰片烯以及氧雜降冰片烯中 的至少一種。
[0014] 所述單體具有化學式1至4的任一個表示的結(jié)構(gòu)：
[0015]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述高分子通過連接到所述蛋白質(zhì) 的引發(fā)劑而結(jié)合到所述蛋白質(zhì)上，其中，所述高分子連接到所述蛋白質(zhì)的N-或C-端及其它 任何遠離所述蛋白質(zhì)的活性的位點和/或不干擾所述蛋白質(zhì)的活性的位點，所述蛋白質(zhì)選 自醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、科研以及其它工業(yè)領域相關的蛋白、小肽和抗體，優(yōu)選粒細胞集落刺激因子、 胰高血糖素樣肽-1及其類似物或水蛭素。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體方法，其中，所述蛋白質(zhì)為干擾素， 所述干擾素選自干擾素 α、干擾素 β、干擾素 Y、干擾素 λ。
3. 如權(quán)利要求2所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述引發(fā)劑連接到所 述干擾素的C-端。
4. 如權(quán)利要求1至3的任一項所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，所述方法包 括： al)制備蛋白質(zhì)-引發(fā)劑的結(jié)合體； bl)所述蛋白質(zhì)-引發(fā)劑結(jié)合體在緩沖液中與高分子單體混合，在催化劑作用下引發(fā) 所述高分子單體的聚合而制備出所述蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體。
5. 如權(quán)利要求1至3的任一項所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，所述方法包 括： a2)所述引發(fā)劑在催化劑作用下引發(fā)所述高分子的單體聚合，生成所述高分子； b2)所述高分子通過所述引發(fā)劑與所述蛋白偶聯(lián)，制備所述蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體。
6. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述引發(fā)劑的結(jié)合位 點通過選自基因突變、引入非天然氨基酸、氧化還原、酶催化、正交化學的化學或生物修飾 方法在所述蛋白質(zhì)上引入。
7. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述高分子由單體通 過聚合反應生成，所述聚合反應選自原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應、可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚 合、開環(huán)異位聚合、開環(huán)加成聚合中的一種。
8. 如權(quán)利要求7所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，引發(fā)所述原子轉(zhuǎn)移自 由基聚合反應的催化劑選自銅離子、二聯(lián)吡啶及其衍生物配體、η受體衍生物配體、氮原子 螯合配體以及脂肪多胺類配體。
9. 如權(quán)利要求7所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，引發(fā)所述可逆加 成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合反應的催化劑選自水溶性的自由基引發(fā)劑，優(yōu)選地，所述水溶性的自 由基引發(fā)劑選自4,4'-偶氮（4-氰基戊酸）、2,2'-偶氮[2_(2_咪唑啉-2-基）丙燒] 二鹽酸鹽、2, 2'-偶氣[2_(2_咪唑琳_2_基）丙燒]-無水焦硫酸鹽、2, 2'-偶氣（2_乙 基丙脒）二鹽酸鹽的至少一種。
10. 如權(quán)利要求7所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，引發(fā)所述開環(huán)異位 聚合的催化劑選自水溶性的Grubbs催化劑。
11. 如權(quán)利要求7所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述聚合反應在低 氧或者惰性氣體氛圍下進行，反應時間是5分鐘至24小時，反應溫度是0?80°C。
12. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述引發(fā)劑選自原 子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應的引發(fā)劑、可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的引發(fā)劑、開環(huán)異位聚合的 引發(fā)劑和開環(huán)加成聚合的引發(fā)劑。
13. 如權(quán)利要求12所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述原子轉(zhuǎn)移自由 基聚合反應的引發(fā)劑為2-(2-(2-(3,4-二溴代馬來酰亞胺-N-乙氧基）乙氧基）乙氧基） 乙基2-溴代-2-甲基丙酸酯。
14. 如權(quán)利要求12所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述原子轉(zhuǎn)移 自由基聚合反應的引發(fā)劑含有選自N-(2-氨乙基）-2-溴代-2-甲基丙酰胺、N-(2-氨乙 基）_2_氯代-2-甲基丙酰胺、2-溴代-N-(2_(2-肼基乙酰氨基）乙基）_2_甲基丙酰胺、 2_氯代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基）乙基）-2-甲基丙酰胺的官能團；所述可逆加成-斷裂 鏈轉(zhuǎn)移聚合反應的引發(fā)劑含有ZC( = S)SR官能團，其中R基團可以是半胱氨酸、肼、羥胺， Z基團選自苯基、烷基、酞酰亞氨甲基；所述開環(huán)異位聚合的引發(fā)劑含有A-B型官能團，其中 A選自半胱氨酸、肼或羥胺，B為烯烴。
15. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述高分子由單體 通過聚合反應生成，所述單體選自乳酸、表氯醇、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基 丙烯酰胺、降冰片烯以及氧雜降冰片烯中的至少一種。
16. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述高分子由單體通過 聚合反應生成，所述單體具有化學式1至4的任一個表示的結(jié)構(gòu)：
其中，化學式1?4中的R基團選自烷基、苯基、芐基、羧甜菜堿基、磺酸甜菜堿基、 寡聚乙二醇、聚乙二醇、

優(yōu)選地，所述燒基選自甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丁基。
17. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述蛋白質(zhì)-高分 子結(jié)合體中的高分子包含均聚物、多雜聚合物、嵌段聚合物、共聚物、三元共聚物。
18. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述高分子由單體 通過聚合反應生成，所述單體包括兩種反應基團，所述兩種反應基團彼此反應形成高分子。
19. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述高分子由單體通過 聚合反應生成，所述單體進一步包括一個或多個在發(fā)生聚合反應時嵌入到所述高分子的骨 架中的反應基團。
20. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述高分子由單體 通過聚合反應生成，所述單體為水溶性或生物可降解的聚合物單體。
21. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述高分子的側(cè)鏈 包括內(nèi)銨鹽側(cè)鏈、羧基內(nèi)銨鹽側(cè)鏈、砜基內(nèi)銨鹽側(cè)鏈、寡聚乙二醇側(cè)鏈、聚乙二醇側(cè)鏈。
22. 如權(quán)利要求1所述的制備位點特異的蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的方法，其中，所述高 分子選自POEGMA或PMPC。
23. -種蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體，所述蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體通過權(quán)利要求1至22的 任一項所述的方法制備。
【文檔編號】C07K14/555GK104231069SQ201410478802
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】高衛(wèi)平, 胡瑾, 王貴林 申請人:清華大學