專(zhuān)利名稱(chēng)：雙光子吸收二吡咯亞甲基二氟化硼染料及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及二吡咯亞甲基二氟化硼染料和這些染料在雙光子激發(fā)下的應(yīng)用。另外本發(fā)明涉及二吡咯亞甲基二氟化硼染料和其軛合物在基于雙光子激發(fā)的生物分析中的應(yīng)用。
本發(fā)明的背景本文所用的說(shuō)明本發(fā)明的背景的出版物和其它材料，和尤其是，用于提供關(guān)于實(shí)踐的補(bǔ)充細(xì)節(jié)的事例在此作為參考并入。
二吡咯亞甲基二氟化硼染料二吡咯亞甲基二氟化硼染料已首次由Treibs和Kreuzer在Liebigs Ann.Chem.718(1968)208和由Wories H.J.等人在Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 104(1985)288中描述。自此二吡咯亞甲基二氟化硼染料已找到各種用途。二吡咯亞甲基二氟化硼染料在光譜的可見(jiàn)區(qū)域具有強(qiáng)熒光。二吡咯亞甲基二氟化硼染料具有以下的綜合性能高量子效率，尖銳的吸收和發(fā)射帶和高吸收系數(shù)。各種各樣的二吡咯亞甲基二氟化硼染料目前是市售的(Haugland R.P.，熒光探頭和研究化學(xué)品手冊(cè)，第六版，分子探頭，Eugene，OR，1996)。這些染料的不同衍生物的合成和熒光性能已在出版物和專(zhuān)利中描述。
US 4,916,711，US 5,189,029，US 5,446,157和EP 0 361936(Morgan和Boyer)描述了二吡咯亞甲基二氟化硼染料在光致熒光的治療(PDT)中和在產(chǎn)生激光時(shí)的應(yīng)用。根據(jù)Morgan和Boyer的描述，二吡咯亞甲基二氟化硼染料具有低三線態(tài)-三線態(tài)吸收以及低激光作用閾值，能夠產(chǎn)生強(qiáng)度高于使用常規(guī)激光染料時(shí)的激光束。另外這些染料的高光穩(wěn)定性導(dǎo)致染料材料減少降解。
熒光染料廣泛用作示蹤劑，通過(guò)熒光顯微鏡檢查用于生物結(jié)構(gòu)的定域，通過(guò)熒光免疫分析用于分析物的定量，用于細(xì)胞的流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析和用于許多其它場(chǎng)合。
通常這些熒光染料通過(guò)共價(jià)鍵連接到生物分子上。為了該連接(標(biāo)記)，這些染料需要一種官能團(tuán)，它可與生物分子中的另一官能團(tuán)反應(yīng)。常用的反應(yīng)性官能團(tuán)包括反應(yīng)性羧酸酯，酸酐，肼和異硫氰酸鹽。US 4,774,339描述了二吡咯亞甲基二氟化硼染料作為熒光標(biāo)簽的用途。根據(jù)US 4,774,339，二吡咯亞甲基二氟化硼染料的熒光性能對(duì)溶劑或pH不敏感。這些染料還具有窄的吸收和發(fā)射帶寬度，高量子產(chǎn)率和高光穩(wěn)定性。
二吡咯亞甲基二氟化硼染料的基本發(fā)色團(tuán)(I)具有吸收和發(fā)射最大值約500nm。
二吡咯亞甲基二氟化硼染料的基本發(fā)色團(tuán)二吡咯亞甲基二氟化硼染料的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)通?？赏ㄟ^(guò)改變發(fā)色團(tuán)的取代基而改變。π-電子共軛的延長(zhǎng)導(dǎo)致發(fā)射和吸收帶移向較長(zhǎng)的波長(zhǎng)。π-電子共軛的延長(zhǎng)也影響光穩(wěn)定性，溶解度和熒光量子產(chǎn)率。US 5,274,113，US 5,451,663和WO 93/09185描述了具有吸收最大值525nm-650nm的二吡咯亞甲基二氟化硼標(biāo)記試劑。吸收和發(fā)射波長(zhǎng)的這種位移已通過(guò)將不飽和有機(jī)基團(tuán)加入發(fā)色團(tuán)而實(shí)現(xiàn)。這些專(zhuān)利描述了芳基，雜芳基和鏈烯基取代基用于延長(zhǎng)π-電子共軛路徑的用途。
US 5,248,782描述雜芳基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料和US 5,187,288描述具有吸收最大值550nm-670nm的乙烯基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。吸收和發(fā)射波長(zhǎng)的位移在大多數(shù)情況下伴隨增加吸收系數(shù)和光穩(wěn)定性。π-電子共軛路徑的延長(zhǎng)另外由Chen J.等人描述于J.Org.Chem.，65(2000)2900。Chen J.等人描述了具有吸收最大值620-660nm和熒光發(fā)射630-680nm的芳基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。US 5,433,896描述了包含稠合芳基取代基的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。這些二苯并吡咯亞甲基二氟化硼染料具有吸收和發(fā)射最大值600nm-740nm。這些染料的摩爾吸收系數(shù)最通常超過(guò)100 000cm-1M-1。
Wories H.J.等人在Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 104(1985)28中描述了一種用于將磺酸基團(tuán)引入二吡咯亞甲基二氟化硼染料和因此增加這些染料的親水性的方法。他們報(bào)道了具有吸收最大值495nm-491nm，和發(fā)射最大值515-510nm的單-和二磺化二吡咯亞甲基二氟化硼染料。
二吡咯亞甲基二氟化硼染料已作為熒光標(biāo)簽用于各種場(chǎng)合。這些染料的合成和多用途已在以上提及的出版物和專(zhuān)利中報(bào)道。但這些染料大多數(shù)具有固有憎水性，這限制了它們用于生物分子的熒光標(biāo)記。對(duì)于包含芳基取代基的二吡咯亞甲基二氟化硼染料，情況尤其如此。
二吡咯亞甲基二氟化硼染料不僅可用作熒光標(biāo)記，而且可用作激光染料和在光致熒光的治療中用作探頭用于治療瘤。這些染料還可用于微顆粒的染色(US 5,723,218)和用作光學(xué)記錄介質(zhì)(US6,060,606)。
雙光子激發(fā)在1931年，Maria Gppert-Mayer(Ann.Phys.9(1931)273)推斷，分子可同時(shí)吸收兩個(gè)光子。該現(xiàn)象長(zhǎng)期保持沒(méi)有實(shí)際用途，直至可得到強(qiáng)激光源。雙光子激發(fā)這樣產(chǎn)生通過(guò)聚焦強(qiáng)光源，單位量和單位時(shí)間的光子的密度變得足夠高使得雙光子同時(shí)被吸收到同一的發(fā)色團(tuán)中。吸收的能量是雙光子的能量的總和。雙光子激發(fā)的可能性取決于光子密度的二次冪。雙光子的吸收因此是一個(gè)二級(jí)的非線性過(guò)程。一個(gè)發(fā)色團(tuán)對(duì)兩個(gè)光子的同時(shí)吸收得到處于激發(fā)態(tài)的發(fā)色團(tuán)。該激發(fā)態(tài)可通過(guò)發(fā)射能量高于照射激光光子的光子而松弛。在本文中包括雙光子激發(fā)和隨后輻射松弛的過(guò)程稱(chēng)作雙光子熒光。雙光子熒光具有通常類(lèi)似于同一發(fā)色團(tuán)的單光子激發(fā)熒光的光譜性能(Xu C.和WebbW.W.，J.Opt.Soc.Am.B，13(1996)481)。可用兩個(gè)同時(shí)吸收的光子激發(fā)和激發(fā)態(tài)松弛伴隨熒光發(fā)射的分子在本文中稱(chēng)作雙光子熒光染料。
雙光子激發(fā)的一個(gè)主要特征在于，激發(fā)僅在焦點(diǎn)的明顯受限的3維(3D)附近進(jìn)行。該特點(diǎn)來(lái)自所產(chǎn)生的熒光發(fā)射的高3D空間定域。由于激發(fā)的非線性性質(zhì)，在樣品周?chē)驮诠鈱W(xué)元件中在焦點(diǎn)之外產(chǎn)生最小的本底熒光。雙光子激發(fā)的另一主要特征在于，照射和發(fā)射在基本上不同的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行。該性能導(dǎo)致泄露到檢測(cè)通道中的散射的照射光可容易通過(guò)使用低通濾波器而減弱(減弱至少10個(gè)數(shù)量級(jí))。因?yàn)榧ぐl(fā)量非常小，雙光子激發(fā)最適用于觀察小樣品量和結(jié)構(gòu)。
雙光子激發(fā)的固有性能(低本底和小激發(fā)量)表明，雙光子激發(fā)最適用于需要由少量物質(zhì)進(jìn)行熒光檢測(cè)的場(chǎng)合。實(shí)際上雙光子激發(fā)量是幾個(gè)毫微微升的量或甚至更低，取決于體系的光學(xué)參數(shù)。在這種小激發(fā)量下，僅少數(shù)熒光分子在任何給定時(shí)間點(diǎn)上存在。涉及雙光子激發(fā)技術(shù)的固有特點(diǎn)之一是熒光團(tuán)的低吸收橫截面。另一特點(diǎn)是，雙光子激發(fā)通常進(jìn)行使用脈沖激光進(jìn)行，使用常規(guī)激光的脈沖間的時(shí)間長(zhǎng)于熒光團(tuán)的壽命時(shí)間，導(dǎo)致降低的激發(fā)速率。這些特點(diǎn)以及小激發(fā)量導(dǎo)致較低的信號(hào)水平。另一問(wèn)題涉及可造成意外作用的強(qiáng)照射強(qiáng)度。這些作用可分成兩種不同的類(lèi)型累計(jì)多脈沖作用(能量的積聚)和單脈沖作用(二級(jí)或更高級(jí)的直接非線性吸收)。累計(jì)多脈沖作用在使用具有高重復(fù)率的脈沖激光(具有重復(fù)率約100MHz數(shù)量級(jí)的亞微微秒脈沖激光)時(shí)尤其相關(guān)。在這種高重復(fù)率下，能量有可能集聚成染料分子的長(zhǎng)壽命三線態(tài)。三線態(tài)通常是非輻射的和因此能量至這些狀態(tài)的集聚降低了雙光子熒光產(chǎn)率。雙光子激發(fā)效率(Ex2ph)與激光的峰功率(Pp)和脈沖持續(xù)時(shí)間(τ脈沖)成比例(Ex2ph∝Pp2*τ脈沖)。據(jù)此，使用具有高峰功率的脈沖激光和中等重復(fù)率(具有kHz重復(fù)率的微微秒至納秒脈沖激光)導(dǎo)致高雙光子激發(fā)效率。高雙光子激發(fā)效率在本文中是指，幾乎所有的染料分子在激光束的焦點(diǎn)被單個(gè)激光脈沖激發(fā)。

圖1表示相對(duì)于照射強(qiáng)度染料分子的雙光子激發(fā)。在理想情況下，發(fā)射對(duì)照射強(qiáng)度的曲線與雙光子激發(fā)對(duì)照射強(qiáng)度的曲線重合。通常當(dāng)照射強(qiáng)度明顯低于達(dá)到飽和水平所需的強(qiáng)度時(shí)情況如此(A，圖1)和雙光子激發(fā)熒光因此遵循照射強(qiáng)度的二次依賴性。在飽和水平(C，圖1)或飽和水平附近(B，圖1)(在使用高雙光子激發(fā)效率激光以使雙光子激發(fā)熒光最大化時(shí))，單脈沖作用變得尤其相關(guān)。在這種情況下，激發(fā)態(tài)吸收和激勵(lì)發(fā)射可降低雙光子熒光產(chǎn)率和造成偏離發(fā)射相對(duì)于照射強(qiáng)度的二次依賴性。根據(jù)樣品，這些作用的出現(xiàn)可限制最大可用照射強(qiáng)度。
Ehrlich J.E.等人Opt.Lett.22(1997)1843，Baur J.W.等人，Chem.Mater.11(1999)2899和Kim O.-K.等人Chem.Mater.12(2000)284報(bào)道，雙光子吸收系數(shù)可隨著測(cè)量條件如激光束的強(qiáng)度水平和脈沖持續(xù)時(shí)間而明顯變化。已經(jīng)指出，如果非常強(qiáng)激光照射用于測(cè)量雙光子吸收橫截面或雙光子熒光產(chǎn)率，一些線性過(guò)程可發(fā)揮作用。這些現(xiàn)象如激發(fā)態(tài)吸收已被認(rèn)為是一些熒光團(tuán)在雙光子激發(fā)下猝滅的一個(gè)原因(Fischer A.等人，Appl.Opt.34(1995)1989)。
Xu C.和Webb W.W.，J.Opt.Soc.Am.B，13(1996)481報(bào)道了各種熒光染料的雙光子吸收橫截面，包括Wories H.J.等人，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 104(1985)288所述的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。Xu和Webb研究的這種二吡咯亞甲基二氟化硼染料具有在495nm處的單光子最大吸收和在515nm處的最大發(fā)射。雙光子激發(fā)光譜記錄在690和1050nm之間。在該研究中，光源是具有標(biāo)稱(chēng)脈沖長(zhǎng)度80毫微微秒的Ti藍(lán)寶石激光器。根據(jù)Xu和Webb，二吡咯亞甲基二氟化硼染料的雙光子吸收橫截面大約比若丹明B低一個(gè)數(shù)量級(jí)。Xu和Webb沒(méi)有報(bào)道對(duì)若丹明B在高強(qiáng)度激光照射下的猝滅的任何觀察或發(fā)射相對(duì)于照射強(qiáng)度的二次依賴性的任何偏差。但若丹明B的猝滅較早由Fischer A.等人報(bào)道于Appl.Opt.34(1995)1989。根據(jù)Fischer等人，雙光子激發(fā)中的猝滅作用導(dǎo)致雙光子顯微鏡檢查中的較差的三維分辨率。
雙光子激發(fā)熒光的生物分析應(yīng)用熒光已在生物分析領(lǐng)域中找到各種用途。使用熒光作為檢測(cè)方法的免疫分析，DNA-雜化分析和受體結(jié)合分析之類(lèi)的應(yīng)用已在前30年中被介紹。這些分析在確定樣品中的分析物量時(shí)利用特定生物親和性反應(yīng)。分析物的量可通過(guò)監(jiān)控取決于結(jié)合分析物的量的熒光信號(hào)而確定。這些分析也可基于通過(guò)特定結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)熒光性能的變化。熒光性能的這種變化可以是熒光強(qiáng)度的變化，發(fā)射波長(zhǎng)的變化，衰變時(shí)間的變化或熒光偏振的變化。
免疫分析已廣泛用于臨床診斷以確定某些疾病或生理狀態(tài)。免疫分析可分成兩種不同類(lèi)型的分析，競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)分析。在競(jìng)爭(zhēng)方法中，標(biāo)記抗原(第二生物特異試劑)與分析物競(jìng)爭(zhēng)地結(jié)合到有限量的抗體(第一生物特異試劑)上。分析物的濃度可由連接到抗體上的標(biāo)記抗原的比例或由標(biāo)記抗原的游離級(jí)分的比例而確定。在非競(jìng)爭(zhēng)方法(免疫測(cè)量方法)中，分析物連接到過(guò)量的結(jié)合抗體(第一生物特異試劑)上。過(guò)量的標(biāo)記抗體(第二生物特異試劑)結(jié)合到分析物的另一位置上。分析物的量可根據(jù)結(jié)合到分析物上的標(biāo)記抗體的分?jǐn)?shù)而確定。該分析方法也可分成多相和均相(無(wú)分離)方法。結(jié)合和游離級(jí)分的分離在多相分析中是必需的但在均相分析中不是[Miyai K.，免疫分析的原理和實(shí)踐，(編者Price C.P.和Newman D.J.)Stockton Press，NewYork 1991，246和Hemmil I.A.，熒光在免疫分析中的應(yīng)用，(編者Winefordner J.D.)John Wiley & Sons，New York 1991]。
相關(guān)于雙光子激發(fā)的分析應(yīng)用的早期報(bào)道之一由Sepaniak等人公開(kāi)于Anal.Chem.，49(1977)1554.他們討論了使用雙光子熒光激發(fā)用于HPLC檢測(cè)的可能性。該體系表現(xiàn)出低本底和簡(jiǎn)便性。
雙光子熒光激發(fā)在激光掃描顯微鏡檢查中的實(shí)用性首次由Denk等人在科學(xué)，248(1990)73中證實(shí)。他們使用一種模式固定的染料激光器提供重復(fù)率80MHz的毫微微脈沖流。Ti藍(lán)寶石激光器的出現(xiàn)便于在標(biāo)準(zhǔn)激光掃描熒光顯微鏡中實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)。雙光子熒光激發(fā)已在過(guò)去的十年中得到深入討論。已出版許多涉及雙光子激發(fā)熒光-成像技術(shù)的研究論文。這種發(fā)展還帶來(lái)了雙光子激光掃描顯微鏡體系的工業(yè)生產(chǎn)。
Lakowicz等人，J Biomolec.Screening 4(1999)355已經(jīng)表明，結(jié)合到DNA上的DAPI(4，6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚)和鈣-依賴性熒光團(tuán)的時(shí)間依賴性強(qiáng)度衰變可用雙光子熒光激發(fā)測(cè)定。Lakowicz等人報(bào)道了多光子激發(fā)在高產(chǎn)量篩分場(chǎng)合中的應(yīng)用。他們已經(jīng)表明，熒光素的雙光子誘導(dǎo)熒光能夠可靠地在高密度多穴板中測(cè)定。
描述于文獻(xiàn)的雙光子激發(fā)熒光的大多數(shù)生物分析應(yīng)用涉及雙光子成像顯微鏡檢查(Denk W.等人US 5,034,613，Denk W.等人，科學(xué)248(1990)73。雙光子熒光激發(fā)在激光掃描顯微鏡檢查中的應(yīng)用提供固有3D空間分辨率而沒(méi)有使用在共焦顯微鏡檢查中必需的針孔。利用一種簡(jiǎn)單的光學(xué)設(shè)計(jì)，雙光子激發(fā)顯微鏡檢查提供與普通單光子激發(fā)共焦顯微鏡檢查相當(dāng)?shù)?D空間分辨率。雙光子激發(fā)技術(shù)的缺點(diǎn)是需要能夠產(chǎn)生具有高重復(fù)頻率的強(qiáng)超短脈沖的昂貴的激光器。
費(fèi)用較少的激光技術(shù)的最新發(fā)展對(duì)于雙光子熒光激發(fā)技術(shù)在常規(guī)生物分析場(chǎng)合中的應(yīng)用是非常令人鼓舞的(Hnninen P.等人，Nat.Biotechnol.18(2000)548；Soini J.T.等人Single Mol.1(2000)203；WO 98/25143和WO 99/63344)。根據(jù)WO 98/25143和WO99/63344，替代昂貴的模式固定激光器，無(wú)源Q-切換二極管-泵激微芯片激光器可用于雙光子激發(fā)。這些激光器是整體的，小的，簡(jiǎn)單的和低成本的。WO 98/25143和WO 99/63344描述了雙光子激發(fā)在生物分析方法中的應(yīng)用。該生物分析方法可用于在溶液或在生物懸浮液中的分析物和它采用微顆粒作為其上連接有第一生物特異試劑的生物親和性結(jié)合固體相。該生物分析方法利用一種標(biāo)以雙光子熒光染料的第二生物特異試劑。根據(jù)WO 98/25143和WO 99/63344，將微顆粒與反應(yīng)量的分析物和第二生物特異試劑接觸并使用基于雙光子激發(fā)的熒光檢測(cè)，這樣成為一種無(wú)分離分析方法。結(jié)合到第一生物特異試劑和結(jié)合到微顆粒上的分析物的量通過(guò)源自標(biāo)記第二生物特異試劑的雙光子激發(fā)熒光信號(hào)而檢測(cè)。標(biāo)記第二生物特異試劑可鍵接到分析物(非競(jìng)爭(zhēng)，免疫測(cè)量方法)或結(jié)合到第一生物特異試劑(競(jìng)爭(zhēng)方法)上。第一和第二生物特異試劑是生物活性分子，如半抗原，生物活性配體，藥物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白質(zhì)，抗體，或抗體的片斷。根據(jù)WO98/25143和WO 99/63344，將具有高雙光子激發(fā)效率的激光聚焦到反應(yīng)懸浮液中和雙光子激發(fā)熒光由單個(gè)微顆粒當(dāng)它們漂浮通過(guò)焦點(diǎn)區(qū)的激光束時(shí)測(cè)定。另外微顆?？捎门c激光束一起帶來(lái)的光學(xué)阱截留一段熒光檢測(cè)時(shí)間。微顆粒至激光束的焦點(diǎn)的束縛作用是基于由照射激光產(chǎn)生到微顆粒上的光學(xué)壓力。根據(jù)WO 98/25143，光學(xué)束縛增加了顆粒在激光束焦點(diǎn)的持續(xù)時(shí)間和減少測(cè)量的死時(shí)間。根據(jù)WO 98/25143，光學(xué)束縛需要較高激光器平均功率和照射強(qiáng)度。在這種情況下激光器的平均功率決定了束縛效率。微芯片激光器的重復(fù)率是較低的和因此需要使用高脈沖能量和因此高峰功率的照射激光，這樣得到足以用于光學(xué)束縛的激光器平均功率。高峰功率，和具有高雙光子激發(fā)效率的激光器的使用可導(dǎo)致雙光子激發(fā)熒光產(chǎn)率的下降，而且還在無(wú)分離分析中由于單脈沖作用而降低信號(hào)-本底比率。但實(shí)際上通常適當(dāng)?shù)厥褂靡环N具有盡可能高雙光子激發(fā)效率的激光器以使熒光信號(hào)最大化。
本發(fā)明的目的和概述本發(fā)明的目的是提供一種用于測(cè)量來(lái)自生物流體或懸浮液的分析物的改進(jìn)的無(wú)分離生物分析方法。
本發(fā)明涉及一種由包含微顆粒作為生物親和性結(jié)合固體相，用雙光子熒光染料標(biāo)記的第二生物特異試劑的生物流體或懸浮液測(cè)量分析物的無(wú)分離生物分析方法，包括將激光聚焦到反應(yīng)懸浮液中，當(dāng)單個(gè)微顆粒無(wú)規(guī)漂浮或被激發(fā)激光的輻射壓力引導(dǎo)通過(guò)焦點(diǎn)區(qū)的激光束時(shí)由其測(cè)量雙光子激發(fā)熒光。雙光子熒光染料具有結(jié)構(gòu)(II) 至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基，噁唑基，異噁唑基，氧雜二唑基，咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，吲哚基，共軛乙烯基，二烯基或三烯基基團(tuán)，和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到一種可用于選擇共價(jià)鍵接到其它分子上的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)，和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到一種水增溶基團(tuán)，和剩余的基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7分別獨(dú)立地選自氫，鹵素，烷基，氰基，羧基，分別可視需要被取代；或基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是取代的或未取代的烷基基團(tuán)，R4是氫，或取代的或未取代的烷基，和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到一種可用于選擇共價(jià)鍵接到其它分子上的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到一種水增溶基團(tuán)。
附圖的簡(jiǎn)要描述圖1是雙光子激發(fā)對(duì)照射強(qiáng)度的曲線圖。
圖2a表示烷基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。
圖2b和2c表示雜芳基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。
圖2d表示芳基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。
圖2e和2f表示苯基乙烯基取代的二吡咯亞甲基二二氟化硼染料。
圖2g和2h表示具有不同反應(yīng)性基團(tuán)的噻吩基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。
圖3表示連接劑化合物。
圖4是在免疫分析中雙光子熒光信號(hào)對(duì)分析物(AFP)濃度的曲線圖。
圖5是用于雙光子熒光測(cè)量的儀器光學(xué)方案。
本發(fā)明的詳細(xì)描述用于本申請(qǐng)的術(shù)語(yǔ)可定義如下●雙光子熒光包括雙光子被同時(shí)吸收到同一發(fā)色團(tuán)中和隨后輻射松弛該激發(fā)態(tài)的過(guò)程。
●雙光子熒光染料可用兩個(gè)被同時(shí)吸收的光子激發(fā)和激發(fā)態(tài)松弛伴隨有熒光發(fā)射的分子。
●累計(jì)多脈沖作用由激發(fā)能量聚集至長(zhǎng)壽命三線態(tài)所帶來(lái)的作用。如果使用具有重復(fù)率約100MHz的亞微微秒激光用于雙光子激發(fā)，該作用造成熒光產(chǎn)率的下降。該作用造成在達(dá)到染料的飽和水平之前雙光子熒光對(duì)照射強(qiáng)度的二次依賴性偏離。
●單脈沖作用由第二或更高級(jí)的直接非線性吸收所帶來(lái)的作用。如果使用具有高脈沖峰功率(Pp)和kHz重復(fù)率的微微秒-納秒標(biāo)稱(chēng)脈沖長(zhǎng)度(τ脈沖)的激光用于雙光子激發(fā)，該作用造成熒光產(chǎn)率的下降。該作用造成在達(dá)到染料的飽和水平之前雙光子熒光對(duì)照射強(qiáng)度的二次依賴性偏離。
●雙光子激發(fā)效率每單位時(shí)間的激發(fā)數(shù)。雙光子激發(fā)效率(Ex2ph，)與激光的峰功率(Pp)和脈沖持續(xù)時(shí)間(τ脈沖)成比例(Ex2ph∝Pp2*τ脈沖)。
●具有高雙光子激發(fā)效率的激光能夠激發(fā)雙光子熒光染料接近飽和水平(B，圖1)的激光。
●信號(hào)-本底比率由顆粒表面上的染料得到的信號(hào)和由溶液中的染料得到的信號(hào)之間的比率。
●照射強(qiáng)度激光脈沖峰功率/束橫截面面積單位。
●平均功率1秒內(nèi)發(fā)射的激光束能量。
●微顆?？捎米骰瘜W(xué)品或生物化學(xué)品的固體相載體的球形或非球形固體物。微顆粒一般被認(rèn)為是0.01-100μm直徑和可由聚合物，玻璃，硅石或其它材料組成。
本發(fā)明涉及具有高雙光子激發(fā)熒光產(chǎn)率和甚至在高強(qiáng)度激光照射下通過(guò)單脈沖作用而具有特別低猝滅的雙光子吸收熒光團(tuán)。
本發(fā)明提供了可用于無(wú)分離生物分析方法的雙光子熒光染料，該方法基于使用具有高雙光子激發(fā)效率的激光。已發(fā)現(xiàn)二吡咯亞甲基二氟化硼染料和所述染料的軛合物作為本發(fā)明的主題提供了特別高的雙光子激發(fā)熒光產(chǎn)率。雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料和所述染料的軛合物作為本發(fā)明的主題理想地適用于微顆?；锓治鲶w系，因?yàn)槎量﹣喖谆鹑玖虾退鋈玖系能椇衔锿ㄟ^(guò)單脈沖作用甚至在光學(xué)束縛微顆粒所需的激光器的高平均功率下也具有特別低的猝滅。本發(fā)明介紹了尤其適用于標(biāo)記生物分子的新型雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料。這些雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料是親水性質(zhì)的和可溶于水溶液。這些染料在水溶液中的溶解度使得它們理想地適用于生物分析方法。
圖1是雙光子激發(fā)對(duì)照射強(qiáng)度的曲線圖。在低照射強(qiáng)度(A)下，激發(fā)遵循照射強(qiáng)度的二次依賴性。為了使雙光子激發(fā)熒光最大化，染料應(yīng)該被激發(fā)至接近飽和水平(B)。在飽和水平(C)下，幾乎所有的染料分子被激發(fā)。圖2a給出了作為化合物1-3描述于實(shí)施例1-3的烷基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。圖2b和2c給出了作為化合物4-9描述于實(shí)施例4-9的雜芳基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。X+是陽(yáng)離子抗衡離子。圖2d給出了作為化合物10和11描述于實(shí)施例10和11的苯基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。X+是陽(yáng)離子抗衡離子。圖2e和2f給出了作為化合物12和13描述于實(shí)施例12和13的苯基乙烯基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。X+是陽(yáng)離子抗衡離子。圖2g和2h給出了作為化合物14-17描述于實(shí)施例14-17的具有氨基-，芳基氨基-，馬來(lái)酰亞胺-和異硫氰酸鹽反應(yīng)性基團(tuán)的噻吩基取代的二吡咯亞甲基二氟化硼染料。X+是陽(yáng)離子抗衡離子。圖3給出了用于增加染料在水溶液中的溶解度的連接劑化合物18.X+是陽(yáng)離子抗衡離子。圖4是在例如描述于實(shí)施例21的基于雙光子熒光的免疫分析中雙光子熒光信號(hào)對(duì)分析物(AFP)濃度的曲線圖。AFP濃度0ng/ml由于用于圖4的對(duì)數(shù)刻度而表示為濃度0.1ng/ml。圖5是用于雙光子熒光測(cè)量的儀器的光學(xué)方案。無(wú)源Q-切換Nd:YAG微芯片激光器1用作雙光子激發(fā)熒光的照射源。激光的波長(zhǎng)是1064nm，脈沖持續(xù)時(shí)間是1ns和重復(fù)率是20kHz。自然發(fā)散的激光束用分色鏡2通過(guò)光學(xué)掃描器單元3導(dǎo)向物鏡4的入口孔。在入口孔處的照射是高斯填充約70％的全孔。物鏡隨后聚焦照射光至具有薄光學(xué)底(厚度0.2mm)的特殊比色杯5中。到達(dá)樣品的平均光學(xué)輸出功率是50mW。焦點(diǎn)區(qū)的大小是約1毫微微升。540-700nm的雙光子激發(fā)熒光信號(hào)由物鏡4的全孔收集和通過(guò)分色鏡2和該帶通過(guò)濾光片6導(dǎo)向光電倍增管7。在顆粒測(cè)量的情況下，測(cè)定雙光子激發(fā)熒光和微顆粒后散射(反射)激光。分色鏡2和2％光束分裂窗孔8使后散射光偏斜至針孔9，使散射信號(hào)的檢測(cè)共焦。用于散射信號(hào)的檢測(cè)器是近紅外GaAs針(pin)光電二極管10。顆粒通過(guò)使用三維束掃描器3而被連續(xù)跟蹤。xy-掃描器是光機(jī)械的和盡可能靠近物鏡的入口孔。由于物鏡入口孔的部分照射，光束在xy-掃描器的全偏離角下的偏離不會(huì)使光束被孔邊緣明顯切割。如果后散射信號(hào)的幅度超過(guò)預(yù)設(shè)的閾值水平，它表示微顆粒出現(xiàn)在焦點(diǎn)區(qū)附近且關(guān)掉x-和y-掃描器鏡。通過(guò)照射激光束而產(chǎn)生的光學(xué)壓力束縛顆粒和將它引導(dǎo)通過(guò)激光束焦點(diǎn)的中心。熒光信號(hào)在顆粒處于焦點(diǎn)，即后散射信號(hào)超過(guò)預(yù)設(shè)閾值時(shí)測(cè)定。除了xy-掃描，進(jìn)一步的z-掃描運(yùn)動(dòng)通過(guò)在軸方向上慢慢移動(dòng)物鏡而進(jìn)行。該運(yùn)動(dòng)的幅度是150μm和運(yùn)動(dòng)在顆粒測(cè)量時(shí)不停止。盡管慢z-掃描，顆粒通過(guò)光學(xué)束縛力而保持在焦點(diǎn)中。
與具有高雙光子激發(fā)效率的激光器結(jié)合使用的雙光子熒光染料必須選擇以使得熒光團(tuán)通過(guò)單脈沖作用具有最小猝滅。這樣能夠激發(fā)接近飽和水平的熒光團(tuán)群和因此使雙光子熒光信號(hào)最大化。對(duì)熒光染料的合適的選擇還能夠在基于雙光子激發(fā)的生物分析中利用微顆粒的光學(xué)束縛和使用微顆粒作為固體載體，描述于WO 98/25143和WO99/63344。如果使用高重復(fù)率激光，單線態(tài)-三線態(tài)交叉的出現(xiàn)也成為用于選擇合適的熒光團(tuán)的一個(gè)重要的參數(shù)。對(duì)于具有低單線態(tài)-三線態(tài)交叉率的熒光團(tuán)，可避免能量至非輻射三線態(tài)的聚集。雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料作為本發(fā)明的主題滿足這兩個(gè)基本要求。另外，雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料的吸收和發(fā)射帶的位置可通過(guò)對(duì)基本發(fā)色團(tuán)的合適的取代而調(diào)整。該性能對(duì)于調(diào)整適用于一種特殊激光的發(fā)色團(tuán)的性能是特別重要的。二吡咯亞甲基二氟化硼染料的熒光量子產(chǎn)率一般超過(guò)70％。如果使用具有高雙光子激發(fā)效率的激光器作為照射源，高量子產(chǎn)率與單脈沖作用下的低猝滅速率一起提供高雙光子激發(fā)熒光。根據(jù)本發(fā)明的二吡咯亞甲基二氟化硼染料的雙光子激發(fā)熒光產(chǎn)率驚人地高。不同于以前發(fā)表的數(shù)據(jù)[Xu C.和Webb W.W.，J.Opt.Soc.Am.B，13(1996)481]，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，二吡咯亞甲基二氟化硼染料的雙光子激發(fā)熒光產(chǎn)率甚至高于若丹明B的雙光子激發(fā)熒光產(chǎn)率。另外，雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料通過(guò)單脈沖作用的最小猝滅使得能夠利用具有高雙光子激發(fā)效率的激光器作為照射源而沒(méi)有明顯損失該體系的3D空間分辨率。雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料也可通過(guò)合適的側(cè)鏈取代而改性以用于水溶液和用于有機(jī)介質(zhì)。
本發(fā)明涉及描述于Hnninen P.等人，Nat.Biotechnol.18(2000)548；Soini J.T.等人Single Mol.1(2000)203；WO 98/25143和WO99/63344的生物分析方法。本發(fā)明提供的雙光子熒光染料在與描述于Hnninen P.等人，Nat.Biotechnol.18(2000)548；Soini J.T.等人Single Mol.1(2000)203；WO 98/25143和WO 99/63344的生物分析方法結(jié)合時(shí)提供高分析性能。雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料和所述染料的軛合物作為本發(fā)明的主題可用于基于使用與高雙光子激發(fā)效率的激光器的無(wú)分離生物分析方法而沒(méi)有信號(hào)-本底比率的任何明顯下降。
根據(jù)本發(fā)明，第二生物特異試劑被標(biāo)以雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料。第二生物特異試劑是生物活性分子，如半抗原，生物活性配體，藥物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白質(zhì)，抗體，或抗體的片斷。標(biāo)以雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料的第二生物特異試劑可結(jié)合到分析物(非競(jìng)爭(zhēng)分析)或結(jié)合到第一生物特異試劑(競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析)上。連接到微顆粒的第一生物特異試劑上的分析物的量通過(guò)源自標(biāo)以雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料的第二生物特異試劑的雙光子激發(fā)熒光信號(hào)檢測(cè)。
增加顆粒在激光束焦點(diǎn)的持續(xù)時(shí)間和減少測(cè)量的死時(shí)間的光學(xué)束縛(描述于WO 98/25143)需要較高的激光平均功率。具有低脈沖頻率的高平均功率導(dǎo)致高脈沖能量，這可導(dǎo)致熒光通過(guò)單脈沖作用而猝滅。根據(jù)本發(fā)明，雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料理想地適用于基于生物分析體系的微顆粒。這些染料甚至在微顆粒光學(xué)束縛所需的高激光平均功率下也通過(guò)單脈沖作用而具有特別低的猝滅。
雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料和所述染料的軛合物作為本發(fā)明的主題也可用于基于監(jiān)控未連接生物特異試劑的雙光子激發(fā)熒光的無(wú)分離生物分析方法。第一生物特異試劑連接到微顆粒上或在比色杯的壁上。標(biāo)以雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料的第二生物特異試劑可結(jié)合到分析物(非競(jìng)爭(zhēng)分析)或結(jié)合到第一生物特異試劑(競(jìng)爭(zhēng)連結(jié)分析)上。通過(guò)第一生物特異試劑連接到微顆粒上或比色杯的壁上的分析物的量根據(jù)源自標(biāo)以雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料的未連接第二生物特異試劑的雙光子激發(fā)熒光信號(hào)而確定。
雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料作為本發(fā)明的目標(biāo)具有以下的一般結(jié)構(gòu)(II)。
在該結(jié)構(gòu)中，R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7選自單獨(dú)或組合形式的取代基氫，鹵素，烷基，環(huán)烷基，鏈烯基，芳基鏈烯基，芳基，烷基芳基，雜芳基，?；?，烷氧基，氰基，羧基，氨基，羥基，烷氧基羰基，硝基，烷基氨基，二烷基氨基和磺基。另外，發(fā)色團(tuán)上的取代基可進(jìn)一步改性以提供化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)?？捎糜谶x擇共價(jià)鍵接到其它分子上的化學(xué)活性基團(tuán)包括但不限于羧酸的衍生物，羧酸反應(yīng)性酯，羧酸酸酐，馬來(lái)酰亞胺，磺酰氯，磺?；?，肼，胺，醇，?；B氮化物，異氰酸酯，醛，鹵代乙酰胺，三嗪或異硫氰酸鹽。
如果調(diào)節(jié)適用于一種特殊激光的基本發(fā)色團(tuán)的性能，可用于將吸收和發(fā)射移動(dòng)至較長(zhǎng)的波長(zhǎng)的取代基是特別重要的。例如，在用Nd:YAG激光在波長(zhǎng)1064nm下的雙光子激發(fā)中，熒光發(fā)射帶應(yīng)該超過(guò)532nm(兩個(gè)1064nm光子的能量的總和)。將二吡咯亞甲基二氟化硼基本發(fā)色團(tuán)的吸收和發(fā)射帶移向較長(zhǎng)的波長(zhǎng)的一種便利方法是延長(zhǎng)π-電子共軛。這可例如通過(guò)將不飽和有機(jī)基團(tuán)加入基本發(fā)色團(tuán)而進(jìn)行。據(jù)此，本發(fā)明的優(yōu)選的化合物具有一種結(jié)構(gòu)，其中至少一種取代基R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7選自苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基，噁唑基，異噁唑基，氧雜二唑基，咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，吲哚基，共軛乙烯基，二烯基，三烯基，和視需要被一種或幾種取代基取代的任何前述基團(tuán)。任選的取代基優(yōu)選選自鹵素，羥基，烷氧基，氰基，硝基，羧基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，磺基和可包含雜原子，取代的雜原子或含側(cè)鏈雜原子的優(yōu)選包含1-10個(gè)碳的直鏈或支化烷基。剩余的取代基R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7分別獨(dú)立地選自氫，鹵素，烷氧基，氰基，羧基烷氧基羰基，硝基，烷基氨基，二烷基氨基，磺基和可包含雜原子，取代的雜原子或含側(cè)鏈雜原子的優(yōu)選包含1-10個(gè)碳的直鏈或支化烷基。最優(yōu)選的化合物是其中R1是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基或苯基乙烯基；R2，R3和R4是氫；R5，R6和R7分別獨(dú)立地是氫，烷基或取代的烷基的那些。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的化合物也可具有一種結(jié)構(gòu)，其中至少一種取代基R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是-YZ，其中-Y-是連接劑單元和Z是可用于將發(fā)色團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)到其它分子，如生物分子上的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)。連接劑單元-Y-是共價(jià)鍵或C1-C20直鏈或支化亞烷基，亞芳基，亞烷芳基，亞芳烷基基團(tuán)或這些的組合。連接劑單元-Y-也可包含雜原子，取代的雜原子或含雜原子的側(cè)鏈，或環(huán)狀殘基。連接劑單元-Y-也可包含聚合物的殘基，優(yōu)選聚合物如多肽，多糖，聚核苷酸，聚醚或其它的殘基或由它們組成。剩余的取代基R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7分別獨(dú)立地選自取代基如氫，鹵素，烷基，環(huán)烷基，鏈烯基，鏈烯基芳基，芳基，芳基烷基，雜芳基，?；?，烷氧基，氰基，羧基，氨基，羥基，烷氧基羰基，硝基，烷基氨基，二烷基氨基和磺基，和視需要被取代。
優(yōu)選的取代基定義如上。
二吡咯亞甲基二氟化硼染料一般可溶于有機(jī)溶劑。
尤其具有芳基取代基的二吡咯亞甲基二氟化硼染料是憎水性質(zhì)的和不溶于水溶液。但水溶性通常是生物分析場(chǎng)合所需要的。熒光標(biāo)記對(duì)水溶液的親水性和溶解度在減少未特定粘結(jié)，保持標(biāo)記在標(biāo)記生物分子中的光物理性能和保留標(biāo)記生物分子的生物性能方面通常是必要的。
水溶性可通過(guò)將合適的水增溶基團(tuán)加入基本發(fā)色團(tuán)而得到。水增溶基團(tuán)優(yōu)選包含磺酸或羧酸的銨或堿金屬鹽，銨或羥基基團(tuán)。水溶性也可通過(guò)將肽或碳水化合物部分加入染料而得到。
據(jù)此，本發(fā)明的優(yōu)選的化合物具有一種結(jié)構(gòu)，其中吸收和發(fā)射帶被適當(dāng)調(diào)節(jié)，該化合物包含可用于將該化合物共價(jià)偶聯(lián)到其它分子上的反應(yīng)性側(cè)鏈和該化合物還包含能增加在水溶液中的溶解度的基團(tuán)。據(jù)此，本發(fā)明的優(yōu)選的化合物具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基，噁唑基，異噁唑基，氧雜二唑基，咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯基乙烯基或吲哚基；和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到可用于選擇共價(jià)鍵接到其它分子上和/或用于進(jìn)一步化學(xué)改性的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到水增溶基團(tuán)。據(jù)此，最優(yōu)選的化合物具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中R1是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基或苯基乙烯基，R2，R3，R4和R5分別獨(dú)立地是氫或烷基，R6或R7是取代基，最優(yōu)選具有式 其中X+是陽(yáng)離子，和剩余的取代基R6或R7是氫或烷基。本發(fā)明的優(yōu)選的化合物也可具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中基團(tuán)R1，R2，R3，R5，R6和R7是取代的或未取代的烷基，R4是氫或取代的或未取代的烷基；和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到可用于選擇共價(jià)鍵接到其它分子上和/或用于進(jìn)一步化學(xué)改性的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到水增溶基團(tuán)。優(yōu)選的取代基定義如上。是水溶性的和因此尤其適用于標(biāo)記生物分子的雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料的例子在實(shí)施例3和8-17中給出。這些雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料是水溶性的和它們甚至在用高雙光子激發(fā)效率激光照射時(shí)也通過(guò)單脈沖作用而具有特別低的猝滅。
按照本發(fā)明的雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料可與生物特異分子偶聯(lián)得到雙光子熒光軛合物。該生物特異分子是生物活性分子，如半抗原，生物活性配體，藥物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白質(zhì)，抗體，或抗體的片斷。雙光子熒光軛合物可用于生物分析體系，其中特定信號(hào)通過(guò)所述軛合物的雙光子激發(fā)熒光而得到。按照本發(fā)明的雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料和軛合物也可用于細(xì)胞和組織的染色。
以下非限定性實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。在以下實(shí)施例中，所提及的化合物(化合物1-18)公開(kāi)于圖2a-2h和3。
實(shí)施例13，3′，5，5′-四甲基-4，4′-羧基乙基-2，2′-二吡咯基亞甲基溴化氫(1)2-乙氧基羰基-3，5-二甲基-4-甲氧基羰基乙基吡咯(1.0g，3.35mmol)溶解在甲酸(3ml)中和加入氫溴酸(48％，3ml)。反應(yīng)混合物在100℃下攪拌2.5h。在混合物冷卻至室溫之后，它在室溫下放置過(guò)夜。產(chǎn)物由反應(yīng)混合物結(jié)晶成小的，橙色，針狀晶體。過(guò)濾反應(yīng)混合物并將結(jié)晶產(chǎn)物用水洗滌。
產(chǎn)物(化合物1)在真空干燥器中干燥。產(chǎn)量是677mg(84％)。附加量(43mg)的產(chǎn)物由濾液在+4℃下放置2天之后得到。總產(chǎn)量是720mg(86％)。
2-乙氧基羰基-3，5-二甲基-4-甲氧基羰基乙基吡咯如Bul lock E.等人，J.Chem.Soc.(1958)1430所述而制備。
實(shí)施例24，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-4-硼雜-3a，4a二氮雜-s-indacene-2，6-二丙酸(2)二吡咯基亞甲基溴化氫(化合物1)(500mg，1.17mmol)懸浮在氯仿(20ml)中和加入三乙胺(4.3ml，31mmol)。起始二吡咯基亞甲基溴化氫在三乙基胺加入(4.3ml，31mmol)之后立即溶解。加入三氟化硼乙醚合物(5ml，31mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2.5h。反應(yīng)混合物用氯仿(50ml)稀釋?zhuān)孟Cl(5％，30ml)和水(30ml)洗滌。
加入少量(5％)乙醇以進(jìn)行有效萃取。
氯仿相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干燥和產(chǎn)物(化合物2)由乙醇/水(7天，在+4℃)沉淀得到棕色-橙色粉末。在產(chǎn)物(化合物2)在真空干燥器中干燥之后，產(chǎn)量是420mg(92％)。
1HNMR(JEOL JNM-LA400，DMSO-d6，400MHz，δppm)2.19(s，6H，2x-CH3)，2.29(t，4H，2x-CH2-)，2.38(s，6H，2x-CH3)，2.57(t，4H，2x-CH2)，7.53(s，1H，Ar-CH＝).
實(shí)施例34，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-6-羧基乙基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亞胺基酯(3)4，4′-二氟-1，3，5，7-四甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2，6-二丙酸(化合物2)(102mg，0.26mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(2.5ml，干)中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(90mg，0.78mmol)和N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(54mg，0.26mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24h。N，N-二甲基甲酰胺蒸發(fā)(5mbar，40-50℃)和產(chǎn)物用柱色譜法使用硅石作為固定相和二氯甲烷∶丙酮∶乙酸(100∶8∶1，v∶v∶v)作為洗脫劑進(jìn)行純化。包含所需單-琥珀酰亞胺基酯(化合物3)的級(jí)分合并和蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶解到少量二氯甲烷中。加入石油醚(bp40-60℃)以沉淀該產(chǎn)物。將溶液過(guò)濾并得到作為橙色固體的沉淀產(chǎn)物(化合物3)。產(chǎn)量50mg(39％)。
1HNMR(JEOL JNM-LA400，DMSO-d6，400MHz，δppm)2.21(s，3H，CH3)，2.22(s，3H，CH3)，2.36(t，2H，-CH2-)，2.40(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，2.59(t，2H，-CH2-)，2.72(t，2H，-CH2-)，2.80(s，4H，2x-CH2-)，2.85(t，2H，-CH2-)，7.60(s，1H，Ar-CH＝)UV-VIS(Ocean Optics SD2000，MeOH)λmax＝523nm(ε＝91 000).
實(shí)施例44，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸甲基酯(4)。
2-甲?；?5-(2-噻吩基)吡咯(150mg，0.84mmol)和2，4-二甲基-3-羧基乙基吡咯(140mg，0.84mmol)溶解在二氯甲烷∶甲醇(10∶1，30ml)中。加入磷酰氯(77μl，0.84mmol)并將溶液在室溫下攪拌18h。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干燥并將殘余物溶解在二氯甲烷(150ml)中。加入N-乙基-N，N-二異丙基胺(1.44ml，8.4mmol)和三氟化硼乙醚合物(1.06ml，8.4mmol)。強(qiáng)橙色熒光在加入三氟化硼乙醚合物之后立即觀察到。反應(yīng)混合物用水洗滌，用硫酸鈉干燥并蒸發(fā)至干。粗產(chǎn)物用柱色譜法使用硅石作為固定相和二氯甲烷作為洗脫劑進(jìn)行純化。匯集包含所需產(chǎn)物的級(jí)分并蒸發(fā)至干，得到304mg(93％)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸甲基酯(化合物4)。
1HNMR(Bruker AM200，CDCl3，200MHz，δppm)2.21(s，3H，Ar-CH3)，2.47(t，2H，-CH2-)，2.59(s，3H，Ar-CH3)，2.74(t，2H，-CH2-)，3.68(s，3H，-COOCH3)，6.70(d，1H，ArH)，6.91(d，1H，ArH)，7.05(s，1H，Ar-CH＝)，7.15(d，1H，ArH)，7.40(d，1H，ArH)，8.04(d，1H，ArH).FAB-MSMH+389.UV-VIS(Ocean OpticsSD2000，MeOH)λmax＝560nm(ε＝82 000).
2-(2-噻吩基)吡咯根據(jù)Kruse C.G.等人，雜環(huán)26(1985)3141制備和根據(jù)Bul lock E.等人J.Chem.Soc.(1963)2326甲?；玫?-甲?；?5-(2-噻吩基)吡咯。
2，4-二甲基-3-羧基乙基吡咯制備如下2-乙氧基羰基-3，5-二甲基-4-甲氧基羰基乙基吡咯(1.5g，5.9mmol)和氫氧化鉀(6.6g)溶解在亞乙基二醇(50ml)中。反應(yīng)混合物在氮?dú)夥障禄亓?190℃)3h。加入水(10ml)并將混合物另外回流2h。冷卻的反應(yīng)混合物用水(200ml)稀釋?zhuān)脻恹}酸酸化和用二乙醚萃取。匯集有機(jī)提取物，用硫酸鈉干燥和蒸發(fā)至干。產(chǎn)物用柱色譜法使用硅石作為固定相和二氯甲烷∶甲醇(10∶1，v∶v)作為洗脫劑進(jìn)行純化。匯集包含產(chǎn)物的級(jí)分并蒸發(fā)至干，得到720mg(72％)2，4-二甲基-3-羧基乙基吡咯。
實(shí)施例54，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸(5)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸甲基酯(化合物4)(107mg，0.27mmol)溶解在四氫呋喃∶水(3∶2，50ml)中。加入磷酸(85％，3ml)并將混合物回流5天。反應(yīng)混合物用水稀釋并將產(chǎn)物用二氯甲烷萃取。有機(jī)相用硫酸鈉干燥并蒸發(fā)至干。粗產(chǎn)物用柱色譜法使用硅石作為固定相和二氯甲烷∶甲醇(10∶1)作為洗脫劑進(jìn)行純化。匯集包含所需產(chǎn)物的級(jí)分并蒸發(fā)至干。產(chǎn)物由二氯甲烷∶石油醚結(jié)晶，得到68mg(66％)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸(化合物5)。
1HNMR(Bruker AM200，DMSO-d6，200MHz，δppm)2.22(s，3H，Ar-CH3)，2.40(t，2H，-CH2-)，2.51(s，3H，Ar-CH3)，2.63(t，2H，-CH2-)，6.80(d，1H，ArH)，7.11(d，1H，ArH)，7.19(dd，1H，ArH)，7.69(s，1H，Ar-CH＝)，7.73(d，1H，ArH)，7.88(d，1H，ArH).
實(shí)施例64，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亞胺基酯(6)。
4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸(化合物5)(57mg，0.15mmol)溶解在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中。加入N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(47mg，0.23mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(52mg，0.45mmol)并將混合物在室溫下攪拌20h。反應(yīng)混合物用二氯甲烷稀釋并將沉淀的N，N′-二環(huán)己基脲過(guò)濾出來(lái)。濾液蒸發(fā)至干并將產(chǎn)物用柱色譜法使用硅石作為固定相和二氯甲烷∶丙酮∶乙酸(100∶8∶1，v∶v∶v)作為洗脫劑進(jìn)行純化。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并并蒸發(fā)至干。
產(chǎn)物在真空干燥器中進(jìn)-步干燥，得到35mg(75％)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亞胺基酯(化合物6)。
1HNMR(Bruker AM200，CDCl3，200MHz，δppm)2.23(s，3H，Ar-CH3)，2.61(s，3H，Ar-CH3)，2.74-2.82(2t，4H，2x-CH2-)，2.86(s，4H，-CH2-)6.72(d，1H，ArH)，6.93(d，1H，ArH)，7.08(s，1H，Ar-CH＝)，7.15(dd，1H，ArH)，7.41(d，1H，ArH)，8.06(d，1H，ArH)實(shí)施例74，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-衍生物(7)。
4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亞胺基酯(化合物6)(35mg，0.074mmol)和Glu-Tau-連接劑(化合物18)(19mg，0.074mmol)溶解在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(1ml)中。加入無(wú)水三乙基胺(31μl，0.22mmol)并將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30min。反應(yīng)混合物在減壓下蒸發(fā)至干。粗產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步純化就使用。
MS(質(zhì)譜)(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算609(M-1)，結(jié)果609(M-1)實(shí)施例84，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4 a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(8)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸(化合物7)的Glu-Tau-衍生物(0.074mmol)溶解在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(2ml)中。加入N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(46mg，0.22mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(26mg，0.22mmol)并將混合物在室溫下攪拌48h。將沉淀的N，N′-二環(huán)己基脲過(guò)濾出來(lái)并將濾液蒸發(fā)至干。產(chǎn)物在真空干燥器中進(jìn)一步干燥且無(wú)需進(jìn)一步純化就使用。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算706(M-1)，結(jié)果706(M-1)實(shí)施例94，4-二氟-5-(2-吡咯基)-1，3-二甲基-4硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(9)4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-1，3-二甲基-4硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(化合物9)使用描述于實(shí)施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5-(吡咯基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亞胺基酯作為起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算689(M-1)，結(jié)果689(M-1)實(shí)施例104，4-二氟-5-苯基-1，3-二甲基4-硼雜3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(10)4，4-二氟-5-苯基-1，3-二甲基-4-硼雜3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(化合物10)使用描述于實(shí)施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5-苯基-1，3-二甲基4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亞胺基酯作為起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算700(M-1)，結(jié)果700(M-1)實(shí)施例114，4-二氟-5-(4-甲氧基苯基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(11)4，4-二氟-5-(4-甲氧基苯基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(化合物11)使用描述于實(shí)施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5(4-甲氧基苯基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亞胺基酯作為起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算730(M-1)，結(jié)果730(M-1)實(shí)施例124，4-二氟-5-苯乙烯基-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(12)4，4-二氟-5-苯乙烯基-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(化合物12)使用描述于實(shí)施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5-苯乙烯基-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亞胺基酯作為起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算726(M-1)，結(jié)果726(M-1)實(shí)施例134，4-二氟-5-(4-甲氧基苯乙烯基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(13)4，4-二氟-5-(4-甲氧基苯乙烯基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(化合物13)使用描述于實(shí)施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5-(4-甲氧基苯乙烯基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亞胺基酯作為起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算756(M-1)，結(jié)果756(M-1)實(shí)施例14
4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-氨基衍生物(14)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(化合物8)(0.062mmol)溶解在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中。加入三乙基胺(26μl，0.185mmol)和乙二胺(42μl，0.62mmol)，并將混合物在室溫下攪拌30min。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干并將產(chǎn)物從二氯甲烷-四氯化碳中沉淀。產(chǎn)物(化合物14)在真空干燥器中進(jìn)一步干燥且無(wú)需進(jìn)一步純化就使用。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算651(M-1)，結(jié)果651(M-1)實(shí)施例154，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-芳基氨基衍生物(15)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亞胺衍生物(化合物8)(0.074mmol)溶解在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中。加入三乙基胺(31μ1，0.22mmol)和4-(2-氨基乙基)苯胺(15mg，0.11mmol)并將混合物在室溫下攪拌3h。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干并將產(chǎn)物從二氯甲烷/四氯化碳中沉淀。產(chǎn)物(化合物15)在真空干燥器中進(jìn)一步干燥且無(wú)需進(jìn)一步純化就使用。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算727(M-1)，結(jié)果727(M-1)實(shí)施例164，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-異硫代氰酸根合衍生物(16)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-芳基氨基衍生物(化合物15)(0.048mmol)溶解在丙酮(9ml)和NaHCO3(9ml，水溶液，飽和)的混合物中。加入硫光氣(183μl，2.4mmol)并將混合物在室溫下攪拌1.5h。反應(yīng)混合物用水(50ml)和二氯甲烷(50ml)稀釋。水相用二氯甲烷(40ml)洗滌兩次。含水相的產(chǎn)物用苯酚(2*20ml)萃取。含苯酚相的產(chǎn)物用水(40ml)洗滌和用二乙基醚(200ml)稀釋。苯酚/二乙基醚相用水(4*30ml)萃取并將合并的水相用二乙基醚(30ml)洗滌兩次。含水相的產(chǎn)物蒸發(fā)至干和產(chǎn)物從二氯甲烷-四氯化碳中沉淀。產(chǎn)物(化合物16)在真空干燥器中進(jìn)一步干燥和儲(chǔ)存。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算769(M-1)，結(jié)果769(M-1)實(shí)施例174，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-馬來(lái)酰亞胺衍生物(17)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-氨基衍生物(化合物14)(0.015mmol)溶解在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中。加入三乙基胺(2.1μl，0.015mmol)和N-琥珀酰亞胺基4-馬來(lái)亞氨基丁酸酯(3.2mg，0.020mmol)并將混合物在室溫下攪拌2h。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干并將產(chǎn)物從二氯甲烷/四氯化碳中沉淀。產(chǎn)物(化合物17)在真空干燥器中進(jìn)一步干燥和儲(chǔ)存。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，負(fù)模式)計(jì)算816(M-1)，結(jié)果816(M-1)實(shí)施例18Glu-Tau連接劑(18)谷氨酸衍生物，BOC-Glu(OtBu)-OSu(Nova Biochem，500mg，1.25mmol)溶解在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中。向三乙胺(1.20ml，8.75mmol)在水(10ml)中的溶液溶解牛磺酸(782mg，6.25mmol)。將?；撬崛芤杭尤隑OC-Glu(OtBu)-Osu的溶液和反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30min。加入乙醇并將沉淀的牛磺酸過(guò)濾出來(lái)和將濾液蒸發(fā)至干。殘余物溶解在三氟乙酸(2ml)中和在室溫下攪拌2h。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干并將殘余物溶解在二氯乙烷甲醇中。產(chǎn)物(化合物18)通過(guò)甲醇在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中的緩慢蒸發(fā)而沉淀為白色固體。所需Glu-Tau連接劑(化合物18)以64％產(chǎn)率(204mg)得到。
MS(ZABSpec-oaTOF，F(xiàn)isons儀器，甘油基質(zhì))計(jì)算255(M+1)，結(jié)果255(M+1)。
實(shí)施例19使用具有高雙光子激發(fā)效率的激光器測(cè)量所選雙光子熒光染料的雙光子熒光產(chǎn)率雙光子熒光產(chǎn)率使用圖5示意給出的實(shí)驗(yàn)裝置測(cè)定。若丹明B(Eastman Kodak)由于其表征良好的熒光性能而選擇為參比。名為BODIPY 530/550，BODIPY 558/568和BODIPY 564/576的三種二吡咯亞甲基二氟化硼染料以及R-藻紅素(R-PE)購(gòu)自Molecular Probes。所有的有機(jī)染料溶解在N，N-二甲基甲酰胺中和用無(wú)水乙醇稀釋至濃度100nM。原料溶液R-PE用磷酸鹽緩沖鹽水(50/150mM，pH7.4)稀釋。結(jié)果匯總于表1。結(jié)果被標(biāo)準(zhǔn)化為若丹明B(100)的信號(hào)。從表1可以看出，二吡咯亞甲基二氟化硼染料的熒光產(chǎn)率與若丹明B的熒光產(chǎn)率處于相同的數(shù)量級(jí)。二吡咯亞甲基二氟化硼染料的高熒光產(chǎn)率使得它們成為若丹明型染料的一種有吸引力的替代物。R-藻紅素具有本文所述染料中的最高熒光產(chǎn)率。但R-PE的實(shí)用性由于大尺寸而受到限制。R-PE的選擇活化的復(fù)雜性也限制其作為標(biāo)記的應(yīng)用。
表1所選雙光子熒光染料的雙光子熒光產(chǎn)率熒光染料 標(biāo)準(zhǔn)化雙光子熒光產(chǎn)率[a.u.]二吡咯亞甲基二氟化硼染料化合物3 18化合物8 219BODIPY 530/550 66BODIPY 558/568 101BODIPY 564/576 128若丹明B 100R-PE 618實(shí)施例20
鼠IgG抗AFP用雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料3標(biāo)記向1.5mg(9.3nmol)鼠IgG抗AFP(克隆A)在400μl磷酸鹽緩沖鹽水(10/150mM，pH7.4)中加入在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(25μl，c＝7.5mM)中的20倍過(guò)量的化合物3。加入40μl NaHCO3(1M，aq)并將混合物在室溫下保溫2h。產(chǎn)物用NAP-5凝膠過(guò)濾柱(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)使用磷酸鹽緩沖鹽水(50/150，10mMNaN3，pH7.4)作為洗脫劑純化。收集快速移動(dòng)橙色級(jí)分并用分光光度法測(cè)定標(biāo)記度。得到5個(gè)熒光團(tuán)/蛋白質(zhì)的標(biāo)記度。
實(shí)施例21R-PE，Alexa 532(Molecular Probes)和二吡咯亞甲基二氟化硼染料(3)在微顆?；庖叻治鲋械谋容^模型分析是一種無(wú)分離免疫測(cè)量分析，采用3.1μm氨基-改性的聚苯乙烯微顆粒(氨基改性的微球PAOSN，Bangs Laboratories，Inc.，F(xiàn)ishers，IN，U.S.A.)作為固相。鼠單克隆抗AFP IgG Fab的片段(克隆B)通過(guò)使用雜雙官能ε-馬來(lái)亞氨基己酰氧基琥珀酰亞胺連接劑而共價(jià)偶聯(lián)到微顆粒上?？笰FP涂覆微顆粒的原料懸浮液用TRIS pH8.0分析緩沖劑稀釋至顆粒濃度為0.05％。鼠單克隆IgG抗AFP(克隆A)被標(biāo)以二吡咯亞甲基二氟化硼染料(化合物3)，Alexa 532(MolecularProbes，Eugene，Oregon)或標(biāo)以R-PE(Molecular Probes，Eugene，Oregon)和用作示蹤劑。示蹤劑用分析緩沖劑稀釋至最終濃度1.58nM(化合物3)，1.45nM(Alexa 532)和0.78nM(R-PE，MolecularProbes)。將5μl微顆粒懸浮液和10μl示蹤劑與10μlα-1-胎兒球蛋白標(biāo)準(zhǔn)(X0900，Dako A/S，Denmark)混合在一起。反應(yīng)混合物是在37℃保溫2小時(shí)和在同一反應(yīng)比色杯中使用圖5示意給出的實(shí)驗(yàn)裝置測(cè)定。結(jié)果匯總于表2和圖4。
示蹤劑濃度根據(jù)每種示蹤劑獨(dú)立地優(yōu)化。二吡咯亞甲基二氟化硼示蹤劑得到最低的本底信號(hào)，即使它的使用濃度高于R-PE或Alexa532示蹤劑。分析本底信號(hào)在分析靈敏度方面是重要的。本底信號(hào)的最基本來(lái)源是標(biāo)記抗體(示蹤劑)在反應(yīng)懸浮液中的游離級(jí)分。三種不同的示蹤劑的本底水平在表2和在圖4中給出。這些結(jié)果清楚地表明，最佳的信號(hào)-本底比率在用二吡咯亞甲基二氟化硼標(biāo)記示蹤劑時(shí)得到。另外，如果將分析結(jié)果與溶液測(cè)量的結(jié)果(實(shí)施例19，表1)比較，可以看出R-PE和化合物3之間的雙光子熒光信號(hào)比率已明顯改變。
在溶液測(cè)量(表1)中，R-PE化合物3的信號(hào)比率是34(618/18＝34)，對(duì)R-PE有利，而在顆粒測(cè)量(表2)中該比率是僅3.2(25.6/8＝3.2)，對(duì)R-PE有利。
表2在無(wú)分離AFP免疫分析中由微顆粒的表面測(cè)定的雙光子熒光(TPF)信號(hào)。零AFP濃度的信號(hào)主要源自溶液中的游離示蹤劑(＝本底信號(hào))AFP濃度 TPF信號(hào)TPF信號(hào) TPF信號(hào)[ng/ml] (R-PE示蹤劑) (Alexa 532示蹤劑) (化合物3示蹤劑)01.80 0.720.5012.75 1.350.7123.10 1.401.0054.20 2.401.5010 6.90 3.502.0050 25.6 12.08.00200 61.0 20.018.0500 64.0 22.038.0實(shí)施例22單脈沖作用的測(cè)量難以直接測(cè)量通過(guò)單脈沖作用而產(chǎn)生的猝滅。但它可間接地通過(guò)測(cè)定染料溶液中的軸向分辨率而測(cè)定。深度組分(z-響應(yīng))最容易改變分辨率。z-響應(yīng)通過(guò)使用描述于圖5的儀器測(cè)定。圖5沖的樣品比色杯被替換為一對(duì)顯微鏡載片。染料溶液放在這兩個(gè)顯微鏡載片之間。隨著染料溶液樣品慢慢移向焦點(diǎn)，記錄升高的信號(hào)的斜率。最大信號(hào)出現(xiàn)在焦點(diǎn)區(qū)完全覆蓋樣品時(shí)。記錄各種染料的20％-80％熒光強(qiáng)度距離并在表3中給出。二吡咯亞甲基二氟化硼染料的20％-80％熒光強(qiáng)度距離值小于R-藻紅素或若丹明B的同一值。因此，二吡咯亞甲基二氟化硼染料在使用具有高雙光子激發(fā)效率的激光器的雙光子激發(fā)體系中提供比若丹明或R-PE更好的空間分辨率和更好的信號(hào)-本底比率。該結(jié)果與描述于實(shí)施例21的微顆粒測(cè)量的結(jié)果非常一致。
表3所選雙光子熒光染料的雙光子20％-80％熒光強(qiáng)度距離值。
熒光染料 20％-80％熒光強(qiáng)度距離值[a.u.]二吡咯亞甲基二氟化硼染料化合物3 11.5化合物8 12.6BODIPY 530/550 12.2BODIPY 558/568 13.7BODIPY 564/576 14.1若丹明B 16.5R-PE 21.5實(shí)施例23低聚核苷酸用化合物6和用化合物8標(biāo)記向5′-氨基改性的低聚核苷酸(17 bases(鹽基)，28μg，5nmol)在碳酸鹽緩沖劑(200μl，100mM，pH8.5)中的溶液加入在無(wú)水DMF(50μl)中的40倍過(guò)量的標(biāo)記試劑(化合物6或8)。反應(yīng)混合物在22℃下保溫20h。標(biāo)記低聚核苷酸通過(guò)使用反相HPLC(RP-18柱)和梯度洗脫技術(shù)純化。溶劑是A在三乙基乙酸銨緩沖劑(50mM，pH7)中的2％乙腈和B在三乙基乙酸銨緩沖劑(50mM，pH7)中的70％乙腈。梯度從5％溶劑B開(kāi)始和溶劑B的量在25分鐘內(nèi)線性地升至40％。染料-低聚核苷酸軛合物(標(biāo)以化合物6或化合物8)在18-22分鐘內(nèi)被洗脫，而未標(biāo)記低聚核苷酸在10分鐘的時(shí)間點(diǎn)被洗脫。未鍵接標(biāo)記試劑通過(guò)增加溶劑B的量至100％從柱中去除。
標(biāo)記低聚核苷酸的濃度用分光光度法測(cè)定。得到標(biāo)記產(chǎn)率25％(化合物6)和20％(化合物8)。標(biāo)記低聚核苷酸被稀釋至等摩爾濃度和熒光產(chǎn)率通過(guò)單和雙光子激發(fā)技術(shù)測(cè)定。結(jié)果，標(biāo)以化合物8的低聚核苷酸的熒光產(chǎn)率與標(biāo)以化合物6的低聚核苷酸相比結(jié)果高一個(gè)數(shù)量級(jí)。相同的結(jié)果通過(guò)單-和雙光子激發(fā)技術(shù)得到。標(biāo)以化合物8的低聚核苷酸的較高熒光產(chǎn)率可解釋為標(biāo)記化合物的親水性增加以及標(biāo)記和低聚核苷酸之間距離增加。
實(shí)施例24鼠IgG抗AFP用熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料(6和8)標(biāo)記。
向0.2mg(1.25nmol)鼠IgG抗AFP(克隆A)在40μl磷酸鹽緩沖鹽水(10/150mM，pH7.4)中的溶液加入在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺中的5倍過(guò)量(6.25nmol)的化合物6或化合物8。加入4μl NaHCO3(1M，aq)并將混合物在室溫下保溫3h。產(chǎn)物用NAP-5凝膠過(guò)濾柱(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)使用磷酸鹽緩沖鹽水(50/150，10mM NaN3，pH7.4)作為洗脫劑純化。收集快速移動(dòng)著色級(jí)分。用分光光度法測(cè)定這些蛋白質(zhì)軛合物(化合物6和8)的標(biāo)記度。得到2.3(化合物6)和2.5(化合物8)熒光團(tuán)/蛋白質(zhì)的標(biāo)記度。
實(shí)施例25標(biāo)以化合物6和化合物8的抗體示蹤劑在微顆?；庖叻治鲋械谋容^AFP分析通過(guò)使用3.2μm羧基改性的聚苯乙烯微顆粒(羧基改性的微球PC05N，Bangs Laboratories，Inc.，F(xiàn)ishers，IN，U.S.A.)作為固相而進(jìn)行。鼠單克隆抗AFP IgG(克隆B)通過(guò)使用EDAC(1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺)偶聯(lián)方法(TechNote#205，BangsLaboratories，Inc.，F(xiàn)ishers，IN，U.S.A.)共價(jià)偶聯(lián)到微顆粒上?？笰FP涂覆微顆粒的原料懸浮液用TRIS pH8.0分析緩沖劑稀釋至顆粒濃度1.5·107顆粒/ml。鼠單克隆IgG抗AFP(克隆A)被標(biāo)以二吡咯亞甲基二氟化硼染料(化合物6或8)和用作示蹤劑。示蹤劑用分析緩沖劑稀釋至濃度16nM。將5μl微顆粒懸浮液和5μl示蹤劑與10μlα-1-胎兒球蛋白標(biāo)準(zhǔn)物(X0900，Dako A/S，Denmark)混合在一起。反應(yīng)混合物在37℃下保溫2小時(shí)和在同一反應(yīng)比色杯中使用圖5示意給出的實(shí)驗(yàn)裝置中測(cè)定。結(jié)果匯總于表4和5。
表4使用標(biāo)以化合物6的示蹤劑的AFP免疫分析。所有的濃度點(diǎn)由6個(gè)平行樣品測(cè)定。
2PF-信號(hào)AFP濃度(6個(gè)平行測(cè)量 標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù)信號(hào)-本底[ng/ml]的平均值) SD (％)CV (S-S0)0 6.03 9.03149.66 0.000.13.02 0.6722.26 -3.011 6.63 5.1477.46 0.605 12.74 3.2825.71 6.7110 18.18 3.6319.96 12.1520 45.01 7.8317.40 38.98100141.46 23.13 16.35 135.43400249.48 27.66 11.09 243.451000 260.98 31.94 12.24 254.95分析的靈敏度通常通過(guò)計(jì)算平行樣品在零分析物濃度下的信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)而確定。給出的信號(hào)大于3SD(在零分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差乘以因子3)的分析物的最低濃度一般用于確定分析的靈敏度。
分析的靈敏度受到例如描述于實(shí)施例21的本底信號(hào)(信號(hào)-本底比率)和受到測(cè)量的重復(fù)能力的極大影響。
表5使用標(biāo)以化合物8的示蹤劑的AFP免疫分析。所有的濃度點(diǎn)由6個(gè)平行樣品測(cè)定。
2PF-信號(hào)AFP濃度(6個(gè)平行測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù) 信號(hào)-本底[ng/ml]的平均值) SD (％)CV(S-S0)0 5.110.28 5.46 0.000.15.880.26 4.47 0.771 7.050.35 5.00 1.945 13.36 0.79 5.95 8.2510 20.65 1.52 7.38 15.5420 39.37 3.80 9.66 34.26100140.33 20.2514.43135.23400274.69 16.796.11 269.581000 333.22 12.453.74 328.12在表4和5中給出的結(jié)果清楚地表明，標(biāo)以親水二吡咯亞甲基二氟化硼染料(化合物8)的示蹤劑提供更靈敏的分析。兩種示蹤劑之間在3SD值上的差異驚人地大，超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)(3SD化合物8＝0.84對(duì)3SD化合物6＝27)。這意味著，標(biāo)以親水二吡咯亞甲基二氟化硼染料(化合物8)的示蹤劑提供比標(biāo)以憎水二吡咯亞甲基二氟化硼染料(化合物6)的示蹤劑好一個(gè)數(shù)量級(jí)的分析靈敏度。平均上，這兩種示蹤劑得到的響應(yīng)取決于分析物濃度，而標(biāo)以親水二吡咯亞甲基二氟化硼染料(化合物8)的示蹤劑具有稍高的信號(hào)水平。另外，標(biāo)以親水二吡咯亞甲基二氟化硼染料(化合物8)的示蹤劑與標(biāo)以憎水染料(化合物6)的示蹤劑相比在整個(gè)分析范圍內(nèi)提供明顯較小的信號(hào)變異(變異系數(shù))。
可以理解，本發(fā)明方法可以各種實(shí)施方案的形式來(lái)體現(xiàn)，其中僅少數(shù)實(shí)施方案在本文中公開(kāi)。對(duì)本領(lǐng)域?qū)＜绎@然的是，存在其它不背離本發(fā)明主旨的實(shí)施方案。因此，所述實(shí)施方案是說(shuō)明性的和不應(yīng)構(gòu)成限制性的。
權(quán)利要求
1.一種由包含微顆粒作為生物親和性結(jié)合固相，標(biāo)以雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料的生物特異第二試劑的生物流體或懸浮液測(cè)量分析物的無(wú)分離生物分析方法，包括將激光聚焦到反應(yīng)懸浮液中，當(dāng)單個(gè)微顆粒無(wú)規(guī)漂浮或被激發(fā)激光的輻射壓力引導(dǎo)通過(guò)焦點(diǎn)區(qū)的激光束時(shí)由其測(cè)量雙光子激發(fā)熒光，特征在于所述雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料具有結(jié)構(gòu)(II)， 其中至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基，噁唑基，異噁唑基，氧雜二唑基，咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，吲哚基，共軛乙烯基，二烯基或三烯基；和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到可用于選擇共價(jià)鍵接到其它分子上的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到水增溶基團(tuán)；和剩余的基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7分別獨(dú)立地選自氫，鹵素，烷基，氰基，和羧基，分別可任選地被取代。
2.一種由包含微顆粒作為生物親和性結(jié)合固相，標(biāo)以雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料的生物特異第二試劑的生物流體或懸浮液測(cè)量分析物的無(wú)分離生物分析方法，包括將激光聚焦到反應(yīng)懸浮液中，當(dāng)單個(gè)微顆粒無(wú)規(guī)漂浮或被激發(fā)激光的輻射壓力引導(dǎo)通過(guò)焦點(diǎn)區(qū)的激光束時(shí)由其測(cè)量雙光子激發(fā)熒光，特征在于所述雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料具有結(jié)構(gòu)(II)， 其中基團(tuán)R1，R2，R3，R5，R6和R7是取代的或未取代的烷基；R4是氫，或取代的或未取代的烷基；和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到可用于選擇共價(jià)鍵接到其它分子上的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；和至少一個(gè)基團(tuán)R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到水增溶基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分析方法，特征在于化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)是羧酸，羧酸反應(yīng)性酯，羧酸酐，馬來(lái)酰亞胺，磺酰氯，磺?；?，肼，胺，醇，?；B氮化物，異氰酸酯，醛，鹵代乙酰胺，三嗪或異硫氰酸鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的分析方法，特征在于所述化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)是琥珀酰亞胺基酯。
5.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的分析方法，特征在于水增溶基團(tuán)是磺酸或羧酸的銨或堿金屬鹽，銨或羥基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的分析方法，特征在于R1是取代的或未取代的2-噻吩基，2-吡咯基，苯基或苯基乙烯基和至少一個(gè)基團(tuán)R2，R3，R4，R5，R6或R7是 其中X+是陽(yáng)離子；和剩余的基團(tuán)R2，R3，R4，R5，R6或R7分別獨(dú)立地是氫或烷基。
7.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的分析方法，特征在于所述生物特異第二試劑是選自半抗原，生物活性配體，藥物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白質(zhì)，抗體和抗體的片段的生物活性分子。
8.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的分析方法，特征在于所述分析物是選自半抗原，生物活性配體，藥物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白質(zhì)，抗體，和抗體的片斷的生物活性分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由包含微顆粒作為生物親和性結(jié)合固相，標(biāo)以雙光子熒光染料的生物特異第二試劑的生物流體或懸浮液測(cè)量分析物的無(wú)分離生物分析方法，包括將激光聚焦到反應(yīng)懸浮液中，當(dāng)單個(gè)微顆粒無(wú)規(guī)漂浮或被激發(fā)激光的輻射壓力引導(dǎo)通過(guò)焦點(diǎn)區(qū)的激光束時(shí)由其測(cè)量雙光子激發(fā)熒光，其中使用一種雙光子熒光二吡咯亞甲基二氟化硼染料。該染料具有結(jié)構(gòu)(II)；和至少一個(gè)基團(tuán)R
文檔編號(hào)G01N33/58GK1526071SQ02813441
公開(kāi)日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2002年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月2日
發(fā)明者N·梅爾托拉, A·索伊尼, N 梅爾托拉, 聊 申請(qǐng)人:北極醫(yī)療診斷有限公司