專利名稱：封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯－殼型粒子及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子及其制造方法。本發(fā)明的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子，由于在表層上以刷(ブラシ)狀擔(dān)載有帶反應(yīng)性官能基的水溶性高分子化合物[比如聚乙二醇(PEG)]的粒子的內(nèi)部封入了可以檢出的物質(zhì)，在最外殼上具有能夠和其他物質(zhì)結(jié)合的活性殘基，所以能夠用做簡(jiǎn)單而且高靈敏度的標(biāo)識(shí)物質(zhì)。
背景技術(shù)：
為了使微量的物質(zhì)視覺化，或者為了將其定量，開發(fā)了種種的標(biāo)識(shí)物。特別是需要高靈敏度的領(lǐng)域，放射性同位素是代表性的標(biāo)識(shí)物，作為代表性的例子，使用了氚或放射性碘等，由膠片進(jìn)行感光，或者由閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射能的形式予以檢出。
作為不受處理放射性物質(zhì)限制影響的方法，接著開發(fā)了酶標(biāo)識(shí)法。開發(fā)了過(guò)氧化酶、堿性磷酸酯酶、葡糖氧化酶或β-D-半乳糖酶等對(duì)抗原或抗體的標(biāo)識(shí)方法，確立了由組織切片的染色法進(jìn)行觀察，適用于酶免疫測(cè)定法的定量方法。
另外，作為組織切片的染色法，用熒光物質(zhì)(比如熒光素或羅丹明)標(biāo)識(shí)抗體，在反應(yīng)以后用熒光顯微鏡觀察的方法是已知的。由于此方法不使用放射性物質(zhì)，在使用不受限制、沒有象酶那樣的和基質(zhì)加成反應(yīng)的步驟等方面，這都是方便之處，但作為標(biāo)識(shí)其絕對(duì)的靈敏度不足是個(gè)缺點(diǎn)。
這種熒光物質(zhì)標(biāo)識(shí)法之一的發(fā)展型是時(shí)間分解熒光測(cè)定術(shù)。對(duì)以銪螯合物為代表的熒光消光時(shí)間長(zhǎng)的熒光物質(zhì)送以脈沖激勵(lì)光，在起因于直接的激勵(lì)光或周邊物質(zhì)的短熒光消光的一定時(shí)間后測(cè)定熒光，通過(guò)測(cè)定銪的特異性熒光，其測(cè)量的精度和靈敏度都得以提高的方法。
為了進(jìn)一步提高靈敏度，試圖將此銪螯合物封閉在聚苯乙烯粒子中，通過(guò)增加每一個(gè)粒子中熒光物質(zhì)的質(zhì)量來(lái)提高靈敏度。在此方法中，每一個(gè)粒子的熒光量確實(shí)增加，但由于聚合物的疏水性，粒子表面也為疏水性，在生物學(xué)反應(yīng)中使用時(shí)，具有與在環(huán)境中存在的許多疏水性物質(zhì)發(fā)生粘連的不利點(diǎn)，必須在弄清楚以后才能使用也是個(gè)缺點(diǎn)。
另外，也是為了提高靈敏度，作為追求操作簡(jiǎn)單的手段，還試圖把色素封閉在聚苯乙烯粒子中，在聚苯乙烯粒子表面涂布抗原或者抗體作為試劑，通過(guò)視覺檢測(cè)由抗原抗體反應(yīng)固定化的聚苯乙烯粒子。
作為公知的技術(shù)已知的，將色素或熒光物質(zhì)封閉在聚苯乙烯粒子中作為標(biāo)識(shí)物質(zhì)的方法，操作簡(jiǎn)便，或者能夠得到一定程度的靈敏度，在此意義上是優(yōu)異的，但是，由于表面是疏水性聚苯乙烯這一特點(diǎn)，所以使用了(1)在結(jié)合了想涂布的抗原或抗體等功能性分子后，在非結(jié)合表面上涂布蛋白質(zhì)或各種生體物質(zhì)的類似物以覆蓋隱藏聚苯乙烯的疏水性的方法，或者，(2)反應(yīng)時(shí)在液體中添加表面活性劑防止聚苯乙烯粒子相互影響的方法等辦法，但由這些非特異性反應(yīng)進(jìn)行判斷有時(shí)還是會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤。
如此，與使用聚苯乙烯粒子作為載體，用封閉劑使此粒子穩(wěn)定化的方法，或者，在反應(yīng)時(shí)的緩沖液中加入添加劑抑制非特異性反應(yīng)的方法等相對(duì)應(yīng)，在靈敏度和特異性這些方面還是有問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題就是提供封入了信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的粒子及其制造方法，該粒子是能夠作為標(biāo)識(shí)物質(zhì)使用的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的粒子，能夠不受比如環(huán)境物質(zhì)或生體成分等非特異性反應(yīng)的影響，且靈敏度高、而且可簡(jiǎn)便配制。
由按照本發(fā)明的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子就能夠解決上述課題，該粒子由(1)基本上由水不溶性高分子化合物組成的芯部分和(2)基本上由具有反應(yīng)性官能基的水溶性高分子化合物組成且以刷狀覆蓋于前述芯部分表面的殼部分構(gòu)成，且上述芯部分和上述殼部分，作為整體，是由水不溶性高分子和水溶性高分子的嵌段聚合物形成的，其特征在于，在上述芯部分中封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)。
本發(fā)明還涉及封入上述信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子的配制方法，其特征在于，通過(guò)使(a)芯-殼型粒子和(b)信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)浸漬在含有能夠膨潤(rùn)上述水不溶性高分子化合物的有機(jī)溶劑的溶液中，從而將上述信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)封入芯部分，該芯-殼型粒子由(1)基本上由水不溶性高分子化合物組成的芯部分和(2)基本上由具有反應(yīng)性官能基的水溶性高分子化合物組成并以刷狀覆蓋在上述芯部分表面上的殼部分構(gòu)成，而且上述芯部分和上述殼部分，作為整體，是由水不溶性高分子和水溶性高分子的嵌段聚合物形成的。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是在實(shí)施例1(1)中配制的嵌段聚合物的1H-NMR波譜；圖2是在實(shí)施例1(2)中得到的在醛末端覆蓋PEG粒子的掃描電子顯微鏡(SEM)照片；圖3是在實(shí)施例1(2)中得到的比較用在醛末端覆蓋PEG粒子的SEM照片；圖4是顯示用封入銪螯合物的粒子，通過(guò)免疫試驗(yàn)法的CRP測(cè)定結(jié)果的圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳形態(tài)以下詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
由(1)以水不溶性高分子化合物為主要成分的芯部分、(2)以具有反應(yīng)性官能基的水溶性高分子化合物為主要成分，而且以刷狀覆蓋在上述芯部分表面的殼部分組成的芯-殼型粒子，即在以水不溶性高分子化合物為主要成分的芯部分的表面上，具有在表層上存在著反應(yīng)性官能基的水溶性高分子化合物刷的芯-殼型粒子，其本身是公知的。
在本發(fā)明中，能夠在形成芯部分時(shí)使用的水不溶性高分子化合物是在水中不溶解的高分子化合物，而且在形成芯部分時(shí)，只要是其內(nèi)部可以封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的高分子化合物，就沒有其他特別的限制。作為上述水不溶性高分子化合物，可以舉出比如疏水性聚合物[比如，聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(丙烯酸-2-羥基乙酯)、聚(N-異丙基丙烯酰胺)、聚異戊二烯、聚氯乙烯、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、或者聚己內(nèi)酰胺等]、水溶性聚合物(比如聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚烯丙基胺或聚丙烯酸等)的交聯(lián)凝膠或水不溶性天然高分子化合物(例如動(dòng)物膠或多糖等)等。
在本發(fā)明中，上述的芯部分可以基本上只由上述水不溶性高分子化合物中的一種，或者基本上由兩種以上的上述水不溶性高分子化合物組合而形成。
上述芯部分的形狀也沒有特別的限制，一般是大致的球狀或大致橢球狀。上述芯部分的尺寸也沒有特定的限制，可根據(jù)用途做適當(dāng)?shù)淖兓?，但大致球狀的芯部分，其直徑一般?～500nm左右。
在本發(fā)明中，可用來(lái)形成殼部分的水溶性高分子化合物是直鏈狀的高分子化合物，在其一端的末端(結(jié)合末端)能夠于芯部分的表面結(jié)合，同時(shí)另一端的末端(自由末端)具有反應(yīng)性官能基或者能夠?qū)敕磻?yīng)性官能基，而且只要能夠以刷狀配置在上述芯部分的表面上就沒有特定的限制。在本說(shuō)明書中，所謂“以刷狀覆蓋在芯部分表面上的殼部分”意味著，其殼部分由許多直鏈狀水溶性高分子化合物組成，它們的直鏈狀水溶性高分子化合物的一端的結(jié)合末端各自與芯部分的表面結(jié)合，而另一端的自由末端，在至少使水溶性高分子化合物和導(dǎo)入物(比如抗原或抗體)反應(yīng)的反應(yīng)液中，以絲狀或棒狀從表面突出到其反應(yīng)液系統(tǒng)中。此外，由于在這些刷狀水溶性高分子化合物鏈的自由末端存在有可與各自導(dǎo)入物[例如、生理活性物質(zhì)(例如、抗體、酶或DNA)]結(jié)合的反應(yīng)性官能基，所以殼部分的最外殼被許多反應(yīng)性官能基覆蓋。
作為上述水溶性高分子化合物，可以舉出比如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚氨基酸、聚丙烯酸、聚丙烯酸二甲基氨基乙酯或聚烯丙基胺等，優(yōu)選PEG或聚乙烯醇。
在本發(fā)明中，對(duì)于構(gòu)成殼部分的水溶性高分子化合物鏈，各個(gè)高分子化合物鏈可以基本上只由一種上述水溶性高分子化合物形成，或者各個(gè)高分子化合物鏈基本上由兩種以上的彼此不同的上述水不溶性高分子化合物組合構(gòu)成。
構(gòu)成上述殼部分的水溶性高分子化合物鏈優(yōu)選基本上完全覆蓋上述芯部分的整個(gè)表面。而構(gòu)成上述殼部分的各個(gè)水溶性高分子化合物鏈各具有基本上相同的長(zhǎng)度，優(yōu)選由各個(gè)水溶性高分子化合物鏈的自由末端形成大致球狀或大致橢球狀的殼部分外殼表面。
上述芯部分的直徑和上述殼部分厚度之比可隨用途不同而適當(dāng)變化。比如芯部分的直徑可以為5～500nm，而殼部分的厚度可以為比如5～500nm。
作為在上述水溶性高分子化合物鏈的自由末端上存在的反應(yīng)性官能基，可以在上述水溶性高分子化合物一端的末端(結(jié)合末端)與芯部分表面結(jié)合以前就存在于另一端的末端(自由末端)，或者可以在上述水溶性高分子化合物一端的末端(結(jié)合末端)與芯部分表面結(jié)合以后導(dǎo)入到另一端的末端(自由末端)。這些反應(yīng)性官能基在水(或水系溶劑)中都是穩(wěn)定的，而且只要是能夠與本發(fā)明的在封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子作為標(biāo)識(shí)物質(zhì)使用時(shí)的導(dǎo)入物[比如生理活性物質(zhì)(比如抗體、酶或DNA)]反應(yīng)的官能基，就沒有特定的限制，可以舉出比如醛基、羧基、巰基、氨基、馬來(lái)酰亞胺基、乙烯基砜基或甲磺?；?，優(yōu)選醛基、氨基、羧基或馬來(lái)酰亞胺基。
作為在以水不溶性高分子化合物為主要成分的芯部分表面上具有在表層上存在反應(yīng)性官能基的水溶性高分子化合物刷的芯-殼型粒子的配制方法，至今已經(jīng)報(bào)告了許多公知的方法是能夠適用的，作為上述公知的方法，可以舉出比如(1)將(a)具有反應(yīng)性官能基的親水性鏈段和疏水性鏈段結(jié)合而成的嵌段共聚物(親-疏水型嵌段共聚物)和(b)疏水性聚合物混合，配制粒子的乳液法；(2)以具有反應(yīng)性官能基的水溶性高分子大單體作為分散劑使疏水性單體聚合的分散聚合法；或(3)在水凝膠粒子表面導(dǎo)入水溶性高分子化合物刷的方法等。
作為在上述乳液法(1)中使用的親-疏水型嵌段共聚物的合成方法和在上述分散聚合法(2)中使用的具有反應(yīng)性官能基的水溶性高分子大單體的合成方法，可以使用比如本發(fā)明人及其共同研究者已經(jīng)開發(fā)的方法(比如WO 96/33233、WO 99/571743或特開平11-322917)。
作為能夠作為上述親-疏水型嵌段共聚物或水溶性高分子大單體使用的化合物是比如在WO 96/33233中敘述的如通式(1A)表示的雜遙爪嵌段共聚物(ヘトロテレケリックブロックコポリマ-) 。上述通式(1A)表示的雜遙爪嵌段共聚物可以按照在比如WO 96/33323中所述的制造方法配制。
而作為可以當(dāng)作上述親-疏水型嵌段共聚物或水溶性高分子大單體使用的化合物，可以舉出比如在WO 99/571743中敘述的用通式(IB)表示的聚氧亞乙基衍生物 (式中，A’和B’各自獨(dú)立地表示有機(jī)甲硅烷基型的氨基保護(hù)基，或者是和與它們相連的氮原子一起能夠形成4～7員硅氮環(huán)雜環(huán)式環(huán)的有機(jī)甲硅烷基型氨基保護(hù)基，Y是氫原子、堿金屬或能夠通過(guò)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)可導(dǎo)入取代堿金屬的有機(jī)基團(tuán)，R是氫原子或碳原子數(shù)1～6的烷基，nB是1～20,000的整數(shù)，mB是0～20,000的整數(shù))。以上述通式(IB)表示的聚氧亞乙基衍生物可以按照比如在WO 99/571743中所述的制造方法配制。
再有，作為可當(dāng)作上述親-疏水型嵌段共聚物或水溶性高分子大單體使用的化合物，可以舉出比如在特開平11-322917中用通式(IC)表示的含有有機(jī)甲硅烷基硫基的化合物或聚氧亞乙基衍生物 (式中，R1C、R2C和R3C各自獨(dú)立地表示直鏈或分支的烷基或芳烷基，ZC選自氫原子、丙烯?；?、甲基丙烯?；?、乙烯基芐基、烯丙基、p-甲苯磺?；?、單-或二-低級(jí)烷基取代的氨基、具有羧基或其酯的烷基、具有醛基或其縮醛基的烷基以及堿金屬，mC是0或1，nC是0～20000的整數(shù)，pC是正數(shù)2或3，但mC、nC不同時(shí)是0)。用上述同時(shí)(IC)表示的具有有機(jī)甲硅烷基硫基的化合物或聚氧亞乙基衍生物，可按照在特開平11-322917中所述的制造方法配制。
按照芯-殼型粒子的上述乳液法(1)，將上述用通式(IA)、(IB)或(IC)表示的各化合物(即親-疏水型嵌段共聚物)和疏水性聚合物混合，就能夠配制出芯-殼型粒子(即封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)前的粒子)。
按照芯-殼型粒子的上述分散聚合法(2)，將以上述通式(IA)、(IB)或(IC)表示的各個(gè)化合物(即水溶性高分子大單體)作為分散劑，通過(guò)使疏水性單體聚合就能夠配制出芯-殼型粒子(即封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)前的粒子)。
可以在本發(fā)明中使用的信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)，只要是即使在封入芯-殼型粒子的芯部分的狀態(tài)下也能從芯-殼型粒子的外側(cè)分析出(包括檢出和測(cè)定)其信號(hào)的物質(zhì)即可，沒有特定的限制，可以舉出比如熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或色素。
作為上述的熒光物質(zhì)，可以舉出比如鑭系螯合物(比如鑭螯合物、鈰螯合物、鐠螯合物、釹螯合物、钷螯合物、釤螯合物、銪螯合物、釓螯合物、鋱螯合物、鏑螯合物、鈥螯合物、餌螯合物、銩螯合物、鐿螯合物或釕螯合物，優(yōu)選銪螯合物或鋱螯合物)、熒光素異氰酸酯、二氯三嗪基熒光素或四甲基羅丹明異氰酸酯。
作為上述色素，可以舉出比如甲基黃、溶劑藍(lán)-35、油性橙SS或油性紅EGN。
封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子的直徑可根據(jù)不同的用途而變化，在大致球狀粒子的情況下，可以是10nm～1mm左右。
本發(fā)明的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子可以由比如本發(fā)明的制造方法配制。
為了用本發(fā)明的制造方法，例如在由前面說(shuō)明的各種公知的方法配制的芯-殼型粒子(即封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)前的粒子)中封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)，首先，在含有一定量能夠使形成芯殼型粒子的芯部分的水不溶性高分子化合物膨潤(rùn)的有機(jī)溶劑(比如丙酮或甲苯等)中，浸漬上述芯-殼型粒子和信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)(比如具有疏水性質(zhì)的色素或熒光物質(zhì)等)。通過(guò)上述浸漬，使上述水不溶性的高分子化合物膨潤(rùn)，伴隨著此膨潤(rùn)使信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)進(jìn)入芯部分。接著，當(dāng)從此混合物中除去有機(jī)溶劑時(shí)，上述水不溶性高分子化合物收縮，疏水的信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)不能從芯部分中離開到外面去，從而封入到芯部分中。根據(jù)希望通過(guò)除去沒有進(jìn)入芯部分的信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)就能夠得到本發(fā)明的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子。
在按照本發(fā)明的制造方法中，作為從上述混合物中除去有機(jī)溶劑的方法沒有特定的限制，但可以舉出比如通過(guò)蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥有機(jī)溶劑的方法，或者在非溶劑中收縮的方法(比如把含有有機(jī)溶劑的溶液置換成不含上述上述有機(jī)溶劑溶液的方法)等。
在用于使芯部分膨潤(rùn)的上述含有有機(jī)溶劑的溶液中，有機(jī)溶劑的含有比例，要達(dá)到使信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)進(jìn)入水不溶性高分子化合物的程度，只要其比例能夠使上述水不溶性高分子化合物膨潤(rùn)就沒有特別的限定，可以是比如40～60(vol/vol)％。
在本發(fā)明中，在存在于本發(fā)明封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子表面上的反應(yīng)性官能基上，還能夠結(jié)合上可與上述反應(yīng)性官能基反應(yīng)的導(dǎo)入物(比如生理活性物質(zhì))。
上述導(dǎo)入物，只要能夠與存在于封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子表面上的反應(yīng)性官能基反應(yīng)即可，沒有特別的限定，可以舉出比如蛋白質(zhì)(比如抗體或酶)或核酸(比如DNA或RNA)或細(xì)胞等。
導(dǎo)入物和與存在于封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子表面上的反應(yīng)性官能基結(jié)合的方法，可以根據(jù)上述導(dǎo)入物和反應(yīng)性官能基的種類從公知的結(jié)合方法中進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
比如，在活性官能團(tuán)是醛基的情況下，可以通過(guò)和生理活性物質(zhì)[比如蛋白質(zhì)(如抗原、抗體或受體等)、肽、低分子激素或DNA等]的氨基形成席夫堿，由此而結(jié)合。
而在反應(yīng)性官能基是羧基的情況下，可以使用縮合劑(比如碳化二亞胺等)進(jìn)行與生理活性物質(zhì)的氨基之間的結(jié)合?；蛘哳A(yù)先用琥珀酰亞胺或馬來(lái)酰亞胺將羧基活化，然后將其原樣與生理活性物質(zhì)混合也能夠結(jié)合。
實(shí)施例下面，通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1(1)合成縮醛-PEG-PLA-甲基丙烯酰氬氣下，在室溫的反應(yīng)容器中加入40mL溶劑四氫呋喃(THF)，然后加入0.32mL(2mmol)3，3’-二乙氧基-1-丙醇，再加入6.2mL(2mmol)濃度為0.3263mol/L的萘鉀絡(luò)合物在THF中的溶液，攪拌15min進(jìn)行金屬化。用冷卻的注射器加入12mL(240mmol)環(huán)氧乙烷后，在室溫下攪拌2天，進(jìn)行開環(huán)聚合。然后加入84mL(84mmol)濃度為1mol/L的DL-丙交酯THF溶液，在室溫下進(jìn)行聚合3h。然后加入4.5mL(28mmol)甲基丙烯酸酐，在室溫下攪拌2天，然后停止反應(yīng)。
將得到的嵌段共聚物溶液在冷卻到-15℃的2-丙醇中進(jìn)行再沉淀，然后在-10℃下以6,000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心分離40min，除去溶劑。在重復(fù)此操作2次對(duì)嵌段共聚物進(jìn)行精制以后，將其溶解于苯，進(jìn)行冷凍干燥。
圖1上顯示的是此嵌段共聚物的1H-NMR波譜。聚乙二醇(PEG)的分子量由GPC的結(jié)果計(jì)算出。聚乳酸(PLA)的分子量由1H-NMR的結(jié)果，使用由GPC測(cè)量得到的PEG分子量計(jì)算出。PEG的分子量大約為5000，PLA的分子量大約為500。
(2)配制醛末端覆蓋有PEG的粒子氬氣下，在室溫的反應(yīng)容器中加入160mL用氬氣置換的超純水，然后在攪拌(400rpm)下滴加用氬氣置換的30mg偶氮二異丁腈(AIBN)和3.4g嵌段共聚物[在實(shí)施例1(1)中配制的]在2mL苯乙烯中的溶液。
在室溫下攪拌30min后，在60℃下攪拌(400rpm)18h，在80℃下再攪拌(400rpm)6h，由此進(jìn)行聚合。在聚合反應(yīng)結(jié)束以后，用濾紙[Filter paper 2(直徑＝185mm)，Advantec公司制造]進(jìn)行過(guò)濾將樹脂塊和碎屑分開，得到在表層上具有縮醛基的顆粒(acetalfunctionalized particle)。將此顆粒分散在水中，然后用1mol/L的鹽酸將上述顆粒分散液的pH值調(diào)節(jié)到2.0，然后再攪拌2h。隨后用1mol/L的NaOH將pH值調(diào)節(jié)到5.0，將保護(hù)基縮醛基解保護(hù)，在表層上導(dǎo)入醛基。
此后，為了進(jìn)行脫鹽，將100mL此顆粒分散液對(duì)2L蒸餾水進(jìn)行一天的透析[分級(jí)分子量(MWCO)＝12000～14000，交換蒸餾水4次]，然后用濾紙[Filter paper 2(直徑＝185mm)，Advantec公司制造]進(jìn)行過(guò)濾，得到表層具有醛基的顆粒(aldehyde functionalizedparticle)，即醛末端嵌段聚合物-苯乙烯粒子(粒徑＝65nm)。將得到的粒子(PEG分子量＝大約5000，PLA分子量＝大約500)進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)照相，如在圖2所示。
在實(shí)施例1(1)中，在進(jìn)行環(huán)氧乙烷的開環(huán)聚合后，除了不加入DL-丙交酯THF溶液而加入甲基丙烯酸酐以外，重復(fù)如實(shí)施例1(1)和實(shí)施例1(2)的操作，配制PLA單元的長(zhǎng)度變化了的比較用粒子(PEG分子量＝大約5000，PLA分子量＝0)，得到的比較用粒子的SEM照片顯示在圖3中。
(3)配制封入銪螯合物的粒子在1mL六水合氯化銪的水溶液(22mg/mL，蒸餾水)中加入1mL噻吩(チエノイル)甲酰三氟丙酮(TTA)的丙酮溶液(37mg/mL)，再加入2mL三辛基膦氧化物(TOPO)的丙酮溶液(43.5mg/mL)，配制成銪螯合物溶液。
另外，在5mL在實(shí)施例1(2)中配制的醛末端嵌段聚合物-苯乙烯粒子(粒徑＝65nm)的懸浮液(18mg/mL，蒸餾水)中加入5mL丙酮并攪拌。在此混合液中加入0.12mL預(yù)先配制的銪螯合物溶液，再攪拌10sec。攪拌結(jié)束后，在室溫和避光下靜置30min以后，吹入氮?dú)獬ケ?。此后，不取出粒子，通過(guò)0.2μm的過(guò)濾器除去由于除去丙酮而沉淀的銪螯合物，就得到了本發(fā)明的封入銪螯合物的粒子。
實(shí)施例2(1)配制封入銪螯合物粒子標(biāo)識(shí)抗CRP的抗體在0.5mL在實(shí)施例1中配制的封入銪螯合物粒子中加入0.5mL的0.2mol/L磷酸緩沖液(pH值8.0)并攪拌以后，加入0.1mL抗C反應(yīng)蛋白質(zhì)(CRP)兔抗體F(ab’)2級(jí)分(20mg/mL生理食鹽水)混合，在室溫下靜置1h進(jìn)行反應(yīng)。上述抗CRP兔抗體F(ab’)2級(jí)分是按照通常的方法由抗CRP兔抗體(Dako公司)配制的。在此反應(yīng)液中，加入12mgNaBCNH3，在室溫下進(jìn)行15h的混合反應(yīng)。
將反應(yīng)液施用于用含有0.15M氯化鈉的50mM tris鹽酸緩沖液(pH值7.8)平衡化的フアクリルS-300柱子(1cm×45cm；藥用)上，以10mL/h的流速分級(jí)為1mL/管。
用紫外部分的吸光度來(lái)監(jiān)測(cè)最初溶出的粒子峰值，收集就成為裝入封入銪的粒子標(biāo)識(shí)的抗CRP抗體。
(2)由使用封入銪粒子標(biāo)識(shí)抗CRP抗體的免疫試驗(yàn)法測(cè)定CRP在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定使用的96穴板的各個(gè)穴中分別注入50μL的用生理食鹽水稀釋為4μg/mL的抗CRP兔抗體F(ab’)2級(jí)分，在4℃下靜置一夜形成涂層。用1/15mol/L磷酸緩沖液(PBS；pH值7.4)洗滌各穴3次以后，將0.25mL含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS分別注入各個(gè)穴中，在37℃下阻斷1h。
在用1/15mol/L的PBS(pH值7.4)洗滌各個(gè)穴3次以后，將各50μL用含有0.1％吐溫20和0.15M氯化鈉的50mM tris鹽酸緩沖液(pH值7.5)稀釋的CRP標(biāo)準(zhǔn)品分別注入各個(gè)穴中，在37℃下靜置1h進(jìn)行反應(yīng)。
在用1/15mol/L的PBS(pH值7.4)洗滌各個(gè)穴3次以后，將各50μL的在實(shí)施例2(1)中配制的封入銪粒子標(biāo)識(shí)CRP抗體的稀釋液[用含有0.1％吐溫20、0.2％BSA和0.15M氯化鈉的50mM tris鹽酸緩沖液(pH值7.5)稀釋1000倍]分別注入各個(gè)穴中，在37℃下靜置1h進(jìn)行反應(yīng)。
在用1/15mol/L的PBS(pH值7.4)洗滌各穴5次以后，用時(shí)間分解熒光光度計(jì)(ワラック公司)測(cè)定板的時(shí)間分解熒光量1sec。結(jié)果入在表1和圖4中所示。
表1CRP抗原濃度 時(shí)間分解熒光量(ng/mL)016110.14 17131.4 256614 19259140 152695產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)粒子，可用作生理活性物質(zhì)的標(biāo)識(shí)物質(zhì)，在進(jìn)行了利用生理活性物質(zhì)的活性的結(jié)合反應(yīng)后，由信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)靈敏度良好，能夠特異性地檢出測(cè)定的對(duì)象物質(zhì)。因此，這種封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的粒子，作為安全而簡(jiǎn)便的優(yōu)異的標(biāo)識(shí)物質(zhì)，可應(yīng)用于廣泛的領(lǐng)域中。
當(dāng)今，以高靈敏度測(cè)定在農(nóng)藥或環(huán)境激素等低分子量物質(zhì)，使各種生體引起異常時(shí)釋放到體液中的抗原或抗體，或者來(lái)自侵入生體內(nèi)的病毒的抗原、與其對(duì)抗的抗體、DNA或RNA等有意義的物質(zhì)是非常多的。因此，開發(fā)了用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)或色素等對(duì)測(cè)定的對(duì)象物質(zhì)具有結(jié)合活性的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)識(shí)，由各種操作法進(jìn)行測(cè)定的方法。但是，本發(fā)明的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)粒子，與公知的標(biāo)識(shí)物質(zhì)相比，是在靈敏度、操作容易以及非特異性反應(yīng)少等方面都很優(yōu)異的標(biāo)識(shí)物質(zhì)。
以上按著特定的形態(tài)說(shuō)明了本發(fā)明，本領(lǐng)域的從業(yè)人員所做的不言自明的各種改變或改良都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子，該粒子由(1)基本上由水不溶性高分子化合物組成的芯部分和(2)基本上由具有反應(yīng)性官能基的水溶性高分子化合物組成且以刷狀覆蓋于前述芯部分表面的殼部分構(gòu)成，且上述芯部分和上述殼部分，作為整體，是由水不溶性高分子和水溶性高分子的嵌段聚合物形成的，其特征在于，在上述芯部分中封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1中所述的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子，其中水溶性高分子化合物是聚乙二醇。
3.如權(quán)利要求1或2中所述的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子，其中水不溶性高分子化合物是聚苯乙烯。
4.如權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子，其中的反應(yīng)性官能基是醛基、氨基、羧基、馬來(lái)酰亞胺基或琥珀酰亞胺基。
5.如權(quán)利要求1～4中任何一項(xiàng)的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子，其中信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)是色素。
6.如權(quán)利要求1～4中任何一項(xiàng)的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子，其中信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)是熒光物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求1～4中任何一項(xiàng)的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子，其中信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)是鑭系螯合物。
8.制造權(quán)利要求1中所述的封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯-殼型粒子的方法，其特征在于，通過(guò)使(a)芯-殼型粒子和(b)信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)浸漬在含有能夠膨潤(rùn)下述水不溶性高分子化合物的有機(jī)溶劑的溶液中，從而將上述信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)封入芯部分，該芯-殼型粒子由(1)基本上由水不溶性高分子化合物組成的芯部分和(2)基本上由具有反應(yīng)性官能基的水溶性高分子化合物組成并以刷狀覆蓋在上述芯部分表面上的殼部分構(gòu)成，而且上述芯部分和上述殼部分，作為整體，是由水不溶性高分子和水溶性高分子的嵌段聚合物形成的。
全文摘要
本發(fā)明公開了封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯－殼型粒子及其制造方法，該粒子由(1)基本上由水不溶性高分子化合物組成的芯部分和(2)基本上由具有反應(yīng)性官能基的水溶性高分子化合物組成且以刷狀覆蓋于前述芯部分表面的殼部分構(gòu)成，且上述芯部分和上述殼部分，作為整體，是由水不溶性的高分子和水溶性高分子的嵌段聚合物形成的，其特征在于，在上述芯部分中封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)。上述封入信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的芯－殼型粒子，作為不使用受到處理限制的放射性物質(zhì)、不使用具有穩(wěn)定性問題的酶、具有比熒光物質(zhì)更高的靈敏度，不發(fā)生非特異性吸附的標(biāo)識(shí)物質(zhì)是有用的。
文檔編號(hào)G01N33/58GK1618019SQ02811100
公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2002年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者片岡一則, 長(zhǎng)崎幸夫, 柴田直哉, 星野信廣 申請(qǐng)人:株式會(huì)社三菱化學(xué)藥得論, 那野伽利阿株式會(huì)社