專利名稱：預測和/或診斷發(fā)展成胃癌危險性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及預測癌癥危險性的方法，尤其是診斷和/或預測幽門螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法。
目前還沒有對幽門螺桿菌感染者進行胃癌預測或診斷的非侵害性檢測。對于中度癥狀但歸為“高?！比巳旱膶ο蠛捅仨氝M行內(nèi)窺鏡檢查并承受其風險的對象來說，這樣的檢測特別有意義。即使在具有“危險癥狀”而仍然需要內(nèi)窺鏡檢查的對象中，這樣的非侵害性檢測也可用作輔助診斷工具。這種方法上的改變將對醫(yī)療保健行業(yè)產(chǎn)生重大影響。
本發(fā)明目的之一就是要克服或減輕現(xiàn)有技術缺陷至少其一，即提供另一種有用的選擇。
發(fā)明概述出人意料的發(fā)現(xiàn)是在發(fā)生胃癌或癌前損傷(化生和消化不良)的幽門螺桿菌感染者中，抗幽門螺桿菌粘膜IgG2抗體和γIFN水平降低，IL-4水平升高。這些改變也會反映在此類對象的血液中。但是，在胃粘膜被幽門螺桿菌感染的其他疾病中則沒有這樣的改變。
首先，本發(fā)明提供了以下診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括a)檢測對象的抗幽門螺桿菌IgG2抗體水平；b)將以上抗幽門螺桿菌IgG2抗體水平與預定的對照水平相比，該水平低于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
其次，本發(fā)明提供了以下診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括a)檢測對象的γIFN水平；b)將以上γIFN水平與預定的對照水平相比，該水平低于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
第三，本發(fā)明提供了以下診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括a)檢測對象的IL-4水平；b)將以上IL-4水平與預定的對照水平相比，該水平高于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
第四，本發(fā)明提供了一種診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括將第一，和/或第二，和/或第三種方法相互聯(lián)用。
第五，本發(fā)明提供了一種診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括將以上第二與第三種方法聯(lián)用。
所述螺桿菌感染最好是幽門螺桿菌感染。
測定的是諸如血液、唾液、胃液等生物液樣品中的抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4水平。
所述抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4水平測定可同時作為反映幽門螺桿菌感染情況的方法，或與這樣的方法聯(lián)用。
最好通過近體試驗(near-subjectassay)中檢測所述抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4。然而，該試驗也可以是實驗室試驗。較好的是，所述試驗為抗體試驗，但是其他已知檢測方法也同樣可用且有效。所述試驗最好是ELISA。
第六，本發(fā)明提供了以下診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括a)檢測對象血液中抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞的頻率；b)將以上抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞頻率與預定的對照水平相比，對象的抗幽門螺桿菌IgG2抗體和/或γIFN產(chǎn)生細胞頻率低于對照，和/或IL-4產(chǎn)生細胞頻率高于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
本領域技術人員都知道，可純化血液以富集白細胞，然后進一步將此白細胞群分離成特定細胞群。
較好的是，在檢測抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4前，用幽門螺桿菌刺激抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞。
第七，本發(fā)明提供了以下診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括a)檢測對象胃粘膜上抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞的頻率；b)將以上抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞頻率與預定的對照水平相比，對象的抗幽門螺桿菌IgG2抗體和/或γIFN產(chǎn)生細胞頻率低于對照，和/或IL-4產(chǎn)生細胞頻率高于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
所述細胞最好來自組織活檢樣本。
抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞最好用流式細胞計數(shù)法檢測。
可以用正常個體即無幽門螺桿菌感染的個體的生物液樣品，或用患有未并發(fā)慢性胃炎或無癥狀的幽門螺桿菌感染者的樣品來確立抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4的對照水平。某些時候，對于進行預后隨訪的對象，對照水平可以是內(nèi)部的，即對象自身的對照水平。
本發(fā)明方法還可通過檢測抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4來診斷和/或確定發(fā)生諸如化生或消化不良等癌前損傷的危險性。
本領域技術人員可以看出，可將抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4與其他參數(shù)(例如抗幽門螺桿菌IgG抗體總量)之比用作胃的癌變前期或癌性病變(包括化生和消化不良)的指標或用于其診斷。對癌變前期或癌性病變更精確的預測和/或診斷需要使用特定的比值，例如IL-4∶γIFN之比，IgG2∶總IgG之比或IgG2∶IgG1之比。也可采用其他比值。
本發(fā)明說明書中，“γIFN”與“IFNγ”混用，都表示細胞因子γ干擾素。
圖2顯示粘膜活檢樣本中的IL-4分泌與幽門螺桿菌抗原刺激后血液T細胞之間高度相關。沒有接收處理的、未并發(fā)性慢性胃炎的幽門螺桿菌感染者的抗原激發(fā)T細胞不分泌IL-4。
圖3幽門螺桿菌感染者胃粘膜中的細胞因子(IL-8，IL-4和γIFN)的產(chǎn)生。
圖4患各種胃腸疾病的幽門螺桿菌感染者血清中的抗幽門螺桿菌IgG1和IgG2水平。
圖5患各種胃腸疾病的幽門螺桿菌感染者血清中的抗幽門螺桿菌IgG1和IgG2水平。
已知，可將血液和胃粘膜中的抗幽門螺桿菌IgG總水平作為幽門螺桿菌感染情況的指標。所以，在以下實施例中，在用抗幽門螺桿菌IgG作為幽門螺桿菌感染情況常規(guī)指標的同時，本發(fā)明還包括用IgG2亞類測得值作為胃癌預測指標或用于其診斷。
檢測人樣品中細胞因子和抗體的方法是本領域熟知的，所用方法和試劑可方便地獲得。有些可用的技術如后文所述，用來說明如何進行某些測定。
除非另做說明，所用的都是標準教科書和實驗室手冊中的各種標準技術。實施例1測定血樣中的細胞因子和抗體水平標準試驗包括用抗IL-4單克隆抗體(MoAb)包被96孔微滴板的微孔。去除抗體并用PBS/Tween20洗滌后，在含有100μl AIM-V培養(yǎng)基的各孔中加入100μl全血。37℃孵育24小時后，分離出血漿上清液，用ILISA檢測γIFN(

圖1)。用ELISA法測定各孔中被IL-4 MoAb俘獲的IL-4量(圖1和圖2)。用ELISA法測定凝血的血清或上述血漿上清液中的抗幽門螺桿菌IgG1和IgG2亞類水平，或IgG2/IgG之比(圖4和圖5)。試驗前，所有樣品保存于-80℃。單獨測定IL-4或同時測定IL-4和抗幽門螺桿菌IgG抗體的試驗系統(tǒng)用含2μg/ml抗IL-4單克隆捕捉抗體的pH8.5碳酸氫鈉溶液包被96孔平底微滴板的各孔。去除抗體溶液后，在各孔中加入等量的新鮮收集的全血。37℃孵育24小時后，分離血漿上清液，通過與生物素化抗IL-4抗體和鏈霉親和素-過氧化物酶偶聯(lián)物的反應檢測結合的IL-4。在讀板儀中，使用合適的標準，根據(jù)顯色測定IL-4量。
在同一板上，將血漿上清液加入以4μg/ml幽門螺桿菌包被的孔，可同時用ELISA試驗檢測抗幽門螺桿菌IgG抗體。結果見表1。
表1全血中的IL-4產(chǎn)生和抗幽門螺桿菌IgG抗體對象IL-4產(chǎn)生(pg/ml)抗幽門螺桿菌IgG(ELISA指數(shù))S1 42.77 0.696S2 9.41.61S3 13.49 1.86S4 108.25 0.95S5 9.41.83S6 18.1 0.67S7 9.44.32S8 19.41 3.22S9 56.64 3.48S10 15.1 3.42S11 9.40.12實施例2胃粘膜內(nèi)的IL-4和γIFN產(chǎn)生細胞頻率從內(nèi)窺鏡檢查獲得的活檢樣本中分離胃T細胞。用1mM二硫蘇糖醇和1mMEDTA洗滌這些組織以去除上皮細胞和上皮內(nèi)細胞，然后用含40U膠原酶(Worthington Biochemical)的無血清AIM-V培養(yǎng)基萃取層間T細胞2-3小時。根據(jù)臺盼藍排除法，去除雜質(zhì)后單核細胞的活度在90％以上。分離自個體樣品的胃單核細胞通常因太少(約0.503×105個細胞/份樣品)而無法進行大規(guī)模的抗原介導的再刺激。于是測定各份分離細胞中的IL-4和γIFN產(chǎn)生細胞頻率進行細胞內(nèi)染色，然后在FACS Vantage上用3色流式細胞計數(shù)法進行分析。分離的胃細胞用PMA和PMA加離子霉素激活，用PerCP-CD3單克隆抗體(Becton Dickinson)染色，然后用上述FITC-γIFN和PE-IL-4單克隆抗體進行胞內(nèi)染色。
除非另做說明，所用的都是標準實驗室教科書中的標準技術。
表2例舉了可基于上述檢測做出的預測/診斷。
表2

實施例3外周血中的IL-4和γIFN產(chǎn)生細胞頻率用胞內(nèi)細胞因子染色和流式細胞計數(shù)法估測不同對象的IL-4和γIFN產(chǎn)生細胞頻率。這可以在因每份樣品分離細胞數(shù)過低而無法在抗原再刺激后用限制稀釋法跡象分析時對從胃組織樣本中獲得的結果進行比較。外周血單核細胞或全血用佛波豆蔻酸乙酸酯(PMA，50ng/ml)和1μM離子霉素在2μM莫能菌素存在下活化4-5小時，固定，透化，并用FITC/PE標記的γIFN/IL-4(Bectin-Dickinson)染色。然后以匹配的同型IgG為對照，用流式細胞計數(shù)法分析γIFN/IL-4頻率，并就淋巴細胞進行選通。
表3和表4列舉了有或無幽門螺桿菌感染對象外周血中的IL-4和γIFN產(chǎn)生細胞頻率。幽門螺桿菌感染者的γIFN∶IL-4產(chǎn)生細胞之比高于無感染者。
用Hp重組抗原(Hp0310檸檬酸合成酶)刺激短期培養(yǎng)物，然后用限制稀釋法定量測定血液中循環(huán)IL-4和γIFN產(chǎn)生細胞頻率。用非保護性重組抗原Hp-0162作為陰性對照。將細胞接種在V形底96孔微滴板上，用兩倍稀釋法從105稀釋至2.5×103，每一細胞濃度一式24孔。培養(yǎng)物用預定濃度的檸檬酸合成酶或Hp0310抗原在rIL-2(5U/ml)存在下進行3天的刺激。對照為不含應答細胞，或培養(yǎng)于無抗原培養(yǎng)基和rIL-2中的應答細胞。因為IL-4不穩(wěn)定，所以采用了一種抗體捕捉法，其中用配對抗體(Engogen/CSL)通過ELISA檢測結合的IL-4。用標準方法檢測上清液中的γIFN。用合法軟件，用最大似然估計法計算產(chǎn)生IL-4和γIFN的外周血單核細胞頻率。
表3抗幽門螺桿菌抗體陽性對象中的細胞因子產(chǎn)生細胞對象γIFN％IL-4％γIFN∶IL-4之比S1 18.32.5 7.3S2 25.43.3 7.6S3 26.011.5 2.3S4 9.6 2.6 3.7S5 14.85.6 2.6平均值±SE 4.7±1.15*表4抗幽門螺桿菌抗體陰性對象中的細胞因子產(chǎn)生細胞對象γIFN％IL-4％γIFN∶IL-4之比S6 24.8 28.3 0.9S7 8.9 3.03.0S8 8.1 2.63.1S9 29.9 29.1 1.0S10 25.9 17.2 1.5平均值±SE 1.9±0.48*P＝0.054圖1至圖5是用對返流、胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍和胃癌等不同胃腸道疾病患者進行研究所得的結果。圖本身說明并反映出IgG2、γIFN和IL-4水平可作為幽門螺桿菌感染者患胃癌的預測指標或用于相應診斷。
雖然以上通過具體實施例對本發(fā)明進行了描述，但是本領域技術人員可以看出，在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明還可以有多種其他實施方式。
權利要求
1.一種診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括a)檢測對象的抗幽門螺桿菌IgG2抗體水平；b)將以上抗幽門螺桿菌IgG2抗體水平與預定的對照水平相比，該水平低于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
2.一種診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括a)檢測對象的γIFN水平；b)將以上γIFN水平與預定的對照水平相比，該水平低于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
3.一種診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括a)檢測對象的IL-4水平；b)將以上IL-4水平與預定的對照水平相比，該水平高于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
4.一種診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括將權利要求1和/或權利要求2和/或權利要求3所述的方法聯(lián)用。
5.一種診斷和/或確定螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法，該方法包括將權利要求2和權利要求3所述的方法聯(lián)用。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的方法，所述螺桿菌感染是幽門螺桿菌感染。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的方法，是在生物液樣品中測定抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4水平。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，所述的生物液是血液。
9.根據(jù)權利要求7所述的方法，所述的生物液是唾液。
10.根據(jù)權利要求7所述的方法，所述的生物液是胃液。
11.根據(jù)權利要求1-10中任一項所述的方法，所述抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4水平測定可同時作為反映幽門螺桿菌感染情況的方法，或與這樣的方法聯(lián)用。
12.根據(jù)權利要求1-11中任一項所述的方法，所述抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4用近體試驗檢測。
13.根據(jù)權利要求1-11中任一項所述的方法，所述試驗是實驗室試驗。
14.根據(jù)權利要求12或13所述的方法，所述試驗是抗體試驗。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，所述試驗是ELISA。
16.一種預測和/或診斷螺桿菌感染者患胃癌的方法，該方法包括a)檢測對象血液中抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞的頻率；b)將以上抗幽門螺桿菌IgG2抗體、和/或γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞頻率與預定的對照水平相比，對象的抗幽門螺桿菌IgG2抗體和/或γIFN產(chǎn)生細胞頻率低于對照，和/或IL-4產(chǎn)生細胞頻率高于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
17.根據(jù)權利要求16所述的方法，通過純化所述血液來富集白細胞。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，將所述白細胞群進一步分離成特定細胞群。
19.根據(jù)權利要求16-18中任一項所述的方法，在檢測抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4前，用幽門螺桿菌刺激抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞。
20.一種預測和/或診斷螺桿菌感染者患胃癌的方法，該方法包括a)檢測對象胃粘膜上抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞的頻率；b)將以上抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞頻率與預定的對照水平相比，對象的抗幽門螺桿菌IgG2抗體和/或γIFN產(chǎn)生細胞頻率低于對照，和/或IL-4產(chǎn)生細胞頻率高于對照說明發(fā)展成胃癌的危險性存在和/或升高。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，所述細胞來自組織活檢樣本。
22.根據(jù)權利要求20或21所述的方法，抗幽門螺桿菌IgG2抗體、γIFN和/或IL-4產(chǎn)生細胞用流式細胞計數(shù)法檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及預測患癌癥危險性的方法,尤其是診斷和/或預測螺桿菌感染者發(fā)展成胃癌危險性的方法。
文檔編號G01N33/53GK1355885SQ00809065
公開日2002年6月26日 申請日期2000年5月15日 優(yōu)先權日1999年5月14日
發(fā)明者R·L·克蘭西, G·龐 申請人:昂科俄勒特控股有限公司