專利名稱：蛋白質(zhì)的分離和分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尤其是通過質(zhì)量分析來分離和分析蛋白質(zhì)。本發(fā)明尤其可應(yīng)用于分離諸如抗體之類的結(jié)合蛋白。本發(fā)明也提供對蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的修飾，以便有助于質(zhì)量分析和或分離由基因文庫成員編碼的特定蛋白質(zhì)。
關(guān)于蛋白質(zhì)分離，本發(fā)明提供了借助與特定靶的結(jié)合而從這類蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物中分離特定蛋白的新方法。具體地說，本發(fā)明提供借助于與特定靶抗原的結(jié)合而從基因文庫衍生的這類抗體結(jié)構(gòu)域混合物中分離特異性抗體結(jié)構(gòu)域的方法。對于蛋白質(zhì)的分析，本發(fā)明提供用于分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物、尤其是用于比較兩種或更多種不同樣品之間的蛋白質(zhì)的新方法。
對于借助于與特定靶的結(jié)合從復(fù)雜混合物中分離蛋白并且在該蛋白的身份或氨基酸序列預(yù)先未知的情況下，分離足夠的與所述靶結(jié)合的蛋白以對該蛋白進(jìn)行直接表征通常是非常困難的。為了從天然的、合成的或半合成的蛋白的大文庫中選擇目的蛋白，已經(jīng)開發(fā)了“蛋白展示”法，用該方法產(chǎn)生在物理上與其基因相連接的重組蛋白，使得所述蛋白的回收使得隨后可以快速回收所述基因。這類方法包括“體內(nèi)”展示法諸如在噬菌體(“噬菌體展示”)、細(xì)菌和酵母上的展示，還包括“體外”展示法諸如在核糖體上的展示(“核糖體展示”)。可以對所回收的基因進(jìn)行測序，以便確定所回收蛋白的身份，或可以用所回收的基因再生所述回收的蛋白。如果對基因文庫進(jìn)行蛋白展示法，藉此根據(jù)特定特性例如與抗原結(jié)合(對于抗體可變區(qū))選擇蛋白，那么在每輪選擇后，所回收的基因?qū)⒏患幋a顯示這類特定特性的蛋白的基因。目前的“體內(nèi)”展示法的缺點(diǎn)包括對所展示的功能蛋白量的限制(噬菌體展示通常限于小于40kDa的多肽)，通常需要將重組蛋白與宿主蛋白融合(這可能干擾重組蛋白的功能或結(jié)合)，以及不能改變每個(gè)展示粒子所展示的蛋白數(shù)；后者也是“體外”展示法諸如核糖體展示的問題。另外，因?yàn)檎故玖Ｗ拥捏w積小，對于具有特定特性例如與抗原結(jié)合的蛋白的選擇方法是有限的，使得不容易使用諸如熒光激活細(xì)胞分類(FACS)的方法。因此，仍需要發(fā)展新方法，以改進(jìn)從復(fù)雜混合物中分離蛋白、特別是改進(jìn)從復(fù)雜的抗體可變區(qū)(Fv)混合物中分離Fv。亦即本發(fā)明提供從復(fù)雜混合物中分離蛋白的改進(jìn)方法。具體地說，本發(fā)明將由基因文庫產(chǎn)生的蛋白文庫的應(yīng)用與質(zhì)譜法改進(jìn)、特別是基質(zhì)輔助激光解附/電離飛行時(shí)間(MALDI-ToF)質(zhì)譜的改進(jìn)和通過串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)對ToF分離的肽直接測序的能力、最近將ToF和MS/MS結(jié)合進(jìn)一個(gè)裝置(Q-ToF)的能力以及將HPLC和電噴霧(ES)串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合的能力相結(jié)合。本發(fā)明也包括從復(fù)雜的蛋白混合物中篩選個(gè)別蛋白的新方法，用所述方法不用將這些蛋白“展示”，即在所述蛋白與所述靶結(jié)合期間或之后將這些蛋白與其相應(yīng)的基因結(jié)合。本發(fā)明也包括從復(fù)雜的蛋白混合物中篩選個(gè)體蛋白的新方法，用所述方法所述蛋白以及所述靶均不用“展示”，即與任何其它分子或結(jié)構(gòu)結(jié)合。本發(fā)明也包括從復(fù)雜的蛋白混合物中篩選個(gè)體蛋白的新方法，用所述方法，所述蛋白及其相應(yīng)的基因通過加入或包括一個(gè)“結(jié)合部分(associating moiety)”連接在一起，從而在加入所述“結(jié)合部分”或者之前或者之后所述蛋白與所述靶結(jié)合。
因此，在第一方面，本發(fā)明提供一種蛋白鑒定、篩選和/或測序的方法，包括提供個(gè)別蛋白的文庫，所述個(gè)別蛋白中的一種或更多種可以與感興趣的靶結(jié)合，其中每種個(gè)別蛋白在其序列中包括一個(gè)“條形碼”序列，該序列可以用來在該文庫中鑒定每種個(gè)別蛋白。
本發(fā)明的該方面可供用于蛋白、尤其是重組抗體結(jié)構(gòu)域(例如Fv)的文庫，從而該文庫的各個(gè)蛋白成員在其氨基酸序列中包括一段序列(“條形碼”)，可以隨后對該段序列測序，以便鑒別哪種蛋白與所述特定靶(或在Fv的情況下為“抗原”)結(jié)合。該實(shí)施方案將尤其可應(yīng)用于Fv衍生自人類基因的情況，從而所選擇的Fv可能適合于人類治療或診斷用途。在這種特定應(yīng)用中，由免疫球蛋白cDNA庫，例如衍生自人類外周血B細(xì)胞的庫，或例如用在一個(gè)或更多個(gè)位置具有半隨機(jī)化的(“組合”)CDR(互補(bǔ)決定區(qū))的人可變區(qū)合成產(chǎn)生的庫，產(chǎn)生廣泛的Fv基因文庫。如果構(gòu)建該基因文庫的方式使得在Fv編碼區(qū)內(nèi)或該區(qū)的末端包括一個(gè)隨機(jī)(或半隨機(jī))基因序列，則這樣一種隨機(jī)/半隨機(jī)基因序列將產(chǎn)生一種與個(gè)別Fv結(jié)合的隨機(jī)/半隨機(jī)肽序列。采用標(biāo)準(zhǔn)方法諸如寡核苷酸引發(fā)/DNA聚合酶延伸或PCR，構(gòu)建這樣一種隨機(jī)/半隨機(jī)基因序列，由此用一種隨機(jī)/半隨機(jī)合成寡核苷酸序列作為在Fv基因文庫構(gòu)建過程中用來擴(kuò)增免疫球蛋白基因片段的一對引物之一。如果該Fv文庫的成員包括兩條鏈(即重鏈和輕鏈衍生鏈(VH和VL))，而不是單鏈(通過肽接頭連接的VH和VL)，那么可以將各個(gè)條形碼與每條鏈連接(或可以僅與其中一條鏈連接)。當(dāng)構(gòu)建該文庫時(shí)，所得到的Fv各包括一個(gè)或更多個(gè)“肽條形碼”，所述“肽條形碼”對于該復(fù)雜文庫內(nèi)的特定Fv是特有的，或?qū)τ谠搹?fù)雜文庫內(nèi)的一小組Fv是特有的。最好是，所述肽條形碼位于單鏈Fv區(qū)的C末端或者VH或VL或者這兩者的C末端，并且包括在其本身和Fv區(qū)之間鄰接的一個(gè)或更多個(gè)蛋白酶敏感位點(diǎn)，例如腸激酶位點(diǎn)(在Asp-Asp-Asp-Asp-Lys之后切割)、因子Xa位點(diǎn)(在Ile-Glu/Asp-Gly-Arg之后切割)或其它內(nèi)肽酶位點(diǎn)。如果由合適的基因文庫產(chǎn)生這類Fv的混合物，那么將該混合物與靶抗原(或多種抗原，例如細(xì)胞上的抗原)混合，其中通常將所述抗原固定化。這導(dǎo)致特異性Fv與靶抗原結(jié)合，而非結(jié)合物(或弱結(jié)合物，取決于洗滌的嚴(yán)格性)被洗去。在洗去多余的抗體后，則通常通過采用用以切割所引入的蛋白酶敏感位點(diǎn)的內(nèi)切蛋白酶消化，從所述Fv中釋放出保留的抗原/Fv復(fù)合體。然后將這種釋放的條形碼標(biāo)記肽或者直接，或如有需要在借助使得所述肽被捕獲到固相的特定氨基酸或氨基酸序列進(jìn)行捕獲后，進(jìn)行質(zhì)量分析/質(zhì)譜測序，所述特定氨基酸或氨基酸序列例如為可以被生物素化用以隨后被捕獲到固定化抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白上的半胱氨酸殘基。另一方面，可以采用任何其它方法，以測定或者在Fv內(nèi)或者釋放后所述肽條形碼的序列，包括用以序列特異性方式與所述條形碼結(jié)合的特異性配體。在測定得自結(jié)合Fv的條形碼序列(或部分序列)后，產(chǎn)生相應(yīng)的合成寡核苷酸，并且用來從該文庫中特異性地?cái)U(kuò)增或富集特定Fv基因。然后這些特定的或被富集的Fv(或VH和VL)基因被進(jìn)一步用來產(chǎn)生相應(yīng)的Fv，然后或者單獨(dú)地，或者作為所分離Fv小庫的部分，再測試所述Fv的抗原結(jié)合。最后，用該方法，可以產(chǎn)生具有所需抗原結(jié)合特性的特定Fv，并且如果所述Fv來自人類來源，則具有潛在的臨床用途。該方面也包括應(yīng)用與個(gè)別蛋白或Fv結(jié)合的多個(gè)條形碼，例如在Fv的C末端的兩個(gè)相鄰的條形碼，由此通過蛋白酶消化，或者同時(shí)從每種Fv釋放兩種肽，以便增強(qiáng)對與所述靶結(jié)合的Fv的識別(identity)，或者順序釋放兩種肽，從而在連接多輪消化中使用不同的蛋白酶，以提供一種不同的方式，以隨后擴(kuò)增對應(yīng)于與該靶結(jié)合的Fv的Fv基因。該方面也包括應(yīng)用同時(shí)進(jìn)行分析的多種條形碼，以便增加全部條形碼序列的多樣性，以提供個(gè)別蛋白的特定編碼。該方面也包括在個(gè)別蛋白內(nèi)應(yīng)用條形碼，例如在Fv的一個(gè)或更多個(gè)CDR位置中應(yīng)用條形碼。該方面也包括應(yīng)用也可能消化所述蛋白靶混合物的蛋白組分的蛋白酶或以及任何用于固定化所述靶的蛋白媒介物，條件是在其它肽的背景下仍可以檢測到從結(jié)合的受試蛋白釋放的條形碼肽，并且對其進(jìn)行測序。在該方面的優(yōu)選形式中，在輕鏈C末端提供一個(gè)條形碼區(qū)，形成一個(gè)可溶性Fab片段，由此VH和VL由同一表達(dá)盒或順反子編碼，使得使用所述條形碼序列既可以選擇VH基因，又可以選擇VL基因。這樣一種Fab片段可以方便地用多種表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生，例如M13噬菌體系統(tǒng)，其中通過引入分泌前導(dǎo)序列，F(xiàn)ab的重鏈和輕鏈被分泌到宿主細(xì)菌的壁膜間隙中，然后從該間隙中收獲所述重鏈和輕鏈。首先通過在合成的寡核苷酸混合物中克隆，制備具有符合讀框的條形碼的載體系統(tǒng)。對于兩個(gè)相鄰條形碼的形成，這可以通過順序克隆或寡核苷酸誘變來方便地進(jìn)行，由此制備含有混合的第一條形碼的匯集的M13重組體，作為隨后克隆第二個(gè)符合讀框的條形碼的模板。最好是，設(shè)計(jì)條形碼，使得所編碼的蛋白含有鄰接這兩種條形碼并且位于這兩種條形碼之間的內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，并且由此與所述條形碼之一相鄰的一個(gè)“間隔”區(qū)產(chǎn)生包括該條形碼、其分子量大于另一條形碼的肽。通過合適的設(shè)計(jì)條形碼并且以該方式應(yīng)用多個(gè)條形碼，提供一種選擇，用于簡單地分析內(nèi)切核酸酶釋放的肽的質(zhì)量，例如通過MALDI-ToF進(jìn)行分析，由此可以推導(dǎo)出(或接近推導(dǎo)出)所述肽的序列，使得可以設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸來分離(或富集)具有通過MALDI-ToF分析檢測到的條形碼的特定蛋白。這些序列的這種推導(dǎo)可以通過序列設(shè)計(jì)來完成，由此使特定氨基酸僅存在于沿所述肽的一個(gè)或兩個(gè)位置。例如，當(dāng)用20種天然氨基酸中的17種(因此為指定的A-Q)設(shè)計(jì)所述肽時(shí)，可以設(shè)計(jì)所述序列，對于沿所肽序列的每個(gè)位置的三個(gè)氨基酸中的任一種有如下多種選擇aa位置 12345678氨基酸選擇 ACEGIKMOBDFHJLNPCEGIKMOQ這種設(shè)計(jì)理論上能產(chǎn)生6561種不同的肽序列條形碼。如果也在同一基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一種具有一個(gè)間隔區(qū)的相鄰條形碼，則這將產(chǎn)生另外6561種不同的條形碼?？傊@將產(chǎn)生4×107種個(gè)條形碼序列，足以獨(dú)特標(biāo)記這種大小的蛋白質(zhì)文庫的大多數(shù)成員。應(yīng)用添加的相鄰條形碼或基于例如在該序列中的任一位置應(yīng)用兩種特定氨基酸的較長的條形碼(因此用19中氨基酸產(chǎn)生262,144種不同的條形碼序列)將增加所提供的條形碼的多樣性。實(shí)際上，在設(shè)計(jì)混合的合成寡核苷酸過程中，通過合理選擇該序列內(nèi)每一位置的密碼子，降低密碼子豐余性。用于MS/MS測序的8個(gè)氨基酸條形碼肽的一種寡核苷酸設(shè)計(jì)如下密碼子-NAC NCC NGG NTG TKC VAG GNV CNT氨基酸-NT R LF Q D HDP G MC E V LHA W VK A PYSG R其中密碼子N＝A、C、G或TK＝G或TV＝A、C或G4×4×3×3×2×3×4×4＝13824種條形碼序列也可以通過不連續(xù)的寡核苷酸合成摻入特定的密碼子，從而將特定的密碼子順序加至分開的先前合成的寡核苷酸混合物(“密碼子誘變”)。一旦通過MALDI-ToF或MS/MS推導(dǎo)出候選條形碼序列，并且單個(gè)條形碼的多樣性小于該文庫的多樣性，則可以用相應(yīng)的特異性寡核苷酸(或如果在密碼子選擇中有豐余性，則用寡核苷酸混合物)作為PCR引物，并結(jié)合根據(jù)該蛋白或載體系統(tǒng)設(shè)計(jì)的相對的引物，來富集可從中檢測到所述條形碼的蛋白的編碼基因。當(dāng)用相鄰條形碼時(shí)，由所述第一引物產(chǎn)生的在一個(gè)基因片段內(nèi)嵌套的第二引物則可以用來富集所檢測的實(shí)際蛋白的編碼基因。如有需要，上述方法可以加入三種或更多種條形碼，以便增加寡核苷酸指導(dǎo)的編碼所需蛋白的特定基因富集的特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明的該第一方面可以包括多種變化的方法，其主要原理是通過對與該特定蛋白結(jié)合或由該特定蛋白編碼的一種或更多種肽進(jìn)行質(zhì)量分析或序列分析，從這種蛋白文庫中回收特定蛋白，因此該方面在分離編碼僅確定或推定肽序列的所需蛋白的基因方面具有廣泛的應(yīng)用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)有所述第一方面的多種變化形式。例如，人們會(huì)理解，肽條形碼可以被摻入多對或多組蛋白中，然后讓所述蛋白結(jié)合，通過鑒定來自參與結(jié)合的每種蛋白質(zhì)的條形碼，確定哪些蛋白相互結(jié)合。作為從復(fù)雜混合物中分離蛋白質(zhì)的一種替代方法，可以用本發(fā)明的方法檢測這些復(fù)雜混合物中表現(xiàn)出一定結(jié)合特性諸如與其它大分子(例如DNA)結(jié)合的蛋白。本發(fā)明的方法包括將肽條形碼加入蛋白質(zhì)的多種方式，包括其中在編碼該蛋白的基因片段內(nèi)編碼條形碼的方法。然而，可以通過肽的直接連接，將條形碼加入這種蛋白，或加入任何其它合適的分子混合物。例如，可以用多種化學(xué)方法或光化學(xué)方法，將特定肽加至特定抗體或蛋白質(zhì)。這樣一種方法的一個(gè)應(yīng)用是用一種條形碼標(biāo)記一種復(fù)雜的蛋白混合物(或例如根據(jù)不同的蛋白特異性選擇條形碼)，而用另一種條形碼標(biāo)記另一復(fù)雜的蛋白混合物，例如以差別條形碼標(biāo)記(barcode)來自兩種不同樣品的蛋白，然后將其混合。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，將肽條形碼加至蛋白或其它分子的原理也可以應(yīng)用于非肽條形碼，由此可以用質(zhì)量或測序法直接鑒定(或大致鑒定)這類條形碼。因此，所述條形碼可以包括與蛋白或其它分子(包括核酸)連接的核酸條形碼。如同肽條形碼一樣，可以通過質(zhì)譜法分析這類核酸條形碼，以提供對質(zhì)量的準(zhǔn)確估計(jì)?？梢杂孟拗菩悦复娴鞍酌?，從所述蛋白中釋放出這種條形碼。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)有所述第一方面的蛋白分離以外的多種應(yīng)用。例如，可以根據(jù)質(zhì)量或序列來分析條形碼，分析與活有機(jī)體內(nèi)特定器官相關(guān)的蛋白質(zhì)或其它配體在該有機(jī)體內(nèi)的分布。在肽或蛋白與其它分子的結(jié)合特異性的分析中，可以構(gòu)建條形碼作為所述肽或蛋白結(jié)合區(qū)的部分，以便通過對條形碼的質(zhì)量或序列分析來分析特異性。例如，可以在MHC分子的已知錨定殘基周圍構(gòu)建混合肽條形碼序列，然后通過所述條形碼的洗脫和質(zhì)量或序列分析，測定與特定MHC分子結(jié)合的肽譜。
第二方面，本發(fā)明提供一種篩選蛋白質(zhì)文庫的方法，包括根據(jù)一種或更多種所需特性篩選所述文庫，然后去復(fù)制(dereplication)以鑒定該文庫中具有所需特性的一種或更多種個(gè)別蛋白。
本發(fā)明的該方面可供用于蛋白質(zhì)文庫，尤其是諸如Fv之類的重組抗體文庫，藉此分離與特定靶結(jié)合的所述文庫的個(gè)別成員，從而分別篩選來自該文庫的蛋白質(zhì)庫，然后對陽性庫進(jìn)行一輪或更多輪去復(fù)制，直至鑒定出該文庫中與所述靶結(jié)合的個(gè)別蛋白。具體地說，該方面涉及不用展示系統(tǒng)而篩選蛋白質(zhì)文庫，即其中所述蛋白與相應(yīng)的基因沒有物理上的連接。在該方面，根據(jù)與所述靶的結(jié)合篩選多個(gè)蛋白庫，由此或者標(biāo)記所述靶以指示哪個(gè)(哪些)庫含有結(jié)合的蛋白，或者其中不經(jīng)標(biāo)記而檢測所述靶。一種特別優(yōu)選的方法是在溶液中篩選蛋白庫，而不將蛋白質(zhì)與其它部分(其可能影響蛋白與其靶的結(jié)合)進(jìn)行任何融合或連接，然后在質(zhì)量分析、尤其是通過MALDI-ToF進(jìn)行質(zhì)量分析之前沉淀所述總蛋白庫(與任何連接的靶一起)，以便根據(jù)代表所述靶并因此指示所述靶是否結(jié)合的電離峰的“指紋”進(jìn)行篩選。一旦鑒定出一個(gè)或更多個(gè)陽性結(jié)合庫，則可以將這些庫去復(fù)制，或者以降低所述庫的復(fù)雜性，或者以分離出個(gè)別蛋白，以篩選與所述靶的結(jié)合物。在實(shí)踐中，裝配蛋白庫的一個(gè)特別優(yōu)選的方式是首先裝配編碼這些蛋白質(zhì)的基因庫。如果將基因克隆到例如質(zhì)?；蚴删w載體中，則可以通過將各個(gè)細(xì)菌菌落或噬菌斑混合在一起合并這些基因，或更方便的是通過在分開的瓊脂平板上鋪平板(以例如每個(gè)平板1000個(gè)菌落/噬菌斑的密度)對菌落/噬菌斑進(jìn)行分離，并且將菌落/噬菌斑從這些平板上刮/洗脫為一種混合物，合并這些基因，然后用該混合物或者通過細(xì)菌/噬菌體表達(dá)或者通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯合成所述蛋白。以相似的方式，可以用其它微生物或體外合成系統(tǒng)來合成蛋白質(zhì)。該方面也包括應(yīng)用復(fù)雜的靶，例如多種分子的混合物、全細(xì)胞或細(xì)胞膜，由此所述分子靶產(chǎn)生成為與所述復(fù)雜靶內(nèi)的特定分子靶結(jié)合的特征性的質(zhì)量分析“指紋”。當(dāng)所述靶為蛋白質(zhì)時(shí)，該方面也包括應(yīng)用蛋白酶消化所述靶，以便產(chǎn)生指示所述靶的肽質(zhì)量指紋，并且當(dāng)所述蛋白酶也消化來自該文庫的所述蛋白質(zhì)時(shí)，甚至在衍生自該文庫的其它肽的背景中仍可以檢測到所述指紋。該方面也包括多種不同類型的“靶”和除與靶結(jié)合以外的篩選蛋白質(zhì)庫或個(gè)別蛋白的標(biāo)準(zhǔn)。例如，該方面包括應(yīng)用生物測定系統(tǒng)作為選擇蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，例如其中根據(jù)刺激或抑制一種生物活性來選擇蛋白質(zhì)。結(jié)合測定的其它形式將包括對配體與其受體結(jié)合的抑制以及選擇與靶上某些位置結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中所述靶可以例如是一種分子、細(xì)胞或組織切片。
第三方面，本發(fā)明提供一種蛋白鑒定和/或測序的方法，包括提供一種個(gè)別蛋白的文庫，一種或更多種所述個(gè)別蛋白可以與感興趣的靶結(jié)合，其中每種個(gè)別蛋白與其基因一起結(jié)合于一個(gè)“結(jié)合部分”。
本發(fā)明的該方面可供用于蛋白質(zhì)文庫，尤其是諸如Fv之類的重組抗體文庫，從而通過加入或包括一個(gè)“結(jié)合部分”將所述蛋白質(zhì)及其相應(yīng)的基因結(jié)合在一起，由此讓所述蛋白質(zhì)或Fv在加入所述“結(jié)合部分”之前或之后與所述靶結(jié)合。所述結(jié)合部分可以用來使得通過所結(jié)合的相應(yīng)基因，例如通過PCR擴(kuò)增(或其它擴(kuò)增方式，例如通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、或通過直接測序和隨后通過該序列進(jìn)行再生)，能夠再生所述蛋白或Fv。如果所述蛋白或Fv作為具有相應(yīng)基因庫的庫產(chǎn)生，則與所述靶結(jié)合(或者如果需要，則不結(jié)合)的蛋白或Fv連接的基因可用作再生個(gè)別或較小的蛋白庫或Fv庫的基礎(chǔ)，以便重復(fù)篩選，以鑒定出與所述靶結(jié)合的特定蛋白或Fv(通過所述相應(yīng)的基因)。
該第三方面的一種具體方式是所述結(jié)合部分是一種粒子，并且因此重組蛋白及其相應(yīng)的基因被共固定化至粒子上，從而個(gè)別粒子的回收可供用于鑒定編碼所述重組蛋白的一種或多種基因。這種形式具體涉及用來將編碼所述重組蛋白的基因共固定化至固定化其相應(yīng)蛋白的同一粒子上的方法，使得在選擇所述重組蛋白時(shí)，也將選擇出相應(yīng)的基因，使得可以鑒定被選擇的蛋白的身份(通過對該基因測序)，或使得可以由該基因產(chǎn)生其它重組蛋白。本發(fā)明的該方法包括通常通過控制該粒子上所述重組蛋白與之結(jié)合的部分的數(shù)目，保證對該粒子上所展示的蛋白的量的控制。本發(fā)明包括保證將其它分子(包括其它蛋白或蛋白鏈，并且包括所述重組蛋白與之結(jié)合的分子，例如抗原)與所述重組蛋白共展示在所述粒子上。
在本發(fā)明的第三方面的基本操作中，提供一種基因陣列或基因混合物陣列，由此用例如體外轉(zhuǎn)錄和翻譯或噬菌體展示等方法來合成重組蛋白，這類蛋白的實(shí)例為抗體可變區(qū)(Fv)。隨后，將基因和重組蛋白共固定化至粒子上，將一種或更多種配體與或者為DNA或者為mRNA的所述基因連接，因此這類配體與所述粒子表面上的“受體”結(jié)合，或者因此這類配體與所述粒子表面反應(yīng)，產(chǎn)生共價(jià)連接或離子連接?；蛘?，所述基因通過形成與天然DNA或RNA反應(yīng)性基團(tuán)的一種或更多種共價(jià)鍵或離子鍵，而直接固定化至所述粒子上。得到的由所述基因編碼的重組蛋白可以具有結(jié)合的一個(gè)或更多個(gè)配體(這類配體是所述蛋白上可以達(dá)到固定化的部分)，例如蛋白序列標(biāo)記(由所述基因編碼)或生物素基團(tuán)(用生物素酰基賴氨酸通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯而摻入)，使得它們也可以與所述粒子表面上的“受體”結(jié)合，或者由此這類配體與所述粒子表面反應(yīng)，產(chǎn)生共價(jià)連接或離子連接。所述基因和蛋白上的配體可以是相同或不同的配體，可以固定化至相同或不同的受體上。關(guān)于本發(fā)明該方面的有用操作，或者作為DNA、mRNA或者在活微生物例如噬菌體中的基因或基因庫被分布到陣列(或多個(gè)反應(yīng)容器等)中，并且重組蛋白在這樣的陣列中產(chǎn)生(例如通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯或通過噬菌體的生長)。含有所述基因的主陣列可以用作用以產(chǎn)生所述重組蛋白的材料源，藉此基因或蛋白樣品被分配到服務(wù)器陣列中，使得每個(gè)基因庫或蛋白庫的陣列位置得以存貯?；蛘咴谠撨^程之前、期間或者之后，將一種或更多種粒子引入該陣列中的每個(gè)位置中，提供基因和蛋白可以與之結(jié)合的受體。在本發(fā)明的一個(gè)變體，首先將所述基因連接于所述粒子，然后從這些基因直接產(chǎn)生蛋白，使得這些重組蛋白隨后被固定化到至同一粒子上。在重組蛋白連接至所述粒子之前或者之后，所述蛋白可以任選地經(jīng)過修飾，例如用其它激酶磷酸化或被其它蛋白結(jié)合。在第三方面的一個(gè)變體中，所述陣列包括其中分隔了基因或活微生物的小滴(通常通過在蛋白合成之前產(chǎn)生所述小滴，因此將所述基因布置在所述小滴中)，例如乳液包油小滴或脂質(zhì)體。蛋白質(zhì)在所述小滴中產(chǎn)生，然后將包括所述基因在內(nèi)的這些物質(zhì)共連接至所述粒子。在小滴的情況下，所述基因和蛋白共連接的粒子可以或者被引入所述小滴中，或者所述粒子可以是小滴本身。例如，在脂質(zhì)體的情況下，可以產(chǎn)生具有與脂質(zhì)體膜結(jié)合的親脂標(biāo)記的蛋白，尤其是在這導(dǎo)致所述蛋白在脂質(zhì)體外表面上“展示”的情況下。一個(gè)相關(guān)的實(shí)例是使用mRNA體外翻譯的情況，其中微粒體膜可以被引入到該反應(yīng)中，從而具有親脂標(biāo)記的蛋白可以整合到這類膜中，隨后這類膜可以分散成為小粒子。
如果希望然后隨所述粒子合并用于選擇過程，則從陣列中回收粒子并將其混合；然后對粒子上的重組蛋白進(jìn)行選擇，通常通過將其暴露于與粒子上的選定蛋白結(jié)合的靶進(jìn)行選擇。某些重組蛋白也可以在該階段進(jìn)行修飾。攜帶選定或經(jīng)修飾的蛋白的粒子然后可以通過多種方法回收，例如，如果用熒光標(biāo)記來標(biāo)記靶，則可以用FACS來分離出具有(或不具有)所述靶的粒子。在本發(fā)明的第一個(gè)主要方面，然后可以通過對共固定化DNA或mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收在這類選定粒子上的編碼重組蛋白的基因。
有許多類型的可以用于本發(fā)明的第三方面連接蛋白與其相應(yīng)基因的“結(jié)合部分”。使用的粒子包括膠乳粒子和磁性粒子、以及在其上直接合成合成的寡核苷酸的粒子。這類粒子通常裝備有所合成的多肽可以結(jié)合的“受體”。其它結(jié)合部分可以是單個(gè)分子或分子復(fù)合體，它們可以用作將基因分子與所合成的蛋白連接的橋。例如，基因分子和所合成的蛋白均可以包括生物素基團(tuán)，然后可以通過加入鏈霉抗生物素蛋白將其交聯(lián)，因此鏈霉抗生物素蛋白可用作結(jié)合部分。以相似的方式，可以采用例如雙特異性結(jié)合試劑例如雙特異性抗體(與序列標(biāo)記和配體兩者均結(jié)合)或抗體-鏈霉抗生物素蛋白綴合物(因此所述抗體或者結(jié)合于蛋白或者結(jié)合于基因上的配體，而鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合于蛋白或基因上的生物素，無論其是否是無配體的)，將蛋白上的序列標(biāo)記和基因分子上的配體交聯(lián)。其它結(jié)合部分可以是細(xì)菌或噬菌體，由此所合成的多肽結(jié)合于所述細(xì)菌或噬菌體上的特異性配體。例如M13表達(dá)系統(tǒng)可以用來在大腸桿菌中產(chǎn)生特異性抗體的Fv片段，然后所述片段可以結(jié)合于M13自身上的特定蛋白抗原，尤其是在蛋白抗原展示在與衣殼蛋白融合的所述噬菌體頭部上的情況下。通過測試已經(jīng)結(jié)合Fv的M13噬菌體，可以通過對M13編碼的Fv基因測序，確定編碼特異性Fv的基因。同樣，M13表達(dá)系統(tǒng)可以用來產(chǎn)生與M13自身上展示的特定蛋白結(jié)合的蛋白。在所有情況下，第三方面的特有特征是重組蛋白分子可以在合成后，通過一個(gè)結(jié)合部分與相應(yīng)的基因連接。這樣的合成后的連接尤其保證不受阻礙地合成蛋白分子，而例如不需要蛋白作為具有其它蛋白分子的融合體來合成，所述其它蛋白分子可能改變所述蛋白的構(gòu)象或干擾其識別或功能。
本發(fā)明包括在與結(jié)合部分連接之前產(chǎn)生重組蛋白的幾種方法。這些方法尤其包括通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的蛋白合成、以及由質(zhì)粒或噬菌體指導(dǎo)的在細(xì)菌中的蛋白合成。在后一種情況下，本發(fā)明提供的優(yōu)點(diǎn)是所產(chǎn)生的蛋白不需要與噬菌體蛋白融合，因?yàn)楸景l(fā)明中的所產(chǎn)生的蛋白隨后被固定化至分離的粒子上。與目前蛋白質(zhì)的噬菌體展示方法(其中這類蛋白與表面噬菌體蛋白或可以達(dá)到表面的蛋白融合)比較，本發(fā)明的第三方面將或者需要噬菌體的裂解，或者需要重組蛋白從噬菌體頭部分泌或滲漏，以便保證其隨后固定化至所述粒子上。因此，產(chǎn)生蛋白的其它體內(nèi)方法，例如在細(xì)菌、酵母或甚至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，可以用于所述第三方面，因此具有比單一展示法更為通用的優(yōu)點(diǎn)。因此，重組蛋白在固定化之前，可以被特定宿主修飾，例如被哺乳動(dòng)物細(xì)胞糖基化。本發(fā)明的一個(gè)特別有用的方面是能夠控制結(jié)合部分上的重組蛋白分子數(shù)目，尤其是當(dāng)所述結(jié)合部分是粒子時(shí)，通過控制所述粒子上“受體”的分子數(shù)目來加以控制。因此在抗體可變區(qū)的情況下，單種抗體或抗體庫的效價(jià)可以根據(jù)選擇標(biāo)準(zhǔn)而變化。再一種可供選擇的結(jié)合部分可以是活細(xì)胞本身，由此重組蛋白被連接至活細(xì)胞表面或附近的配體，例如帶有所述表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記，或者由此當(dāng)分泌時(shí)，所述蛋白則結(jié)合于從中表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞。所述蛋白然后可以與靶反應(yīng)，然后可以分離出帶有結(jié)合所述靶的特異性Fv的表達(dá)盒的細(xì)胞。
本文的第三方面提供了一種特別有用的方法，用于選擇與靶結(jié)合的重組蛋白，或用于選擇通過特定處理例如通過用細(xì)胞或組織裂解液處理而被修飾的重組蛋白。因此該方法將證明尤其可用于重組蛋白的分子進(jìn)化，藉此連續(xù)多輪選擇確保僅回收具有嚴(yán)格特性(例如與靶高親和性地結(jié)合)的蛋白。該方法也包括對選定基因進(jìn)行連續(xù)多輪誘變，以將進(jìn)化選擇的多樣性最大化。有許多可以基于本發(fā)明的第三方面使用、但屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的變化方式，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。例如，用來捕獲所述基因和重組蛋白的結(jié)合部分、尤其是粒子，可以將另一種多肽鏈結(jié)合至粒子本身，由此當(dāng)?shù)鞍?蛋白結(jié)合發(fā)生時(shí)，所述重組蛋白不是被所述粒子直接捕獲，而是被已經(jīng)在所述粒子上的多肽鏈捕獲。然后，可以用重組蛋白上的適當(dāng)標(biāo)記或配體為檢測蛋白-蛋白結(jié)合事件提供工具。可以以同一方式將合成寡核苷酸結(jié)合到粒子上，所述合成寡核苷酸隨后用來退火至所述基因上，用作捕獲所述基因到粒子上的工具。
第四方面，本發(fā)明提供一種蛋白鑒定和/或測序的方法，包括提供一種個(gè)別蛋白的文庫，一種或更多種所述個(gè)別蛋白可以結(jié)合于目標(biāo)靶，其中每種個(gè)別蛋白連接于一種單獨(dú)的“編碼部分”。
在本發(fā)明的該方面，由基因文庫合成的重組蛋白隨后被連接于通過一種編碼方法或其它編碼方法可區(qū)別的“編碼部分(codingmoiety)”，例如粒子，所述區(qū)別方式使得所述編碼與連接于所述粒子的重組蛋白的編碼基因的身份相關(guān)。當(dāng)將重組蛋白固定化至所編碼的粒子上時(shí)，所述重組蛋白可以具有一種或更多種相連接的配體，例如蛋白序列標(biāo)記或生物素基團(tuán)，使得它們可以結(jié)合于所編碼的粒子表面的“受體”上，或由此所述配體與所述粒子表面反應(yīng)，以產(chǎn)生共價(jià)連接或離子連接。在本發(fā)明該方面的操作中，在大陣列中合成或分隔重組蛋白或蛋白庫。然后將具有獨(dú)特編碼的粒子引入該陣列中的每個(gè)位置中。這類編碼包括例如可測量的信號部分(例如熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或放射性標(biāo)記)的不同比率或區(qū)別粒子的不同物理特征，例如不同形狀或標(biāo)志，例如一種蝕刻在所述粒子中的一種編碼或特有標(biāo)記。在每種情況下，各種所編碼的粒子可以相互區(qū)分。用于本發(fā)明的粒子包括任何具有可以連接蛋白的特性的這類粒子、復(fù)合體或分子。在合并粒子并且讓所編碼粒子上的蛋白混合物與特定靶結(jié)合后，則可以測定選定粒子的編碼，以便確定其原始陣列位置，并且因此確定所選定重組蛋白的編碼基因的陣列位置。作為本發(fā)明這些方面的一個(gè)變體，可以采用例如MALDI-TOF(質(zhì)譜法)的方法或采用標(biāo)記抗體以鑒定已知蛋白，鑒定粒子上的選定蛋白。本發(fā)明第四方面的操作和范圍將共享本發(fā)明上述第三方面的許多方面和范圍。
35.第五方面，本發(fā)明提供一種分析蛋白混合物的方法，包括(i)消化或切割所述蛋白混合物；(ii)分級分離所產(chǎn)生的肽；以及通過其質(zhì)量和/或序列來分析所產(chǎn)生的肽。
本發(fā)明該方面涉及分析蛋白混合物的方法。具體地說，本發(fā)明涉及比較不同細(xì)胞和組織之間的蛋白的方法。本發(fā)明涉及以下步驟的組合消化或切割蛋白混合物、采用蛋白結(jié)合試劑文庫分級分離肽以及隨后分析肽分級分離部分的質(zhì)量或序列。除用蛋白結(jié)合試劑分級分離外，本發(fā)明還包括任選的蛋白或肽片段的物理分級分離。目前分析整個(gè)復(fù)雜的蛋白混合物(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中的蛋白混合物)的方法，需要采用例如雙向(2D)凝膠電泳的技術(shù)分離蛋白。對于這一技術(shù)，細(xì)胞蛋白通常在一向基于電荷進(jìn)行分離，而在另一向基于大小進(jìn)行分離?？梢曰蛘邊⒖家阎鞍椎碾娪具w移圖形，或者通過從電泳分離的斑點(diǎn)中洗脫所述蛋白并且通過例如質(zhì)譜法和核磁共振的方法進(jìn)行分析，來鑒定蛋白質(zhì)。然而，2D蛋白凝膠法的限制包括對來自細(xì)胞的蛋白質(zhì)的分辨率和檢測有限(通常僅清楚地檢測到5000種細(xì)胞蛋白)、對所分離蛋白鑒定的限制(例如質(zhì)譜法通常需要100費(fèi)摩爾或更多的蛋白用于鑒定)、該技術(shù)的專業(yè)化性質(zhì)和難以使該技術(shù)自動(dòng)化以便達(dá)到非常高的蛋白分析通量。因此需要優(yōu)越的方法來分析整個(gè)復(fù)雜的蛋白混合物，尤其是采用不用凝膠電泳的方法和易于自動(dòng)化的方法進(jìn)行分析。
第五方面的核心是將蛋白或者消化或者切割為較小的肽片段，然后用蛋白親和試劑文庫進(jìn)行分級分離，然后進(jìn)行質(zhì)量分析，尤其是通過質(zhì)譜法分析。除用蛋白親和試劑進(jìn)行分級分離外，可以任選地對蛋白或肽片段進(jìn)行物理分級分離，并且也可以將其與一種或更多種“化學(xué)標(biāo)記”綴合，以有助于分級分離。
第五方面的主要方面可供用于采用蛋白酶或化學(xué)方法切割蛋白、分級分離由此產(chǎn)生的肽混合物，并且隨后進(jìn)行質(zhì)量分析。采用蛋白親和試劑、尤其是重組抗體片段的文庫，來完成肽的分級分離。該方法可選地包括采用物理方法或特異性親和試劑例如抗體、或者固相或反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)分離肽或肽混合物，來對蛋白或肽進(jìn)行另外的分級分離，以用于隨后的質(zhì)量分析。用蛋白親和試劑從肽混合物中回收個(gè)別肽或多組肽，以進(jìn)行隨后的質(zhì)量分析?；蛘?，或另外，可以用蛋白親和試劑從該混合物中去除肽，由此隨后對所述混合物本身進(jìn)行質(zhì)量分析。蛋白親和試劑或者可以借助肽中特定序列或結(jié)構(gòu)來結(jié)合，或者借助特定化學(xué)基團(tuán)(或者作為所述肽的天然組分，或者作為在切割之前或之后加入所述肽的化學(xué)標(biāo)記)來結(jié)合。
關(guān)于對較大的肽混合物的分析，可以使用多組蛋白親和試劑，例如由抗體Fv片段(包括單鏈Fv)的重組文庫提供的蛋白親和試劑，以便分離多個(gè)亞組的肽以進(jìn)行隨后的分析。這樣的多組Fv將包括各種各樣的肽特異性，所述肽特異性可以例如通過將抗體文庫預(yù)吸附至目的肽樣品上而達(dá)到，或者通過用目的肽樣品免疫動(dòng)物并且由所述動(dòng)物的B細(xì)胞產(chǎn)生重組Fv文庫而達(dá)到。另一方面，可以由免疫動(dòng)物制備多克隆抗血清或多組單克隆抗體，將其用來分級分離肽。然后用個(gè)別的選定抗體或選定抗體混合物，從試驗(yàn)樣品中分離(或去除)特定亞組的肽。對多種肽的隨后質(zhì)量分析可以便于檢測出試驗(yàn)樣品之間的特定蛋白的差異。
產(chǎn)生抗一種混合物中所有肽的重組Fv或抗體是困難的，并且這高度取決于混合物中肽的數(shù)目和個(gè)別肽以適當(dāng)親和性與抗體結(jié)合的容易性(“抗原性”)。對于非常大的肽混合物，一個(gè)限制是冗余度，由此具有相同肽特異性的抗體重復(fù)出現(xiàn)，而針對其它肽特異性的抗體出現(xiàn)不足或缺乏。如果來自特定蛋白的肽沒有被抗體結(jié)合，這可能使得未對特定蛋白進(jìn)行質(zhì)量分析。因此，一種特別有用的方法是通過在切割之前將蛋白通過其N末端和/或C末端預(yù)吸附至固相，或者通過將N末端和/或C末端化學(xué)標(biāo)記以用于切割后的隨后分離，從蛋白中分離N末端肽或C末端肽。原則上，這則應(yīng)該導(dǎo)致回收代表來自該樣品的所有蛋白的所有N末端和/或C末端肽。蛋白質(zhì)中N末端氨基和C末端羧基與內(nèi)部氨基和羧基相比的差別反應(yīng)性質(zhì)，大大有利于這種N末端和/或C末端肽的分離。采用或者識別特定肽序列或者識別所述肽上化學(xué)標(biāo)記的其它親和試劑，可以對這類分離的N末端肽和/或C末端肽進(jìn)行進(jìn)一步分級分離，或者通過物理方法例如HPLC進(jìn)行進(jìn)一步的分級分離。然后在質(zhì)量分析之前，用蛋白親和試劑對這類分離的N末端肽和/或C末端肽進(jìn)行分級分離。此外，本發(fā)明可供用于將不同的化學(xué)標(biāo)記順序綴合于所述蛋白/肽混合物，尤其是通過特異性切割所述蛋白/肽而順序暴露N末端或C末端、并且因此所述N末端或C末端(或兩者)在該末端暴露時(shí)與特定化學(xué)標(biāo)記綴合。因此，本發(fā)明的該方面可供用于一系列具有多種于末端引入綴合的化學(xué)標(biāo)記的蛋白部分，這樣的部分用與所述標(biāo)記結(jié)合的親和試劑進(jìn)行分離。作為替代于蛋白分子末端進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記的一個(gè)特別有用的方法，也可以將化學(xué)標(biāo)記特異性地連接于非末端氨基酸，使得可以通過內(nèi)部化學(xué)標(biāo)記分離內(nèi)部肽。特有的化學(xué)適用于將配體連接至幾種特定的氨基酸，例如賴氨酸的ε-氨基、半胱氨酸的巰基以及天冬氨酸和谷氨酸的羧基。借助非末端標(biāo)記分離肽的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以對較大的肽進(jìn)行選擇，所述較大的肽更可能含有連接標(biāo)記的特定氨基酸，因此在質(zhì)量分析期間利用超過具有較大的背景噪音的低分子量質(zhì)量的質(zhì)量來分離肽。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是已經(jīng)可以獲得將化學(xué)標(biāo)記引入到蛋白或肽中的特定氨基酸上的試劑陣列，尤其是提供生物素標(biāo)記的試劑陣列。
第五方面的另一實(shí)施方案提供了順序循環(huán)用蛋白酶或化學(xué)方法進(jìn)行蛋白切割，在連續(xù)的蛋白切割步驟期間或之后用蛋白親和試劑進(jìn)行分級分離以及隨后進(jìn)行質(zhì)量分析。在這種情況下，順序的切割循環(huán)有助于蛋白混合物的分析，從而用蛋白親和試劑對所述范圍的蛋白和肽進(jìn)行分級分離，并且在每個(gè)切割循環(huán)后進(jìn)行分析。該方法也可以包括切割循環(huán)之間的化學(xué)標(biāo)記循環(huán)以增加質(zhì)量，或包括除去側(cè)基例如糖基團(tuán)以便降低質(zhì)量的步驟。如果此外在每次切割循環(huán)(或者加上或不加化學(xué)標(biāo)記、切割或其它修飾)結(jié)束時(shí)測定在該范圍的蛋白片段的質(zhì)量，則每個(gè)循環(huán)將獲得一定范圍的質(zhì)量分布。采用合適的一系列質(zhì)量修飾循環(huán)，一種蛋白或混合物的結(jié)果將是在連續(xù)循環(huán)時(shí)改變的蛋白/肽片段的質(zhì)譜；這些改變的模式將提供該混合物中特定蛋白/肽的“指紋”。在加上或不加化學(xué)標(biāo)記、切割或其它修飾的特定切割循環(huán)之后具有一定質(zhì)量的特定蛋白/肽片段的出現(xiàn)和消失，將為所述片段片列的鑒定提供了指紋，尤其是為通過參考這類指紋的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定提供了指紋。因此，對來自不同相關(guān)樣品的蛋白/肽片段譜的比較，可供用于鑒定這些樣品之間的蛋白/肽片段差異。在本發(fā)明該方面特別有用的是特異性地識別兩個(gè)氨基酸并且因此切割該蛋白的蛋白酶。這類蛋白酶的一個(gè)實(shí)例是激素原轉(zhuǎn)化酶，它在雙堿性(dibasic)氨基酸對之間切割。因此，本發(fā)明的第五方面提供了采用蛋白消化或切割、用蛋白親和試劑進(jìn)行分級分離和質(zhì)量分析的組合來分析蛋白混合物的新方法。
在第五方面的一個(gè)相關(guān)方面，在切割之前對蛋白進(jìn)行分級分離。對于大的蛋白混合物，特別是直接從全細(xì)胞或組織中分離的蛋白混合物，可能希望對蛋白進(jìn)行預(yù)分級分離，以便降低進(jìn)行隨后切割、肽分級分離和質(zhì)量分析的混合物的復(fù)雜性。盡管主要使用直接結(jié)合所述蛋白/肽中序列或結(jié)構(gòu)的蛋白親和試劑，但一種替代方法或一種補(bǔ)充方法是應(yīng)用化學(xué)標(biāo)記文庫，以提供由一組蛋白親和試劑結(jié)合的部分。預(yù)分級分離的更常規(guī)的方法包括應(yīng)用或者單向或者雙向凝膠電泳，其中分離所凝膠切片，然后對其中的蛋白進(jìn)行切割和質(zhì)量分析。其它預(yù)分級分離方法包括根據(jù)天然修飾例如磷酸化、糖基化、蛋白-蛋白(或肽)相互作用來分離蛋白；或者，可以對膜蛋白或者對來自細(xì)胞內(nèi)特定區(qū)室的蛋白進(jìn)行預(yù)分級分離。另一重要的預(yù)分級分離方法是用親和試劑例如抗體結(jié)合并除去高豐度蛋白，從混合物中除去這類蛋白。作為預(yù)分級分離的一種替代方法，在切割后產(chǎn)生的肽可以用這些方法中的許多方法來分級分離，也包括利用HPLC的大小/電荷分級分離法。這類方法對于分級分離已經(jīng)通過應(yīng)用蛋白親和試劑從混合物選擇出的肽特別有用。特別是，可以將HPLC與質(zhì)量分析相連，使得直接對來自HPLC分離的肽部分進(jìn)行質(zhì)量分析。也可以根據(jù)天然修飾，采用例如結(jié)合肽中磷酸化氨基酸的抗體，對切割后產(chǎn)生的肽進(jìn)行分級分離。通過采用蛋白親和試劑例如單克隆/多克隆抗體來分離用于隨后切割和質(zhì)量分析的特定蛋白，可以完成蛋白的預(yù)分級分離。對于較大蛋白混合物的這類分析，優(yōu)選抗體文庫，例如由重組Fv文庫提供的抗體文庫，以便分離多個(gè)亞組的蛋白或多個(gè)亞組的切割肽，以用于隨后的質(zhì)量分析。這類抗體文庫將包括各種各樣的蛋白或肽特異性，但也可以預(yù)富集與特定目的樣品中的目的蛋白/肽結(jié)合的抗體文庫。對于肽，這最好是通過測試個(gè)別Fv與該樣品中的一種肽或少數(shù)肽的選擇性結(jié)合來完成?；蛘?，通過將抗體文庫預(yù)吸附至混合目的蛋白/肽樣品上，然后用個(gè)別選定抗體或選定抗體的混合物分離多組蛋白或肽，可以完成預(yù)富集。用蛋白親和試劑進(jìn)行分級分離，為一定范圍的不同蛋白/肽部分提供質(zhì)譜，因此有助于檢測樣品之間特定蛋白的差異。
應(yīng)用化學(xué)標(biāo)記的再一優(yōu)點(diǎn)是隨后用親和試劑對肽進(jìn)行分級分離，可以大大減少來自一種蛋白分子的選定肽的數(shù)目，因此從質(zhì)量分子中去除分子的其余肽。一種尤其方便的選擇性化學(xué)標(biāo)記的方法是標(biāo)記混合物中該蛋白分子的N末端和C末端中任一個(gè)(或者這兩者)，然后用合適的選擇性試劑例如氨基酸特異性或序列特異性蛋白酶(例如內(nèi)肽酶Arg-C)或切割試劑(例如酸性pH，以于Asp-Pro切割)消化或切割所述蛋白分子。然后采用親和試劑，可以分離出來自所述原始蛋白的N末端肽或C末端肽(或這兩者)，并且棄去所有內(nèi)部肽。因此這種復(fù)雜性的降低足以滿足用質(zhì)量分析，尤其是采用HPLC與串聯(lián)質(zhì)譜儀偶聯(lián)分析整個(gè)肽，以從混合物鑒定所述個(gè)別肽。
另一方面，可以僅在例如用雙堿性切割劑激素原轉(zhuǎn)化酶消化/切割后進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記。這將確保僅在原始蛋白的一種或多種內(nèi)部位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。如果然后用一種不同的酶或切割試劑對所述蛋白混合物進(jìn)行第二個(gè)消化/切割步驟，則當(dāng)在原始蛋白中存在切割位點(diǎn)時(shí)，將減小所標(biāo)記的肽的大小。然后可以用蛋白親和試劑對所標(biāo)記的肽進(jìn)行分級分離，并進(jìn)行質(zhì)量分析。
在第五方面的另一實(shí)施方案中，讓一種蛋白混合物經(jīng)過多個(gè)標(biāo)記、消化/切割和質(zhì)量分析循環(huán)，，由此僅對通過應(yīng)用親和試劑與特定化學(xué)標(biāo)記的結(jié)合所產(chǎn)生的一等份混合物產(chǎn)物進(jìn)行蛋白親和試劑分級分離和質(zhì)量分析，然后用一種不同的化學(xué)標(biāo)記對主混合物進(jìn)行標(biāo)記以及消化/切割。這順序提供了一定范圍的不同片段。對該方法的另一種變化涉及與上述相同的初始步驟，但在切割后暴露了新的N末端和C末端，然后可任選地用一種不同的化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記這些新末端之一(或兩者)，因此這標(biāo)記了原始蛋白的內(nèi)部位點(diǎn)。如果需要，可以用一種不同的蛋白酶或切割試劑將該過程重復(fù)一次或多次，每次將一種不同的化學(xué)標(biāo)記加至所述N末端或C末端。在該方法的一種形式中，首先用兩種不同的化學(xué)基團(tuán)分別在N末端和C末端對整個(gè)蛋白混合物進(jìn)行標(biāo)記，然后用一種蛋白酶切割，例如用在特定氨基酸鄰近特異性切割的蛋白酶切割，然后用另外兩種不同的化學(xué)基團(tuán)于新N末端和C末端進(jìn)行標(biāo)記。這將產(chǎn)生各自于末端帶有化學(xué)標(biāo)記的肽混合物。由于所述N末端肽和C末端肽將具有一種特定標(biāo)記，因此此后用合適的親和試劑從混合物中分離出所述肽。沒有原始N末端標(biāo)記或C末端標(biāo)記的內(nèi)部肽可以利用其特定標(biāo)記加以分離。然后可以重復(fù)消化和標(biāo)記過程，以產(chǎn)生帶有標(biāo)記的其它肽。采用特定標(biāo)記的親和試劑的特定組合，則可以分離出來自所述原始蛋白的N末端肽或C末端肽或特定內(nèi)部肽，并且棄去選定的肽，以達(dá)到復(fù)雜性的降低。在將化學(xué)標(biāo)記加至肽中的兩種或更多種氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)時(shí)，順序應(yīng)用親和標(biāo)記可以分離出含有特定氨基酸組合的肽的部分。例如，如果將平均長度為20個(gè)氨基酸的肽混合物分別于賴氨酸和苯丙氨酸標(biāo)記，并且該混合物包含25％的不包括賴氨酸和苯丙氨酸的肽、25％的僅包括賴氨酸的肽、25％的具有苯丙氨酸的肽以及25％的既包括賴氨酸又包括苯丙氨酸的肽，那么分開應(yīng)用或順序應(yīng)用或者賴氨酸特異性或者苯丙氨酸特異性的親和試劑，將導(dǎo)致將肽分級分離為4個(gè)相等的部分。實(shí)際上，這樣一種分級分離方案將有利于較大肽與親和試劑的結(jié)合，因?yàn)檫@些肽更可能含有一種或更多種標(biāo)記的特定氨基酸。這將不利于分析非常小的肽，例如分子量小于1000道爾頓的那些肽，這些肽當(dāng)經(jīng)過質(zhì)譜分析時(shí)，將更可能與由片段化的肽和其它小分子產(chǎn)生的背景噪音重合。
當(dāng)需要分析復(fù)雜的混合物，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中的蛋白混合物時(shí)，本發(fā)明提供了一種主要方法，其中在切割之前或者之后用蛋白親和試劑對蛋白進(jìn)行分級分離，然后對所述肽進(jìn)行質(zhì)量分析。對復(fù)雜的蛋白或肽混合物的分級分離需要相應(yīng)的復(fù)雜的蛋白親和試劑混合物，并且可以用一種或更多種另外的可以識別作為分級分離基礎(chǔ)的所述蛋白/肽特征的親和試劑來輔助進(jìn)行。當(dāng)切割在分級分離之前進(jìn)行時(shí)，本發(fā)明中最常用的方法是用例如胰蛋白酶或V8(Glu-C)蛋白酶的蛋白酶切割整個(gè)蛋白混合物，然后對某些肽進(jìn)行選擇性地分離和質(zhì)量分析。
通常是，一般通過在切割之前將化學(xué)標(biāo)記加至所述蛋白的N末端和/或C末端，并且采用一種分離具有所述化學(xué)標(biāo)記的肽的親和試劑，分離來自所述肽混合物的N末端肽或C末端肽(或這兩者)。或者，可以采用已經(jīng)選擇用于與特定蛋白中的特定肽結(jié)合的親和試劑，分離特定肽(N/C末端的或其它的)；這些將從所述混合物中選出那些肽。對于更加復(fù)雜的蛋白混合物，在質(zhì)量分析之前，最好使用基于大小、電荷或疏水性的再一個(gè)分級分離步驟，例如HPLC分級分離，尤其是當(dāng)該步驟可以與質(zhì)量分析相連時(shí)。然后對肽的選擇性分離可供用于對衍生自替代蛋白混合物的特定肽的相對量(涉及其相應(yīng)混合物中所述蛋白的相對水平)以及在某些情況下對所述肽的修飾進(jìn)行比較分析。
關(guān)于N末端肽或C末端肽的分級分離，蛋白親和試劑的制備和應(yīng)用是本發(fā)明的一個(gè)重要方面，蛋白的N末端或C末端的標(biāo)記是另一重要方面。關(guān)于典型的來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織或者許多活有機(jī)體的蛋白混合物，將修飾(例如通過甲基化)這些蛋白的幾個(gè)N末端(和某些C末端)，使得可以阻止將化學(xué)標(biāo)記加至所述末端。另外，對于典型的來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織或許多活有機(jī)體的蛋白混合物，所述蛋白將以不同的相對豐度水平存在，通?？隙òǜ哓S度蛋白。當(dāng)將來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織或其它活有機(jī)體的蛋白混合物用于蛋白親和試劑的初次選擇時(shí)，這類高豐度蛋白可能決定親和試劑的選擇，并且可能在用于質(zhì)量分析的最終肽混合物中占優(yōu)勢。對這兩個(gè)問題的解決方法是用人工混合蛋白源分離所述親和試劑。通常，這將是一種基因表達(dá)系統(tǒng)，藉此用基因(通常是cDNA)文庫來產(chǎn)生無N末端或C末端修飾的蛋白。另外，基因表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用使得基因文庫可以被“標(biāo)準(zhǔn)化”，以減少或除去文庫內(nèi)的高豐度基因。這通常通過在構(gòu)建該文庫之前使所述DNA(或RNA)自退火來完成。因此，本發(fā)明中的一種常用方法是通過基因文庫(通常被標(biāo)準(zhǔn)化的)的表達(dá)產(chǎn)生蛋白，產(chǎn)生無顯著N末端或C末端修飾的蛋白，當(dāng)被標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，產(chǎn)生無特定蛋白占優(yōu)勢的蛋白混合物。與基因文庫一起使用的一種典型的表達(dá)系統(tǒng)是采用真核生物核糖體制劑的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯；這也提供了將經(jīng)修飾的氨基酸摻入所表達(dá)蛋白中的可能性。所表達(dá)的蛋白混合物然后可以直接用于N末端或C末端標(biāo)記。在N末端氨基或C末端羧基未被修飾或防止其進(jìn)行隨后的化學(xué)標(biāo)記的情況下，也可以使用其它表達(dá)系統(tǒng)。在發(fā)生修飾時(shí)，在某些情況下可以或者用諸如組蛋白脫乙酰酶之類的酶或者諸如除去N末端甲硫氨酸的有限溴化氰切割之類的化學(xué)法，除去N末端修飾。
在產(chǎn)生無N/C末端修飾的蛋白混合物后，則可以將化學(xué)標(biāo)記加至N/C末端氨基。對于N末端，最初可以用例如檸康酐或乙酰亞胺酸甲酯(methyl acetimidate)之類的試劑封閉賴氨酸的ε-氨基，以便僅允許N末端氨基反應(yīng)?；蛘撸梢酝ㄟ^將經(jīng)修飾的賴氨酸加入表達(dá)系統(tǒng)例如體外轉(zhuǎn)錄/翻譯中，從而例如可以將生物素修飾的賴氨酸代替賴氨酸直接摻入，封閉賴氨酸的ε-氨基。然后，例如用可以得到親和試劑的特定分子的異硫氰酸酯，將化學(xué)標(biāo)記選擇性地加至蛋白的N末端。一種這樣的實(shí)例是熒光素，通過所述蛋白與異硫氰酸熒光素反應(yīng)摻入熒光素，使得隨后可以用抗熒光素抗體進(jìn)行純化。或者，可以將多羧酸螯合劑作為異硫氰酸酯摻入，使得隨后可以用特定金屬進(jìn)行純化。一旦標(biāo)記了混合物中蛋白的N末端和/或C末端，則可以或者用化學(xué)法或者用酶法，用例如胰蛋白酶的蛋白酶或另一種切割劑，對所述蛋白進(jìn)行全面的特異性切割。這樣的切割由此從每種蛋白釋放出單個(gè)標(biāo)記的末端肽片段，然后可以用一種適當(dāng)親和試劑(例如對所述化學(xué)標(biāo)記特異性的抗體)從未標(biāo)記肽混合物中純化這種片段的集合。如果需要，可以增加化學(xué)標(biāo)記的大小，以產(chǎn)生更大的質(zhì)量用于分析；這對于由非常靠近所述化學(xué)標(biāo)記的切割而產(chǎn)生的肽片段是有用的，否則所述肽片段是如此之小以致在質(zhì)量分析中被分析為較低分子量“噪音”?；瘜W(xué)標(biāo)記可能例如包括一段在核酸合成期間引入的通過反應(yīng)基與所述肽連接的核酸。這種核酸分子也可用于通過將所述核酸退火至互補(bǔ)序列來分離所標(biāo)記的肽。
在化學(xué)標(biāo)記和分離后，可以用所回收的N/C末端肽混合物作為“餌”，從直接得自哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織或其它活有機(jī)體的蛋白中分離與這些相同肽結(jié)合的蛋白親和試劑。這類親和試劑通常衍生自作為粒子一部分展示的重組Fv文庫，其中所述粒子含有編碼所述抗體的相應(yīng)基因。這類粒子的實(shí)例是核糖體展示粒子或噬菌體展示粒子，在每種情況下，可以拯救來自選定抗體的基因，以便繁殖那些特異性抗體。作為一種可供選擇的方法，可以用N/C末端肽混合物篩選抗體(例如重組單鏈抗體或Fab、Fv)的大陣列，并且可以通過相應(yīng)的基因回收顯示出與所述肽結(jié)合的抗體。作為另一種可供選擇的方法，通過適當(dāng)?shù)孛庖邉?dòng)物，可以用N末端肽和/或C末端肽直接產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。采用這些方法，選擇蛋白親和試劑文庫，然后所述文庫可以用于分析蛋白混合物，例如來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織或其它活有機(jī)體的蛋白混合物。這種分析可能涉及或者用所述親和試劑文庫從得自哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織或其它活有機(jī)體的蛋白中選擇出N/C末端肽，或者用個(gè)別親和試劑選擇出個(gè)別肽。然后可以對所選定的肽進(jìn)行質(zhì)量分析，通常采用MALDI-ToF(基質(zhì)輔助激光解附/電離飛行時(shí)間)分析，其中所述個(gè)別肽給出獨(dú)特的荷質(zhì)比，該比率則可以用來鑒定所述肽的氨基酸組分。如果可以分離出所述肽，則隨后可以用MS-MS(雙質(zhì)譜法)肽測序來鑒定所述肽。另一方面，新一代四極-ToF LC-MS-MS(“Q-ToF”)儀可供用于在同一儀器中進(jìn)行順序的MALDI-ToF和MS-MS。事實(shí)上，或者單獨(dú)或者在混合物中的蛋白親和試劑可以或者間接或者直接固定化至插入MALDI-ToF儀中的解附芯片上，隨后可以通過親和試劑將肽結(jié)合至芯片上。這樣，可以在一個(gè)芯片上分析由多種親和試劑在不同位點(diǎn)上吸附的多種肽部分。應(yīng)用重組蛋白作為“餌”來分離蛋白親和試劑，也提供了將其它標(biāo)記連接至那些蛋白、從而由所述基因序列編碼所述標(biāo)記的前景；例如，可以例如通過PCR介導(dǎo)的摻入，將C末端多聚組氨酸標(biāo)記(使得隨后可以用鎳螯合劑純化所標(biāo)記的片段)加入所述基因序列中。
應(yīng)用重組蛋白作為“餌”來分離蛋白親和試劑，也提供了本發(fā)明第五方面用于采用由所述重組蛋白編碼的標(biāo)記來特異性地分離肽的另一種常用的方法。采用編碼這類標(biāo)記并且設(shè)計(jì)用以將這類標(biāo)記加入所產(chǎn)生的表達(dá)蛋白中的特定PCR引物，這類標(biāo)記可以方便地在基因文庫構(gòu)建期間摻入基因(通常為cDNA)文庫成員中，或摻入單個(gè)克隆或多組克隆中。最好是，這類標(biāo)記將在所有讀框中摻入所表達(dá)的蛋白中，以便產(chǎn)生生產(chǎn)性標(biāo)記的蛋白。這類標(biāo)記最好通過PCR反應(yīng)的下游引物摻入，通常的結(jié)果是朝所表達(dá)的蛋白的C末端產(chǎn)生所述標(biāo)記(盡管在某些克隆中，上游終止密碼子可能阻止這種產(chǎn)生)。然而，也可以在N末端或者在N末端和C末端兩者中摻入標(biāo)記。
對于從肽混合物中分離特定肽，可以合成(或通過重組DNA)產(chǎn)生所述肽序列，然后如上所述，將其用作“餌”來捕獲特定的蛋白親和試劑。這些親和試劑然后可以用來從得自例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織或其它活有機(jī)體的經(jīng)切割的蛋白混合物中分離這些同樣的肽。
作為選擇性分級分離N末端肽或C末端肽或特定內(nèi)部肽的一種可供選擇的方法，諸如包括磷酸化氨基酸的肽之類的修飾肽，可以用選擇性地與磷酸化氨基酸(酪氨酸、蘇氨酸或絲氨酸或其組合)結(jié)合的抗體來分離，或者采用固定化Fe3+來捕獲帶負(fù)電荷的肽。同樣，在肽的修飾被進(jìn)一步衍生化以有助于分離的某些情況下，可以分離出通過糖基化和其它修飾來修飾的肽。例如，可以容易地通過高碘酸鹽反應(yīng)來修飾糖類，作為加入例如熒光素的化學(xué)標(biāo)記的中間體。本發(fā)明的一個(gè)特別重要的方面是對選擇性修飾的肽進(jìn)行分級分離，由此在切割之前借助將這類肽差別暴露在原始蛋白環(huán)境內(nèi)的標(biāo)記，選擇性地標(biāo)記這類肽。例如，通過用優(yōu)先與特定氨基酸基團(tuán)反應(yīng)的標(biāo)記劑處理細(xì)胞，可以例如用生物素選擇性地標(biāo)記活細(xì)胞上的表面暴露蛋白。用于在通過細(xì)胞內(nèi)其它刺激物天然標(biāo)記的蛋白中達(dá)到這樣的標(biāo)記的一種間接方法是應(yīng)用這類刺激物實(shí)現(xiàn)所述蛋白的標(biāo)記。例如，通過將受體的配體加入那些細(xì)胞中，可以潛在地標(biāo)記(例如磷酸化)細(xì)胞內(nèi)的與受體結(jié)合的酪氨酸激酶分子。在修飾后，通過切割從蛋白中釋放出肽，然后直接對其進(jìn)行質(zhì)量分析，或者在進(jìn)行質(zhì)量分析之前，用蛋白親和試劑如上所述進(jìn)行分級分離。
最好用質(zhì)譜法進(jìn)行本發(fā)明對蛋白和肽的質(zhì)量分析。特別是，MALDI-ToF分析具有非常準(zhǔn)確地測量各種肽的具體質(zhì)荷比的能力。該方法具有同時(shí)分析數(shù)千種肽的能力。當(dāng)個(gè)別肽(和蛋白)大于4kD時(shí)，對其的分辨率則變得較差，使得必需將蛋白切割為肽片段以提供精細(xì)的分辨率。最近將液相色譜分離法(例如HPLC)與串聯(lián)質(zhì)譜法連接的方法已經(jīng)使得可以對包含至多200種蛋白的蛋白混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析。當(dāng)在蛋白酶消化后分析這類蛋白時(shí)，如果假定每種蛋白平均10種肽，則該方法可以分析至多2000種肽。因此采用本發(fā)明的方法，例如僅分析標(biāo)記的N末端肽，則任何一次都可以分析衍生自至多2000種蛋白的至多2000種N末端肽。由于這對于全面分析來自細(xì)胞的哺乳動(dòng)物蛋白(通常50,000種/細(xì)胞)不夠靈敏，因此必須將肽分隔為至少25個(gè)部分，以便對所有這些部分進(jìn)行分析。這種進(jìn)一步的分級分離可以或者采用預(yù)先選定的蛋白親和試劑文庫直接完成，或者在連續(xù)蛋白消化/切割步驟后利用試劑標(biāo)記內(nèi)部末端，然后根據(jù)其標(biāo)記用特定蛋白親和試劑分級分離肽而完成。作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜法的一種替代方法，可以用MALDI-ToF來產(chǎn)生蛋白質(zhì)量分布圖，可以比較來自不同細(xì)胞的蛋白混合物的所述分布圖。
化學(xué)標(biāo)記通常是可以通常于N末端或C末端共價(jià)連接于蛋白的部分。對N末端的化學(xué)標(biāo)記通常于末端氨基進(jìn)行。如果必需避免標(biāo)記賴氨酸的ε-氨基，則可以最初采用例如檸康酐或乙酰亞胺酸甲酯的試劑封閉這些氨基。末端氨基可與種類繁多的化學(xué)試劑反應(yīng)，通常采用異硫氰酸酯進(jìn)行反應(yīng)。因此，可以常用的抗體所識別的配體例如二硝基酚和熒光素將這些標(biāo)記連接于N末端，隨后可以采用抗體親和試劑進(jìn)行分級分離。例如，常用的Edman試劑異硫氰酸苯酯可以用來特異性地連接至蛋白的N末端，并且必要時(shí)可以用可供用于隨后與親和試劑結(jié)合的部分將其衍生化。對于C末端的化學(xué)標(biāo)記，通常采用基于碳二亞胺活化的方法來引入被親和試劑結(jié)合的配體。另一方面，已經(jīng)描述了采用反向蛋白水解將各個(gè)部分加入蛋白的C末端，從而某些蛋白酶例如羧肽酶Y和賴氨酰內(nèi)肽酶可以以反向工作，以加入化學(xué)標(biāo)記，通常通過或者作為具有與親和試劑結(jié)合的標(biāo)記的衍生化氨基酸的氨基酸，或者通過隨后可以被親和試劑特異性結(jié)合的氨基酸的天然序列來進(jìn)行。人們會(huì)認(rèn)識到，也可以化學(xué)標(biāo)記各種各樣的內(nèi)部氨基酸，包括通過ε-氨基標(biāo)記Lys、通過羧基標(biāo)記Glu/Asp、通過巰基標(biāo)記Cys、通過羥基標(biāo)記Ser/Thr以及通過羥苯基標(biāo)記Tyr。已經(jīng)描述了大部分其它氨基酸的特異性衍生化。人們公認(rèn)可以利用翻譯后蛋白修飾來加入化學(xué)標(biāo)記，尤其是利用糖基化，其中通常用高碘酸將糖殘基氧化為甲醛基團(tuán)，然后甲醛基團(tuán)可以與含胺分子反應(yīng)。可以用來加入化學(xué)標(biāo)記的其它修飾包括脂化(1ipidation)、磷酸化和金屬離子的加入。人們會(huì)認(rèn)識到，本領(lǐng)域中有許多用于在蛋白分子或肽內(nèi)的特定位點(diǎn)引入一種或更多種化學(xué)標(biāo)記的方法。
用于第五方面的蛋白親和試劑通常是單克隆抗體。對于蛋白或肽內(nèi)的特定序列或結(jié)構(gòu)，采用通常為Fab、Fv或單鏈Fv形式的重組抗體結(jié)合位點(diǎn)文庫，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)通常采用例如噬菌體或核糖體復(fù)合體來“展示”，使得可以回收編碼特定抗體結(jié)合位點(diǎn)的基因。關(guān)于在本發(fā)明中的應(yīng)用，可以將抗體結(jié)合位點(diǎn)文庫分為多個(gè)組，例如通過將噬菌斑挑出并且形成陣列，或者將載體中的基因挑出并且形成陣列以進(jìn)行核糖體展示。這類庫通常含有數(shù)種蛋白或肽的抗體結(jié)合位點(diǎn)，使得可以用所述庫進(jìn)行分級分離。另一方面，可以將需要抗體親和試劑文庫的蛋白或肽混合物固定化，并且用作預(yù)選擇合適親和試劑的靶，然后將所述親和試劑分為多個(gè)庫，或作為單個(gè)試劑使用。對于化學(xué)標(biāo)記，可以用個(gè)別單克隆抗體來特異性地與個(gè)別標(biāo)記結(jié)合，以便達(dá)到隨后的分級分離。
本發(fā)明的第五方面包括應(yīng)用非單克隆抗體的蛋白親和試劑，其中這類試劑可以便于在質(zhì)量分析之前將肽或蛋白分級分離。這類親和試劑可以包括選擇性地結(jié)合某些肽例如主要組織相容性蛋白和T細(xì)胞受體的免疫分子。其它蛋白親和試劑可以包括通常參與蛋白-蛋白結(jié)合相互作用的蛋白結(jié)構(gòu)域，例如SH1結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明包括將包括在混合物中的肽環(huán)化的概念，尤其是當(dāng)通過例如在還原性條件下連接半胱氨酸殘基連接至固相時(shí)。對此的一種方法可以是在固定化肽暴露的N末端或C末端上加入額外的半胱氨酸殘基，例如對于C末端固定化肽、采用肽合成的標(biāo)準(zhǔn)條件，或采用反向蛋白水解，由此使用某些蛋白酶例如羧肽酶Y和賴氨酰內(nèi)肽酶。第五方面也包括將蛋白或肽進(jìn)一步分級分離的方法，即通過通常于N末端加入形成蛋白酶識別序列一部分的氨基酸，所述蛋白酶在兩個(gè)或多個(gè)氨基酸識別序列特異性切割，而由起始蛋白或肽提供所述蛋白酶識別位點(diǎn)中的一個(gè)或更多個(gè)末端氨基酸。這樣，借助新產(chǎn)生的序列，僅對加入新氨基酸的蛋白或肽部分進(jìn)行蛋白酶切割。這樣，可以用通常位于N末端的額外氨基酸標(biāo)記蛋白或肽，在由此標(biāo)記的混合物部分中產(chǎn)生特定蛋白酶切割位點(diǎn)。然后可以例如通過所述新末端，例如采用一種經(jīng)標(biāo)記的末端氨基酸，或通過將一種化學(xué)標(biāo)記加至所述末端，由此可以用一種親和試劑來將所標(biāo)記的部分固定化，從而將所述蛋白或肽固定化。在除去非固定化的未標(biāo)記分子后，可以用所述特定蛋白酶切割所述蛋白或肽，所述蛋白酶則僅在已經(jīng)通過合成衍生的氨基酸和原始蛋白或肽衍生的氨基酸組合產(chǎn)生的切割位點(diǎn)進(jìn)行切割。然后可以用蛋白親和試劑對經(jīng)切割的蛋白進(jìn)行分級分離，并且進(jìn)行質(zhì)量分析(或在質(zhì)量分析之前進(jìn)一步加工)，由此提供所述肽混合物的一個(gè)亞組。通過采用將特定氨基酸平行合成至已暴露末端，然后固定化并進(jìn)行切割，可以根據(jù)末端氨基酸對大的蛋白或肽混合物進(jìn)行分級分離。蛋白酶識別位點(diǎn)的一個(gè)實(shí)例是ile，glu，gly，arg，該識別位點(diǎn)在gly和arg之間被因子Xa切割?？梢詫⑿蛄衖le，glu，gly合成到蛋白或肽的N末端，因此，如果該蛋白或肽序列中的相鄰氨基酸是arg，則將產(chǎn)生所述切割位點(diǎn)，并且可以被因子Xa切割。蛋白酶切割位點(diǎn)的其它實(shí)例是asp，asp，asp，asp，lys，由腸激酶在asp和lys之間切割；pro，gly，ala，ala，his，tyr，由基因酶(genease)I在his和tyr之間切割；leu，val，pro，arg，gly，ser，由凝血酶在arg和gly之間切割。部分序列asp，asp，asp，asp的N末端加入，可以用來鑒定具有N末端lys(由腸激酶切割)的蛋白或肽，pro，gly，ala，ala，his的N末端加入可以用來以鑒定具有N末端tyr(由基因酶切割)的蛋白/肽，leu，val，pro，arg的N末端加入可以用來鑒定N末端gly，ser；或leu，val，pro，arg，gly的N末端加入可以用來鑒定N末端ser(由凝血酶切割)。諸如MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)之類的具有特定識別位點(diǎn)的其它蛋白酶可以用來分級分離具有其它N末端氨基酸的蛋白。不同的蛋白酶識別位點(diǎn)因此可以與所述蛋白酶結(jié)合使用，以根據(jù)N末端氨基酸分級分離蛋白或肽。作為一種替代方法，將一個(gè)或更多個(gè)氨基酸加至肽的游離N末端，可以用來產(chǎn)生被親和試劑結(jié)合的位點(diǎn)，包括這樣一種位點(diǎn)取決于來自所述肽的一個(gè)或更多個(gè)N末端氨基酸的情況。因此，通過將氨基酸加至N末端，以取決于N末端氨基酸的方式產(chǎn)生蛋白酶消化位點(diǎn)或親和試劑結(jié)合的位點(diǎn)，可以區(qū)別不同的肽或多組肽。當(dāng)?shù)鞍子米髟牧希绕涫菍τ趤碜圆溉閯?dòng)物細(xì)胞的蛋白，因此所述N末端蛋白是甲硫氨酸時(shí)，必要時(shí)這可以通過例如甲?；蛘咄ㄟ^特異性除去末端甲酰甲硫氨酸的細(xì)菌蛋白酶的切割來除去。
蛋白親和試劑是本發(fā)明第五方面的一個(gè)重要方面，并且可以用于廣泛地分級分離多組蛋白/肽，或用于特異性地分級分離個(gè)別蛋白/肽。關(guān)于分級分離，首先必需制備與一個(gè)特定部分的肽或特定肽結(jié)合并且與其它部分/肽不結(jié)合的多個(gè)部分的蛋白親和試劑或單個(gè)蛋白親和試劑。一種便利的方法是在分離蛋白親和試劑之前分級分離所述蛋白或肽。在抗體作為蛋白親和試劑的情況下，則可以用這種蛋白/肽或者結(jié)合來自文庫的展示的抗體，或者可以用來免疫動(dòng)物用以產(chǎn)生抗血清。當(dāng)使用重組抗體結(jié)合位點(diǎn)文庫例如單鏈Fv文庫時(shí)，可以在與蛋白/肽部分結(jié)合后回收編碼這些重組抗體結(jié)合位點(diǎn)的基因，提供可復(fù)制的親和試劑源，用于隨后分離特定的蛋白/肽部分。另一方面，可以根據(jù)結(jié)合特異性篩選個(gè)別單鏈Fv，例如通過用MALDI-ToF分析肽結(jié)合。在這種情況下，與來自大蛋白混合物的一種肽結(jié)合的單鏈Fv作為基因克隆保留(實(shí)際上也保留結(jié)合至多3種肽的那些單鏈Fv)，用于隨后單獨(dú)應(yīng)用或在Fv混合物中應(yīng)用，以從該混合物中分離一個(gè)蛋白/肽部分。人們會(huì)認(rèn)識到，來自蛋白的游離N末端通常是用于分離高度特異性抗體的良好的靶，因此來自蛋白的N末端肽的捕獲和釋放將特別有利于隨后的抗體分離。某些Fv可以用于從混合物除去高豐度蛋白或肽。人們會(huì)認(rèn)識到，單鏈Fv結(jié)合的保留和表征也可以提供通過消除具有與其它Fv相同的特異性的Fv來降低豐余性的一種手段。
本發(fā)明第五方面的各種實(shí)施方案包括以下的組合蛋白消化/切割、用蛋白親和試劑進(jìn)行分級分離和質(zhì)量分析、以及采用針對所述蛋白或肽中特定序列或結(jié)構(gòu)的親和標(biāo)記的可任選的分級分離步驟、和化學(xué)標(biāo)記并根據(jù)這些標(biāo)記分級分離的可任選的步驟。不同的方面包括如下這些步驟的不同順序1-重復(fù)消化/切割循環(huán)和質(zhì)量分析2-消化/切割、用蛋白親和試劑分級分離、質(zhì)量分析3-用蛋白親和試劑分級分離、消化/切割、質(zhì)量分析4-末端化學(xué)標(biāo)記、消化/切割、用親和試劑分級分離、質(zhì)量分析5-同3一樣，但還有標(biāo)記、消化/切割、分級分離的額外的循環(huán)6-同3一樣，但還有重復(fù)的標(biāo)記、消化/切割循環(huán)和質(zhì)量分析本發(fā)明第五方面應(yīng)該被認(rèn)為包括這些和相關(guān)的蛋白/肽加工步驟以及降低蛋白混合物復(fù)雜性的核心目的，以便達(dá)到對所產(chǎn)生的蛋白/肽步驟的質(zhì)量分析。
目前用于本發(fā)明操作的常用方法涉及消化蛋白(或者是天然的，或者由cDNA文庫編碼)混合物的N末端和/或C末端、用蛋白酶切割、將所述N末端和/或C末端肽片段固定化、以及釋放所述肽和對所述肽進(jìn)行質(zhì)量分析。另一方面，通過在用序列特異性蛋白酶切割之前加入氨基酸，可以對N末端或C末端進(jìn)行修飾。在質(zhì)量分析之前，用所述肽來結(jié)合蛋白親和試劑例如抗體，其中已經(jīng)預(yù)選擇出這些抗體來分級分離所述肽，或這些抗體本身作為親和試劑保留?？梢岳绺鶕?jù)大小對蛋白混合物進(jìn)行預(yù)分級分離，或可以由通過分隔克隆預(yù)分級分離的cDNA文庫產(chǎn)生蛋白混合物。然后用所保留的蛋白親和試劑來分析復(fù)雜的蛋白樣品，從而用所述抗體來結(jié)合肽，然后對所述肽進(jìn)行質(zhì)量分析。
人們會(huì)認(rèn)識到，本文描述的蛋白的消化/切割、分級分離和質(zhì)量分析的相同原理中的許多原理也可以應(yīng)用于其它聚合分子，例如DNA或RNA。在DNA或RNA的情況下，5’端和3’端的游離磷酸基團(tuán)和羧基分別提供一種高度特異性地加入化學(xué)標(biāo)記或與固相直接連接的一種工具。序列特異性限制性酶或修飾酶可供用于切割或修飾DNA分子。有用的DNA或RNA的親和試劑是核酸本身，它們可以與互補(bǔ)DNA或RNA序列特異性地雜交，在雜交之前或之后將其連接于固相。用這類方法，可以對復(fù)雜的核酸混合物進(jìn)行分級分離，然后進(jìn)行質(zhì)量分析，尤其是采用質(zhì)譜法進(jìn)行質(zhì)量分析。
通過以下實(shí)施例描述本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)被認(rèn)為對范圍進(jìn)行限制；
將這些構(gòu)建體克隆到載體pET 5c(Rosenberg AH等，Gene，56125-135，1987)中，該載體提供一個(gè)T7啟動(dòng)子，后接來自T7基因10的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。將所述scAb構(gòu)建體插入該載體的NdeI位點(diǎn)，使得編碼所述附加表位的序列位于T7基因10的第一個(gè)ATG之后。第一種構(gòu)建體包括抗銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的scAb(Molloy P.等，Journal of Applied Bacteriology，78359-365，1995)，同時(shí)在N末端加入FLAG表位(MDYKDDDK)(Knappik A和Pluckthun A，BioTechniques，17，754-761，1994)，在所述蛋白的C末端區(qū)加入c-fos的b-拉鏈結(jié)構(gòu)域(Abate，C等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.871032-1036，1990)。第二種構(gòu)建體包含由抗胎兒抗原抗體340(Durrant LG等Prenatal Diagnosis，14131-140，1994)構(gòu)建的ScAb，同時(shí)在該蛋白N末端具有多聚組氨酸標(biāo)記、在該蛋白C末端區(qū)具有c-jun的b-拉鏈結(jié)構(gòu)域(Abate C.等，出處同上)。
如下所述構(gòu)建抗銅綠假單胞菌(α-Ps-fos)scAb和340-jun scAb用分別引入5’FLAG表位序列以及除去3’終止密碼子的引物RD5’FLAG5’gcggatcccatatggactacaaagacgatgacgacaaacaggtgcagctgcag3’(Genosys Biotechnologies Europe Ltd，Cambridge，UK.)和RD3’5’gcgaattcgtggtggtggtggtggtgtgactctcc3’(Genosys)，擴(kuò)增載體pPM1His(Mollogy P.等，出處同上)中的α-Ps scAb的DNA。反應(yīng)混合物包括0.1μg模板DNA、2.6單位ExpandTM高保真性PCR酶混合物(BoehringerMannheim，Lewes，UK.)、Expand HF緩沖液(Boehringer Mannheim)、1.5mM MgCl2、200μM脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)(Life Technologies，Paisley，UK)和每種引物25皮摩爾。循環(huán)是96℃5分鐘、然后是[95℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1分鐘]×5、[95℃45秒、50℃1分鐘、72℃1分鐘30秒]×8、[95℃45秒、50℃1分鐘、72℃2分鐘]×5、以72℃5分鐘結(jié)束。用BamHI和EcoRI切割所獲得的1123bp產(chǎn)物，并將其克隆到載體pUC19(Boehringer Mannheim)中。采用Thermo Sequenase放射性標(biāo)記終止子循環(huán)測序試劑盒與[33P]二脫氧核苷酸(Amersham Life Science，Amersham，UK)，確證該DNA序列。將該構(gòu)建體作為NdeI-EcoRI片段克隆到pET5c載體(Promega UK Ltd，Southampton，UK.)(參見Molecular Cloning，A Laboratory ManualSambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.編著，Cold Spring Harbor LaboratoryPress 1989，New York，USA)。用WizardPlus SV Minipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega UK Ltd)，或者對于較大規(guī)模，采用Qiagen Plasmid Midi試劑盒(Qiagen Ltd，Crawley，UK.)，制備質(zhì)粒DNA。所產(chǎn)生的新質(zhì)粒命名為pET5c FLAG-αPs scAb。
通過以下重疊寡核苷酸的PCR裝配fos盒Foslfor 5’-atggaattcctcgagaccgacaccctacaggcggaaaccgaccagctggaFos80rev 5’-tcgcgatttcggtttgcagcgcggatttttcgtcttccagctggtcggttFos71for 5’-aaaccgaaatcgcgaacctgctgaaagaaaaagaaaagctggagttcatcFos155rev 5’ggaagcttgaattccgccggacggtgtgccgccaggatgaactccagctt上述寡核苷酸以各1pmol包括在反應(yīng)混合物中，采用高保真性聚合酶和如先前所述的反應(yīng)組分，用10pmol引物FoslfS5’-atggaattcctcgagacc和Fos 155rS 5’-ggaagcttgaattccgcc驅(qū)動(dòng)該反應(yīng)。所產(chǎn)生的155bp產(chǎn)物用EcoRI消化，將其純化并克隆到EcoRI切割的pUC19中，用于采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行序列分析(參見Molecular Cloning，ALaboratory Manual出處同上)。通過取代現(xiàn)有的攜帶人恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的320bp XhoI-EcoRI片段，將Fos盒作為XhoI-EcoRI片段亞克隆到pET5c FLAG-αPs scAb質(zhì)粒中。
通過用340抗體的VH和VK來代替ppMlHis中的α-Ps VH和VK，產(chǎn)生340scAb。用引物5’cagctgcaggagtctgggggaggcttag3’(Genosys)和5’tcagtagacggtgaccgaggttccttgaccccagta3’(Genosys)，擴(kuò)增340VH。反應(yīng)混合物包括0.1μg模板DNA、2.6單位ExpandTM高保真性PCR酶混合物、Expand HF緩沖液、1.5mM MgCl2、200μM dNTP和每種引物25pmole。循環(huán)是96℃5分鐘、然后是[95℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1分鐘]×5、[95℃45秒、50℃1分鐘、72℃1分鐘30秒]×8、[95℃45秒、50℃1分鐘、72℃2分鐘]×5、以72℃5分鐘結(jié)束。用PstI和BstEII切割所獲得的357bp產(chǎn)物，并將其克隆到PstI和BstEII切割的pPMlHis(參見Molecular Cloning，A LaboratoryManual出處同上)中。同樣，用引物5’gtgacattgagctcacacagtctcct3’和5’cagcccgttttatctcgagcttggtccg3’(Genosys)，擴(kuò)增340VK。用SstI和XhoI切割339bp產(chǎn)物并克隆進(jìn)SstI和XhoI切割修飾的pPMlHis(在上面產(chǎn)生)中。如前所述，采用Thermo Sequenase放射性標(biāo)記終止子循環(huán)測序試劑盒與[33P]二脫氧核苷酸，確證該DNA序列。用分別于5’端引入6個(gè)組氨酸殘基和除去3’終止密碼子的引物RD 5’HIS5’gcggatcccatatgcaccatcatcaccatcaccaggtgcagctgcag3’(Genosys)和RD 3’(在以上給出的)，擴(kuò)增載體pPMlHis中的340scAb的DNA。用于擴(kuò)增的試劑和條件與用于α-Ps構(gòu)建體的完全一樣。用BamHI和EcoRI切割所獲得的1114bp產(chǎn)物，并將其克隆到載體pUC19(參見MolecularCloning，A Laboratory Manual出處同上)中。如上所述確證所述DNA序列，將該構(gòu)建體作為NdeI-EcoRI片段克隆到pET5c載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒pEt5c HIS 340 scAb。
通過以下重疊寡核苷酸的PCR裝配jun盒Jun1for 5’-atgagaattctcgagcgtatcgctcgtctggaagaaaaagttaaaaccctJun 85rev 5’-tagcggtggaagccagttcggagttctgagctttcagggttttaacttttJun 71for 5’-tggcttccaccgctaacatgctgcgtgaacaggttgctcagctgaaacagJun 146rev 5’-catgcgaattcgtggttcataactttctgtttcagctgagcaacc上述寡核苷酸以各1pmol包括在反應(yīng)混合物中，采用高保真性聚合酶和如先前所述的反應(yīng)組分，用10pmol引物Jun 1for-S5’-atgagaattctcgagcg和Jun 146rev-S5’-catgcgaattcgtggttc驅(qū)動(dòng)該反應(yīng)。所產(chǎn)生的146bp產(chǎn)物用EcoRI消化，將其純化并克隆到EcoRI切割的pUC19中，用于采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行序列分析(參見Molecular Cloning，ALaboratory Manual出處同上)。通過取代現(xiàn)有的攜帶人恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的320bp XhoI-EcoRI片段，將Jun盒作為XhoI-EcoRI片段亞克隆到pEt5c HIS 340 scAb質(zhì)粒中。
質(zhì)粒his-340-jun和FLAG-αPs-fos用作采用生物素化引物BioT75’-agatctcgatcccgcaaatta和引物petrev-5’-aaataggcgtatcacgaggcc的PCR的模板。引物由GenoSys(Cambridge，UK)供應(yīng)，并以1pmol的濃度用于該反應(yīng)中。組分和PCR條件與前述相同。his-340-jun反應(yīng)產(chǎn)物是992bp，而FLAG-αPs-fos反應(yīng)產(chǎn)物是1002bp。用旋轉(zhuǎn)純化柱(Qiagen，Crawley，UK)純化產(chǎn)物，并將其稀釋至100ng/μl的濃度。通過260nm下的UV吸光度定量。使500ng生物素標(biāo)記的DNA與10μl鏈霉抗生物素蛋白包被的磁性粒子(Bangs labs，F(xiàn)ishers，USA)反應(yīng)。反應(yīng)在硅化微量離心管中的500μl PBS 1％(w/v)BSA體積中于室溫進(jìn)行10分鐘。在結(jié)合后，用磁鐵(Dynal，Bromborough，UK)收獲粒子，將其用PBS1％BSA洗滌3次。
在最后一次洗滌后，通過加入補(bǔ)充有生物素酰基賴氨酸t(yī)RNA(Promega)的25μl T7 Quick偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄翻譯混合物(Promega，Southampton，UK)，起始體外翻譯反應(yīng)。翻譯反應(yīng)于30℃進(jìn)行60分鐘，然后置于冰上。用磁鐵收獲粒子，并且采用含有1％BSA的冰冷PBS洗滌。
在某些實(shí)驗(yàn)中，將非磁性鏈霉抗生物素蛋白粒子用于IVTT反應(yīng)(Bangs Labs，F(xiàn)ishers，USA)中。在這種情況下，在洗滌循環(huán)期間通過離心回收粒子。
在某些實(shí)驗(yàn)中，在IVTT反應(yīng)中使用著色的磁性和非磁性鏈霉抗生物素蛋白粒子(Bangs Labs)。
在某些實(shí)驗(yàn)中，用抗體檢測結(jié)合于粒子上的反應(yīng)產(chǎn)物的工程化到每種模型基因構(gòu)建體中的或者Flag或者h(yuǎn)is6表位。將抗體加入在PBS中稀釋的洗滌過的粒子中。在溫和混合下于4℃溫育60分鐘。將第二種試劑(抗小鼠-HRP綴合物)以PBS中的推薦稀釋液加入，并且于4℃再溫育30分鐘。在用生色底物顯色之前，用200μl PBS將粒子洗滌3次。反應(yīng)物于492nm下讀數(shù)。
用結(jié)合于粒子表面的IVTT蛋白進(jìn)行蛋白-蛋白結(jié)合反應(yīng)。在這類實(shí)驗(yàn)中，通過蛋白介導(dǎo)的(fosjun)與磁性粒子表面的結(jié)合，“捕獲”非磁性鏈霉抗生物素蛋白粒子。將帶有fos IVTT產(chǎn)物的磁性粒子與表面結(jié)合有jun的磁性粒子溫和地混合。反應(yīng)在100μl PBS，BSA中進(jìn)行，讓其于室溫進(jìn)行30分鐘。在一個(gè)陰性對照反應(yīng)中，將表面結(jié)合有Sca蛋白(α-Ps scAb；Molloy P等，出處同上)與包被有fos IVTT產(chǎn)物的磁性粒子混合。溫育后，用磁鐵捕獲所述粒子，將其用PBS，1％BSA洗滌6次。
采用PCR和DNA測序確證所捕獲的靶蛋白基因的存在。為了檢測jun模型基因，在PCR測定中使用jun特異性引物Jun 1for-S和Jun146rev-。通過將10％(v/v)粒子加入PCR混合物中啟動(dòng)該測定。組分和反應(yīng)條件如前所述。通過凝膠電泳檢測146bp jun特異性產(chǎn)物。為了測定fos模型基因，在PCR測定中使用引物FoslfS和Fos 155rS。反應(yīng)條件和155bp fos特異性產(chǎn)物的檢測如上所述。為了測定陰性對照蛋白，用引物Seqlscab 5’agatccctactataggta和Seq2scab5’-ggtgagctcgatgtatcc來檢測α-Ps scAb蛋白基因中的115bp產(chǎn)物。
在上述實(shí)驗(yàn)中，在與fos磁性粒子相互作用后不能檢測到α-PsscAb PCR產(chǎn)物的條件下，在用fos磁性粒子捕獲后檢測Jun PCR產(chǎn)物。
在一個(gè)單獨(dú)的PCR中，用先前詳細(xì)描述的引物(Marks，J.D，Antibody Engineering，Borrebaek C.A.K.編著，New York O.U.P.，1995)，由所克隆的模板pSW1-ScFvD1.3(McCafferty等，1990，Nature 348522-554)擴(kuò)增形式(Gly4Ser)3的接頭片段(Huston J.S.等，1988，PNAS，855879-5883)。將93bp接頭片段產(chǎn)物與Vh和Vl PCR產(chǎn)物的等摩爾混合物一起退火。采用Vaughan等詳述的側(cè)翼引物HuVHBACKsfi和HuFORNot(Vaughan T.J.等1996，Nature Biotech.14309-314)，在“穿入(pull through)”反應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增該混合物。將用于穿入反應(yīng)中的所有片段在包括在該反應(yīng)之前進(jìn)行純化，使其不含其起始引物。用Promega的Wizard PCR Preps系統(tǒng)(Promega，Southampton UK)進(jìn)行純化。
如上所述，采用標(biāo)準(zhǔn)條件用限制性酶SfiI和NotI(Boehringer)消化形式Vh-接頭-Vl的裝配重疊群，并且將其純化。將所純化的片段與一種雙鏈合成寡核苷酸連接物混合物一起退火，所述混合物設(shè)計(jì)用以引入一個(gè)V8蛋白酶切割位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)與Vl基因C末端符合讀框的一段隨機(jī)序列重疊。通過一對合成寡核苷酸庫-形式5’-ggccgcgaggaagaggaa[(atg)/(can)/(agn)/(aan)/(gan)/(ttn)]2gc-3’和5’-ggccgc[(naa)/(ntc)/(ngt)/(nct)/(nag)/(cat)]2ctccttctcctcgc-3’的退火，產(chǎn)生這種V8/獨(dú)特序列條形碼。該接頭具有NotI匹配末端(下劃線)，因此便于將完整的單鏈抗體-V8/獨(dú)特序列條形碼片段插入SfiI-NotI制備的pCANTAB 5(Pharmacia)噬菌粒載體中。
所述獨(dú)特序列條形碼設(shè)計(jì)用來避免引入終止密碼子，以及進(jìn)一步偏向排除具有兩種以上可變密碼子的編碼殘基。采用該策略，將鑒定給定解碼的肽序列所需要的具體寡核苷酸數(shù)目最小化。總之，所述獨(dú)特序列條形碼能夠編碼20種氨基酸中的11種。除V8肽酶切割位點(diǎn)(一串4個(gè)谷氨酸殘基)外，所述序列條形碼長12個(gè)密碼子。因此從11種氨基酸(其中10種由兩種密碼子中任一種編碼)的所有組成成分，能夠編碼1112/2＝約1.5×1012種不同的肽。
將具有SfiI和NotI制備的末端的裝配scfv片段(Vh-接頭-Vl)退火并連接至所述NotI序列-條形碼連接物，并進(jìn)行再純化。對于通過噬菌體展示表達(dá)人scfv文庫的實(shí)驗(yàn)，將整個(gè)片段連接到SfiI-NotI制備的pCANTAB 5(Pharmacia)噬菌粒載體中，并且轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TG1大腸桿菌中。
對于采用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯(IVTT)的其它實(shí)驗(yàn)，將裝配的scfv文庫亞克隆到SfiI NotI制備的pCANTAB5-T7中。該載體與市售的pCANTAB5相同，只是其經(jīng)過修飾，以包括于位置2235的HindIII位點(diǎn)插入的T7啟動(dòng)子序列(ttaatacgactcactata)。通過將序列為5’-agctaatacgactcactata的雙鏈合成DNA接頭連接到HindIII切割并且去磷酸化的pCANTAB5中，完成該修飾。用診斷性PCR選擇含有T7啟動(dòng)子的重組克隆。
在連接和轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TG1大腸桿菌中后，讓細(xì)胞在1ml SOC培養(yǎng)基中生長1小時(shí)，然后平板接種到含有100ug/ml氨芐青霉素的TYE培養(yǎng)基上。將菌落刮下，接種到含有氨芐青霉素的5ml 2x TY肉湯中。用所述培養(yǎng)的文庫制備用于IVTT反應(yīng)的DNA。
在體外翻譯反應(yīng)中使用pCANTAB5-T7 Scfv文庫DNA。采用50μl總體積中的T7 Quick偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄翻譯混合物(Promega，Southampton，UK)和10μgpCANTAB5-T7 Scfv文庫DNA進(jìn)行IVTT。翻譯反應(yīng)于30℃進(jìn)行90分鐘，然后置于冰上。在某些實(shí)驗(yàn)中，用35S-甲硫氨酸摻入測定，根據(jù)翻譯產(chǎn)物的存在監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)物在用于結(jié)合測定和篩選測定之前貯存于-70℃。
該單鏈抗體文庫用于與重組人p53蛋白(Oncogene ResearchProduts-Calbiochem，Nottingham，UK)的結(jié)合反應(yīng)中。將IVTT混合物在PBS中稀釋10倍，并用于與96孔微量培養(yǎng)板中固定化的人重組p53蛋白的結(jié)合測定中。將p53蛋白以在磷酸緩沖液中的100μg/ml的濃度于4℃保溫過夜而將其固定化。用PBS 0.5％(w/v)BSA洗滌板，并將稀釋的IVTT混合物加入測試孔和對照孔中進(jìn)行結(jié)合。結(jié)合反應(yīng)于37℃進(jìn)行90分鐘。用PBS-T(PBS+0.05％v/v吐溫20)將板洗滌3次，然后進(jìn)行V8蛋白酶消化(Takara，Wokingham，UK)。從上清液中收集蛋白片段，并且進(jìn)行大小分級分離，以排除V8蛋白酶和其它大片段，然后通過MALDI-tof進(jìn)行分析。
MALDI-tof片段分析鑒定出許多肽片段。用所述肽序列設(shè)計(jì)一組相應(yīng)的合成寡核苷酸。將所述寡核苷酸用于基于PCR的單鏈文庫篩選中。用Pfu turbo(Stratagene Europe)DNA聚合酶合成所述人單鏈抗體文庫DNA中成員的互補(bǔ)鏈。在15輪熱循環(huán)后，對產(chǎn)物進(jìn)行DpnI消化。該步驟中排除混合物中的親代質(zhì)粒分子，以確保僅增殖新合成的引發(fā)產(chǎn)物。將1μl該反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到TG1感受態(tài)細(xì)胞中，然后平板接種到含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，挑出單個(gè)克隆，放大培養(yǎng)并且制備DNA。所述DNA直接用于包括IVTT、抗原結(jié)合、V8蛋白酶消化、MALDI-tof片段分析的第二輪篩選中。2輪篩選后，分離出6種結(jié)合重組p53的scFv。
為了裝配所述輕鏈片段，用Hybaid Touchdown熱循環(huán)儀，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從含有抗銅綠假單胞菌的單鏈抗體片段(scAb)的克隆pPM1-HIS(Molloy，P.等，Journal of Applied Bacteriology，78359-365，1995)中，擴(kuò)增pel B前導(dǎo)序列。這一初始反應(yīng)用寡核苷酸OL001和OL002進(jìn)行，寡核苷酸OL001編碼一個(gè)BglII限制位點(diǎn)、pelB前導(dǎo)序列的N末端殘基和SD序列，而寡核苷酸OL002編碼pel B前導(dǎo)序列的C末端和來自pDIVKV3(文獻(xiàn)(ref))的κ輕鏈的N末端殘基。用WizardPCR純化試劑盒(Promega UK Ltd，Southampton，UK)，從NuSieve GTG瓊脂糖(Flowgen，Lichfield，UK)中純化該反應(yīng)的產(chǎn)物，將其變性，并且與編碼所述κ輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)的接點(diǎn)的OL004結(jié)合使用，以用標(biāo)準(zhǔn)方案，通過PCR從克隆pDIVKV3擴(kuò)增所述κ輕鏈的可變區(qū)。用編碼所述可變區(qū)C末端殘基和所述恒定區(qū)N末端殘基的OL003和編碼所述κ輕鏈恒定區(qū)的C末端殘基以及限制性酶切位點(diǎn)EcoR1的OL005，通過PCR從克隆pPMl-HIS(Molloy等人)擴(kuò)增所述κ輕鏈的恒定區(qū)。隨后用OL001和OL005通過重疊PCR擴(kuò)增這兩種片段，用Bg/II和EcoRI消化，并將其克隆到pLITMUS28中，以產(chǎn)生pC5A8-01。
通過用編碼一個(gè)EcoRI位點(diǎn)和SD序列和OL006和編碼pel B前導(dǎo)序列的C末端殘基和來自pDIVKV4的重鏈N末端殘基的OL007，從所述裝配的輕鏈擴(kuò)增pel B前導(dǎo)序列，裝配所述重鏈。使用該反應(yīng)的產(chǎn)物以及編碼所述重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)接點(diǎn)的OL009，從克隆pDIVHV4擴(kuò)增IgG1重鏈的可變區(qū)。用編碼所重鏈可變區(qū)的C末端殘基和所述恒定鏈N末端(OL008)以及外顯子1的C末端殘基和SstI限制位點(diǎn)(OL010)的OL008和OL010，通過PCR從克隆pSVgptHuIgGl擴(kuò)增所述重鏈恒定區(qū)的外顯子1。用OL006和OL010，通過重疊PCR擴(kuò)增這些反應(yīng)的產(chǎn)物，用EcoRI和SstI消化，并克隆到含有所述輕鏈片段的pLITMUS28中，以產(chǎn)生pC5A8-02。
用包括限制位點(diǎn)Eco1CRI和Bst98I的OL011和OL012，加入CH1的C末端殘基和C末端FLAG標(biāo)記序列(DYKDDDDK)(Knappik A.和Pluckthun A.Biotechniques，17；754-761，1990)，產(chǎn)生pC5A8-03?；蛘撸@些標(biāo)記可以包括6HIS標(biāo)記或MS標(biāo)記(參見實(shí)施例)。
以下列出用于產(chǎn)生pC5A8-0、pC5A8-02和pC5A8-03的寡核苷酸OL001；5’ GGGCAGATCTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTATTGCCTACGG 3’OL002；5’ GGGTCTGGGTCATAACGATATCGGCCATCGCTGGTTGGGCAGC 3’OL003；5’ GGTACCAAACTGGAGATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCT 3’OL004；5’ AGATGGTGCAGCCACAGTCCGTTTGATCTCCAGTTTGGTACC 3’OL005；5’ GATCGAATTCCTAACACTCTCCGCGGTTGAAGCTCTTTG 3’OL006；5’ GATCGAATTCTAACTITAAGAAGGAGATATACATATG 3’OL007；5’ GGACTGAACCAGTTGGACTTCCGCCATCGCTGGTTGGGCAGC 3’OL008；5’ ACCCTGGTTACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC 3’OL009；5’ GATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTAACCAGGGTAC 3’OL010；5’ GATCGAGCTCTGCTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGC 3’OL011；5’ CCCAAATCTTTGCGCTGCAGACTACAAAGACGACGACGACAAATAGCTCGAGC 3’OL012；5’ TTAAGCTCGAGCTATTTGTCGTCGTCGTTTGTAGTCTGCAGGGCAAGATTTGGG 3’通過ELISA證明產(chǎn)生功能性Fab?？傊瑢⑸鲜鲚d體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌菌株DH5α中并在100μg/ml氨芐青霉素和1％葡萄糖存在下于37℃生長直至達(dá)到0.5的OD600。通過在缺乏葡萄糖的情況下加入1mM異丙硫基-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)生。用30mM Tris HCl、20％蔗糖pH 8.0、1mM EDTA，然后用5mM MgSO4，通過滲透休克釋放周質(zhì)部分(Molloy，P.等，Journal of Applied Bacteriology，78359-365，1995)，并將其直接加入已經(jīng)在潮濕室中預(yù)先用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)pH 7.4中的1μg/ml濃度的可溶性人CD4(Intracel Corp.，Issaquah，WA)于室溫包被過夜的Immulon 4 ELISA板(Dynex，)中?；蛘?，可以通過細(xì)胞裂解或者通過加入1mM EDTA釋放周質(zhì)部分。通過在加入可溶性Fab之前，將板與含有0.05％吐溫20、2％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％硫柳汞(Sigma)的PBS于室溫溫育1小時(shí)，降低非特異性結(jié)合。用山羊抗人IgG Fab特異性辣根過氧化物酶綴合物(Sigma，UK)檢測抗CD4特異性Fab，所述辣根過氧化物酶綴合物本身用磷酸/檸檬酸緩沖液pH5.0中的5，5’四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸鹽(TMB)(Sigma，UK)和過氧化氫檢測。30分鐘后用0.2N硫酸終止顯色反應(yīng)，于450nm監(jiān)測吸光度?；蛘哂肁BTS/檸檬酸鹽(Sigma，UK)進(jìn)行檢測。
為了產(chǎn)生CDR3序列的文庫，通過寡核苷酸定向誘變(Kunkel TA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA488-492(1985)和Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel FM，Brent R.，Kingston RE.Moore DD.，Seidman JG.，Smith JA.，Struhl K.編著，John Wiley & Sons，Inc.)，用以下所列的寡核苷酸，將獨(dú)特限制位點(diǎn)引入載體pC5A8-03中。通過用合適的限制性酶消化，證實(shí)分別在所述κ輕鏈和重鏈中存在AatII和HindIII(位于LCDR3的5’和3’)以及BssHII和SanDI(位于HCDR3的5’和3’)限制位點(diǎn)。各含有一個(gè)額外限制位點(diǎn)的這些質(zhì)粒被命名為pC5A8-04至pC5A8-07。OL013；5’ GAAGACGTCGCTGTTTAC 3’OL014；5’ GGTACCAAGCTTGAGATC 3’OL015；5’ CTACTGCGCGCGTGAAAAAG 3’OL016；5’ GGGTCAGGGGACCCTGG 3’在用AtaII和HindIII消化pC5A8-07后，采用攜帶錨定殘基(aa83-88和aa 97-103)和于其3’端包含HindIII內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的10個(gè)核苷酸的回文序列的簡并寡核苷酸混合物，將所述κ輕鏈可變區(qū)CDR3中的高度可變殘基隨機(jī)化。這些寡核苷酸于其3’端雜交，然后用作DNA聚合酶的底物，導(dǎo)致產(chǎn)生雙鏈同雙鏈體，將該雙鏈體用所述兩種限制性酶消化，并采用標(biāo)準(zhǔn)方案將其克隆到所述消化的載體中(參見Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel FM，Brent R.，KingstonRE.Moore DD.，Seidman JG.，Smith JA.，Struhl K.編著，John Wiley &Sons，Inc.)。制備所述寡核苷酸，使得通過在所述寡核苷酸合成(Geneosys，Cambridge，UK)的每個(gè)步驟包括等濃度的每種寡核苷酸，將殘基91、92、93、94、95、95A、95B和96隨機(jī)化。
所述誘變寡核苷酸的序列基于10個(gè)殘基的CDR3長度。殘基89和90相對保守，因此在該實(shí)施例中將其固定。待隨機(jī)化的殘基以斜體顯示。也通過改變所述隨機(jī)化區(qū)的長度，構(gòu)建具有6、7、8或9個(gè)殘基的CDR3的其它文庫。正鏈；5’GAAGACGTCGCTGTTTACTACTGCCAGCAGNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSACCTTCGGTGGTGGTACCAAGCTTGG 3’負(fù)鏈；5’CCAAGCTTGGTACCACCACCGAAGGTSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNCTGCTGGCAGTAGTAAACAGCGACGTCTTC 3’用限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)BssHII和SanDI和以下所列的誘變寡核苷酸，以前一節(jié)中所述的相似方式將所述重鏈的CDR3隨機(jī)化。在這種情況下，將殘基95-100D隨機(jī)化。待隨機(jī)化的殘基以斜體顯示。通過改變所述隨機(jī)化區(qū)的長度，也可以構(gòu)建具有9、11或12個(gè)殘基的CDR3的其它文庫。正鏈；5’CTACTGCGCGCGTNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSTTCGCTTACTTGGGGTCAGGGGACCCCT負(fù)鏈；5’AGGGGTCCCCTGACCCCAGTAAGCGAASNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNACGCGCGCAGTAG 3’通過實(shí)施上述的重鏈誘變法和輕鏈誘變法，產(chǎn)生重鏈和輕鏈均含有隨機(jī)化CDR3的文庫。
為了提高對高親和結(jié)合劑篩選的效率，用限制性內(nèi)切核酸酶PstI和XhoI，用一個(gè)質(zhì)量標(biāo)記取代上述FLAG標(biāo)記。為了增加文庫大小，可以使用另外兩種標(biāo)記。在這種情況下，所述標(biāo)記必須在長度上相差至少兩個(gè)殘基，以便在用蛋白酶例如因子Xa取出標(biāo)記1和標(biāo)記2后進(jìn)行區(qū)別。設(shè)計(jì)于3’端具有一個(gè)回文序列的寡核苷酸，所述回文序列包括XhoI的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。所述寡核苷酸于其3’端雜交，然后用作DNA聚合酶的底物，導(dǎo)致產(chǎn)生雙鏈的同雙鏈體，將該雙鏈體用兩種限制性酶Pstl和XhoI消化，并采用標(biāo)準(zhǔn)方案將其克隆到所述消化的載體中(參見Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel FM，Brent R.，Kingston RE.Moore DD.，Seidman JG.，Smith JA.，Struhl K.編著，John Wiley & Sons，Inc.)。
作為一個(gè)實(shí)例，用寡核苷酸5’NAC NCC NGG NTG TKC VAGGNV CNT 3’產(chǎn)生8個(gè)殘基的標(biāo)記。如果由于加入蛋白酶因子Xa的位點(diǎn)(以斜體顯示)導(dǎo)致也包括一個(gè)8個(gè)殘基的第二標(biāo)記，則將該標(biāo)記的長度增至11個(gè)殘基。這使得所述標(biāo)記在將其取出并進(jìn)行質(zhì)譜分析后，可以被鑒定為標(biāo)記1或標(biāo)記2。單一標(biāo)記正向寡核苷酸；5’ GCG CTG CAG GAY GGN CGN NAC NCC NGG NTG TKC VAG GNV CNTTAG CTC GAG CTA 3’反向寡核苷酸；5’ TAG CTC GAG CTA ANG BNC CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCGCCC GTC CTG CAG CGC 3’正向寡核苷酸； 5’ GCG CTG CAG GAY GGN CGN NAC NCC NGG NTG TKC VAG GNV CNTGAY GGN CGN NAC NCC NGG NTG TKC VAG GNV CNT TAG CTC GAG CTA 3’反向寡核甘酸； 5’ TAG CTC GAG CTA ANG BNC CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCG CCCGTC ANG BNC CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCG CCC GTC CTG CAG CGC 3’
將產(chǎn)生可溶性Fab文庫的100ml細(xì)菌培養(yǎng)物于4℃以4000 rpm離心20分鐘，將產(chǎn)生的沉淀重懸于含有1mM EDTA的磷酸緩沖鹽溶液中。在冰上攪拌5-20分鐘后，EDTA使外膜預(yù)透化，使得滲漏出周質(zhì)內(nèi)容物。然后通過離心將上清液澄清，將該上清液用于隨后的步驟。也可以利用釋放周質(zhì)內(nèi)容物的其它可選方案(Molloy，P.等，Journal ofApplied Bacteriology，78359-365，1995和Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF.和Maniatis T.編著，ColdSpring Harbor Laboratory Press 1989，New York，USA)。
將含有所述Fab文庫的周質(zhì)提取物等份加入到已經(jīng)在潮濕室中用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)pH 74中的1μg/ml濃度的可溶性人CD4(Intracel Corp.，Issaquah，WA)于室溫包被過夜的Nunc-immunotube中。通過在加入可溶性Fab之前，將所述管與含有0.05％吐溫20、2％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％硫柳汞(Sigma)的PBS于室溫溫育1小時(shí)，降低非特異性結(jié)合。在讓所述Fab與所述CD4抗原于室溫結(jié)合1小時(shí)后，通過用PBS，0.05％吐溫20將管洗滌20次去除未結(jié)合的Fab。
為了鑒定保持結(jié)合的那些Fab的氨基酸序列，采用標(biāo)準(zhǔn)方案用因子Xa取出質(zhì)量標(biāo)記。然后通過MALDI-TOF(MS/MS)光譜測定法分析所述質(zhì)量標(biāo)記，其中測定每種標(biāo)記的的分子量，然后通過分析第二次電離事件獲得序列信息。通過綜合該信息，可以確定所述標(biāo)記的氨基酸序列。
在某些情況下，可能必需通過洗脫結(jié)合的Fab、中和并通過用按照生產(chǎn)商的說明制備的sepharose-抗Ck柱(Pierce Warriner，Cheshire，UK)進(jìn)行親和純化、從其它大腸桿菌蛋白中純化所述Fab，來提高蛋白酶切割效率。然后可以用因子Xa從結(jié)合的Fab取出這些質(zhì)量標(biāo)記。
在鑒定質(zhì)量標(biāo)記后，產(chǎn)生另外兩種寡核苷酸。所述3’寡核苷酸編碼所述質(zhì)量標(biāo)記的序列，而5’寡核苷酸是于所述Fab的N末端編碼所述序列的OL001。
正鏈； 5’GG GCA GAT CTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CATATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG G3’負(fù)鏈；5’TAG CTC GAG CTA ANG BNC CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCG CCCGTC ANG BNC CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCG GTC CTG CAG CGC3’通過將10μl所述大腸桿菌文庫加入含有上述寡核苷酸的PCR反應(yīng)中，拯救含有高親和性結(jié)合劑的克隆。該反應(yīng)所需的條件可以根據(jù)所使用的寡核苷酸而變化。在擴(kuò)增后，對PCR產(chǎn)物測序，隨后從低熔點(diǎn)瓊脂糖中純化，用AatII和SanDI消化，AatII位點(diǎn)存在于所述κ輕鏈CDR3的N末端，而SanDI位點(diǎn)存在于載體pC5A8-07中的重鏈CDR3的C末端；用標(biāo)準(zhǔn)方案(參見Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF.和Maniatis T.編著，Cold Spring HarborLaboratory Press 1989，New York，USA)，將所述產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)用相同的限制性內(nèi)切核酸酶消化的載體pC5A8-07中。采用標(biāo)準(zhǔn)方案，通過電穿孔將所產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌DH5α中，并貯存于-70℃?；蛘?，可以用多種替代的限制性內(nèi)切核酸酶消化所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并將其轉(zhuǎn)移到用于Fab表達(dá)的替代載體中。
在某些情況下，在最初一輪淘選后可以存在多種質(zhì)量標(biāo)記。在這種情況下，用3’寡核苷酸混合物從所述貯存的文庫中擴(kuò)增一個(gè)克隆文庫。然后可以對該有限文庫進(jìn)行另外的多輪淘選，可以MALDI-TOF對結(jié)合的克隆進(jìn)行再分析，并且用內(nèi)部標(biāo)記的序列產(chǎn)生一種有限的PCR引物的所有組分成分。
為了證實(shí)選定的抗CD4特異性Fab的親和性，應(yīng)該如上所述制備周質(zhì)提取物，并且立即用于CD4特異性ELISA中。表觀親和性是真實(shí)親和性和所述Fab濃度的綜合，因此應(yīng)該通過在同一提取物上進(jìn)行另外的捕獲ELISA來確定所述Fab的濃度，其中針對FLAG標(biāo)記或人Ck結(jié)構(gòu)域作標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線(McGregor DP.，Molloy PE.，Cunningham C.和Harris WJ.Molecular Immunology 31，219-116，1994)。
結(jié)果顯示出一個(gè)對應(yīng)于65個(gè)氨基酸的N末端Arg-C內(nèi)切蛋白酶片段的主峰，沒有顯著水平的其它p53 Arg-C峰。
用Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)(Pharmacia)產(chǎn)生小鼠單鏈Fv(ScFv)文庫。用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體引物，由所述mRNA產(chǎn)生第一鏈cDNA。然后用互補(bǔ)于所述抗體可變區(qū)側(cè)翼的保守序列的特異性重鏈引物和輕鏈引物，擴(kuò)增抗體的重鏈和輕鏈基因。在瓊脂糖凝膠電泳后，分別純化所產(chǎn)生的分別為340個(gè)堿基對和325個(gè)堿基對的重鏈DNA和輕鏈DNA的產(chǎn)物。然后用DNA接頭-引物混合物產(chǎn)生通過(Gly4Ser)3肽與VL區(qū)連接的VH區(qū)，將這些產(chǎn)物裝配成單一ScFc構(gòu)建體。用設(shè)計(jì)分別于5’端和3’端插入Sfi1和Not1位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增所裝配的ScFv，產(chǎn)生一種800bp產(chǎn)物。將該片段純化，用SfiI和NotI順序消化，然后再純化。然后將片段連接到SfiI和NotI切割的pCANTAB 5噬菌粒載體中。pCANTAB 5含有編碼噬菌體基因3蛋白(g3p)的基因，將該ScFv鄰近g3信號序列插入，使得它將作為g3p融合蛋白表達(dá)。用pCantab 5/ScFv噬菌粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1細(xì)胞，隨后用M13KO7輔助噬菌體感染。所產(chǎn)生的重組噬菌體含有編碼所述ScFv基因的DNA，并且在其尖端上展示一個(gè)或更多個(gè)拷貝的作為融合蛋白的重組抗體。
通過淘選選擇或富集與所述肽結(jié)合的噬菌體展示的ScFv。簡而言之，將來自實(shí)施例1的生物素酰化和經(jīng)蛋白酶處理的p53制備物應(yīng)用于鏈霉抗生物素蛋白包被的玻片(Radius Biosciences，Waltham，USA)上，將玻片在PBS中洗滌4次。用2％脫脂乳粉的PBS溶液封閉后，應(yīng)用所述噬菌體制備物并溫育1小時(shí)。用TBS/0.05％吐溫20洗滌10次后，用辣根過氧化物酶綴合的抗M13抗體檢測肽反應(yīng)性重組噬菌體，并用鄰苯二胺顯色底物顯示。隨后用0.1M甘氨酸.Hcl pH 2.2和1mg/ml BSA稀釋這些噬菌體，并且用2M Tris堿中和。在于25ml J肉湯中生長的JM103中擴(kuò)增經(jīng)稀釋的噬菌體。進(jìn)行另外2輪淘選，最后分離出10個(gè)單個(gè)噬菌斑，將其合并并進(jìn)一步純化。將1等份1010個(gè)擴(kuò)增的噬菌體于4c與TSO緩沖液中的0.1ug生物素酰化和內(nèi)切蛋白酶Arg-C消化的p53一起溫育2小時(shí)。2小時(shí)后，加入TSO中的0.5ug抗M13(Pharmacia)并且溫育1小時(shí)，此后加入5ul A蛋白/G瓊脂糖(Sigma)，在旋轉(zhuǎn)下將混合物再溫育0.5小時(shí)。然后將瓊脂糖珠粒沉淀，如以上實(shí)施例1中所述進(jìn)行洗滌，并且通過質(zhì)譜法分析。
結(jié)果顯示出與實(shí)施例1中相同的對應(yīng)于65個(gè)氨基酸的N末端Arg-C內(nèi)切蛋白酶片段的主峰。
權(quán)利要求
1.一種蛋白鑒定、篩選和/或測序方法，包括提供一種個(gè)別蛋白文庫，所述個(gè)別蛋白中的一種或更多種可以與目標(biāo)靶結(jié)合，其中每種個(gè)別蛋白在其序列中包括一個(gè)“條形碼”序列，所述序列可以用來在所述文庫中鑒定每種個(gè)別蛋白。
2.權(quán)利要求1中要求保護(hù)的方法，其中所述個(gè)別“條形碼”序列由插入所述文庫中所述個(gè)別蛋白的編碼基因中的一個(gè)或更多個(gè)核酸序列編碼。
3.權(quán)利要求2中要求保護(hù)的方法，其中一個(gè)或更多個(gè)所述“條形碼”序列鄰接一個(gè)或多個(gè)內(nèi)切蛋白酶消化的識別位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求3中要求保護(hù)的方法，其中所述識別位點(diǎn)是內(nèi)切蛋白酶例如腸激酶或因子Xa的位點(diǎn)。
5.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4中要求保護(hù)的方法，其中使所述蛋白文庫與一種或更多種靶部分例如靶蛋白接觸/相連。
6.權(quán)利要求5中要求保護(hù)的方法，其中所述蛋白和一種或更多種靶部分在溶液中結(jié)合。
7.權(quán)利要求5或權(quán)利要求6中要求保護(hù)的方法，其中在結(jié)合后分離所述蛋白/靶部分復(fù)合體，然后用內(nèi)切蛋白酶消化，以釋放一種或種個(gè)所述“條形碼”序列。
8.權(quán)利要求7中要求保護(hù)的方法，其中一種或多種所述釋放的“條形碼”序列用來設(shè)計(jì)一種或更多種合成寡核苷酸例如引物，以回收或擴(kuò)增一種或更多種與所述靶部分結(jié)合的蛋白的編碼基因。
9.權(quán)利要求8中要求保護(hù)的方法，其中用質(zhì)譜法測定任何釋放的“條形碼”序列的質(zhì)量，所述質(zhì)量進(jìn)而可以鑒定所釋放的一種或更多種序列，或其中用質(zhì)譜法直接測定任何釋放的“條形碼”的序列。
10.權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中所述蛋白文庫是抗體文庫。
11.權(quán)利要求10中要求保護(hù)的方法，其中所述蛋白文庫是抗體結(jié)構(gòu)域文庫，例如包括抗體可變區(qū)的重組抗體結(jié)構(gòu)域例如Fv的文庫。
12.權(quán)利要求11中要求保護(hù)的方法，其中所述文庫包括由兩條鏈(重鏈和輕鏈衍生鏈，VH和VL)組成的Fv。
13.權(quán)利要求12中要求保護(hù)的方法，其中所述VH和VL鏈各自具有其自身的“條形碼”序列。
14.權(quán)利要求10-13的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中所述“條形碼”序列位于所述Fv序列的C末端。
15.在權(quán)利要求1-14的任一項(xiàng)中限定的蛋白文庫。
16.一種篩選蛋白文庫的方法，包括根據(jù)一種或更多種所需特性篩選所述文庫，然后將其去復(fù)制，以鑒定所述文庫中具有所述所需特性的一種或更多種個(gè)別蛋白。
17.權(quán)利要求16中要求保護(hù)的方法，其中根據(jù)與靶部分的結(jié)合篩選所述文庫。
18.權(quán)利要求17中要求保護(hù)的方法，其中通過質(zhì)譜法、特別是基質(zhì)輔助激光解附/電離飛行時(shí)間(MALDI-ToF)質(zhì)譜檢測結(jié)合。
19.權(quán)利要求16中要求保護(hù)的方法，其中根據(jù)特定生物活性篩選所述文庫。
20.權(quán)利要求17或權(quán)利要求18中要求保護(hù)的方法，其中所述靶是復(fù)雜的混合物，例如多種分子的混合物、全細(xì)胞或細(xì)胞膜。
21.一種蛋白鑒定和/或測序方法，包括提供一種個(gè)別蛋白的文庫，所述個(gè)別蛋白中的一種或更多種可以與目標(biāo)靶結(jié)合，其中每種個(gè)別蛋白與其基因一起結(jié)合于一個(gè)“結(jié)合部分”。
22.權(quán)利要求21中要求保護(hù)的方法，其中使所述蛋白文庫在與所述“結(jié)合部分”接觸之前或者之后，與所述目標(biāo)靶接觸。
23.權(quán)利要求21或22中要求保護(hù)的方法，其中在根據(jù)與所述靶結(jié)合進(jìn)行篩選后，將所述文庫去復(fù)制，以鑒定具有所需特性的一種或更多種蛋白，即與所述靶結(jié)合的蛋白。
24.權(quán)利要求21-23的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中所述“結(jié)合部分”是一種粒子。
25.權(quán)利要求24中要求保護(hù)的方法，其中所述粒子是膠乳珠粒。
26.權(quán)利要求21-23的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中所述“結(jié)合部分”是一種蛋白或蛋白復(fù)合體。
27.權(quán)利要求26中要求保護(hù)的方法，其中所述“結(jié)合部分”是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，并且所述文庫中的每種蛋白及其相關(guān)基因被生物素?；?br> 28.權(quán)利要求21或權(quán)利要求22中要求保護(hù)的方法，其中所述“結(jié)合部分”是能夠與所述蛋白和基因兩者均結(jié)合的雙特異性結(jié)合分子。
29.權(quán)利要求21-23的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中所述“結(jié)合部分”是活細(xì)胞或細(xì)胞的病毒，例如細(xì)菌或噬菌體。
30.權(quán)利要求21-29的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中將改變所述文庫中蛋白的特性的一種分子或其它分子結(jié)合于所述“結(jié)合部分”。
31.權(quán)利要求21-30的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中將所述文庫中的蛋白的編碼基因在合成所述個(gè)別蛋白之前連接于所述“結(jié)合部分”。
32.權(quán)利要求21-31的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中所述蛋白文庫是抗體蛋白文庫，例如抗體結(jié)構(gòu)域諸如Fv的文庫。
33.一種蛋白鑒定和/或篩選方法，包括提供一種個(gè)別蛋白的文庫，所述蛋白中的一種或更多種可以與目標(biāo)靶結(jié)合，其中將每種個(gè)別蛋白連接于一種個(gè)別“編碼部分”。
34.權(quán)利要求33中要求保護(hù)的方法，其中所述“編碼部分”是具有特有標(biāo)識符“編碼”的粒子。
35.權(quán)利要求34中要求保護(hù)的方法，其中所述“編碼”是可測量信號的不同比率，所述可測量信號例如為熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或放射性標(biāo)記，或者是一種物理特征，例如特有標(biāo)記。
36.一種分析蛋白混合物的方法，包括(iii)消化或切割所述蛋白混合物；(iv)將所產(chǎn)生的肽分級分離；以及(v)根據(jù)所產(chǎn)生的肽的質(zhì)量和/或序列對所產(chǎn)生的肽進(jìn)行分析。
37.權(quán)利要求36中要求保護(hù)的方法，其中所述步驟(ii)中的分級分離采用蛋白結(jié)合劑文庫進(jìn)行。
38.權(quán)利要求36中要求保護(hù)的方法，其中作為所述分級分離步驟的一部分，對所述產(chǎn)生的肽進(jìn)行物理分級分離和/或化學(xué)標(biāo)記。
39.權(quán)利要求36中要求保護(hù)的方法，其中作為所述分級分離步驟的一部分，對所述產(chǎn)生的肽進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的添加。
40.權(quán)利要求37-39的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中所述蛋白結(jié)合劑文庫是抗體或抗體片段的文庫。
41.權(quán)利要求37-39的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中所述蛋白結(jié)合劑是主要組織相容性蛋白、T細(xì)胞受體和參與蛋白-蛋白結(jié)合相互作用的天然蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域，例如SH1結(jié)構(gòu)域。
42.權(quán)利要求40或權(quán)利要求41中要求保護(hù)的方法，其中根據(jù)與得自受分析的蛋白混合物或相關(guān)蛋白混合物的一種或更多種蛋白或肽的結(jié)合，對所述蛋白結(jié)合劑文庫進(jìn)行預(yù)選擇。
43.權(quán)利要求42中要求保護(hù)的方法，其中所述蛋白混合物得自標(biāo)準(zhǔn)化重組基因文庫。
44.權(quán)利要求36-43的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中最初在消化或切割之前，或者通過所述N末端或C末端，或者通過特定氨基酸，或者通過氨基酸的特定序列，將所述蛋白混合物結(jié)合于固相。
45.權(quán)利要求36-43的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中將在所述蛋白中發(fā)現(xiàn)的特定氨基酸或經(jīng)修飾的氨基酸衍生化，然后結(jié)合于固相，這種結(jié)合發(fā)生在所述蛋白混合物的消化或切割之前或之后。
46.權(quán)利要求45中要求保護(hù)的方法，其中在與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合之前，用生物素將所述特定的或經(jīng)修飾的氨基酸衍生化。
47.權(quán)利要求45中要求保護(hù)的方法，其中在與配體特異性親和試劑結(jié)合之前，用配體將特定的或經(jīng)修飾的氨基酸衍生化。
48.權(quán)利要求36-43的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中用修飾特異性親和試劑將所述蛋白中發(fā)現(xiàn)的特定的天然修飾的氨基酸結(jié)合于固相，這種結(jié)合發(fā)生在所述蛋白混合物的消化或切割之前或之后。
49.權(quán)利要求45-48的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中進(jìn)行一個(gè)以上的消化/切割和衍生化的循環(huán)。
50.權(quán)利要求49中要求保護(hù)的方法，其中在每個(gè)消化或切割循環(huán)之后進(jìn)行質(zhì)量分析。
51.權(quán)利要求36-50的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中在用蛋白結(jié)合劑分級分離之前或之后，采用物理方法例如HPLC對在消化/切割后釋放的肽進(jìn)行分級分離。
全文摘要
提供用于蛋白鑒定和/或測序的新方法。這些方法特別適合于篩選抗體文庫,在優(yōu)選實(shí)施方案中,利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行直接或間接測序。
文檔編號G01N33/68GK1344370SQ00805178
公開日2002年4月10日 申請日期2000年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月23日
發(fā)明者F·J·卡爾 申請人:拜奧維森有限公司