專利名稱：：磺胺二甲嘧啶殘留快速顯色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種動(dòng)物血液檢測(cè)方法，特別是一種能快速通過(guò)顯色來(lái)檢測(cè)畜產(chǎn)品血漿中獸藥(磺胺二甲嘧啶)殘留的方法。
背景技術(shù)：
：隨著農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展，飼料添加劑的使用范圍及其用量不斷的增加，從而提高了畜牧業(yè)的產(chǎn)量。特別是抗生素類飼料添加劑在改善動(dòng)物生產(chǎn)性能方面和預(yù)防疾病的效果是其它任何詞料添加劑都無(wú)法比擬的。然而，大量、長(zhǎng)期在詞料中使用獸藥不可避免地造成獸藥在畜產(chǎn)品中的殘留。畜產(chǎn)品中獸藥殘留不僅危害人類健康，同時(shí)也影響畜產(chǎn)品品質(zhì)，造成經(jīng)濟(jì)損失。動(dòng)物性食品中抗生素殘留問(wèn)題是當(dāng)今最為關(guān)注的一個(gè)現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，已引起人們高度的重視?；前范奏奏儆谖覈?guó)現(xiàn)在允許使用的獸藥范圍內(nèi)，己建立了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，但在快速現(xiàn)場(chǎng)殘留檢測(cè)還存在著空缺，詳見(jiàn)下表。幾種常用檢測(cè)方法的比較表類型特點(diǎn)應(yīng)用情況微生物檢測(cè)法薄層色譜法氣相色譜法高效液相色譜法聯(lián)用技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附法不易篩選到特別敏感的菌株，常受到其它敏感菌株的影響操作簡(jiǎn)單，靈敏度不高，可定性或半-需對(duì)樣品衍生處理高效、靈敏度高，檢出率高，但設(shè)備昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員有較高的要求，但分析費(fèi)時(shí)能確證結(jié)構(gòu)，但專屬性強(qiáng)，成本也高前處理簡(jiǎn)便，可同時(shí)分析多個(gè)樣品，分析時(shí)間短，且敏感度高，還能減少環(huán)境的污染。目前免疫試劑合昂貴、對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員有較高的要求。檢測(cè)限往往高于藥物的MRLs，且缺乏特異性和敏感性應(yīng)用較少，因需進(jìn)行復(fù)雜的前處理較少用于獸藥殘留分析是目前應(yīng)用最普遍、最有效的分析方法，最低檢測(cè)限可以達(dá)到0.5-0.2ng之間應(yīng)用越來(lái)越廣泛，檢測(cè)限可達(dá)到ng級(jí)目前幾乎所有重要的獸藥已建立或試圖建立ELISA，檢測(cè)限可以達(dá)到ng級(jí)，適亍火量樣品的篩選這就在客觀上要求改進(jìn)傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，尋求一種快速、精確的檢測(cè)方法，使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種磺胺二甲嘧啶殘留快速顯色方法，利用磺胺二甲嘧徒的特殊結(jié)構(gòu)，與某些物質(zhì)發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺判斷其殘留量大小，具有檢測(cè)快速、精確、可靠的特點(diǎn)。一種磺胺二甲嘧啶殘留快速顯色方法，建立了磺胺二甲嘧啶的化學(xué)重氮-偶合反應(yīng)，血漿中不同殘留濃度的磺胺二甲嘧啶經(jīng)過(guò)反應(yīng)后，呈現(xiàn)不同的顏色，借助分光光度計(jì)，就能得出血漿中磺胺二甲嘧啶殘留的濃度，實(shí)現(xiàn)了磺胺二甲嘧啶殘留的活體檢測(cè)?；前范奏奏榘咨蛭ⅫS色粉末，無(wú)臭，基本無(wú)味，易溶于鹽酸，堿溶液，溶于熱乙醇，不溶于水和乙醚。其分子結(jié)構(gòu)為從磺胺二甲嘧啶結(jié)構(gòu)圖中，可以看出，氨基是一個(gè)活潑的基團(tuán)，在進(jìn)行顯色反應(yīng)時(shí)首先要考慮從氨基的特殊性入手，偶氮化合物一般都有顏色。該反應(yīng)能生成猩紅色的重氮-偶合產(chǎn)物，磺胺二甲嘧啶與鹽酸萘乙二胺在酸性條件下能生成有色的重氮-偶合產(chǎn)物具體如下:(猩紅色偶氮化合物)其中，亞硝酸鈉與血漿的配比應(yīng)在0.05mg/m1-0.3mg/ml范圍內(nèi)。形成的偶合產(chǎn)物于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行可見(jiàn)光波段的全掃描，在可見(jiàn)光區(qū)域，所形成的偶合物有特征吸收峰，其最大檢測(cè)波長(zhǎng)為545nm。反應(yīng)所需的酸性條件的pH值范圍為2.0-2.5。本發(fā)明的效果檢測(cè)(1)回收率的測(cè)定取5.Oml血漿于50ml離心管中，分別加入IOW、50W、10(^1濃度為100Pg/ml、的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使血漿中的磺胺二甲嘧啶濃度為1.0Pg/ml、5Pg/ml、10!ig/ml三個(gè)添加水平，每個(gè)水平設(shè)三個(gè)重復(fù)，按照1.3確定的前處理方法，其回收率和變異系數(shù)見(jiàn)下表。表試樣的加標(biāo)回收率及變異系數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由上表可知，在1.0Pg/g、5.0Pg/g、10.0Pg/g三個(gè)添加水平上，血漿中磺胺二甲嘧啶的回收率范圍分別為79.8%81.3%，81.6%83.1%，78.15%81.23%，平均回收率在79.0%以上，變異系數(shù)在2.0%以下。(2)最低檢測(cè)限的確立取5ml血漿，添加適量的SM2標(biāo)準(zhǔn)貯備液，使?jié)舛瘸蔀?.054g/ml、0.ll^g/m〗、0.5Pg/ml、Hg/ml、5.0iVml、10.OPg/ml系列血漿濃度，按照1.3確定方法進(jìn)行處理，測(cè)定結(jié)果顯示，血漿中的藥物濃度與所生成的顏色呈正比，3濃度大于1.(Hig/ml時(shí)，直接用肉眼就能識(shí)別，當(dāng)其濃度小于l.(￥g/ml時(shí)，可以選用721分光光度計(jì)，此時(shí)的檢測(cè)濃度可以達(dá)到0.l化/ml。四圖l是本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線——濃度吸光度值關(guān)系圖五具體實(shí)施例方式一種磺胺二甲嘧啶殘留快速顯色方法，建立磺胺二甲嘧啶的化學(xué)重氮-偶合反應(yīng)，血漿中不同殘留濃度的磺胺二甲嘧啶經(jīng)過(guò)反應(yīng)后，呈現(xiàn)不同的顏色，借助分光光度計(jì)，就能得出血槳中磺胺二甲嘧啶殘留的濃度，實(shí)現(xiàn)了磺胺二甲嘧啶殘留的活體檢測(cè)。該反應(yīng)能生成猩紅色的重氮-偶合產(chǎn)物，磺胺二甲嘧啶與鹽酸萘乙二胺在pH值為2的酸性條件下能生成有色的重氮-偶合產(chǎn)物(猩紅色偶氮化合物)其中，亞硝酸鈉與血漿的配比是O.lmg/ml。形成的偶合產(chǎn)物于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行可見(jiàn)光波段的全掃描，在可見(jiàn)光區(qū)域，所形成的偶合物有特征吸收峰，其最大檢測(cè)波長(zhǎng)為545nm。(1)儀器電子天平(AG245，PB303,PB5001)，瑞士梅特勒公司，感應(yīng)量0.Olmg;721分光光度計(jì)；離心機(jī)(RC25C，RC3C)，美國(guó)杜邦公司。(2)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液準(zhǔn)確稱取10mg磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容于10ml的容量瓶中，使之濃度為lmg/m]的標(biāo)準(zhǔn)，并貯藏于4。C以下的冰箱中。5()%三氯乙酸準(zhǔn)確稱取5()g三氯乙酸，溶解于50ml的水中，使之濃度成為50%的溶液。0.5%亞硝酸鈉準(zhǔn)確稱取0.5g亞硝酸鈉，用水定容于1000ml的容量瓶中，使之濃度為O.5%的溶液。2g/L鹽酸萘乙二胺準(zhǔn)確稱取2g鹽酸萘乙二胺，用水定容于1000ml的容量瓶中，使之濃度為2g/ml的溶液。(3)血漿樣品的處理方法5ml血漿中加入lml三氯乙酸，400()r/min離心lOm.iri，過(guò)濾，再用2m]水進(jìn)行淋洗，加入的亞硝酸鈉，靜置5min，加入lml的鹽酸萘乙二胺。(4)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備在6個(gè)試管中分別加入5ml血漿，在6個(gè)試管中分別添加濃度為lmg/ml的磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液014、25^1、5(M、7514、IOOW，使血漿中的磺胺二甲嘧啶為OPg/ml、5Pg/m]、醇g/ml、歸g/ml、20Pg/ml。以濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線——濃度吸光度值關(guān)系圖。(5)血漿樣品的檢測(cè)5ml血漿中加入lml三氯乙酸，4000r/min離心10min，過(guò)濾，再用2ml水進(jìn)行淋洗，加入1()W的亞硝酸鈉，靜置5min，加入.l.ml的鹽酸萘乙二胺。直接用分光光度計(jì)于545nm下測(cè)定其吸光度值，根據(jù)所制備的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，就可以得出血漿中磺胺二甲嘧啶的殘留量?；前范奏奏さ闹氐己戏磻?yīng)簡(jiǎn)便、快速，能夠適用于血漿的現(xiàn)場(chǎng)快速篩選，整個(gè)處理過(guò)程只需1520min即可完成，該方法即使采用較簡(jiǎn)易的7^1分光光度計(jì)，吸光度值和殘留濃度之間的線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)能達(dá)到().98以上。在l.O、5.0、10.0化/g三個(gè)添加水平上，血漿中磺胺二甲嘧啶的回收率范圍分別為79.8%81.3%，81.6%83.1%，78.15%81.23%，平均回收率在79.0%以上，變異系數(shù)在2.0%以下。權(quán)利要求1、一種磺胺二甲嘧啶殘留快速顯色方法，其特征在于建立磺胺二甲嘧啶的化學(xué)重氮-偶合反應(yīng)，血漿中不同殘留濃度的磺胺二甲嘧啶經(jīng)過(guò)反應(yīng)后，呈現(xiàn)不同的顏色，借助分光光度計(jì)，就能得出血漿中磺胺二甲嘧啶殘留的濃度，實(shí)現(xiàn)了磺胺二甲嘧啶殘留的活體檢測(cè)。該反應(yīng)能生成猩紅色的重氮-偶合產(chǎn)物，磺胺二甲嘧啶與鹽酸萘乙二胺在酸性條件下能生成有色的重氮-偶合產(chǎn)物(猩紅色偶氮化合物)其中，亞硝酸鈉與血漿的配比應(yīng)在0.05mg/ml-0.3mg/ml范圍內(nèi)。形成的偶合產(chǎn)物于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行可見(jiàn)光波段的全掃描，在可見(jiàn)光區(qū)域，所形成的偶合物有特征吸收峰，其最大檢測(cè)波長(zhǎng)為545nm。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的磺胺二甲嘧啶殘留快速顯色方法，其特征在于反應(yīng)所需的酸性條件的pH值范圍為2.0-2.5。全文摘要本發(fā)明提供了一種血漿磺胺二甲嘧啶殘留快速顯色方法，該利用磺胺二甲嘧啶的特殊結(jié)構(gòu)，與鹽酸萘乙二胺在酸性條件下發(fā)生顯色反應(yīng)，生成有色的重氮-偶合產(chǎn)物，見(jiàn)上圖，根據(jù)反應(yīng)生成顏色的深淺，借助分光光度計(jì)就可得出血漿中磺胺二甲嘧啶的殘留量。整個(gè)處理過(guò)程只需15～20min即可完成，方法的平均回收率能達(dá)到78％以上，該檢測(cè)方法快速、精確、可靠，能夠適用于血漿的現(xiàn)場(chǎng)快速篩選。文檔編號(hào)G01N21/78GK101430325SQ20071006634公開(kāi)日2009年5月13日申請(qǐng)日期2007年11月5日優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日發(fā)明者勇劉,曦張,楊秀娟,葛長(zhǎng)榮,陶琳麗申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)