一株磺胺二甲嘧啶降解菌s-07及其篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物降解處理的一株磺胺二甲嘧啶降解菌S?07及其篩選方法。所述的降解菌S?07經(jīng)鑒定為地桿菌(Geobacillus)，該菌16S rDNA的Genbank登錄號(hào)為KU588289。于2016年04月21日保藏于“中國普通微生物菌種保藏管理中心”，其保藏號(hào)CGMCC No. 12382。本發(fā)明的磺胺二甲嘧啶降解菌S?07在溫度為50?75℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，對(duì)磺胺二甲嘧啶有很強(qiáng)的耐受力，并且能高效降解液相和固相中的磺胺二甲嘧啶。該菌能夠應(yīng)用于畜禽糞便或污泥高溫堆肥中的磺胺二甲嘧啶殘留物的降解去除，去除率大于95 %，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景和環(huán)境效益。CGMCC No.1238220160421
【專利說明】
一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境保護(hù)與有機(jī)污染物微生物降解技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07及其篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]磺胺類抗生素是畜禽養(yǎng)殖業(yè)中常用的六大類抗生素之一，廣泛用于畜禽動(dòng)物疾病的治療和添加于飼料中促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)?；前奉惪股氐目咕鷻C(jī)理是:它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上類似對(duì)氨基苯甲酸(PABA)，可與PABA競(jìng)爭(zhēng)性作用于細(xì)菌體內(nèi)的二氫葉酸合成酶，從而阻止PABA作為原料合成細(xì)菌所需要葉酸的過程，減少了具有代謝活性的四氫葉酸的量，而后者則是細(xì)菌合成DNA的必需物質(zhì)，因此抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。磺胺二甲嘧啶是常用的磺胺類藥物之一，其經(jīng)過動(dòng)物腸道不能被完全吸收而以原形或代謝產(chǎn)物的形式通過糞便和尿液排出。所以，在動(dòng)物糞便中會(huì)有大量的磺胺二甲嘧啶殘留物存在。而動(dòng)物糞便常作為肥料應(yīng)用于農(nóng)業(yè)土地，這就導(dǎo)致殘留的磺胺二甲嘧啶等其他抗生素藥物進(jìn)入生態(tài)環(huán)境中，引發(fā)系列環(huán)境問題。堆肥技術(shù)被認(rèn)為是一種糞便無害化和資源化處理的簡(jiǎn)便易行方法，能有效去除糞便中多數(shù)抗生素殘留。但磺胺二甲嘧啶是一類較頑固的抗生素，其在常規(guī)堆肥溫度下不易分解，堆肥成熟之后仍然會(huì)有部分殘留物未能去除。
[0003]通過對(duì)國內(nèi)外研究的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)目前篩選出的對(duì)磺胺類抗生素具有降解能力的菌大多數(shù)為常溫或低溫菌，無法應(yīng)用于高溫堆肥中。中國專利號(hào):ZL 201210153552.7，申請(qǐng)公布日為2013年03月06日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為:一株P(guān)seudomonas psychrophila HA-4低溫磺胺甲基異惡唑降解菌及其篩選方法和應(yīng)用。該菌可以以磺胺甲基異惡唑?yàn)槲ㄒ惶?、氮及能源生長(zhǎng)，其細(xì)胞液體培養(yǎng)可以降解磺胺甲基異惡唑，能夠應(yīng)用于城市污水中磺胺甲基異惡唑的生物降解，該菌在低溫條件下對(duì)初始濃度為100 mg/L的磺胺甲基異惡唑去除率達(dá)到35.34 %。這種菌為常/低溫菌種，無法應(yīng)用于高溫堆肥中，且該菌對(duì)抗生素的降解效率較低。因此，應(yīng)該篩選出對(duì)磺胺類抗生素具有高效降解能力的高溫菌，把它們制備成菌劑應(yīng)用于實(shí)際的高溫堆肥，不但能提高堆肥中微生物的多樣性，提高堆肥溫度，還可以進(jìn)一步使殘留的磺胺藥物徹底降解，這對(duì)于降低堆肥產(chǎn)物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07及其篩選方法。篩選出的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，能在高溫(50-75°C)下高效降解磺胺二甲嘧啶，可制備成微生物菌劑，應(yīng)用于高溫堆肥中，實(shí)現(xiàn)堆肥產(chǎn)品中磺胺二甲嘧啶抗生素的高效降解，為堆肥產(chǎn)品的農(nóng)業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0005]上述目的與任務(wù)是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07于2016年04月21日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為:CGMCCN0.12382。保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。經(jīng)鑒定其為:喜熱嗜油地芽孢桿菌(Geobacillus thermoleovorans)。該菌的 16S rDNA的Genbank登錄號(hào)為KU588289。
[0006]進(jìn)一步地，所述磺胺二甲啼啶降解菌S-07經(jīng)I 6 s rRNA鑒定為地桿菌屬(Geobacillus)的一種，與GeobaciI Ius thermoIeovorans的同源性達(dá)到99.65 %。該菌 16SrDNA 的 Genbank 登錄號(hào)為 KU588289。
[0007]進(jìn)一步地，所述磺胺二甲嘧啶降解菌S-07是在70°C下從抗生素制藥廠車間污泥樣品，通過富集、馴化和分離純化得到。篩選方法的具體步驟如下:
1)富集馴化
取含水率為70-85 %的抗生素藥廠車間原污泥，按20 ml/g的比例加入磺胺二甲嘧啶的初始濃度為5.0 mg/L的MMSM培養(yǎng)基中；在溫度為70°C，搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm的條件下避光培養(yǎng);每馴化10天后，將培養(yǎng)液離心，離心得到的沉淀物轉(zhuǎn)接至新的MMSM培養(yǎng)基中，每轉(zhuǎn)接一次，MMSM培養(yǎng)基中磺胺二甲嘧啶的濃度增加5 mg/L，直到磺胺二甲嘧啶濃度達(dá)到50 mg/L;
2)分離純化
取0.1ml最終的培養(yǎng)液涂布于磺胺二甲嘧啶濃度為50 mg/L的選擇性平板上，置于70°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將平板上長(zhǎng)出的單菌落挑出，經(jīng)過多次在磺胺二甲嘧啶選擇性平板上劃線，分離純化得到磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，并將其劃線至LB培養(yǎng)基斜面上，置于4°C冰箱保藏。
[0008]進(jìn)一步地，所述的MMSM培養(yǎng)基組成為:Na2EDTA.2H20 (0.018 g/L)，F(xiàn)eSO4.7H20(0.013 g/L), CaCl2.2H20 (0.013 g/L), MgSO4.7H20 (0.25 g/L), Na2HPO4 (7.5 g/L), KH2PO4(5 g/L), NH4NO3 (5 g/L),酵母提取物(0.6 g/L)，葡萄糖(0.5 g/L)。
[0009]進(jìn)一步地，所述的選擇性平板的制備方法為在MMSM培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉搖勻，于121°C高壓滅菌鍋，滅菌20分鐘，冷卻至60-70 °C，向其中加入磺胺二甲嘧啶溶液，搖勻后倒入培養(yǎng)皿中，凝固后制備出選擇性平板。
[0010]進(jìn)一步地，所述的LB培養(yǎng)基組成為:胰蛋白胨(10.0g/L)，酵母提取物(5.0 g/L),NaCKlO g/L);也可向其中加入2.0 %的瓊脂粉，制成固體LB培養(yǎng)基。
[0011]進(jìn)一步地，所述的磺胺二甲嘧啶的降解能力測(cè)試方法為:將斜面保藏的菌S-07用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，并制成種子液。接種至磺胺二甲嘧啶的濃度為10 mg/L、pH為6.0的MMSM培養(yǎng)基中，置于70°C，搖床轉(zhuǎn)速為50 rpm條件下避光培養(yǎng)。24 h后測(cè)得液體培養(yǎng)基中的磺胺二甲嘧啶的降解率大于90 %。
[0012]進(jìn)一步地，所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07可以制備成微生物菌劑應(yīng)用于畜禽糞便或污泥高溫堆肥中，降解其中的磺胺二甲嘧啶。
【附圖說明】
[0013]圖1為磺胺二甲嘧啶降解菌S-07在掃描電鏡下的形態(tài)。
[0014]圖2為溫度對(duì)磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的生長(zhǎng)以及降解磺胺二甲嘧啶能力的影響。
[0015]圖3為pH對(duì)磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的生長(zhǎng)以及降解磺胺二甲嘧啶能力的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述。
[0017]實(shí)施例1
稱取5.0 g抗生素藥廠車間污泥置于250 ml三角瓶中，其中加入100 ml MMSM培養(yǎng)基，其中磺胺二甲啼啶的濃度為5.0 mg/L，置于70°C，搖床轉(zhuǎn)速為10rpm條件下避光培養(yǎng)。每馴化10天，取5.0 ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接I次，每次培養(yǎng)基中抗生素濃度增加5 mg/L，直到磺胺二甲嘧啶濃度達(dá)到50 mg/L。取0.1 ml培養(yǎng)液涂布于磺胺二甲嘧啶濃度為50mg/L的選擇性平板，置于70°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將平板上長(zhǎng)出的菌落挑出，分離純化得到降解菌S-07。
[0018]其中，MMSM培養(yǎng)基制備方法為:Na2EDTA.2H20 (0.018 g/L) , FeSO4.7H20(0.013 g/L), CaCl2.2H20 (0.013 g/L), MgSO4.7H20 (0.25 g/L), Na2HPO4 (7.5 g/L), KH2PO4 (5 g/L), NH4NO3 (5 g/L),酵母提取物(0.6 g/L)，葡萄糖(0.5 g/L)，磺胺二甲嘧啶。篩選培養(yǎng)基制備方法為:MMSM培養(yǎng)基中加入2.0%的瓊脂粉，制成磺胺二甲嘧啶選擇性平板。培養(yǎng)基均是于121 °C高壓滅菌鍋，滅菌20分鐘后使用。
[0019]采用16s rRNA基因序列法對(duì)降解菌S-07進(jìn)行分類鑒定。測(cè)得的16s rRNA基因序列與GenBank中已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明降解菌S-07為地桿菌(Geobaci I Ius)的一種，該菌與地桿菌屬的GeobaciIIus thermoIeovorans的同源性達(dá)到99.65 %。
[0020]溫度對(duì)降解菌S-07降解能力的影響
LB培養(yǎng)基在70 0C下培養(yǎng)12 h后的種子液，在室溫下6000 rpm，離心5分鐘，得到的沉淀物用PBS緩沖液洗滌2次，再用生理鹽水將菌體制成0D6QQ=2.0的菌懸液。MMSM培養(yǎng)基(pH=6.5)中磺胺二甲嘧啶的濃度為10 mg/L，50 ml培養(yǎng)基中接種1.0 %的菌懸液，搖床溫度分別設(shè)定為50、55、60、65、70和75 V，24 h后取樣檢測(cè)磺胺二甲嘧啶的濃度，并測(cè)定菌體生長(zhǎng)量(ODboo)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，在70 °C下，磺胺二甲嘧啶的降解效果最佳。
[0021 ] pH對(duì)降解菌S-07降解能力的影響
LB培養(yǎng)基在70 0C下培養(yǎng)12 h后的種子液，在室溫下6000 rpm，離心5分鐘，得到的沉淀物用PBS緩沖液洗滌2次，再用生理鹽水將菌體制成OD6qq為2.0的菌懸液。MMSM培養(yǎng)基中磺胺二甲嘧啶的濃度為10 mg/L，并用酸堿調(diào)節(jié)pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。50 ml培養(yǎng)基中接種1.0 %的菌懸液，搖床溫度設(shè)定為70°C。24 h后取樣測(cè)定磺胺二甲嘧啶的濃度，并測(cè)定菌體生長(zhǎng)量(OD6qq )。由圖3可以看出該菌在pH=6.0時(shí)，培養(yǎng)基中磺胺二甲嘧啶的降解率達(dá)到最大，并且生長(zhǎng)量也達(dá)到最大。
[0022]最適溫度和pH條件下降解菌S-07對(duì)磺胺二甲嘧啶的降解
LB培養(yǎng)基在70 0C下培養(yǎng)12 h后的種子液，在室溫下6000 rpm，離心5分鐘，得到的沉淀物用PBS緩沖液洗滌2次，再用生理鹽水將菌體制成OD6qq為2.0的菌懸液。MMSM培養(yǎng)基中磺胺二甲嘧啶的濃度為10 mg/L，并用酸堿調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值=6.0。實(shí)驗(yàn)組在50 ml培養(yǎng)基中接種1.0 %的菌懸液，對(duì)照組則是在50 ml培養(yǎng)基中加入1.0 %的無菌水，搖床溫度設(shè)定為70°C，轉(zhuǎn)速為50 rpm ο 24 h后取樣測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的磺胺二甲嘧啶的濃度，并計(jì)算得出相應(yīng)的降解率。對(duì)照組24 h磺胺二甲嘧啶的降解率為23.35 %，實(shí)驗(yàn)組24 h磺胺二甲嘧啶的降解率可達(dá)97.45 %。除去溫度的降解效果，降解菌S-07對(duì)磺胺二甲嘧啶的降解效果達(dá)到74.10%。
[0023]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07于2016年04月21日保藏于“中國普通微生物菌種保藏管理中心”，其保藏號(hào)CGMCC N0.12382。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述磺胺二甲嘧啶降解菌S-07經(jīng)16s rRNA鑒定為地桿菌屬(Geobaci I Ius )的一種，與Geobaci I Iusthermoleovorans 的同源性達(dá)到 99.65%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的16S rDNA的Genbank登錄號(hào)為KU588289。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的篩選方法，其特征在于:所述磺胺二甲嘧啶降解菌S-07是在70°C下從抗生素制藥廠車間污泥樣品中，通過富集、馴化和分離純化得到。5.篩選方法的具體步驟如下: 1)富集馴化:取含水率為70-85%的抗生素藥廠車間原污泥，按20ml/g的比例加入磺胺二甲嘧啶的初始濃度為5.0 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MMSM)中；在溫度為70°C，搖床轉(zhuǎn)速為100rpm的條件下避光培養(yǎng);每馴化10天后，將培養(yǎng)液離心，離心得到的沉淀物接至新的MMSM培養(yǎng)基中，每轉(zhuǎn)接一次，MMSM培養(yǎng)基中磺胺二甲嘧啶的濃度增加5 mg/L，直到磺胺二甲嘧啶濃度達(dá)到50 mg/L； 2)分離純化:取0.1ml最終的培養(yǎng)液涂布于磺胺二甲嘧啶濃度為50 mg/L的選擇性平板上，置于70 0C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的選擇性平板，將平板上長(zhǎng)出的單菌落挑出，經(jīng)過多次在磺胺二甲嘧啶選擇性平板上劃線，分離純化得到磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，并將其劃線至LB培養(yǎng)基斜面上，置于4 °C冰箱保藏。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的篩選方法，其特征在于:所述的MMSM培養(yǎng)基組成為:Na2EDTA.2H20 (0.018 g/L)，F(xiàn)eSO4.7H20 (0.013 g/L)，CaCl2.2H20 (0.013 g/L), MgSO4.7H20 (0.25 g/L), Na2HPO4 (7.5 g/L), KH2PO4(5 g/L),NH4NO3 (5 g/L),酵母提取物(0.6 g/L)，葡萄糖(0.5 g/L)。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的篩選方法，其特征在于:所述的選擇性平板的制備方法為在MMSM培養(yǎng)基中加入2 %的瓊脂粉搖勻，于121 0C高壓滅菌鍋，滅菌20分鐘，冷卻至60-70°C，向其中加入磺胺二甲嘧啶溶液，搖勻后倒入培養(yǎng)皿中，凝固后制備出選擇性平板。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07的篩選方法，其特征在于:所述的LB培養(yǎng)基組成為:胰蛋白胨(10.0 8/1)，酵母提取物(5.0 g/L)，NaCl(10.0 g/L);也可向其中加入2.0 %的瓊脂粉，制成固體LB培養(yǎng)基。10.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述的磺胺二甲嘧啶的降解能力測(cè)試方法為:將斜面保藏的菌S-07用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，并制成種子液。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的種子液，其特征在于:將種子液接種至磺胺二甲嘧啶濃度為10mg/L，pH為6.0的MMSM培養(yǎng)基中，置于70°C，搖床轉(zhuǎn)速為50 rpm條件下避光培養(yǎng)，24 h后測(cè)得液體培養(yǎng)基中的磺胺二甲嘧啶的降解率大于95 %。12.根據(jù)權(quán)利要求1、2或7所述的磺胺二甲嘧啶降解菌S-07，其特征在于:所述的磺胺二 。鉭塑in趦鵝Kc/C f ^ 「I 七 Xl V 98298901 Zo
【文檔編號(hào)】C05F3/00GK105861385SQ201610345650
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】汪印, 潘蘭佳, 余廣煒, 唐曉達(dá), 李 杰
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所