專(zhuān)利名稱(chēng)：：谷氨酰胺合成酶的磷酰基轉(zhuǎn)移酶活性的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)酶的磷?；D(zhuǎn)移酶活性，包括通過(guò)膦甲酸(carboxyphosphate)中間體介導(dǎo)的磷?；D(zhuǎn)移酶活性的物質(zhì)和方法。例如，提供用于調(diào)節(jié)谷氨酰胺合成酶活性的物質(zhì)和方法，包括用于調(diào)節(jié)腺苷酰化谷氨酰胺合成酶的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的物質(zhì)和方法。
背景技術(shù)：
：谷氨酰胺合成酶(GS，EC6.3丄2)是參與氮代謝并催化L-谷氨酸、ATP和氨可逆轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-谷氨酰胺、ADP和無(wú)機(jī)磷酸的核心酶。該反應(yīng)通過(guò)"谷氨酰磷酸中間體調(diào)節(jié)。存在三種不同形式的谷氨酰胺合成酶GSI、GSII和GSIII。GSI形式的酶只存在于細(xì)菌(真細(xì)菌)和古菌(古細(xì)菌)中。GSII存在于真核細(xì)胞和某些土壤細(xì)菌，而只在少數(shù)菌種中發(fā)現(xiàn)GSIII基因。有兩個(gè)重要的GSI亞門(mén)GSI-a和GSI-P。在嗜熱菌、低G+C革蘭氏陽(yáng)性菌和廣古菌(包括產(chǎn)甲垸菌類(lèi)、嗜鹽菌類(lèi)和一些嗜熱菌類(lèi))中發(fā)現(xiàn)GSI-a基因，而在所有其它細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)GSI-P基因。GSI-p酶通過(guò)腺苷酰化/去腺苷?；?jí)聯(lián)被調(diào)節(jié)，并且還含有在GSI-a形式中不存在的25個(gè)氨基酸插入序列。具有GSI-p基因的細(xì)菌包括白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌、傷寒沙門(mén)氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門(mén)螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyellaxiiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌。GSI-a亞門(mén)的細(xì)菌包括蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。在具有GSI-P基因的大腸桿菌和其它細(xì)菌中，通過(guò)1個(gè)和12個(gè)GS亞基之間的腺苷?；瘉?lái)調(diào)節(jié)GS活性。所有原核細(xì)菌的腺苷?；稽c(diǎn)(相當(dāng)于大腸桿菌中的Tyr397)均表現(xiàn)出高度保守，而腺苷?；潭扰c培養(yǎng)基中氮能源和碳能源的可利用性有關(guān)。具有10-12個(gè)腺苷?；瘉喕墓劝滨０泛铣擅府a(chǎn)生于過(guò)量氮和限量碳存在下生長(zhǎng)的細(xì)胞中。GS的腺苷?；€改變了酶對(duì)二價(jià)金屬離子從Mg^到Mi^+的特異性。鑒于細(xì)菌感染對(duì)發(fā)達(dá)與不發(fā)達(dá)國(guó)家?guī)?lái)的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)的破壞以及細(xì)菌抗生素耐藥性菌株的飛速增長(zhǎng)，用于治療、預(yù)防和改善細(xì)菌感染的新種類(lèi)的抗生素會(huì)很有用。
發(fā)明內(nèi)容除非另外具體說(shuō)明，本文鑒定的所有的GS氨基酸殘基數(shù)是指大腸桿菌(五.co//)GS的殘基。如果給出細(xì)菌GS多肽序列之間的同源性，本領(lǐng)域技術(shù)人員就能利用例如同源性比對(duì)或分子模擬等方法測(cè)定其它種的GS所關(guān)注的相應(yīng)殘基。本說(shuō)明書(shū)基于以下發(fā)現(xiàn)，即在形成，谷氨酰磷酸中間體的過(guò)程中，腺苷酰化形式的GS利用包括(Mn"V(HCCV;h2ATP復(fù)合物的獨(dú)特反應(yīng)機(jī)理，將ATP的Y-磷酸基轉(zhuǎn)移到谷氨酸的？羧酸酯。因此，可利用關(guān)于該復(fù)合物、該復(fù)合物在GS上的結(jié)合位點(diǎn)以及提出的相關(guān)的膦甲酸中間體磷酰基轉(zhuǎn)移機(jī)理的信息來(lái)設(shè)計(jì)靶向腺苷?；疓SI-p酶的化合物。該化合物可用于抑制腺苷?；疓S活性并因此用于治療、預(yù)防或改善細(xì)菌感染。因?yàn)橥ㄟ^(guò)腺苷酰化/去腺苷?；?jí)聯(lián)可調(diào)節(jié)細(xì)菌GSI-卩酶，但卻不能調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的GSII酶，因此對(duì)腺苷?；疓S有抑制作用、但對(duì)去腺苷酰化GS沒(méi)有或僅有最小抑制作用的化合物可用于選擇性地抑制GSI-P細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的負(fù)面影響也被最小化。因此提供計(jì)算機(jī)輔助的方法以設(shè)計(jì)試驗(yàn)抑制劑化合物和用于體外和體內(nèi)篩選試驗(yàn)分子的抑制活性的方法。本文還提供用于抑制GS活性，包括腺苷?；腿ハ佘挣；疓S活性的化合物和組合物；用于抑制或預(yù)防體外和體內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的化合物和組合物；以及用于治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物細(xì)菌感染的化合物和組合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本文提供一種產(chǎn)生腺苷?；劝滨０泛铣擅?GS)多肽的磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的試驗(yàn)抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助方法，所述方法使用包括處理器和輸入設(shè)備的程序式計(jì)算機(jī)，所述方法包括(a)向所述輸入設(shè)備輸入包括GS多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)；(b)使用所述處理器將試驗(yàn)抑制劑分子對(duì)接到所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)內(nèi)；以及(c)基于所述對(duì)接，確定所述試驗(yàn)抑制劑分子是否例如通過(guò)抑制膦甲酸中間體的形成來(lái)抑制所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的活性。該方法可進(jìn)一步包括將(Mn")3'(HCCV;h2'ATP復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元(structuralmotifs)對(duì)接到所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)內(nèi)。該方法可包括基于所述對(duì)接，確定所述試驗(yàn)抑制劑分子是否抑制所述(M^+)y(HCCV;h2，ATP復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元與所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的結(jié)合，或者抑制膦甲酸中間體的形成。在有些實(shí)施方式中，該方法可包括設(shè)計(jì)由步驟(c)確定的試驗(yàn)抑制劑以抑制所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的活性并體外評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡囊种苹钚?。體外評(píng)價(jià)可包括使用能測(cè)量ATP水解、ADP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法。在有些實(shí)施方式中，該方法可進(jìn)一步包括體外評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)去腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡囊种苹钚?，以評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)所述腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的特異性抑制活性，和/或生成所述試驗(yàn)抑制劑并評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)含有GSI-p谷氨酰胺合成酶基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制活性，例如，該細(xì)菌選自白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌、傷寒沙門(mén)氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門(mén)螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyelladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌。在有些實(shí)施方式中，該方法包括評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。另一方面，提供一種產(chǎn)生抑制腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供谷氨酰胺合成酶多肽的三維結(jié)構(gòu)；以及(b)基于所述三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)能抑制所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)與(Mn2+)3《HC03-)12ATP復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元之間相互作用的試驗(yàn)化合物。所述谷氨酰胺合成酶多肽的三維結(jié)構(gòu)包括結(jié)合到所述磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的(M^+)3，(HC03')^ATP復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元。在另一實(shí)施方式中，提供一種產(chǎn)生抑制腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡牧柞；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的試驗(yàn)化合物的方法，所述方法包括(a)提供(Mn2+V(HC(V;h2'ATP復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；以及(b)基于所述三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)具有類(lèi)似于(Mn")3.(HC03—;h2.ATP復(fù)合物結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元的試驗(yàn)化合物。另一方面，提供一種體外篩選試驗(yàn)化合物以確定所述試驗(yàn)化合物是否抑制腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的方法，所述方法包括(a)在對(duì)磷?；D(zhuǎn)移酶活性和/或膦甲酸中間體的形成有效的條件下，使腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽與試驗(yàn)化合物接觸；以及(b)確定相對(duì)于還沒(méi)有與所述試驗(yàn)化合物接觸過(guò)的腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡幕钚?，所述腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡牧柞；D(zhuǎn)移酶的活性是否有所降低。該方法可進(jìn)一步包括確定相對(duì)于還沒(méi)有與所述試驗(yàn)化合物接觸過(guò)的去腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡幕钚?，所述去腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶的活性是否有所降低。還提供一種用于抑制腺苷?；疓S多肽的磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的體外方法，所述方法包括使腺苷?；疓S多肽與含有本文所述的式I、II、III、IV、V、VI或VII表示的化合物的組合物接觸。還提供一種用于抑制含有GSI-P基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的體外方法，其中所述方法包括使所述細(xì)菌與含有本文所述的式i、n、III、IV、V、VI或VII表示的化合物的組合物接觸。另一方面，提供一種用于治療、預(yù)防或改善與哺乳動(dòng)物的細(xì)菌感染有關(guān)的或與具有細(xì)菌感染危險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物的細(xì)菌感染有關(guān)的一種或多種癥狀或障礙的方法，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-p基因的細(xì)菌引起，所述方法包括將含有本文所述的式i、n、ni、iv、v、vi或vn表示的化合物的組合物給予所述哺乳動(dòng)物。還提供一種用于抑制腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡牧柞；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的體內(nèi)方法，所述方法包括(a)將含有本文所述的式I、II、III、IV、V、VI或VII表示的化合物的組合物給予受到細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-p基因的細(xì)菌引起。本文還提供例如如式i、ii、in、iv、v、vi或vn表示的化合物，同時(shí)還提供其藥學(xué)上可接受的鹽和衍生物以及含有這些化合物的藥物組合物。還提供用于治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物細(xì)菌感染的化合物或藥物組合物的用途。還提供相同方法的中使用的例如具有特定識(shí)別化合物編號(hào)的特定化合物。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員所普遍理解的意義相同。如有沖突，本文件包括定義將決定保護(hù)范圍。盡管與本文記載的方法和材料類(lèi)似或等同的方法和材料也可用于實(shí)施本發(fā)明或?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行試驗(yàn)，但以下記載了優(yōu)選的方法和材料。所有的出版物，專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利及其它參考文獻(xiàn)均以整體引入本文。本文公開(kāi)的材料、方法和實(shí)施例只用于說(shuō)明而沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖。從以下說(shuō)明、附圖和權(quán)利要求書(shū)中將明顯看出本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，例如抑制腺苷?；疓S的活性和由此用于治療細(xì)菌感染的方法。圖1描述了所提出在腺苷?；疓S的磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的催化機(jī)理。小寫(xiě)字母是指以下提出的步驟-a.二氧化碳鰲合作用；b.電荷移位；C.分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移；d.金屬模板化；e.氨基甲酰磷酸的形成；f.磷?；D(zhuǎn)移；以及g.潰陷。具體實(shí)施例方式在其它發(fā)現(xiàn)中，發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)相比于在Mg^存在下的去腺苷酰化形式的酶，在Mi^+存在下的腺苷?；问降腉S酶中存在一種新的谷氨酰胺合成酶ATP-磷?；D(zhuǎn)移反應(yīng)機(jī)理。該反應(yīng)機(jī)理顯示需要存在碳酸鹽和Mn2+,與ATPW(Mn2+)3《HCCV)12ATP復(fù)合物的形式發(fā)揮作用。如下面進(jìn)一步示出的，假定的反應(yīng)包括ATP的N7的羧基化，形成允許Cg質(zhì)子通過(guò)締合的HC(V去質(zhì)子的亞胺正離子(immoniumspecies),并伴隨形成Mi^+卡賓，而且隨后進(jìn)行N7羧酸酯對(duì)，磷酸的進(jìn)攻，形成膦甲酸中間體，然后促使通過(guò)GS某些重要的氨基酸側(cè)鏈(即，His269和His271)使磷?；D(zhuǎn)移到谷氨酸。參見(jiàn)圖1。因此，本文提出，基于(Mn")3乂HC(V;h2ATP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或其結(jié)構(gòu)的組成部分以及基于它們?cè)谙佘挣；疓S中結(jié)合位點(diǎn)的分析可設(shè)計(jì)特定的腺苷?；疓S抑制劑，并提出這些抑制劑使酶結(jié)合到(Mn2+)3《HC03—)12ATP結(jié)合位點(diǎn)以抑制細(xì)菌酶；或抑制(Mn2+)3《HC03—)^ATP在結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合；或抑制膦甲酸中間體的形成。定義除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"GS多肽"和"谷氨酰胺合成酶多肽"在本文中可互換使用，是指例如來(lái)自GSI-a或GSI-p細(xì)菌的細(xì)菌GSI多肽。除非另有說(shuō)明，該術(shù)語(yǔ)包括全長(zhǎng)的多肽及其片段。此外，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將公認(rèn)的那樣，GS可作為體內(nèi)十二聚體，GS活性位點(diǎn)可由來(lái)自于一個(gè)以上單體的氨基酸組成。因此，該術(shù)語(yǔ)還包括全長(zhǎng)GS的多聚體(例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體、九聚體、十聚體、十一聚體和十二聚體)、GS片段的多聚體、作為一個(gè)或多個(gè)GS活性位點(diǎn)一部分的一個(gè)或多個(gè)殘基(例如一組殘基，所述殘基可能在GS的一級(jí)序列中不鄰接，但卻組成GS活性位點(diǎn)的至少一部分)以及這些組合的多聚體。"多肽"和"蛋白"可互換使用，是指無(wú)論長(zhǎng)度或翻譯后修飾，氨基酸的任意肽連接鏈(peptide-linkedchain)。術(shù)語(yǔ)"分離的"可指沒(méi)有自然存在的對(duì)應(yīng)物或已經(jīng)從與之自然相伴的成分例如下列組織或體液中分離或純化的多肽，所述組織例如是胰腺、肝、脾、卵巢、睪丸、肌肉、關(guān)節(jié)組織、神經(jīng)組織、胃腸組織或腫瘤組織(例如乳腺癌或結(jié)腸癌組織)；所述體液例如是血液、血清或尿，或是從細(xì)菌或真菌培養(yǎng)液中分離或純化的多肽。通常，當(dāng)至少70%干重的多肽不含有與之自然相關(guān)聯(lián)的蛋白和其它自然存在的有機(jī)分子時(shí)，認(rèn)為多肽是"分離的"。優(yōu)選地，多肽制劑是至少80%、更優(yōu)選至少90%和最優(yōu)選至少99%干重的多肽。因?yàn)榛瘜W(xué)合成的多肽其本身是從與之自然共存的成分中分離出來(lái)的，所以合成的多肽是"分離的"。分離的多肽可以例如通過(guò)從天然來(lái)源(例如從組織)提取、通過(guò)編碼多肽的重組核酸的表達(dá)或通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得。因?yàn)楸囟ú缓信c之自然相伴的成分，因此在與自然產(chǎn)生多肽來(lái)源不同的細(xì)胞體系內(nèi)產(chǎn)生的多肽是"分離的"。通過(guò)任何適合的方法，例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析可以測(cè)量分離或純化的程度。在檢測(cè)之前，通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法和本文記載的方法可對(duì)任何多肽進(jìn)行修飾，例如腺苷酰化、磷酸化或糖基化。本文使用的化合物的"藥學(xué)上可接受的衍生物"包括鹽、酯、烯醇醚、烯醇酯、縮醛、縮酮、原酸酯、半縮醛、半縮酮、酸、堿、溶劑合物、水合物或其前體藥物。使用用于這些衍生的已知方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地制備這些衍生物。將生成的化合物給予動(dòng)物或人而沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的毒性作用，并且該化合物具有藥學(xué)活性或者為前體藥物。藥學(xué)上可接受的鹽包括胺鹽，例如N,N'-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、氨、二乙醇胺和其它羥垸基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、l-對(duì)-氯芐基-2-吡咯烷-l'-基甲基-苯并咪唑、二乙胺和其它垸基胺、哌嗪和三(羥甲基)氨基甲垸，但不限于此；堿金屬鹽，例如鋰鹽、鉀鹽和鈉鹽，但不限于此；堿土金屬鹽，例如鋇鹽、鈣鹽和鎂鹽，但不限于此；過(guò)渡金屬鹽，例如鋅鹽，但不限于此；和其它金屬鹽，例如磷酸氫鈉和磷酸二鈉，但不限于此；還包括但不限于硝酸鹽、硼酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、無(wú)機(jī)酸鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽和硫酸鹽，但不限于此)；以及有機(jī)酸鹽，例如醋酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、酒石酸鹽、擰檬酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽和延胡索酸鹽，但不限于此。藥學(xué)上可接受的酯包括酸基的垸基酯、烯基酯、炔基酯、芳基酯、雜芳基酯、芳烷基酯、雜芳烷基酯、環(huán)垸基酯和雜環(huán)酯，但不限于此，其中所述酸基包括羧酸、磷酸、次磷酸、磺酸、亞磺酸和硼酸，但不限于此。藥學(xué)上可接受的烯醇醚包括式C:C(OR)表示的衍生物，其中R為氫、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳垸基、環(huán)烷基或雜環(huán)基，但不限于此。藥學(xué)上可接受的烯醇酯包括式C:C(OC(O)R)的衍生物，其中，R為氫、垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環(huán)垸基或雜環(huán)基，但不限于此。藥學(xué)上可接受的溶劑合物和水合物為一個(gè)或多個(gè)溶劑或水分子與化合物的復(fù)合物，或1-約100個(gè)、或1-約10個(gè)、或1-約2個(gè)、1-約3個(gè)或1-約4個(gè)溶劑或水分子與化合物的復(fù)合物。本文使用的治療意指以任何方式使細(xì)菌感染例如結(jié)核分枝桿菌感染的一種或多種癥狀得以改善或發(fā)生其它有利地改變。治療還包括本文所述的組合物的任何藥物用途，例如用于治療哺乳動(dòng)物(例如人)懷疑受到細(xì)菌感染或與細(xì)菌感染有牽連的疾病、障礙或失調(diào)的用途。本文使用的通過(guò)給予特定化合物或藥物組合物使特定障礙的癥狀得以改善是指任何可歸因于組合物給予或與組合物給予有關(guān)的減輕，無(wú)論這種減輕是持久的或臨時(shí)的、持續(xù)的或短暫的。本文所用的ICso是指在測(cè)量響應(yīng)的方法中，對(duì)最大響應(yīng)的抑制達(dá)到50%的特定試驗(yàn)化合物的量、濃度或劑量。本文所用的術(shù)語(yǔ)Ki代表酶/抑制劑復(fù)合物的解離常數(shù)。Ki理論上與被抑制劑試驗(yàn)的底物無(wú)關(guān)。使用方程式Ki=IC5()*Km/(S+Km)由IQo可計(jì)算Ki，其中，S是底物濃度，Km是反應(yīng)速度為最大值一半時(shí)的底物濃度(在沒(méi)有抑制劑時(shí))。用于抑制特定底物(固定Km)的抑制劑的Ki是常數(shù)。本文所用的ECso是指達(dá)到50%抑制時(shí)的藥物濃度，以及CCso是指達(dá)到50%毒性時(shí)的藥物濃度。本文所用的前體藥物是經(jīng)體內(nèi)給予，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)步驟或過(guò)程被代謝、或通過(guò)另外的方式被轉(zhuǎn)化為該化合物在生物學(xué)上、藥學(xué)上或治療學(xué)上的活性形式。為生成前體藥物，對(duì)藥學(xué)上的活性化合物進(jìn)行修飾以使該活性化合物通過(guò)代謝過(guò)程再生。可以設(shè)計(jì)前體藥物以改變其代謝穩(wěn)定性或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)特性、掩蓋副作用或毒性、改善藥物味道或改變藥物的其它特性或性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員一旦獲知具有藥學(xué)活性的化合物，可通過(guò)體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)過(guò)程和藥物代謝的知識(shí)設(shè)計(jì)該化合物的前體藥物(參見(jiàn)例如Nogrady(1985)MedicinalChemistryABiochemicalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork,388-392)。應(yīng)該理解的是，本文提供的化合物可含有手性中心。該手性中心可是(R)或(S)構(gòu)型，或者可以是其混合物。因此，本文提供的化合物可以是對(duì)映體純的、或者是立體異構(gòu)或非對(duì)映異構(gòu)的混合物。對(duì)于氨基酸殘基，這些殘基可以是L-型或D-型。自然存在的氨基酸殘基的構(gòu)型通常是L-型。沒(méi)有特別說(shuō)明時(shí)，殘基則為L(zhǎng)-型。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"氨基酸"是指a-氨基酸，為外消旋的、或D-構(gòu)型或L-構(gòu)型。氨基酸名稱(chēng)(例如dAla、dSer、dVal等)前的符號(hào)"d"是指氨基酸的D-異構(gòu)體。氨基酸名稱(chēng)前的符號(hào)"dl"是指氨基酸L-異構(gòu)體和D-異構(gòu)體的混合物。應(yīng)該理解的是，本文提供的化合物的手性中心在體內(nèi)可能發(fā)生差向異構(gòu)化。同樣地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，對(duì)于在體內(nèi)發(fā)生差向異構(gòu)化的化合物來(lái)說(shuō)，給予(R)型化合物等同于給予(S)型化合物。本文所用的關(guān)于化合物"相當(dāng)純的"是指足夠均一以至于當(dāng)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員評(píng)價(jià)純度使用的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，例如薄層層析法(TLC)、凝膠電泳法、高效液相色譜法(HPLC)和/或質(zhì)譜法(MS)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，顯示不含有容易檢測(cè)的雜質(zhì)，或足夠純以至于進(jìn)一步純化不會(huì)檢測(cè)到物質(zhì)的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)(例如酶活性和生物活性)的改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于對(duì)化合物進(jìn)行純化以產(chǎn)生化學(xué)上相當(dāng)純的化合物的方法。然而，化學(xué)上相當(dāng)純的化合物可以是立體異構(gòu)體的混合物。在這種情況下，進(jìn)一步純化可增加化合物的比活性。本文所用的"垸基"、"烯基"和"炔基"是指可以是直鏈或支鏈的碳鏈。本文示例性的烷基、烯基和炔基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、異丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基、新戊基、叔戊基、異己基、烯丙基(丙烯基)和炔丙基(丙炔基)，但不限于此。本文所用的"環(huán)垸基"是指飽和的單環(huán)或多環(huán)體系，在某些實(shí)施方式中含有3-10個(gè)碳原子，在其它實(shí)施方式中含有3-6個(gè)碳原子。環(huán)烷基的環(huán)體系可包括一個(gè)或兩個(gè)或更多個(gè)環(huán)，以稠環(huán)、橋環(huán)或螺環(huán)連接的方式連接在一起。例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基，但不限于此。本文所用的"芳基"是指含有6-19個(gè)碳原子的芳香族單環(huán)或多環(huán)基。芳基包括例如未取代的或取代的芴基、未取代的或取代的苯基以及未取代的或取代的萘基，但不限于此。本文所用的"雜芳基"是指單環(huán)或多環(huán)芳香族環(huán)體系，在某些實(shí)施方式中，約為5-15元環(huán)，其中環(huán)體系中的一個(gè)或多個(gè)原子為雜原子，在一個(gè)實(shí)施方式中，環(huán)體系中的1-4個(gè)原子為雜原子，所述雜原子為碳以外的其它元素的原子，包括氮、氧或硫，但不限于此。任選地，雜芳基可稠合到苯環(huán)。雜芳基包括呋喃基、咪唑基、嘧啶基、四唑基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、三唑基、喹啉基和異喹啉基，但不限于此。本文所用的"雜環(huán)基"是指單環(huán)或多環(huán)的非芳香族環(huán)體系，在一個(gè)實(shí)施方式中為3-10元環(huán)，在另一實(shí)施方式中為4-7元環(huán)，在又一實(shí)施方式中為5-6元環(huán)，其中環(huán)體系中的一個(gè)或多個(gè)原子為雜原子，在某些實(shí)施方式中，環(huán)體系中的1-3個(gè)原子為雜原子，所述雜原子為碳以外的其它元素的原子，包括氮、氧或硫，但不限于此。本文所用的"鹵基"、"鹵素"或"鹵化物"是指F、Cl、Br或I。本文所用的擬鹵化物或擬鹵基是其行為基本類(lèi)似于鹵化物的基團(tuán)。該化合物的使用和處理可與鹵化物相同。擬鹵化物包括氰化物、氰酸鹽、硫氰酸鹽、硒氰酸鹽、三氟甲氧基和疊氮化物，但不限于此。本文所用的"鹵垸基"是指一個(gè)或多個(gè)氫原子被鹵素替代的垸基。本文所用的"羧基"是指二價(jià)基-C(O)O-。本文所用的"氨基羰基"是指-C(0)NH2。本文所用的"氨烷基"是指-RNH2，其中R是烷基。本文所用的"垸氧基"和"垸硫基"是指RO-和RS-，其中R是垸基。本文所用的"芳氧基"和"芳硫基"是指RO-和RS-，其中R是芳基。本文所用的"酰胺基"是指二價(jià)基團(tuán)-C(O)NH-。本文所用的"酰肼"是指二價(jià)基團(tuán)-C(O)NHNH-。任意給定取代基的數(shù)目是未定的(例如鹵烷基)，可能存在一個(gè)或多個(gè)取代基。例如，"鹵烷基"可包括一個(gè)或多個(gè)相同或不同的鹵素。除非另有說(shuō)明，本文所用的任何保護(hù)基、氨基酸和其它化合物的縮寫(xiě)均符合它們的慣常用法、公認(rèn)的縮寫(xiě)或IUPAC-IUB委員會(huì)對(duì)于生物化學(xué)命名的規(guī)定(參見(jiàn)(1972)Biochem.11:942-944)。磷酰基轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)的抑制劑的設(shè)計(jì)方法本文提供用于設(shè)計(jì)結(jié)合到和/或抑制GS多肽(特別是腺苷酰化GS多肽、更特別是來(lái)自GSI-(5細(xì)菌的腺苷?；疓S多肽)的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的化合物的方法，包括基于計(jì)算機(jī)的方法。如本文所述，發(fā)明者已假設(shè)(Mn")HHCCV:h2ATP復(fù)合物結(jié)合到腺苷?；疓S的磷酰基轉(zhuǎn)移活性位點(diǎn)，因此產(chǎn)生將ATP的Y-磷酸轉(zhuǎn)移到谷氨酸的，羧酸酯從而形成Y-谷氨酰磷酸中間體的獨(dú)特反應(yīng)機(jī)理。通過(guò)分析(Mi^+V(HC03:h2.ATP復(fù)合物與磷?；D(zhuǎn)移活性位點(diǎn)之間的相互作用，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道如何使用標(biāo)準(zhǔn)分子模擬或其它技術(shù)來(lái)鑒定多肽、擬肽和小分子，該多肽、擬肽和小分子將結(jié)合腺苷?；疓S多肽的磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)從而抑制磷?；D(zhuǎn)移酶的活性。例如，小分子可以與磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)中的某些氨基酸直接作用來(lái)抑制假設(shè)反應(yīng)機(jī)理(例如防止膦甲酸中間體的形成)，或者可在變構(gòu)位點(diǎn)作用，該變構(gòu)位點(diǎn)即不直接參與磷?；D(zhuǎn)移酶活性但化合物與其結(jié)合會(huì)導(dǎo)致(例如通過(guò)誘導(dǎo)分子構(gòu)象發(fā)生變化)活性抑制的分子區(qū)域。"分子模擬"是指基于三維結(jié)構(gòu)信息和作用模型的物理作用的結(jié)構(gòu)和功能的定量和/或定性分析。這包括常規(guī)的基于數(shù)字的分子動(dòng)力學(xué)和能量最小化模型、交互式計(jì)算機(jī)圖形模型、修飾分子力學(xué)模型、距離幾何和基于其它結(jié)構(gòu)的約束模型。通常使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分子模擬以及可以使用己知方法進(jìn)一步優(yōu)化。設(shè)計(jì)特異性(例如以高的親合力)結(jié)合到磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)，例如腺苷?；疓S多肽(例如腺苷酰化GSI-卩多肽)的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的方法，通常也是基于計(jì)算機(jī)，并且涉及使用具有能產(chǎn)生原子模型的程序的計(jì)算機(jī)。使用X射線結(jié)晶數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序?qū)τ谠O(shè)計(jì)這些化合物尤其有用。例如，程序(例如RasMol)可用于產(chǎn)生以下物質(zhì)的三維模型，例如腺苷?；疓S、腺苷?；疓S的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)、或(Mn2+)3.(HC03-)irATP復(fù)合物。計(jì)算機(jī)程序，例如INSIGHT(Accelrys，Burlington,MA)、Auto-Dock(Accelrys)禾口DiscoveryStudio1.5(Accelrys)允許進(jìn)一步處理并且具備引入新結(jié)構(gòu)的能力。可使用例如計(jì)算機(jī)硬件或軟件或二者的組合設(shè)計(jì)化合物。然而，優(yōu)選以一個(gè)或多個(gè)程序式計(jì)算機(jī)上執(zhí)行的一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)程序來(lái)實(shí)施設(shè)計(jì)，每個(gè)程序式計(jì)算機(jī)均包括處理器和至少一個(gè)輸入設(shè)備。計(jì)算機(jī)優(yōu)選還包括數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)(包括非永久性和永久性的存儲(chǔ)器和/或存儲(chǔ)元件)以及至少一個(gè)輸出設(shè)備。使用程序代碼輸入數(shù)據(jù)來(lái)實(shí)現(xiàn)上述功能并產(chǎn)生輸出信息。以已知的方式將輸出信息應(yīng)用到一個(gè)或多個(gè)輸出設(shè)備上。計(jì)算機(jī)例如可以是常規(guī)設(shè)計(jì)的個(gè)人計(jì)算機(jī)、微機(jī)或工作站。優(yōu)選以高水平的過(guò)程化程序設(shè)計(jì)語(yǔ)言或面向?qū)ο蟮某绦蛟O(shè)計(jì)語(yǔ)言來(lái)執(zhí)行每個(gè)程序從而與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行交流。然而，若需要，可以匯編語(yǔ)言或機(jī)器語(yǔ)言來(lái)執(zhí)行程序。在任何情況下，所述語(yǔ)言可以是編譯型語(yǔ)言或解釋型語(yǔ)言。優(yōu)選將每個(gè)計(jì)算機(jī)程序存儲(chǔ)使用通用的或?qū)Ｓ玫目删幊逃?jì)算機(jī)即可讀取的存儲(chǔ)介質(zhì)或設(shè)備(例如ROM或磁盤(pán))上。當(dāng)程序被計(jì)算機(jī)讀取時(shí)，該計(jì)算機(jī)程序的作用是設(shè)置和操作計(jì)算機(jī)執(zhí)行本文所述的程序。還可通過(guò)設(shè)置計(jì)算機(jī)程序的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法，其中如此設(shè)置的所述存儲(chǔ)介質(zhì)使計(jì)算機(jī)以特定和預(yù)設(shè)的方式操作從而實(shí)現(xiàn)本文所述的功能。例如，在設(shè)計(jì)試驗(yàn)化合物的方法中需要計(jì)算機(jī)的步驟可包括(a)例如通過(guò)鍵盤(pán)、磁盤(pán)或磁帶向輸入設(shè)備輸入數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)(例如原子坐標(biāo))限定結(jié)合到第二分子或復(fù)合物的第一分子或復(fù)合物的三維(3-D)結(jié)構(gòu)。所述第一分子或復(fù)合物例如是GS多肽、腺苷?；疓S多肽、GS多肽或腺苷?；疓S多肽的片段、構(gòu)成GS多肽或腺苷?；疓S多肽活性位點(diǎn)(例如磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn))的一組殘基，它們中的任一個(gè)可包括一個(gè)或多個(gè)結(jié)合的ATP、ADP、谷氨酰胺或谷氨酸分子；所述第二分子或復(fù)合物例如是ATP、ADP、(Mn2+)HHC03-)wATP復(fù)合物、或該復(fù)合物的一部分；以及(b)使用處理器測(cè)定參與結(jié)合到第二分子或復(fù)合物的第一分子或復(fù)合物上的位點(diǎn)的3-D結(jié)構(gòu)(例如原子模型)。從由此方式獲得的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員例如能在某些殘基上并且以某種方式(例如氫鍵作用、靜電相互作用和/或范德華相互作用)來(lái)設(shè)計(jì)和制造具有適合3-D結(jié)構(gòu)的抑制性化合物(例如肽、非肽小分子、擬肽和適體(例如核酸適體))。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)與第一分子的某些殘基可相互作用的抑制性化合物。應(yīng)該注意的是，盡管原始的GS3-D結(jié)構(gòu)來(lái)自一個(gè)種，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如同源性比對(duì)或分子模擬來(lái)確定其它種的GS所關(guān)注的相應(yīng)殘基。此外，如果獲得用于候選化合物的計(jì)算機(jī)可用的3-D數(shù)據(jù)(例如，X-射線結(jié)晶數(shù)據(jù))，結(jié)合上述基于計(jì)算機(jī)的步驟(a)和(b)，可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)以下基于計(jì)算機(jī)的步驟(C)例如通過(guò)鍵盤(pán)、磁盤(pán)或磁帶向輸入設(shè)備輸入限定候選化合物三維(3-D)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)(例如原子坐標(biāo))；(d)使用處理器測(cè)定所述候選化合物的3-D結(jié)構(gòu)(例如原子模型)；(e)使用所述處理器確定候選化合物是否結(jié)合到第一分子或復(fù)合物上的位點(diǎn)，或抑制膦甲酸中間體的形成，或防止例如(Mn2+)HHC(V)2.ATP復(fù)合物的結(jié)合；以及(f)鑒定候選化合物為抑制第一和第二分子或復(fù)合物之間相互作用、或抑制膦甲酸中間體的形成、或防止例如(Mn")3乂HC03—;h2ATP復(fù)合物結(jié)合的化合物。該方法可包括另外的步驟，即向輸出設(shè)備輸出該化合物的3-D結(jié)構(gòu)的模型。此外，可將候選化合物的3-D數(shù)據(jù)與例如在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)中存儲(chǔ)的3-D結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)相比較。例如，在有些實(shí)施方式中，產(chǎn)生腺苷?；疓S多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的試驗(yàn)抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助方法可包括(a)向輸入設(shè)備輸入數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)包括結(jié)合到GS多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的(M^+)y(HC03':h2ATP復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元的結(jié)構(gòu)(例如，包括構(gòu)成磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的一組殘基的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù))；(b)使用處理器將試驗(yàn)抑制劑分子對(duì)接到所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)內(nèi)；以及(c)基于所述對(duì)接，確定試驗(yàn)抑制劑分子是否抑制磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的活性。使用其它基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)/模擬技術(shù)(參見(jiàn)例如JacksonC1997)Se脂V^As/"0"co/ogy24:L164-172;和Jones等人(1996)MedC7zem.39:904-917)，由本文所述化合物的結(jié)構(gòu)信息還可交互設(shè)計(jì)本發(fā)明的化合物。還可通過(guò)例如使用計(jì)算機(jī)模擬鑒定候選化合物以將本發(fā)明的化合物和多肽鑒定為在空間上且選擇性地(即以高的親合力)與磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)相配合。然后，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞抑制方法、或無(wú)細(xì)胞酶抑制方法、或酶抑制方法來(lái)檢測(cè)上述鑒定的候選化合物。本文描述了示例性的方法?？捎赏ㄟ^(guò)各種方法獲得的數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)定生物大分子(例如GS、腺苷?；疓S、核酸、碳水化合物和脂質(zhì))的3-D結(jié)構(gòu)。已經(jīng)最有效地用于評(píng)價(jià)蛋白3-D結(jié)構(gòu)的這些方法包括(a)X射線晶體法；(b)核磁共振(NMR)光譜法；(c)大分子上確定位點(diǎn)之間形成的物理距離約束的分析，例如蛋白上殘基之間的分子內(nèi)化學(xué)交聯(lián)(例如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US00/14667，其公開(kāi)內(nèi)容以整體引入本文作為參考)，以及(d)基于所關(guān)注蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)知識(shí)的分子模擬方法，例如使用計(jì)算機(jī)程序例如MONSSTER(ModelingOfJ^ewStructuresfromSecondaryand工ertiaryRestraints)(參見(jiàn)例如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US99/11913，其公開(kāi)內(nèi)容以整體引入本文作為參考)的同源建模技術(shù)、線程算法或從頭開(kāi)始結(jié)構(gòu)建模。還可使用符合本發(fā)明的其它分子模擬技術(shù)(例如Cohen等人(19%)J.Med.Chem.33:883-894;Navia等人(1992)CurrentOpinionsinStructuralBiology,2，202-210，其公開(kāi)內(nèi)容以整體引入本文作為參考)。所有這些方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)均可受計(jì)算機(jī)分析的指導(dǎo)。還可用于本發(fā)明方法、但目前不提供有關(guān)生物分子原子水平結(jié)構(gòu)詳情的其它光譜法，包括圓二色譜法、熒光色譜法以及紫外/可見(jiàn)光吸收光譜法。優(yōu)選的分析方法是X射線晶體法。下面對(duì)該方法和NMR光譜法進(jìn)行描述。X射線晶體法X射線晶體法是在所關(guān)注區(qū)域的晶體中，通過(guò)圍繞原子核的電子云，基于特征波長(zhǎng)的X射線衍射。該技術(shù)使用純化的生物大分子(但是這些生物大分子常常包括溶劑組分、輔因子、底物或其它配體)的晶體來(lái)測(cè)定構(gòu)成特定生物大分子的原子的接近原子級(jí)的分辨率。通過(guò)X射線晶體法揭示大分子3-D結(jié)構(gòu)的先決條件是能強(qiáng)烈衍射X射線的有序晶體。該方法將一束X射線照射到許多相同分子的有序、重復(fù)的陣列以使X射線由該陣列以可恢復(fù)單個(gè)分子結(jié)構(gòu)的模式衍射。有序晶體，例如球蛋白分子的有序晶體是具有不規(guī)則表面的、大的、球形物或橢圓形物。在單個(gè)分子之間，晶體含有大孔道。這些通常占到晶體體積一半以上的孔道被無(wú)序的溶劑分子所填充，蛋白分子只在少數(shù)小區(qū)域處彼此接觸。這就是為何晶體內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)通常與溶液中蛋白結(jié)構(gòu)相同的一個(gè)原因。GS已被多次結(jié)晶化，例如來(lái)自鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌的GS(Almassy，R.J.等人(1986)Nature(London)323:304-309，Liaw，S-H.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:4996-5000);在活性位點(diǎn)中帶有甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的GS(Liaw，S-H和D.Eisenberg(1994)J.Biol.Chem.33:675-681);在5個(gè)結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)中帶有AMPPNP、谷氨酸、L-蛋氨酸-S-亞砜酰亞胺、谷氨酰胺和ADP的GS(Liaw，S-H.，Jun，G.和D.Eisenberg(1993)ProteinScience,2:470-471);以及在活性位點(diǎn)中帶有ATP的GS(Liaw，S-H.，Jun，G.禾口D.Eisenberg(1994)Biochemistry33:11184-11188)。以下描述或本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知獲得GS或GS片段包括腺苷?；腉S的方法。晶體的形成依賴(lài)于一些不同的參數(shù)，包括pH、溫度、生物大分子濃度、溶劑和沉淀劑的性質(zhì)、以及存在的添加離子或蛋白配體。需要許多常規(guī)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)以篩選用于所有這些參數(shù)的組合，所述參數(shù)的組合可得到適于X射線衍射分析的晶體。結(jié)晶自動(dòng)機(jī)械可以使結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的大量再現(xiàn)性工作實(shí)現(xiàn)自動(dòng)操作并得到加速(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,790,421)。多肽結(jié)晶發(fā)生在多肽濃度超過(guò)其最大溶解度的溶液中(即，多肽溶液是過(guò)飽和的)。該溶液可通過(guò)降低多肽濃度恢復(fù)平衡，所述降低多肽濃度優(yōu)選通過(guò)多肽晶體的沉淀。通常，通過(guò)添加改變多肽表面電荷或干擾多肽與本體水之間相互作用的試劑以促進(jìn)引起結(jié)晶的締合，誘導(dǎo)多肽從過(guò)飽和溶液中結(jié)晶。結(jié)晶通常在4。C到20。C之間進(jìn)行。常常使用已知用作"沉淀劑"的物質(zhì)，通過(guò)在多肽分子周?chē)纬稍谀芰可喜焕某恋砗谋M層，來(lái)減小多肽在濃溶液中的溶解度(Weber(1991)AdvancesinProteinChemistry,41:1-36)。除沉淀劑之外，有時(shí)還向多肽結(jié)晶溶液添加其它物質(zhì)。這些物質(zhì)包括調(diào)節(jié)溶液pH的緩沖劑和降低多肽溶解度的鹽。本領(lǐng)域已知有各種沉淀劑，包括以下所列乙醇、3-乙基-2,4戊二醇和許多聚乙二醇類(lèi)例如聚乙二醇(PEG)。沉淀溶液可包括例如13-24%PEG4000、5-41%硫酸銨和1.0-1.5M氯化鈉，并且pH在5-7.5范圍。其它添加劑可包括0.1MHepes、2-4%丁醇、0.1M或20mM醋酸鈉、50-70mM擰檬酸、120-130mM磷酸鈉、lmM乙二胺四乙酸(EDTA)和lmM二硫蘇糖醇(DTT)。將這些試劑在緩沖液中制備，并以各種組合逐滴添加到結(jié)晶緩沖液中。通常使用的多肽結(jié)晶方法包括以下技術(shù)間歇式結(jié)晶、懸滴式結(jié)晶、晶種引發(fā)式結(jié)晶以及透析。在上述每種方法中，重要的是通過(guò)保持溶液過(guò)飽和而形成晶核后促進(jìn)連續(xù)結(jié)晶。在間歇式結(jié)晶方法中，多肽與沉淀劑混合以達(dá)到過(guò)飽和，將容器密封并擱置直至晶體出現(xiàn)。在透析方法中，將多肽保留在密封透析膜中，將所述密封透析膜置于含有沉淀劑的溶液中。膜的整體平衡增大了多肽和沉淀劑的濃度，由此使多肽達(dá)到過(guò)飽和水平。在優(yōu)選的懸滴式結(jié)晶技術(shù)(McPherson(1976)J.Biol.Chem.，251:6300-6306)中，將沉淀劑添加到多肽濃溶液中生成初始多肽混合物。多肽和沉淀劑的濃度應(yīng)為使多肽在此初始形式下不結(jié)晶。將一小滴該混合物置于載玻片上，將所述載玻片倒置并懸掛于第二溶液的lfc液池上方。然后將系統(tǒng)密封。通常，第二溶液含有較高濃度的沉淀劑或其它脫水劑。沉淀劑濃度的差異使該蛋白溶液的蒸汽壓比第二溶液高。因?yàn)楹袃煞N溶液的系統(tǒng)是密封的，所以建立平衡，水由多肽混合物轉(zhuǎn)移到第二溶液。該平衡使多肽溶液中的多肽和沉淀劑的濃度增大。在多肽和沉淀劑的臨界濃度，可形成多肽的晶體。結(jié)晶的另一方法將晶核形成位點(diǎn)引進(jìn)多肽濃溶液。通常，制備多肽濃溶液并將多肽晶種引入該溶液。如果多肽和任意沉淀劑的濃度適宜，晶種會(huì)提供晶核形成位點(diǎn)，較大晶體在此晶核形成位點(diǎn)周?chē)纬?。此外，結(jié)晶的另一方法是電結(jié)晶法，在該方法中，利用在電極鄰近的Helmholtz層內(nèi)自動(dòng)排列(self-align)的蛋白大分子的偶極矩(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,597,457)。有些蛋白可能抗拒結(jié)晶。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用幾種技術(shù)誘導(dǎo)結(jié)晶。例如，除去蛋白氨基或羧基端的柔性多肽部分可促進(jìn)生成結(jié)晶蛋白樣品?？墒褂梅肿由飳W(xué)技術(shù)或使用蛋白酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶處理蛋白以除去這些部分。在衍射實(shí)驗(yàn)中，由X射線源獲取窄且平行的X射線光束并照射到晶體上以產(chǎn)生衍射光束。入射主射束對(duì)大分子和溶劑分子均造成損害。因此，使晶體冷卻(例如冷卻到-220。C至-50。C)以延長(zhǎng)其壽命。主射束必須從多個(gè)方向射擊晶體以產(chǎn)生所有可能的衍射點(diǎn)，因此，在實(shí)驗(yàn)期間，晶體在光束內(nèi)旋轉(zhuǎn)。將衍射點(diǎn)記錄在膠片上或通過(guò)電子檢測(cè)器記錄。必須將曝光的膠片在掃描設(shè)備內(nèi)進(jìn)行數(shù)字化和量化，而電子檢測(cè)器將其檢測(cè)到的信號(hào)直接輸入計(jì)算機(jī)。電子區(qū)域檢測(cè)器顯著減少采集和測(cè)量衍射數(shù)據(jù)所需的時(shí)間。以膠片上的點(diǎn)得以記錄的每束衍射光使用三種性質(zhì)來(lái)定義振幅，根據(jù)點(diǎn)的強(qiáng)度來(lái)測(cè)量；波長(zhǎng)，根據(jù)X射線源來(lái)設(shè)定；以及相位，其在X射線實(shí)驗(yàn)中損失。為了測(cè)定引起衍射光束的原子位置，所有衍射光束均需要所有這三種性質(zhì)。測(cè)定相位的一種方式叫作多重同晶置換(MIR)，它需要將外源X射線散射體(例如金屬原子等重原子)引入晶體的晶胞。關(guān)于MIR更為詳細(xì)的描述，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,093,573的第15欄。原子坐標(biāo)是指由涉及數(shù)據(jù)傅立葉合成的數(shù)學(xué)方程式得到的笛卡爾坐標(biāo)(x、y和z位置)，所述數(shù)據(jù)是由晶體形式的所關(guān)注的生物大分子的原子(散射中心)的單色X射線衍射而獲得的圖案得到的。衍射數(shù)據(jù)用于計(jì)算晶體內(nèi)重復(fù)單元(晶胞)的電子密度圖。電子密度圖用于確定晶體的晶胞內(nèi)各個(gè)原子的位置(原子坐標(biāo))。因?yàn)闅w屬于原子坐標(biāo)的絕對(duì)值可通過(guò)延x、y和/或z軸一起或分別轉(zhuǎn)動(dòng)和/或平移而改變，但卻保持原子之間的相對(duì)空間關(guān)系不變，因此原子坐標(biāo)的絕對(duì)值表示原子之間的空間關(guān)系。因此，生物大分子(例如蛋白)，其一組絕對(duì)原子坐標(biāo)值可通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)和/或平移調(diào)節(jié)為與另一樣品分析的一組在先測(cè)定值相符，可認(rèn)為該生物大分子的原子坐標(biāo)與由該另一樣品獲得的原子坐標(biāo)相同。由美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,093,573以及國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US99/18441、PCT/US99/11913和PCT/US00/03745可獲得有關(guān)X射線晶體法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。NMR光譜法X射線晶體法需要所關(guān)注的大分子的單晶，但是NMR測(cè)量卻在接近生理?xiàng)l件下的溶液中進(jìn)行。然而，NMR得到的結(jié)構(gòu)沒(méi)有晶體得到的結(jié)構(gòu)那樣詳細(xì)。雖然NMR光譜法的使用直至最近仍限于闡述相對(duì)小的分子(例如100-150個(gè)氨基酸殘基的蛋白)的3-D結(jié)構(gòu)，但包括對(duì)所關(guān)注的分子進(jìn)行同位素標(biāo)記以及橫向弛豫-優(yōu)化譜法(TROSY)的最新進(jìn)展使得已將該方法擴(kuò)展到分析更大的分子，例如110kDa分子量蛋白(Wider(2000)BioTechniques，29:1278-1294)。NMR使用射頻輻射來(lái)檢驗(yàn)由特定射頻來(lái)脈沖的均一磁場(chǎng)內(nèi)的磁性原子核的環(huán)境。該脈沖干擾具有非零自旋核的那些原子的核磁化。當(dāng)系統(tǒng)恢復(fù)平衡時(shí)，檢測(cè)瞬態(tài)時(shí)域信號(hào)。將該瞬態(tài)信號(hào)的傅立葉變化為頻域獲得一維NMR光譜。這些光譜的峰代表各種活性核的化學(xué)位移。原子的化學(xué)位移由其局部電子環(huán)境來(lái)決定。二維NMR實(shí)驗(yàn)可提供有關(guān)在結(jié)構(gòu)和三維空間中各種原子接近程度的信息。通過(guò)進(jìn)行一些二維(有時(shí)是三維或四維)NMR實(shí)驗(yàn)以及使用所得信息作為系列蛋白折疊模擬中的約束因素可測(cè)定蛋白結(jié)構(gòu)。關(guān)于NMR光譜法的更多信息，包括關(guān)于如何將NMR實(shí)驗(yàn)獲得的原始數(shù)據(jù)用于測(cè)定大分子3-D結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述可參見(jiàn)下列文獻(xiàn)ProteinNMRSpectroscopy,PrinciplesandPractice,J.Cavanagh等人，AcademicPress,SanDiego，1996;Gronenborn等人(1990)Anal.Chem.62(1):2-15;和Wider(2000)，同上。使用上述計(jì)算機(jī)，由X射線結(jié)晶圖的數(shù)據(jù)和/或NMR數(shù)據(jù)，可使用任何可用的方法構(gòu)建所關(guān)注的GS區(qū)域的3-D模型。通過(guò)輸入設(shè)備輸入計(jì)算機(jī)的分析數(shù)據(jù)點(diǎn)和通過(guò)使用已知軟件包的處理器可構(gòu)建該模型，所述軟件包例如CATALYST(Accelrys)、INSIGHT(Accelrys)禾QCeriusII、HKL、MOSFILM、XDS、CCP4、SHARP、PHASES、HEAVY、XPLOR、TNT、NMRCOMPASS、麗RPIPE、DIANA、NMRDRAW、FELIX、VNMR、MADIGRAS、QUANTA、BUSTER、SOLVE、O、FRODO或CHAIN。通過(guò)計(jì)算機(jī)輸出設(shè)備，使用可利用的系統(tǒng)，可使由這些數(shù)據(jù)構(gòu)建的模型顯示出來(lái)，所述可用的系統(tǒng)例如SiliconGraphics、EvansandSutherland、SUN、HewlettPackard、AppleMacintosh、DEC、IBM或Compaq。設(shè)計(jì)本發(fā)明的化合物一旦使用上述方法中的任一種建立了結(jié)合到所關(guān)注GS多肽區(qū)域(例如GS磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)，包括腺苷?；疓S磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn))的化合物的3-D結(jié)構(gòu)，就可制備具有與所鑒定的化合物基本相同的3-D結(jié)構(gòu)(或包括結(jié)構(gòu)基本相同的域)的化合物。在本文中，"具有基本相同的3-D結(jié)構(gòu)"是指具有類(lèi)似于所鑒定的化合物的氫鍵和疏水性特征的化合物。在有些情況下，具有與所鑒定的化合物基本相同的3-D結(jié)構(gòu)的化合物可包括雜環(huán)體系以及在氫鍵區(qū)域附近顯示疏水性質(zhì)的區(qū)域，盡管該疏水性質(zhì)的區(qū)域可具有某些氫鍵性質(zhì)。這類(lèi)化合物可包括但不限于能在空間上賦予空間體積的取代基，該空間另外可包封具有所鑒定化合物特征的錳和碳酸鹽配位的磷酸骨架，例如(Mn")3乂HC03';h2ATP。具備上述的3-D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)并且知道所關(guān)注區(qū)域的化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如，對(duì)蛋白而言是氨基酸序列)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道如何制造具有上述性質(zhì)的化合物。這些方法包括化學(xué)合成法，對(duì)于蛋白而言是重組法(參照上文)。例如，可使用被適當(dāng)置于化合物內(nèi)以形成二硫鍵的半胱氨酸殘基來(lái)將化合物或化合物的域約束為適當(dāng)?shù)?-D結(jié)構(gòu)。此外，在本身是多肽或包括多肽域的化合物中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道為了產(chǎn)生例如多肽骨架中的a-螺旋、p結(jié)構(gòu)、或轉(zhuǎn)角或彎曲，所述化合物包括何種氨基酸以及以何種序列來(lái)包含這些氨基酸。雖然基于計(jì)算機(jī)的方法不是必需的，但其可用于設(shè)計(jì)本發(fā)明的化合物。適合的計(jì)算機(jī)程序包括InsightII(Accelrys)、CATALYST(Accelrys)、LUDI(Accelrys.，SanDiego，CA)、Aladdin(DaylightChemicalInformationSystems,Irvine,CA);和LEGEND[Nishibata等人(1985)J.Med.Chem.36(20):2921-2928]。本身是肽的本發(fā)明化合物也包括上述結(jié)構(gòu)，但是經(jīng)修飾后才可在體內(nèi)使用，即通過(guò)在氨基和/或羧基端添加阻斷劑以利于相關(guān)多肽在體內(nèi)的存活。這對(duì)于那些在細(xì)胞攝入之前肽末端容易被蛋白酶降解的情形很有用。該阻斷劑可以包括但不限于附加的相關(guān)的或不相關(guān)的肽序列，這些序列可被連接到將要給予的肽的氨基和/或羧基端殘基上。這可在合成肽的過(guò)程中通過(guò)化學(xué)方式來(lái)完成，或者通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方法使用重組DNA技術(shù)來(lái)完成?；蛘?，可將阻斷劑(例如焦谷氨酸)或本領(lǐng)域已知的其它分子連接到氨基端殘基和/或羧基端殘基，或者可用不同部分來(lái)取代氨基端的氨基或羧基端的羧基。此外，在給予前，可將肽化合物共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)于藥學(xué)上可接受的"載體"蛋白。另外所關(guān)注的是，基于本發(fā)明的肽化合物的氨基酸序列而設(shè)計(jì)的擬肽化合物。擬肽化合物是具有與所選肽的三維構(gòu)象基本相同的三維構(gòu)象(即"肽基序")的合成化合物。擬肽化合物可具有增強(qiáng)其體內(nèi)效用的附加特性，例如增加細(xì)胞通透性和延長(zhǎng)生物半衰期。擬肽通常具有部分非肽的骨架或完全非肽的骨架，但是具有與其所基于的肽內(nèi)存在的氨基酸殘基的側(cè)基相同的側(cè)基。在構(gòu)建抗蛋白酶的擬肽中，本領(lǐng)域已知的幾類(lèi)化學(xué)鍵通常是有用的肽鍵取代物，這些化學(xué)鍵例如酯鍵、硫酯鍵、硫代酰胺鍵、逆酰胺(retroamide)鍵、還原羰基鍵、二亞甲基鍵和酮亞甲基(ketomethylene)鍵。作為(M^+)3'(HC(V;h2ATP復(fù)合物的類(lèi)似物和/或可結(jié)合到磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的小分子化合物具有特殊意義。以下提供該特殊種類(lèi)小分子的其它信息以及制備這些分子的合成方法。篩選分析以下還提供用于鑒定化合物的體外方法，所述化合物抑制GS活性，包括腺苷?；疓S活性，例如腺苷?；疓S多肽的磷酰基轉(zhuǎn)移酶活性。腺苷酰化GS抑制的特異性基于以下事實(shí)即腺苷?；疓S與去腺苷?；疓S的反應(yīng)機(jī)理、活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)中間體的結(jié)構(gòu)不同。在篩選化合物的方法中，GS多肽(包括腺苷?；疓S多肽)在對(duì)腺苷酰化GS多肽發(fā)生磷?；D(zhuǎn)移有效的特定分析條件下可與試驗(yàn)化合物接觸，所篩選的化合物抑制(Mi^+V(HC(V;h2ATP復(fù)合物或其一部分通過(guò)膦甲酸中間體結(jié)合到GS多肽，例如腺苷酰化GS多肽，特別是腺苷酰化GS多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)。評(píng)價(jià)腺苷?；疓S活性的分析法通常與去腺苷酰化GS的分析法不同。可在pH6.3和HC(V:Mn2+:ATP的濃度比為12:3:1的條件下分析腺苷?；疓S，而在pH7.2和Mg2+:ATP的濃度比為1:1的條件下分析去腺苷?；疓S。腺苷酰化GS的典型分析條件為20mM咪唑緩沖液(pH6.3)、lmMATP、3mMMnCl2、12mMNaHC03、4mMNH4C1和2mM谷氨酸鈉；而去腺苷?；疓S的典型分析條件為20mM咪唑緩沖液(pH7.2)、lmMATP、lmMMgCl2、12mMNaCl、4mMNH4C1和2mM谷氨酸鈉。上述分析可在37。C下進(jìn)行?？稍谠囼?yàn)化合物存在和不存在的條件下測(cè)量ATP的水解、ADP的產(chǎn)生和/或谷氨酸的利用和谷氨酰胺的產(chǎn)生。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，一種體外篩選試驗(yàn)化合物以確定其是否抑制腺苷?；疓S多肽的磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的方法，包括(a)在對(duì)磷酰基轉(zhuǎn)移酶活性有效的條件下，使腺苷?；疓S多肽與試驗(yàn)化合物接觸；以及(b)確定相對(duì)于還沒(méi)有與試驗(yàn)化合物接觸過(guò)的腺苷?；疓S多肽的活性，所述腺苷?；疓S多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶活性是否有所降低?？赏ㄟ^(guò)膦甲酸中間體來(lái)調(diào)節(jié)磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性。任何抑制活性可與試驗(yàn)化合物抑制去腺苷酰化GS多肽所獲得的抑制相比較?；衔锖退幬锝M合物本文還提供化合物，例如，本文所述的藥物組合物所包含的化合物和/或用于本文所述方法中的化合物。如本文和以下實(shí)施例中所示的那樣，基于GS的磷?；D(zhuǎn)移位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和機(jī)理信息，設(shè)計(jì)和制備一些類(lèi)嘧啶和類(lèi)嘌呤分子和相關(guān)的類(lèi)似物以評(píng)價(jià)它們對(duì)腺苷酰化GS磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的抑制作用。例如，考慮了一些基于腺嘌呤的類(lèi)似物，在6元環(huán)的周?chē)哂锌臻g特征、氫鍵網(wǎng)絡(luò)和極性圖的不同組合。這些類(lèi)似物包括5，6稠合的雙環(huán)化合物、6,6稠合的雙環(huán)化合物、6,6雙環(huán)化合物和具有金屬配位能力的腺嘌呤類(lèi)似物。該化合物可用于抑制腺苷?；疓S活性；用于抑制具有GSI-P基因的細(xì)菌(包括結(jié)核分枝桿菌)的生長(zhǎng)；以及用于治療、預(yù)防或改善受到、可能受到、或懷疑受到細(xì)菌感染(例如感染了結(jié)核分枝桿菌)的哺乳動(dòng)物。因此，在有些實(shí)施方式中，用于本文所述的方法或包含在本文所述組合物中的化合物可以是如式I:表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中&是氫、鹵基、ORs或NR6R7;R2是氫、鹵基或NR7Rs;R3是氫、鹵基或NR6R7;R4是SR5、NR6R或H;Rs是H、取代的或未取代的C1-C20垸基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或是取代的或未取代的芳基或雜芳基；以及R6、R7和Rs每個(gè)獨(dú)立地選自H;酰基；羥基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)烷基、雜芳基或雜環(huán)基；或NR7Rs可以是N:0的形式，其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。在有些實(shí)施方式中，R6和/或R7和/或R8可以是取代的垸基或環(huán)垸基，例如，羥基取代的環(huán)烷基，例如碳水化合物部分。在有些實(shí)施方式中，^是氯。在有些實(shí)施方式中，R2是NR7Rs。在有些實(shí)施方式中，R4是H。在有些實(shí)施方式中，Ri是NR6R7，其中R6是H、R7是甲基、芐基、2-羥乙基、4-溴苯基或2-吡啶基。在有些實(shí)施方式中，R2是亞硝基、氨基、溴、氨垸基或氨芳基，例如芐氨基。在有些實(shí)施方式中，R3是氯、二甲氨基、吡咯垸基、嗎啉基或2-(吡咯垸-l-基)羧酸酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，R4是H，Ri是NR6R7，其中R6是H，R7是芐基，R2是亞硝基，R3是氯。在另一實(shí)施方式中，R4是H，R!是NR6R7，其中R6是H，R7是2-羥乙基，R2是氨基，R3是吡咯烷基。如下面進(jìn)一步所述，化合物97、105和111也是式I的具體實(shí)施方式。可使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)合成法制備如式I表示的化合物，如以下實(shí)施例所示的那樣。在有些情況下，可以是如式II:表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中R^是氫、鹵基、ORs或皿6R7;R4是氫、SR5、NR6R7或ORs;Rs是H，取代的或未取代的C1-C20的烷基、烯基或炔基，其中所述垸基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；R6、R7和R8每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；涣u基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)垸基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)垸基、雜芳基或雜環(huán)基；或NR7Rs可以是N:0的形式；R9是H、鹵基或取代的或未取代的垸基、芳基、雜環(huán)基、雜芳基、OR5或NR6R7;X和Y可以獨(dú)立地是N或CH;以及其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。在有些實(shí)施方式中，Ri是OH或NH2。在有些實(shí)施方式中，R4是H、OH或NH2。在有些實(shí)施方式中，R6是H或垸基。在有些實(shí)施方式中，R9是取代的烷基、烯基、炔基或芳基。在有些實(shí)施方式中，R9是氨基取代的垸基。在一個(gè)實(shí)施方式中，R4是H，Re是芐基，R9是H和R^是NR6R7，其中R6是甲基和R7是甲基。在另一實(shí)施方式中，R4是NH2，！^是OH，R6是H，R9是苯基。以下進(jìn)一步記載的化合物81是如式II表示的化合物的例子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)合成方法和/或以下實(shí)施方式所述的方案可制備如式II表示的化合物。在有些實(shí)施方式中，例如可通過(guò)適合的取代法和閉環(huán)法由式I化合物衍生得到如式II表示的化合物?；衔铮缬糜诒疚乃龇椒ㄖ械幕衔?，還可以是如式III表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中Ri是氫、鹵基、ORs或NR6R7;R4是氫、SR5、NR6R7或OR5;Rs是H、取代的或未取代的C1-C20垸基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；Re和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；?、羥基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)垸基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)烷基、雜芳基或雜環(huán)基；X、Y可以獨(dú)立地是CH或N;其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。在有些實(shí)施方式中，Ri是OH或H。在有些實(shí)施方式中，R4是H、OH或NH2。在有些實(shí)施方式中，R6是OH或H。在有些實(shí)施方式中，R7是H或取代的烷基。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)合成方法可制備式III表示的化合物。在有些情況下，可將式I表示的化合物轉(zhuǎn)化為式III化合物，例如以下實(shí)施例所示的那樣。在有些實(shí)施方式中，化合物可以是如式IV表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中Rn是氫或取代的或未取代的Cl-C20垸基、烯基或炔基，其中所述垸基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；其中l(wèi)-3個(gè)取代基允許在任何取代的Ru部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、卣基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H;以及Ru是未取代的或取代的垸基或烯基、或未取代的或取代的芳基，其中Ru取代基可選自NH2、OH、COOH、CHO、NCHO、CONH2、齒基、OR5、C02R5|nNR6R7，其中Rs是H、取代的或未取代的C1-C20垸基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；以及R6和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；⒘u基；以及取代的或未取代的垸基、環(huán)垸基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)烷基、雜芳基或雜環(huán)基；以及其中l(wèi)-3個(gè)取代基允許獨(dú)立地在R5、R6或R7取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和SOsH。在有些實(shí)施方式中，Rn是垸基或H。在有些實(shí)施方式中，Ru是未取代的或取代的芳基或烯基，所述芳基或烯基例如具有l(wèi)-10個(gè)C原子。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)合成方法可制備如式IV表示的化合物，例如以下實(shí)施例所示的那樣。在有些實(shí)施方式中，化合物可以是如式V:表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中Ri是氫、鹵基、ORs或NR6R7;Rs是H、取代的或未取代的C1-C20烷基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；R6和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；⒘u基；以及取代的或未取代的垸基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)垸基、雜芳基或雜環(huán)基；Ru獨(dú)立地是取代的或未取代的垸基、芳基、雜芳基或環(huán)烷基；Rw是H或NHR15，其中R15獨(dú)立地是取代的或未取代的垸基、芳基、雜芳基或環(huán)垸基；X和Y可以獨(dú)立地是N或CH;以及其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。在有些實(shí)施方式中，R,是H。在有些實(shí)施方式中，Ru是取代的或未取代的芳基。在有些實(shí)施方式中，Rw是取代的或未取代的芳基、烷基或環(huán)烷基。在有些實(shí)施方式中，X和Y均是CH。如下面進(jìn)一步所述，化合物117是如式V化合物的一個(gè)例子。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)合成方法可制備如式V表示的化合物。在有些情況下，例如以下實(shí)施方式所示的那樣，使用芳香雜環(huán)胺、醛和異氰化物，通過(guò)3組分偶聯(lián)反應(yīng)可制備如式V表示的化合物。在有些實(shí)施方式中，化合物可以是如式VI<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中:Ru是氫或取代的或未取代的Cl-C20烷基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；其中l(wèi)-3個(gè)取代基允許在任何取代的Ru部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和SOsH;以及Ru是未取代的或取代的烷基或烯基、或未取代的或取代的芳基，其中Ru取代基可選自NH2、OH、COOH、CHO、NCHO、CONH2、鹵基、OR5、C。2R5禾口NR6R7，其中Rs是H、取代的或未取代的C1-C20烷基、烯基或炔基，其中所述垸基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；以及R6和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；?、羥基；以及取代的或未取代的垸基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或Rs和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)烷基、雜芳基或雜環(huán)基；以及其中1-3個(gè)取代基允許獨(dú)立地在R5、R6或R7取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S。3H。在有些實(shí)施方式中，Ri3是H。在有些實(shí)施方式中，Ru是取代的或未取代的芳基或烯基。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)合成方法可制備如式VI表示的化合物。在有些實(shí)施方式中，如以下實(shí)施例所示的那樣，例如通過(guò)適合的水解法，可以由式IV化合物衍生得到如式VI表示的化合物。化合物，例如用于本文所述方法的化合物，還可以是如式VII表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中R6和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；⒘u基；以及取代的或未取代的垸基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)烷基、雜芳基或雜環(huán)基；以及Rw是H;?；?、取代的或未取代的烷基、環(huán)垸基、芳基或雜芳基；其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。在有些實(shí)施方式中，R6是H。在有些實(shí)施方式中，R"是H。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)合成方法可制備如式VII表示的化合物，例如以下實(shí)施例所示的那樣?；衔锏闹苽溆糜诒疚奶峁┑慕M合物和方法中的化合物可由商購(gòu)(例如Sigma、Aldrich、RiedeldeHah、Merck和Acros)獲得或可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法或通過(guò)本文所示的方法來(lái)制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)這些方法的常規(guī)改變，使用適合的原料能夠制備本文所用的所有化合物。藥物組合物的配制本文提供的藥物組合物含有治療有效量的一種或多種本文所提供的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體，所述化合物用于治療、預(yù)防或改善與細(xì)菌感染(例如含有GSI-(3基因的細(xì)菌，例如結(jié)核分枝桿菌)有關(guān)的一種或多種癥狀，與細(xì)菌感染有牽連或懷疑受到細(xì)菌感染的障礙、病癥或失調(diào)。適于給予本文提供的化合物的藥物載體包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于特定給予方式的任何載體。此外，可將所述化合物作為單一藥學(xué)活性成分而配制成的組合物或與其它活性成分組合。例如，所述化合物可以進(jìn)行配制或與已知的抗菌化合物、抗炎癥化合物、類(lèi)固醇類(lèi)和/或抗病毒劑類(lèi)組合。本文提供含有一種或多種化合物的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，將所述化合物配制成合適的藥物制劑，例如用于口服給藥的溶液劑、混懸劑、片劑、分散片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋劑或酏劑，或用于胃腸外給藥的無(wú)菌溶液或混懸液形式，以及透皮貼劑和干粉吸入劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)和工藝，將上述化合物配制成藥物組合物(參見(jiàn)例如AnselIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,第四版，1985，126)。在這些組合物中，將有效濃度的一種或多種化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物與適當(dāng)?shù)乃幬镙d體混合。如上所述，在配制前，可將化合物衍生為相應(yīng)的鹽、酯、烯醇醚或烯醇酯、縮醛、縮酮、原酸酯、半縮醛、半縮酮、酸、堿、溶劑合物、水合物或前體藥物。組合物中化合物的濃度為給予后的輸送量對(duì)治療、預(yù)防或改善一種或多種細(xì)菌感染癥狀有效。在一個(gè)實(shí)施方式中，將組合物配制為單劑量給予。為配制組合物，將重量分?jǐn)?shù)的化合物以有效濃度溶解、混懸、分散于所選的載體中或以另外的方式混合于所選的載體中，使所治療的病癥得到緩解或一種或多種癥狀得到改善。活性化合物以充足的用量包含在藥學(xué)上可接受的載體中，從而對(duì)治療的患者在無(wú)不利副作用的條件下發(fā)揮治療的有益作用?？赏ㄟ^(guò)體外系統(tǒng)、間接體內(nèi)(exvivo)系統(tǒng)和體內(nèi)系統(tǒng)測(cè)試該化合物，經(jīng)驗(yàn)性地確定治療有效濃度，然后由此推斷用于人的劑量。藥物組合物中活性化合物的濃度取決于活性化合物的吸收率、失活率和排泄率、化合物的物化特性、劑量安排(dosageschedule),給予量以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。制備藥物的單元型制劑(dosageunitforms),使每單元型制劑含有約(O.Olmg、O.lmg或lmg)至約(500mg、lOOOmg或2000mg)的活性成分或基本成分的組合，在一個(gè)實(shí)施方式中，為約lOmg-約500mg?？梢淮涡越o予活性成分，或可分成多個(gè)小劑量在時(shí)間間隔內(nèi)給予?？梢岳斫獾氖牵_的劑量和治療周期與所治療的障礙有密切關(guān)系，并且可使用已知的試驗(yàn)技術(shù)或通過(guò)體內(nèi)或體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行推斷進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性地確定。應(yīng)該注意的是濃度和劑量值還可隨待減輕病癥的嚴(yán)重程度而改變。還應(yīng)該理解的是對(duì)于任何特定的受試者，根據(jù)個(gè)人需要以及給予組合物或監(jiān)督組合物給予的人士的專(zhuān)業(yè)判斷，應(yīng)該隨時(shí)間調(diào)整特定的劑量方案，并且本文提出的濃度范圍只是示例性的并無(wú)意限制所要求保護(hù)的組合物的范圍和實(shí)施。對(duì)于化合物顯示溶解度不足的情況，可使用溶解化合物的方法。該方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括使用助溶劑，例如二甲基亞砜(DMSO);使用表面活性劑，例如TWEEN;或溶解于碳酸氫鈉水溶液，但不限于此。還可使用化合物的衍生物，例如化合物的前體藥物配制有效的藥物組合物?；衔锘旌匣蛱砑雍?，所得混合物可以是溶液、混懸液、乳液等。所得混合物的形式依賴(lài)于一些因素，包括所期望的給予方式和化合物在所選載體或賦形劑中的溶解度。有效濃度足以改善疾病癥狀、障礙或治療的病癥，并且可經(jīng)驗(yàn)性地確定該有效濃度?？梢园凑諉卧椭苿┑男问较蛉撕蛣?dòng)物給予所述藥物組合物，所述單元型制劑例如含有適量的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物的片劑、膠囊劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、無(wú)菌的胃腸外溶液劑或混懸劑和口服液劑或混懸劑以及油-水乳液。在一個(gè)實(shí)施方式中，以單劑量形式(unit-dosageforms)或多劑量形式(multiple-dosageform)配制禾卩給予藥學(xué)上具有治療活性的化合物及其衍生物。如本領(lǐng)域所知，本文所用的單劑量形式是指適于人和動(dòng)物受試者并單獨(dú)包裝的物理離散單元。每個(gè)單劑量形式含有預(yù)定量的具有治療活性的化合物，結(jié)合所需要的藥物載體、賦形劑或稀釋劑，足以產(chǎn)生所希望的治療效果。單劑量形式的例子包括安瓿和注射器以及單獨(dú)包裝的片劑或膠囊劑。可部分或成倍地給予單劑量形式。多劑量形式是包裝在單一容器內(nèi)的多個(gè)相同的單劑量形式，從而以分隔的多劑量形式給予。多劑量形式的例子包括片劑或膠囊劑的瓶、小瓶或以品脫或加侖裝的瓶。因此，多劑量形式是在包裝中不分隔的多個(gè)單劑量形式。藥學(xué)上可給予的液體組合物可以例如通過(guò)在載體中溶解、分散或以另外的方式混合如上定義的活性化合物和可選的藥用輔料來(lái)制備，由此形成溶液劑或混懸劑，所述載體例如水、鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等。若需要，欲給予的藥物組合物還可含有少量的無(wú)毒助劑，例如潤(rùn)濕劑、乳化劑、增溶劑、pH緩沖劑等，例如醋酸鹽、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、失水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺、醋酸鈉、油酸合三乙醇胺以及其它此類(lèi)試劑。制備該劑型的現(xiàn)行方法已為或?qū)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員所知；例如，參見(jiàn)Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton，Pa.，第十五版，1975?？芍苽渑c無(wú)毒載體平衡的含有0.005%-100%的活性成分的劑型或組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備這些組合物的方法。預(yù)期的組合物可含有0.001%-100%的活性成分，或者在一個(gè)實(shí)施方式中為含有0.1-95%的活性成分。1.用于口服給予的組合物口服藥物劑型為固體劑、凝膠劑或液體劑。固體劑型為片劑、膠囊劑、顆粒劑和散粉劑(bulkpowders)?？诜瑒╊?lèi)型包括壓縮的可咀嚼錠劑和片劑，所述錠劑和片劑可以是腸溶的、糖衣的或薄膜包衣的。膠囊劑可以是硬的明膠膠囊或軟的明膠膠囊，而顆粒劑和粉劑可以非泡騰形式或泡騰形式與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它成分組合起來(lái)提供。a.用于口服給予的固體組合物在某些實(shí)施方式中，制劑是固體劑型，在一個(gè)實(shí)施方式中，為膠囊劑或片劑。片劑、丸劑、膠囊劑、含片等可含有一種或多種以下成分或相似性質(zhì)的化合物粘合劑；潤(rùn)滑劑；稀釋劑；助流劑；崩解劑；著色劑；甜味劑；調(diào)味劑；潤(rùn)濕劑；催吐包衣劑(emeticcoating);以及薄膜包衣劑。粘合劑例子包括微晶纖維素、黃芪膠、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、凝膠溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯垸酮、聚維酮、交聯(lián)聚維酮、蔗糖和淀粉糊。潤(rùn)滑劑包括滑石、淀粉、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、石松和硬脂酸。稀釋劑包括例如乳糖、蔗糖、淀粉、高嶺土、鹽、甘露醇和磷酸二轉(zhuǎn)。助流劑包括膠體二氧化硅，但不限于此。崩解劑包括交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、海藻酸、玉米淀粉、土豆淀粉、膨潤(rùn)土、甲基纖維素、瓊脂和羧甲基纖維素。著色劑包括例如批準(zhǔn)認(rèn)證的任何水溶性FD和C染料及其混合物；以及混懸于水合氧化鋁的水不溶性FD和C染料。甜味劑包括蔗糖、乳糖、甘露醇和人工甜味劑例如糖精和許多噴霧干燥調(diào)味劑。調(diào)味劑包括從植物(例如水果)中提取的天然調(diào)味劑以及合成的產(chǎn)生愉悅感的化合物的混合劑，例如薄荷油和甲基水楊酸，但不限于此。潤(rùn)濕劑包括單硬脂酸丙二醇酯、失水山梨醇單油酸酯、二乙二醇單月桂酸酯和聚氧乙烯十二垸基醚。催吐包衣劑包括脂肪酸、脂肪、蠟、紫膠、含氨紫膠和醋酸鄰苯二甲酸纖維素。薄膜包衣包括羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇4000和醋酸鄰苯二甲酸纖維素?？梢詫⒒衔锘蚱渌帉W(xué)上可接受的衍生物以組合物的形式提供以保護(hù)其受到胃中酸性環(huán)境的損害。例如，可以將組合物配制為腸溶包衣的形式，使其在胃中保持完整性并在腸內(nèi)釋放活性化合物。還可以結(jié)合抗酸劑或其它這類(lèi)成分配制組合物。當(dāng)單元型制劑是膠囊時(shí)，除上述類(lèi)型的物質(zhì)之外，它還可含有液體載體例如脂肪油。此外，單元型制劑可含有改變劑量單位物理形式的各種其它物質(zhì)，例如糖衣劑和其它腸溶劑?；衔镞€可作為酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、噴劑(sprinkle)、口香糖等的組分給予。除活性化合物之外，糖漿可含有作為甜味劑的蔗糖和某些防腐劑、染料和著色劑以及調(diào)味劑?；钚晕镔|(zhì)還可與不破壞所希望作用的其它活性物質(zhì)混合，或與補(bǔ)充所希望作用的物質(zhì)混合。活性成分是本文所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物?？砂ㄝ^高濃度直到約98重量％的活性成分。在所有實(shí)施方式中，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可對(duì)片劑和膠囊劑進(jìn)行包衣以改變或保持活性成分的溶解性。因此，例如可以使用常規(guī)的腸溶的可消化包衣(例如水楊酸苯酯、蠟和醋酸鄰苯二甲酸纖維素)對(duì)它們進(jìn)行包衣。b.用于口服給予的液體組合物液體口服劑型包括由非泡騰顆粒劑再造而來(lái)的水溶液、乳狀液、混懸劑、溶液和/或混懸液以及由泡騰顆粒劑再造而來(lái)的泡騰制劑。水溶液包括例如酏劑和糖漿。乳狀液為水包油或油包水。酏劑是清澈的、具有甜味的水醇制劑。用于酏劑的藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑。糖漿為糖(例如蔗糖)的濃縮水溶液，并且可含有防腐劑。乳狀液是雙相體系，其中一種液體以小球形式分散到整個(gè)另一液體中。用于乳狀液的藥學(xué)上可接受的載體為非水液體、乳化劑和防腐劑。混懸劑使用藥學(xué)上可接受的混懸劑和防腐劑。用于非泡騰顆粒劑從而再造為液體口服劑型的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)包括稀釋劑、甜味劑和潤(rùn)濕劑。用于泡騰顆粒劑從而再造為液體口服劑型的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)包括有機(jī)酸和二氧化碳源。所有的上述劑型均使用著色劑和調(diào)味劑。溶劑包括甘油、山梨醇、乙醇和糖漿。防腐劑的例子包括甘油、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸鈉和醇。用于乳狀液的非水液體的例子包括礦物油和棉籽油。乳化劑的例子包括明膠、阿拉伯樹(shù)膠、黃芪膠、膨潤(rùn)土和表面活性劑(例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯)?；鞈覄┌燃谆w維素鈉、果膠、黃芪膠、硅酸鎂鋁(Veegum)和阿拉伯樹(shù)膠。甜味劑包括蔗糖、糖漿、甘油和人工甜味劑(例如糖精)。潤(rùn)濕劑包括單硬脂酸丙二醇酯、失水山梨醇單油酸酯、二乙二醇單月桂酸酯和聚氧乙烯十二垸基醚。有機(jī)酸包括檸檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氫鈉和碳酸鈉。著色劑包括任何批準(zhǔn)認(rèn)證的水溶性FD和C染料及其混合物。調(diào)味劑包括從植物(例如水果)提取的天然調(diào)味劑以及合成的產(chǎn)生愉悅感的化合物的混合劑。對(duì)于固體劑型，例如碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液或混懸液，在一個(gè)實(shí)施方式中被封入明膠膠囊中。在美國(guó)專(zhuān)利No.4,328,245、4,409,239以及4,410,545中公開(kāi)了這些溶液和制劑及其膠囊化。對(duì)于液體劑型，例如聚乙二醇中的溶液，可使用足量的藥學(xué)上可接受的液體載體(例如水)稀釋從而容易地測(cè)量以用于給予。或者，通過(guò)在植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(例如碳酸丙烯酯)和其它此類(lèi)載體中溶解或分散活性化合物或鹽，并在硬的明膠膠囊殼或軟的明膠膠囊殼中封入這些溶液或混懸液，可制備液體或半固體口服制劑。在美國(guó)專(zhuān)利No.RE28，819和4,358,603中闡述了包括它們的其它有用的制劑。簡(jiǎn)而言之，該制劑包括但不限于含有本文所提供的化合物(二烷基化的單亞垸基二醇或聚亞垸基二醇)的那些制劑，包括但不限于1，2-二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750是指聚乙二醇的近似平均分子量，該制劑還包括一種或多種抗氧化劑，例如丁基化羥基甲苯(BHT)、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、沒(méi)食子酸丙酯、維生素E、對(duì)苯二酚、羥基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、腦磷脂、抗壞血酸、蘋(píng)果酸、山梨醇、磷酸、硫代二丙酸及其酯以及二硫代氨基甲酸酯。其它制劑包括含有藥學(xué)上可接受的縮醛的含水酒精溶液，但不限于此。用于這些制劑的醇為具有一個(gè)或多個(gè)羥基的任何藥學(xué)上可接受的水混溶性溶劑，包括丙二醇和乙醇，但不限于此。縮醛包括但不限于低碳烷基醛的二低碳垸基縮醛，例如乙醛二乙縮醛。2.注射型制劑溶液和乳狀液本文還涵蓋胃腸外給予，在一個(gè)實(shí)施方式中，其特征為皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)的注射。注射劑可制備為常規(guī)劑型，制備為液體溶液劑或混懸劑、在注射之前適于液體中的溶液劑或混懸劑的固體劑型，或制備為乳狀液。注射劑、溶液劑和乳劑還含有一種或多種賦形劑。適宜的賦形劑例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，若需要，欲給予的藥物組合物還可含有少量的無(wú)毒助劑，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和其它此類(lèi)試劑，例如乙酸鈉、失水山梨醇單月桂酸酯、油酸合三乙醇胺和環(huán)糊精。本文還涵蓋緩慢釋放或持續(xù)釋放體系的植入，使劑量保持在穩(wěn)定的水平(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.3,710,795)。簡(jiǎn)而言之，使本文提供的化合物分散于下列固體內(nèi)部基質(zhì)，所述內(nèi)部基質(zhì)例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑聚氯乙烯或未增塑聚氯乙烯、增塑尼龍、增塑聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、天然橡膠、聚異戊二烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅橡膠、聚二甲基硅氧垸、硅碳酸酯共聚物、親水性聚合物例如丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的水凝膠、膠原、交聯(lián)的聚乙烯醇和交聯(lián)的部分水解的聚乙酸乙烯酯，其被外部聚合物膜包圍，所述聚合物例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅橡膠、聚二甲基硅氧垸、氯丁二烯橡膠、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯和乙酸乙烯酯的共聚物、1,1-二氯乙烯、乙烯-丙烯、離聚物聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、丁基橡膠-表氯醇橡膠、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物，所述外部聚合物膜不溶于體液。在釋放速率控制步驟中，化合物擴(kuò)散過(guò)外部的聚合物膜。該胃腸外組合物含有的活性化合物的百分?jǐn)?shù)強(qiáng)烈依賴(lài)于其特定的性質(zhì)，以及化合物活性和受試者的需要。組合物的胃腸外給予包括靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi)給予。用于胃腸外給予的制劑包括準(zhǔn)備用于注射的無(wú)菌溶液、在使用之前準(zhǔn)備與溶劑混合的無(wú)菌干燥的可溶性制品(例如凍干粉劑，包括皮下注射用片劑)、準(zhǔn)備用于注射的無(wú)菌混懸劑、在使用之前準(zhǔn)備與賦形劑混合的無(wú)菌干燥的不溶性制品以及無(wú)菌乳狀液。溶液可以是水溶液或非水溶液。如果靜脈內(nèi)給予，適宜的載體包括生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和含有增稠劑和增溶劑的溶液，所述增稠劑和增溶劑例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。用于胃腸外制劑的藥學(xué)上可接受的載體包括水性賦形劑、非水性賦形劑、抗菌劑、等張劑、緩沖液、抗氧化劑、局部麻醉劑、混懸和分散劑、乳化劑、多價(jià)螯合劑或螯合劑以及其它藥學(xué)上可接受的物質(zhì)。水性賦形劑的例子包括氯化鈉注射液、林格(Ringers)注射液、等張右旋糖注射液、無(wú)菌水注射液、右旋糖以及乳酸化林格注射液。非水性胃腸外賦形劑包括植物來(lái)源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。必須以抑制細(xì)菌或抑制真菌的濃度將抗菌劑加入到包裝于多劑量容器中的胃腸外制劑中，該抗菌劑包括苯酚或甲酚、滎制劑、苯甲醇、氯丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯銨和芐索氯銨。等張劑包括氯化鈉和右旋糖。緩沖劑包括磷酸鹽和檸檬酸鹽?？寡趸瘎┌蛩釟溻c。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因。混懸和分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素和聚乙烯吡咯垸酮。乳化劑包括聚山梨酯80(TWEEN80)。金屬離子的多價(jià)螯合劑或螯合劑包括EDTA。藥物載體還包括用于水混溶性賦形劑的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于調(diào)節(jié)pH的氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。將藥學(xué)活性化合物的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得注射可提供有效量從而產(chǎn)生所希望的藥效。如本領(lǐng)域所知，確切的劑量依賴(lài)于患者或動(dòng)物的年齡、體重和病癥。以安瓿、小瓶或帶針注射器來(lái)包裝單位計(jì)量的胃腸外制劑。如本領(lǐng)域所知和所實(shí)踐的那樣，用于胃腸外給予的所有制劑應(yīng)該是無(wú)菌的。作為例子，靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)輸注含有活性化合物的無(wú)菌水溶液是有效的給予模式。另一實(shí)施方式是當(dāng)需要時(shí)注射含有活性物質(zhì)的無(wú)菌水溶液或油性溶液或混懸劑以產(chǎn)生所希望的藥效。設(shè)計(jì)用于局部給予和全身給予的注射型制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，將治療有效劑量配制成對(duì)于治療的組織含有濃度至少約0.1%W/W至約90%w/w或更高，在某些實(shí)施方式中，對(duì)于治療的組織，含有濃度大于P/。w/w的活性化合物?；衔锟梢晕⒎坌问交蚱渌m合的形式混懸存在，或者可進(jìn)行衍生以生成溶解性更好的活性產(chǎn)物或生成前體藥物。所得混合物的形式依賴(lài)于一些因素，包括期望的給予模式和化合物在所選載體或賦形劑中的溶解性。有效濃度足以改善病癥的癥狀并可憑經(jīng)驗(yàn)確定。3.凍干粉劑本文所關(guān)注的還有凍干粉劑，可將其溶解為溶液、乳狀液和其它混合物用于給予。還可將其溶解和配制為固體或凝膠。通過(guò)將本文提供的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物溶解于適宜的溶劑來(lái)制備無(wú)菌凍干粉劑。所述溶劑可含有賦形劑，所述賦形劑改善粉劑的其它藥理組分或由粉劑制備的再造溶液的穩(wěn)定性?？墒褂玫馁x形劑包括右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它適宜的試劑，但不限于此。所述溶劑還可含有緩沖液，例如擰檬酸鹽緩沖溶液、磷酸鈉或磷酸鉀緩沖溶液或本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它此類(lèi)緩沖溶液，在一個(gè)實(shí)施方式中，含有pH近于中性的緩沖溶液。隨后，在本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行溶液的無(wú)菌過(guò)濾，然后是凍干，得到所希望的制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，將所得溶液分裝到小瓶中用于凍干。每個(gè)小瓶含有單劑量或多劑量的化合物?？稍谶m宜的條件下，例如約4°C至室溫下儲(chǔ)存凍干粉劑。將上述凍干粉劑使用注射用水進(jìn)行溶解，得到胃腸外給予用的制劑。為實(shí)現(xiàn)溶解，將凍干粉劑加入無(wú)菌水或其它適宜的載體中。精確的用量依賴(lài)于所選的化合物?？蓱{經(jīng)驗(yàn)確定該用量。4.局部給予如前所述制備用于局部給予和全身給予的局部用混合物。所得混合物可以是溶液、混懸劑、乳狀液等，并且可配制成霜?jiǎng)⒛z劑、軟膏劑、乳劑、溶液劑、酏劑、洗劑、混懸劑、酊劑、貼劑、泡沫劑、氣霧劑、灌洗劑、噴霧劑、栓劑、繃帶、皮膚貼劑或適于局部給予的任何其它制劑?？蓪⒒衔锘蚱渌帉W(xué)上可接受的衍生物配制成氣霧劑用于局部使用，例如通過(guò)吸入(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.4,044,126、4，414，209和4,364,923，其描述了用于治療炎性疾病尤其是哮喘的用于輸送類(lèi)固醇的氣霧劑)。用于呼吸道給予的這些制劑可以氣霧劑或溶液的形式用于噴霧器或以微細(xì)粉劑的形式用于吸入，單獨(dú)使用或與惰性載體例如乳糖組合使用。在這種情況下，在一個(gè)實(shí)施方式中，制劑顆粒的直徑小于50微米，在一個(gè)實(shí)施方式中，制劑顆粒的直徑小于IO微米?？蓪⒒衔锱渲朴糜诓糠只蚓植渴褂?，例如以凝膠、霜?jiǎng)┖拖磩┬问骄植繎?yīng)用到皮膚和黏膜(例如眼內(nèi)黏膜)以及用于眼睛，或用于腦池內(nèi)或脊柱內(nèi)。局部給予預(yù)期用于經(jīng)皮輸送并且還用于給予眼睛或黏膜或用于吸入治療。還可給予鼻用溶液，所述鼻用溶液僅含有活性化合物或活性化合物與其它藥學(xué)上可接受的賦形劑組合。可將這類(lèi)溶液，尤其是期望用于眼部的溶液與適合的鹽一起配制為0.01%~10%的等張溶液，pH約為57。5.用于其它給予途徑的組合物本文還涵蓋其它給予途徑，例如包括離子導(dǎo)入設(shè)備和電泳設(shè)備的經(jīng)皮貼劑，以及直腸給予。包括離子導(dǎo)入設(shè)備和電泳設(shè)備的經(jīng)皮貼劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，美國(guó)專(zhuān)利No.6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6，010，715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957公開(kāi)了該貼劑。例如，用于直腸給予的藥物劑型為具有全身效果的直腸栓劑、膠囊劑和片劑。本文所用的直腸栓劑是指用于插入直腸的固體劑，該固體劑在體溫下熔化或軟化，釋放一種或多種藥理活性成分或治療性活性成分。用于直腸栓劑的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)為提高熔點(diǎn)的基質(zhì)或載體和試劑。該基質(zhì)的例子包括可可脂(可可油)、甘油-明膠、碳蠟(Carbowax)(聚乙二醇)和脂肪酸單甘油酯、脂肪酸甘油二酯和脂肪酸甘油三酯的適宜混合物。可使用不同基質(zhì)的組合。提高栓劑熔點(diǎn)的試劑包括鯨蠟和蠟。可通過(guò)壓縮法或制模法制備直腸栓劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，直腸栓劑重量為約23克。使用與口服給予制劑相同的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)和相同的方法制備用于直腸給予的片劑和膠囊劑。6.靶制劑還可將本文提供的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物配制成靶向制劑，所述制劑靶向待治療的受試者的特定組織、受體或身體其它部位。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知許多靶向方法。本文涵蓋了用于即時(shí)組合的所有靶向方法。關(guān)于靶向方法的非限制性例子參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6，139，865、6,131,570、6，120，751、6,071,495、6,060,082,、6，048，736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。在一個(gè)實(shí)施方式中，脂質(zhì)體混懸劑，包括耙向組織的脂質(zhì)體(例如靶向腫瘤的脂質(zhì)體)也可適于用作藥學(xué)上可接受的載體?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備這些制劑。例如可根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利No.4,522,811所述的那樣制備脂質(zhì)體制劑。簡(jiǎn)而言之，可將燒瓶中的蛋黃卵磷脂和腦中磷脂酰絲氨酸(摩爾比7:3)通過(guò)干燥來(lái)制備脂質(zhì)體例如多層脂質(zhì)體(MLV)。將溶解于無(wú)二價(jià)陽(yáng)離子的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的本文提供的化合物的溶液加入燒瓶并振蕩直至脂質(zhì)膜得以分散。洗滌所得微泡，以除去未包封的化合物，離心成球，然后重懸于PBS中。7.希U品可將化合物或藥學(xué)上可接受的衍生物包裝成制品(例如試劑盒)，所述制品含有包裝材料、位于包裝材料內(nèi)的本文提供的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物以及標(biāo)簽，所述標(biāo)簽顯示化合物或組合物、或其藥學(xué)上可接受的衍生物用于治療、預(yù)防或改善與細(xì)菌感染包括結(jié)核分枝桿菌感染有關(guān)的一種或多種癥狀或障礙。本文提供的制品含有包裝材料。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已熟知用于包裝藥品的包裝材料。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,323，907、5,052,558和5,033,252。藥物包裝材料的例子包括泡罩包裝(blisterpacks)、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器和適于所選配方和希望的給予方式和治療方式的任何包裝材料，但不限于此。8.緩釋劑本發(fā)明還提供緩釋制劑，將化合物以髙循環(huán)水平(10—9與10—\1之間)輸送到所希望的目標(biāo)。該水平的緩釋制劑在患者體內(nèi)進(jìn)行全身循環(huán)，或在一個(gè)實(shí)施方式中，停留在例如麻痹部位。可以理解的是，如所希望的，在某段時(shí)間內(nèi)化合物水平保持不變，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地測(cè)定該水平。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的輸送設(shè)備的緩釋方式可制備該緩釋制劑和/或定時(shí)釋放劑，例如美國(guó)專(zhuān)利No.3，845,770;3,916,899;3,536,809;3,598,123;4,008,719;4,710,384;5，674，533;5,059,595;5，591，767;5,120,548;5,073,543;5,639,476;5,354,556和5,733,566所述的制劑，將這些文獻(xiàn)公開(kāi)的內(nèi)容引入本文作為參考。使用如下物質(zhì)可將這些藥物組合物用于一種或多種活性化合物的緩慢或持久釋放，這些物質(zhì)例如羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質(zhì)、凝膠、滲透膜、滲透系統(tǒng)、多層包衣、微粒體、脂質(zhì)體、微球體等?？梢院苋菀椎剡x擇本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的適宜緩釋制劑，包括本文所述的制劑，與本文提供的藥物組合物一起使用。因此，本文涵蓋了適于緩釋的口服給予的單元型制劑，例如片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、膠囊形片劑、粉劑等，但不限于此。在一個(gè)實(shí)施方式中，緩釋制劑含有活性化合物，例如微晶纖維素、麥芽糊精、乙基纖維素和硬脂酸鎂，但不限于此。如上所述，本文涵蓋了與所公開(kāi)的化合物性質(zhì)兼容的所有已知的包封方法。通過(guò)使用緩溶聚合物對(duì)本文提供的藥物組合物粒子或顆粒進(jìn)行不同厚度的包衣或通過(guò)微囊包封來(lái)包封緩釋制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用不同厚度(例如約1微米200微米)的包衣材料包封緩釋制劑，使得藥物組合物在給予哺乳動(dòng)物后約48~72小時(shí)溶解。在另一實(shí)施方式中，所述包衣材料是經(jīng)批準(zhǔn)可用于食物的添加劑。在另一實(shí)施方式中，緩釋制劑是通過(guò)將緩溶聚合物載體與藥物一起壓成片劑而制成的基質(zhì)溶解裝置。在一個(gè)實(shí)施方式中，如美國(guó)專(zhuān)利No.4,710,384和5,354,556所公開(kāi)的，包衣粒子大小為約0.1~300微米，將這些文獻(xiàn)整體引入本文作為參考。每個(gè)粒子以微矩陣形式存在，活性成分均勻分布在整個(gè)聚合物中。例如在美國(guó)專(zhuān)利No.4，710,384中公開(kāi)的那些緩釋制劑，其以整體引入本文作為參考，文獻(xiàn)中公開(kāi)了該緩釋制劑在包衣中含有相對(duì)高百分比的增塑劑，以提供足夠的彈性從而預(yù)防壓片過(guò)程中的實(shí)質(zhì)破損。增塑劑的具體用量有所不同，依賴(lài)于包衣的性質(zhì)和所用的特定增塑劑。通過(guò)檢測(cè)所制片劑的釋放特征，憑經(jīng)驗(yàn)可容易地確定增塑劑的用量。若藥物釋放過(guò)快，則使用較多量的增塑劑。釋放特征也是包衣厚度的函數(shù)。當(dāng)使用的增塑劑用量相當(dāng)大時(shí)，包衣的緩釋能力減弱。因此，可以稍微增加包衣厚度以補(bǔ)償增塑劑用量的增大。通常，在實(shí)施方式中，存在的增塑劑的用量約為包衣中緩釋材料的15~30%，在一個(gè)實(shí)施方式中，為2025%，而包衣用量為活性物質(zhì)重量的10~25%，在另一實(shí)施方式中，包衣用量為活性物質(zhì)重量的1520%。可將任何常規(guī)的藥學(xué)上可接受的增塑劑加入包衣中?？蓪⒈疚奶峁┑幕衔锱渲瞥删忈屩苿┖?或定時(shí)釋劑。所有的緩釋藥物制品均能達(dá)到改善藥物療效以超過(guò)其非緩釋對(duì)應(yīng)物的目的。理想的情形是，在醫(yī)療中，使用優(yōu)化設(shè)計(jì)的緩釋制劑的特點(diǎn)是使用最少的藥物物質(zhì)來(lái)治愈或控制病癥。緩釋制劑的優(yōu)點(diǎn)可包括1)組合物活性延長(zhǎng)，2)藥劑使用次數(shù)減少，以及3)患者依從性提高。此外，緩釋制劑還可用于影響藥物作用時(shí)間或其它性能，例如組合物的血液濃度，由此可影響藥物副作用的產(chǎn)生。將本文提供的緩釋制劑設(shè)計(jì)為最初釋放能快速產(chǎn)生所希望療效的治療組合物用量，然后逐漸并持續(xù)釋放組合物的其它用量，使得在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)能保持該水平的療效。為了保持該水平在體內(nèi)穩(wěn)定，必須以一定的速度從制劑中釋放治療組合物，以便能補(bǔ)償由體內(nèi)代謝和分泌的組合物?？赏ㄟ^(guò)不同的誘因例如pH、溫度、酶、水、其它生理?xiàng)l件或化合物來(lái)刺激活性成分的緩慢釋放?？蓪⒖诜o予制劑適當(dāng)配制成能控制釋放活性化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，將化合物配制為可以很容易配制成液體形式的分散微粒的控制釋放粉劑。緩釋粉劑包括含有活性成分的粒子，并可任選包括具有至少一種無(wú)毒聚合物的賦形劑。粉劑可分散或混懸于液相載體并且在使用期間能保持其緩釋特征。這些分散劑或混懸劑具有化學(xué)穩(wěn)定性和溶解速率穩(wěn)定性。粉劑可含有包括聚合物的賦形劑，該聚合物可以是可溶的、不可溶的、可滲透的、不可滲透的或可生物降解的。該聚合物可以是聚合物或共聚物。該聚合物可以是天然或合成的聚合物。天然聚合物包括多肽(例如玉米蛋白)、多糖(例如纖維素)和海藻酸。代表性的合成聚合物包括美國(guó)專(zhuān)利No.5,354,556(該文獻(xiàn)以整體引入本文作為參考)中第3欄、第33-45行記載的那些，但不限于此。特別適合的聚合物包括美國(guó)專(zhuān)利No.5,354,556(該文獻(xiàn)以整體引入本文作為參考)中第3欄第46行-第4欄第8行記載的那些，但不限于此。可配制用于胃腸外給予的本文提供的緩釋組合物，例如通過(guò)肌內(nèi)注射或植入到皮下組織和不同體腔以及透皮裝置給予。在一個(gè)實(shí)施方式中，將肌內(nèi)注射劑配制為水混懸液或油混懸液。在水混懸液中，復(fù)合過(guò)程中活性化合物溶解度降低或溶解速率減小會(huì)部分導(dǎo)致緩釋作用。油混懸液和溶液采用了類(lèi)似方法，其中通過(guò)將活性化合物從油中分配到周?chē)越橘|(zhì)來(lái)測(cè)定活性化合物的釋放速率。只有油溶的并且具有所希望的分配性質(zhì)的活性化合物才是適合的。可用于肌內(nèi)注射的油包括芝麻油、橄欖油、落花生油、玉米油、杏仁油、大豆油、棉籽油和蓖麻油，但不限于此。能在數(shù)天至數(shù)年的時(shí)間段內(nèi)緩釋的十分成熟的藥物輸送形式是在皮下或不同的體腔內(nèi)植入載藥聚合物裝置。用于植入的聚合物材料必須是生物相容和無(wú)毒的，其包括水凝膠、硅酮、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物或可生物降解的聚合物，但不限于此?；衔锏幕钚栽u(píng)價(jià)本文提供的作為GS活性(例如腺苷酰化GS的活性，包括腺苷?；疓S的膦甲酸中間體介導(dǎo)的磷酰基轉(zhuǎn)移酶活性)抑制劑的化合物的活性，和/或作為治療、預(yù)防或改善與細(xì)菌感染(例如結(jié)核分枝桿菌感染)有關(guān)的一種或多種癥狀、病癥或障礙的化合物的活性，均可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分析法來(lái)測(cè)量或評(píng)價(jià)?？梢允褂妹敢种品?例如Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶法、ATP水解法、ADP形成以及谷氨酸利用和谷氨酰胺形成法)、細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)、存活以及細(xì)胞毒性分析，所有這些均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知和/或如下文所述?；衔锖徒M合物的使用方法使用本文所述的化合物和組合物可以實(shí)施體外或體內(nèi)方法。本發(fā)明化合物的體外應(yīng)用可用于例如GS反應(yīng)機(jī)理的基礎(chǔ)科學(xué)研究、或用于治療、預(yù)防、減弱或抑制細(xì)菌污染或感染、或用于抑制GS磷?；D(zhuǎn)移酶活性。該化合物還可用作體內(nèi)治療試劑以治療細(xì)菌感染，包括病原菌或機(jī)會(huì)致病菌的感染。尤其是，該化合物可用作治療試劑以治療由GSI-P細(xì)菌引起的感染或由GSI-a細(xì)菌引起的感染，所述GSI-(3細(xì)菌例如白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌、傷寒沙門(mén)氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門(mén)螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyelladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌。該化合物可用于預(yù)防和/或治療涉及細(xì)胞內(nèi)微生物(即在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的感染性因子)，例如細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌(例如結(jié)核分支桿菌)的疾病。本發(fā)明方法可用于寬范圍的物種，例如哺乳動(dòng)物例如人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)例如猴子、馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、豚鼠、倉(cāng)鼠、大鼠和小鼠。因?yàn)榧?xì)菌的GSI-(3酶通過(guò)腺苷?；?去腺苷酰化級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)，而哺乳動(dòng)物的GSII酶卻不是這樣，并且本文的某些抑制劑被假設(shè)選擇性地靶向腺苷?；腉S，所以該化合物和組合物可用于選擇性地抑制細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)而最低限度地對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響。在一種體內(nèi)方法中，將本文所述的化合物或藥物組合物(例如式I、II、III、IV、V、VI或VII所表示的化合物；或如實(shí)施例中所闡述的那些物質(zhì))給予受試者，例如哺乳動(dòng)物，例如懷疑受到細(xì)菌感染或正在受到細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物。通常，將本發(fā)明化合物混懸于藥學(xué)上可接受的載體(例如生理鹽水)中，并經(jīng)口服給予、或經(jīng)皮給予、或進(jìn)行靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、葉鞘內(nèi)、鼻內(nèi)、胃內(nèi)、氣管內(nèi)或肺內(nèi)注射(或輸注)?？蓪⑺鼈冎苯虞斔偷竭m當(dāng)?shù)氖芗膊∏忠u的組織。所用的抑制性化合物和輔助藥劑的劑量依賴(lài)于給予途徑的選擇；制劑的性質(zhì)；患者疾病的性質(zhì)；受試者的體型、體重、表面積、年齡和性別；給予的其它藥物；以及主治醫(yī)師的判斷。適合的劑量通常為0.0001-100.0mg/kg?？紤]到可用的化合物和輔助藥劑的種類(lèi)以及各種給予途徑的不同效率，預(yù)計(jì)所需劑量會(huì)有很大變化。例如，預(yù)計(jì)口服給予比靜脈注射給予需要更大的劑量。這些劑量水平的變化可使用本領(lǐng)域熟知的用于優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)的常規(guī)方式來(lái)調(diào)節(jié)?？梢詥蝿┬突蚨鄤┬?例如2倍、3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍或更多倍)的形式給予化合物和/或輔助藥劑。實(shí)施例實(shí)施例1Mn(HC03)"ATP復(fù)合物的催化機(jī)理和結(jié)構(gòu)的闡明理論背景使用核磁弛豫技術(shù)測(cè)定錳復(fù)合物中腺苷5'-三磷酸(ATP)的構(gòu)象(參見(jiàn)下文)。由Solomon-Bleombergen方程(Bloembergen，N.(1957)J.Chem.Phys.27:(2)，572-596;Mildvan，A,S.和Eagle,J.L.(1972)MethodsEnzymol.26:654-682禾卩Mildvan,A.S.禾卩Cohn，M.(1970)Adv.Enzymol.33:1-70)的偶極項(xiàng)計(jì)算Mr^+到ATP核心的距離，該方程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>其中S=電子自旋量子數(shù)(對(duì)于Mii"為5/2)力=核磁旋比(對(duì)于]1!為2.675xl(^弧度'秒"'高斯")g=電子的"g"因子(對(duì)于Mn2+為2)卩=玻爾磁子(8.795xl06弧度'秒+高斯")tc=偶極相關(guān)時(shí)間(對(duì)于Mn-(H2O)6為^3.0x10—")叫=核共振頻率(&在23.487高斯為6.28x108)。s=電子自旋共振頻率。H在23.487高斯為4.13x1011)h=超精細(xì)耦合常數(shù)r=電子-核子的平均距離(厘米)T1=質(zhì)子的縱向弛豫時(shí)間T2=質(zhì)子的橫向弛豫時(shí)間te=電子自旋相關(guān)時(shí)間p=順磁離子與配體濃度比通過(guò)減去反磁的貢獻(xiàn)來(lái)計(jì)算順磁對(duì)縱向馳豫速率和橫向馳豫速率1/Lp和1/T2p的貢獻(xiàn)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>其中，1/TK。bs)是存在順磁性物質(zhì)時(shí)的馳豫速率，1/Tk。)是不存在順磁性物質(zhì)時(shí)的馳豫速率。對(duì)馳豫速率的順磁貢獻(xiàn)1/T^與第一配位層的馳豫速率l/TiM有關(guān)，關(guān)系式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>其中，1/TK。s)是對(duì)馳豫速率的外層貢獻(xiàn)，p是順磁離子濃度與配體濃度的比，q是配位層內(nèi)的配體數(shù)。q值由水的馳豫速率得到，說(shuō)明順磁離子上有多少水分子被配體配位取代。核子在順磁離子第一配位層的停留時(shí)間TM考慮結(jié)合形式與未結(jié)合形式之間的交換速率。通過(guò)與p相乘，將1/T,p和1〃21)進(jìn)行濃度的歸一化。結(jié)合的ATP磁核的第一配位層的弛豫時(shí)間T^在快速交換極限處與pqT^相等。為了解釋順磁金屬-有機(jī)分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，必須測(cè)定q、r和^的值(或極限)。相關(guān)時(shí)間、表征了調(diào)節(jié)偶極相互作用的速率過(guò)程，其由下式定義<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>對(duì)相關(guān)時(shí)間有貢獻(xiàn)的參數(shù)是核間離子-核子矢徑旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的時(shí)間常數(shù)V電子自旋弛豫時(shí)間Ts和核子在順磁離子第一配位層的停留時(shí)間Tm。1/V值是結(jié)合形式與未結(jié)合形式之間的配體交換速率。通過(guò)最快速率過(guò)程或^、L或^中最短的時(shí)間來(lái)測(cè)定相關(guān)時(shí)間Te。需要估計(jì)這些時(shí)間才能計(jì)算1/Tc。在25-46°C溫度范圍內(nèi)獲得Mn(HC(V)2-ATP和MnCl2-ATP復(fù)合物的ATP質(zhì)子H8、H2、H!和H20的L和12弛豫時(shí)間。然后測(cè)定每個(gè)質(zhì)子的T^和T2M值以及馳豫速率1/T^和l/T2p。在200、300、400和500MHz下測(cè)定質(zhì)子H8、H2、Hi和H20的和12弛豫時(shí)間對(duì)頻率的依賴(lài)性。然后將溫度和頻率用于解析不同相關(guān)時(shí)間對(duì)1/pT^和1/pT2p值的貢獻(xiàn)。相對(duì)于水合物(Mn(H20)62+)的馳豫速率，馳豫速率的增加是可預(yù)期的。在水合物中，旋轉(zhuǎn)時(shí)間Tr決定TC。如果在第一配位層的停留時(shí)間Tm決定縱向馳豫速率1/T!p，則V〉^M，因?yàn)門(mén)2M《Tw，^一定也決定1/T2P，1/T1P^1/T2P。因?yàn)門(mén)m隨溫度增加而減小，所以1/T!p和1/T2P—定隨溫度增加而增加。因?yàn)関不依賴(lài)于頻率，1/Tw和1/T2p不依賴(lài)于頻率，所以當(dāng)改變NMR頻率(①？)時(shí)，T!p圖應(yīng)該顯示T^對(duì)頻率依賴(lài)性。如果T^不依賴(lài)于頻率(W)2，則Tm為決定因子。在L對(duì)co的圖中，斜率與截距比為；2，因此才能計(jì)算Te。如果馳豫速率隨溫度的增加而減小，則Tw和T2M(外層馳豫)決定1/T^禾卩1/T2P。除依賴(lài)于溫度外，如果觀察到馳豫速率還依賴(lài)于頻率的話，則除化學(xué)交換外，速率過(guò)程對(duì)Tip做出顯著貢獻(xiàn)。當(dāng)1/Tip對(duì)溫度的圖為正時(shí)，原因可能為下述3種可能性1.化學(xué)交換速率1/tm足夠緩慢以至于決定1/T1P。2.如果發(fā)生快速交換并且^決定T,m，在該條件下^具有正溫度系數(shù)。3.如果T^10-8秒以至于CO,TcVl，/(Tj為1/Tc的函數(shù)，且當(dāng)T。隨溫度增加而變短時(shí)，/(Te)增加。以下方程給出了表征通過(guò)化學(xué)鍵而不是通過(guò)空間來(lái)傳輸?shù)臉?biāo)量相互作用的相關(guān)時(shí)間Te:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage63</formula>在多數(shù)條件下，A小于^，在高溫下，有些離子的^可能小于K。、可由Tt對(duì)co圖的斜率與截距之比(=te2)得到。如果、小于ts的下限，則不可能發(fā)生快速交換，并且^不可能決定T^。在該條件下，Tc可能不具有正溫度系數(shù)。如果在1/Tip的正溫度系數(shù)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)NMR頻率對(duì)1/Tip無(wú)影響，則主導(dǎo)的馳豫機(jī)理可歸因于配體交換速率1/TM。因此，使用1/Tip的溫度和頻率依賴(lài)性以及EPR光譜來(lái)判定哪個(gè)速率過(guò)程或速率過(guò)程的組合(；、K或v)是造成核自旋馳豫的原因。因此，由M盧復(fù)合物的EPR光譜，可得到電子自旋弛豫時(shí)間ts的下限。碳酸氫鹽的離解及其在二價(jià)金屬離子存在下對(duì)ATP的影響碳酸氫根離子在溶液中的離解依賴(lài)于pH。在Mn21nMg^存在下測(cè)定HC(V離解對(duì)GS活性的影響。這具有生理學(xué)重要性，因?yàn)榫虶S的活性而言，依賴(lài)于酶的腺苷?；癄顟B(tài)，GS具有兩個(gè)最適pH，即pH6.3和pH7.3?；诮?jīng)典的離解理論，在pH6.3時(shí)，碳酸氫根與C02以50:50的比存在，而在pH7.3，則幾乎僅以HC(V存在，CO,形式的量可以忽略。在pH5.0和pH8.0之間時(shí)，碳酸氫鹽例如NH4HC03或NaHC03的離解平衡如下NH4HC03+H20SNH4++HC03-SNH4++C02+OH-SNH3+C02+H20NaHC035Na++HC03-^Na++C02+OIT在多元酸水溶液中，由于離解平衡的重疊，很難對(duì)電導(dǎo)率測(cè)量給出一個(gè)簡(jiǎn)單的解釋。在本研究關(guān)注的pH范圍內(nèi)，即pH5.5-8.0，假定很重要的物質(zhì)只有NH4+、hc03'和c02。co,在假設(shè)反應(yīng)機(jī)理中起的作用可忽略或沒(méi)有。離解反應(yīng)的平衡常數(shù)通過(guò)下式得到麗i+]hco3然而:NH4HC03依賴(lài)于溶液的pH，建立了第二平衡:^二[NH3][C。2]尸2HC03-2其中，F(xiàn),表示活性系數(shù)的商f，=/nh3/co2通過(guò)Henderson-Hasselbach方程，由溶液pH和總離解度a確定溶液中存在的不同物質(zhì)的濃度pHpK,+Log^Al[酸〗然而，在pH5.5-8.0和濃度lmM-5mM條件下，未離解的NH4HC03量可忽略。通常=10脾—沐,)[NH4HC03〗—=c(l-a)因此，=10(pH-pK,)—當(dāng)pH由pH5.5增加到pH8.0時(shí)，該pH水平范圍內(nèi)的溶液電導(dǎo)率應(yīng)當(dāng)指示溶液中HC03-濃度，并且通過(guò)溶液中C02濃度的差異來(lái)指示。在lOmM咪唑.HCl緩沖溶液存在下，相對(duì)濃度不同。因此，研究確定在含有NH4HC03的溶液中，咪唑的存在以何種程度影響HC(V離解為C02。重要的是應(yīng)該知道，在(M^+)HHCCV;h2.ATP復(fù)合物存在下，上述每種物質(zhì)的相對(duì)濃度影響腺苷?；疓S的功能。還可以認(rèn)為HC(V和C02在腺苷?；疓S催化調(diào)節(jié)的反應(yīng)中均發(fā)揮作用。咪唑.HC1在25°C時(shí)的pIQ為6.92。在含有NH4HC03的溶液中，咪唑韋翁鹽是作為HCCV的抗衡離子。在低pH條件下，NH4HC03趨于離解形成可溶的C02和NH3。NH4HC03-^NH4++HC03+NH3+C02咪唑，HC1在水溶液中的離解為AHCI_+、HN、CIH2N、N含有l(wèi)mMNH4HC03的10mM咪唑.HC1溶液在較高pH下，溶液中過(guò)量的咪唑可成為HC(V的抗衡離子，生成通過(guò)電導(dǎo)率分析可測(cè)量其存在的另外的離子物質(zhì)。NH4HC03+HN、,N——^NH,+HCO,+在考慮不同pH水平下所觀察的摩爾電導(dǎo)率A是構(gòu)成電解液的離子j的貢獻(xiàn)總和，？w是每個(gè)離子的電導(dǎo)率。A="(A)[NH4+]+^[HC03-]+義」[Imi+])電導(dǎo)率分析用于測(cè)定在濃度比為lOmM咪唑與lmMNH4HC03的咪唑緩沖溶液中，是否仍可定量測(cè)定NH4HC03的離解。在pH值范圍內(nèi)，添加lmMNH4HC03使咪唑的最終濃度為lOmM從而制備咪唑.HCl溶液。催化機(jī)理的證明-綜述(Mn2+)3.(HC0012.ATP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析和分子模擬說(shuō)明所述(Mn2+)3.(HC03-)irATP復(fù)合物在反應(yīng)機(jī)理中起很重要的作用。兩種方法用于證明該反應(yīng)機(jī)理。定點(diǎn)突變(SDM)用于證明酶活性位點(diǎn)的主要氨基酸在磷?；D(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。SDM發(fā)生在His269、His271、Glu207和Arg356。如前所述，所有的氨基酸殘基編號(hào)對(duì)應(yīng)于大腸桿菌的GS殘基；使用已知技術(shù)，例如分子模擬或同源性比對(duì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由其它物種測(cè)定GS中的相應(yīng)殘基。然后可測(cè)定每個(gè)突變酶的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的酶活性并與未突變酶的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的酶活性相比較。為獲得完全去腺苷?；拿?，在GS腺苷?；稽c(diǎn)進(jìn)行SDM，也就是使Tyr397突變?yōu)閂al397。如Senior,P.J.(1975)J.Bact.123:(2)，407-418略述的那樣，在氮過(guò)量和碳限量或氮限量和碳過(guò)量條件下，通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)大腸桿菌也可獲得完全腺苷?；蛉ハ佘挣；腉S。完全腺苷?；疓S優(yōu)選在Mr^+存在時(shí)發(fā)揮作用，而去腺苷酰化GS優(yōu)選在Mg^存在時(shí)發(fā)揮作用。用于證明反應(yīng)機(jī)理的第二種方法是使用NMR光譜法證明在ATP催化的磷?；D(zhuǎn)移反應(yīng)中使用Mg^或Mi^+作為二價(jià)金屬離子可產(chǎn)生的功能差異。這些反應(yīng)在無(wú)酶條件下發(fā)生。質(zhì)子NMR馳豫數(shù)據(jù)說(shuō)明對(duì)于Mn2、該二價(jià)金屬離子可能緊鄰腺嘌呤環(huán)，而且最初的假設(shè)認(rèn)為這可能對(duì)催化過(guò)程發(fā)揮作用。隨后發(fā)現(xiàn)在某些條件下，ATP的Q質(zhì)子易變，可解釋該情況發(fā)生的一種機(jī)理是Mi^+是否結(jié)合到C8形成金屬卡賓。有人提出在酶結(jié)合底物的過(guò)程中，可發(fā)生由配位HC(V引起的N7的可能羧化或質(zhì)子化，在N7處誘發(fā)亞胺正離子。該亞胺正離子進(jìn)一步促使Mi^+與Q之間形成假定的結(jié)合從而形成金屬卡賓。有人提出電荷(有效質(zhì)子)由配位的HC(V移位到N7。相同的結(jié)果可通過(guò)N7的羧化來(lái)調(diào)節(jié)。金屬卡賓一旦形成，則N7的羧基可在磷酰基轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用，形成羧基-磷酸，同時(shí)伴隨金屬卡賓的斷裂。在酶催化過(guò)程中，磷?；ㄟ^(guò)氨基酸殘基His269和His271的側(cè)鏈轉(zhuǎn)移到谷氨酸，形成y-谷氨酰磷酸，Glu207和Arg356在催化過(guò)程中也發(fā)揮作用。為證明易變的C8-H，在D20中制備Mg-ATP、Mn(HC03)2-ATP和MnCl2-ATP復(fù)合物，并通過(guò)&NMR監(jiān)測(cè)Q-H的存在。在020中發(fā)生整個(gè)反應(yīng)，因?yàn)槿绻鸆s質(zhì)子易變，在反應(yīng)過(guò)程中Cg質(zhì)子的&NMR位移會(huì)消失，因?yàn)闀?huì)發(fā)生ATP的該質(zhì)子與體相的交換，即該質(zhì)子被交換進(jìn)入D20中。在反應(yīng)過(guò)程中還監(jiān)測(cè)ATP的水解。通過(guò)在谷氨酰胺合成酶分析法中使用C8氘代的ATP和測(cè)定引起的催化同位素效應(yīng)，還可證明Cs質(zhì)子在反應(yīng)中的作用。發(fā)現(xiàn)催化同位素效應(yīng)只發(fā)生在通過(guò)使用Mi^+的腺苷?；劝滨０泛铣擅刚{(diào)節(jié)的反應(yīng)中，而不發(fā)生在通過(guò)使用Mg^的去腺苷?；劝滨０泛铣擅刚{(diào)節(jié)的反應(yīng)中。催化機(jī)理的證明-材料和方法Mn(HC03)2-ATP和MnCl2-ATP復(fù)合物的制備將Na2ATP溶解于水，使其濃度約為80mM。然后使溶液通過(guò)酸式的Dowex50WX2強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，從ATP中除去Na+離子。使3倍床體積的50mMHCl通過(guò)柱，然后用5倍床體積的1120洗柱，將Dowex50WX2樹(shù)脂轉(zhuǎn)化為酸式。收集合并含有酸-ATP的所有樣品，并與等摩爾濃度的MnC03、Mg(OH)r3MgCCV3H20反應(yīng)或與MnCV混合。攪拌含有Mg(OH)r3MgC03'3H20和MnC03的溶液直至所有MnC03或Mg(OH)r3MgC03-3H20得以溶解。然后用NaHC03將Mn(HC03>ATP溶液的pH調(diào)節(jié)至pH6.3-7.0。用NaOH調(diào)節(jié)ATP的Mg2+和MnCl2復(fù)合物的pH。通過(guò)用NaOH調(diào)節(jié)80mM溶液的pH到pH7.0來(lái)制備N(xiāo)a4ATP。用電噴霧質(zhì)譜證明復(fù)合物的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。用ICP測(cè)定Mi^+的正確的化學(xué)計(jì)量(數(shù)據(jù)未顯示)。以單計(jì)量方式(monometrically)測(cè)定Mn(HCCV)2-ATP復(fù)合物中的HCCV的大致化學(xué)計(jì)量。ATP濃度對(duì)Na4ATP、Mn(HC03-)2-ATP、Mg-ATP和MnCl2-ATP復(fù)合物的NMR分析的影響為測(cè)定對(duì)ATP的&NMR的堆積效應(yīng)，測(cè)定Na4ATP、Mn(HC03-)rATP、Mg-ATP和MnCl2-ATP的ATP濃度對(duì)H8、H2、和H20質(zhì)子的弛豫時(shí)間的影響。以Na4ATP或Mg-ATP濃度的10_3的濃度，將Mn(HC(V)2-ATP和MnCl2-ATP加入Na4ATP和Mg-ATP。以5-120mM的濃度范圍加入ATP。Na4ATP、Mn(HCCV)2-ATP、Mg-ATP和MnCl2-ATP復(fù)合物的NMR分析測(cè)定Mn(HC(V)2-ATP復(fù)合物和MnClrATP復(fù)合物對(duì)H8、H2、1^和H20質(zhì)子的縱向Tt和橫向T2弛豫時(shí)間的影響。將Mn(HC03—)2-ATP復(fù)合物和MnCl2-ATP復(fù)合物加入60mMNa4ATP或Mg-ATP溶液中，使其濃度變?yōu)?0pM。將含有Mn(HC03')2-ATP或MnCl2-ATP復(fù)合物的60mMNa4ATP溶液凍干，在-20。C下儲(chǔ)存，并根據(jù)需要，通過(guò)溶解于D20的制備溶液。在存在和不存在Mn(HC03')2-ATP或MnCl2-ATP的條件下，使用VarianUNITYplus400MHz核磁共振儀對(duì)Na4ATP或Mg-ATP復(fù)合物進(jìn)行核磁共振實(shí)驗(yàn)從而獲得L和T2弛豫時(shí)間。Mn(HC(V)2-ATP復(fù)合物基于加入到溶液中的Na2HC03、MnC03、ATP的相對(duì)濃度。在溫度范圍內(nèi)測(cè)定弛豫時(shí)間。在200MHz、300MHz、400MHz和500MHz下測(cè)定NMR頻率對(duì)Tj和丁2弛豫時(shí)間的影響。使用的設(shè)備為VarionGemini200/2000(200MHz)、VarionUnityI謂a400(400MHz)、BriikerARX300(300MHz)禾口Advance500(500MHz)。pH對(duì)咪唑緩沖液中NH4HC03離解的影響測(cè)定pH對(duì)咪唑緩沖液中NH4HC03離解的影響。制備pH水平范圍內(nèi)的溶解于咪唑'HC1緩沖液(10mM)的NH4HC03(ImM)溶液。還測(cè)定不同pH水平下的僅10mM咪唑.HC1以及10mM咪唑.HC1加ImMNH4HC03的電導(dǎo)率。用比電導(dǎo)率為18pS的水制備所有溶液。然后使用Jenway4150電導(dǎo)儀測(cè)定比電導(dǎo)率。因此，所得的兩個(gè)關(guān)聯(lián)的比電導(dǎo)率之間的差異包括構(gòu)成電解液溶液的離子7的比電導(dǎo)率的貢獻(xiàn)。所觀察到的不同pH水平下的摩爾電導(dǎo)率A是單個(gè)摩爾電導(dǎo)率的總和。A=a(;i/NH4+]+義乂[HCO,]+;i)[Imi+])ATP水解速率和Na4ATP、Mn(HC03-)2-ATP、Mg-ATP和MnClrATP復(fù)合物中C-Hs的氘代NMR光譜法用于證明在某些條件下ATP的C8質(zhì)子易變并且只在Mn"結(jié)合到Q時(shí)發(fā)生。為證明易變的Q-H，制備溶解于D20的Mg-ATP、Mn(HC03-)2-ATP和MnCl2-ATP復(fù)合物，并且通過(guò)&NMR監(jiān)測(cè)C8-H的存在隨時(shí)間的變化。在D20中進(jìn)行整個(gè)反應(yīng)從而測(cè)定Mi^+或Mg^對(duì)C8質(zhì)子氘代速率的影響，因?yàn)橐栽撡|(zhì)子與D20的交換為結(jié)果的反應(yīng)過(guò)程中，Q質(zhì)子的111NMR位移消失。因此ATP在Q位置被氘代。還可測(cè)定在反應(yīng)過(guò)程中ATP的水解速率。用H20作為溶劑也可發(fā)生該反應(yīng)。所有反應(yīng)發(fā)生在pH6.3或pH7.3的咪唑緩沖液中。在咪唑濃度為20mM時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用的NaHC03、MnCl2和MgCV濃度為NaHC03在0-12mM之間變化，MnCl2和MgCl2在0-4mM之間變化。在特定的時(shí)間間隔，取150pL樣品，并用D2O或H2O稀釋到730pL。加入EDTA(20nL)至其濃度為2.0mM，10min后離心樣品以除去二價(jià)金屬離子。通過(guò)iHNMR分析樣品，然后通過(guò)HPLC測(cè)定ADP濃度。M^濃度對(duì)腺苷酰化和去腺苷?；疓S活性的影響在一定的ATP濃度范圍和一定的M"與ATP比率范圍內(nèi)，測(cè)定Mn2+和Mg^濃度對(duì)腺苷?；腿ハ佘挣；疓S活性的影響。使用的ATP濃度為200pM、400nM、600nM、800pM和1000nM。在所用的每個(gè)ATP濃度，加入MnCl2或MgCl2至其濃度為ATP濃度的1、2、3或4倍。分析法的其它組分為20mM咪唑.HC1、12mMNaHC03、4mMNH4Cl和4mML-谷氨酸和4mMNH4Cl。在pH6.3下進(jìn)行使用腺苷?；劝滨０泛铣擅傅姆治龇?，而在pH7.2下進(jìn)行使用去腺苷?；劝滨０泛铣擅傅姆治龇?。以NaHC03作為最后加入的化合物，在使用前立即新鮮制備分析溶液，并且在加入時(shí)立即調(diào)節(jié)pH。HC03'濃度對(duì)腺苷?；腿ハ佘挣；疓S活性的影響在一定的Mn"+濃度范圍內(nèi)測(cè)定HC(V濃度對(duì)腺苷?；疓S活性的影響。分析物包括20mM咪唑.HC1、4mMNH4C1、600&MATP、1.8mMMnCl2和4mML-谷氨酸，并且在pH6.3下進(jìn)行該分析。NaHC03濃度在l-12jimoleNaHC03moleATP之間變化。不能使用去腺苷酰化GS進(jìn)行分析，因?yàn)樵诟咛妓猁}濃度時(shí)，Mg^發(fā)生沉淀。在C-8位置氘代的ATP和13CHCOf對(duì)腺苷酰化GS比活性的影響通過(guò)在60°C下將20mMNa2ATP加入到溶解于D20的50mM三乙醇胺中，使Na2ATP気代96小時(shí)。然后將樣品凍干并在-20。C下儲(chǔ)存，當(dāng)需要時(shí)將其溶解于水中。然后使用LunaCm反相柱(250mmx25.2mm)、以乙酸銨作為流動(dòng)相、流速為7.0ml/min，對(duì)氘代的ATP進(jìn)行純化。然后收集樣品并凍干以除去流動(dòng)相。然后檢查所得ATP在C-8位置是否完全氘代。測(cè)定在C-8位置氘代的ATP的濃度對(duì)腺苷?；疓S活性的影響。分析物包括20mM咪唑'HC1、12mMNaHC03、4mML-谷氨酸和4mMNH4C1，在pH6.3進(jìn)行分析。不能使用去腺苷?；疓S進(jìn)行分析，因?yàn)锳TP在C-8位置的気代對(duì)去腺苷?；疓S的比活性沒(méi)有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。在気代和未氘代的ATP存在下還可測(cè)定Na^HC03對(duì)谷氨酰胺合成酶比活性的影響。分析物包括20mM咪唑.HC1、12mMNaHC03(或Na13HC03)、4mML-谷氨酸和4mMNH4C1，并且在pH6.3下進(jìn)行。在800mMATP下進(jìn)行分析，比較C-8位置氘代的ATP和天然豐度的ATP。細(xì)菌菌株和培養(yǎng)基表1列出了所用的細(xì)菌菌株和載體。將所有細(xì)菌菌株低溫保藏于-70°€下的38%111甘油溶液中。除非另有說(shuō)明，將所有大腸桿菌培養(yǎng)物保持在LM培養(yǎng)基(5g/1NaCl、10g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨；pH7.2)上。若需要，則添加濃度為15g/l的瓊脂。對(duì)于pAlter-l,用50嗎/ml氨芐青霉素或12.5pg/ml四環(huán)素補(bǔ)充培養(yǎng)基，而對(duì)于pBluescriptlISK+，用100pg/ml氨芐青霉素補(bǔ)充。通過(guò)使用含痕量鹽的M9培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)突變株在基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。痕量鹽在0.1NHC1中制備，該痕量鹽包括以下(表示為每升溶液含有)3.5gFeS04.7H20、0.5gMnS04H20、O.llgNa2B4O7,10H2O、0.13gNa2Mo04.2H20、l.lgZnS04、O.lgCuS04.5H20和FeCl36H20。使用之前，將痕量鹽在等體積的O.lNNaOH中稀釋并以20mL/LM9培養(yǎng)基的濃度加入。當(dāng)需要時(shí)，將氨芐青霉素和四環(huán)素抗生素分別以濃度為50叫.mL"和12.5i!g'mL"加入培養(yǎng)基中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>g/wA基因的分離和載體的構(gòu)建使用QiaPrepSpinMiniprepKit(Qiagen)或通過(guò)堿裂解法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.禾口T.Maniatis(1989)In:MolecularCloning:ALaboratoryManual.，第二版ColdSpringHaborLaboratoryLaboratoryPress)小規(guī)模分離DNA。使用QiagenMidiDNA分離試劑盒(Qiagen)來(lái)完成大規(guī)模DNA分離。使用購(gòu)自AmershamBiosciences的限制性?xún)?nèi)切酶并按照廠商說(shuō)明來(lái)進(jìn)行DNA酶切。堿性磷酸酶來(lái)自AmershamBiosciences。T4DNA連接酶來(lái)自Promega并按照該酶提供的方案來(lái)使用。用于DNA電泳的瓊脂糖為分子生物學(xué)級(jí)。ra^聚合酶(r7bg)來(lái)自TaKaRaBioInc.并用于一般篩選。高忠實(shí)性的ra《聚合酶(Exra《)也來(lái)自TaKaRaBioInc.并用于擴(kuò)增用來(lái)克隆的基因。使用標(biāo)準(zhǔn)步驟(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和T.Maniatis(1989)In:MolecularCloning:ALaboratoryManual.，第二版ColdSpringHaborLaboratoryPress)進(jìn)行限制性酶切和瓊脂糖凝膠電泳。lkbDNA梯狀條帶用于所有電泳。按照每個(gè)試劑盒提供的方案，使用來(lái)自Promega公司的AlteredSites體外突變?cè)噭┖?，或?lái)自Stratagene的QuikChangeXL定點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行定點(diǎn)突變。所有的化學(xué)品為分析級(jí)或分子生物學(xué)級(jí)，并且無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。除非另有說(shuō)明，所有化學(xué)品來(lái)自Merck或Sigma。大腸桿菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆將引物設(shè)計(jì)到由Genbank(登錄號(hào)X05173)獲得的大腸桿菌glnA基因序列。將引物設(shè)計(jì)成在5'端帶有Nsil限制酶切位點(diǎn)(黑體字示出的)。以下示出了該引物5'引物5'-GATATGCATCCGTCAAATGCG-S'(SEQIDNO:1)3'引物5'-GCGATGCATAAAGTTTCCACGG-3'(SEQIDNO:2)使用pGLn6的DNA為模板以及上述引物來(lái)進(jìn)行PCR。PCR混合物含有l(wèi)pl質(zhì)粒DNA(50ng)、5pl每種引物(2.5pmol/nl)、4pl2.5mMdNTP、含有20mMMgCl2的5^110X緩沖液和0.5|il高忠實(shí)性的&《聚合酶(2.5個(gè)單位)。按如下步驟進(jìn)行PCR，即先對(duì)模板DNA在95。C下預(yù)變性5min，隨后在95°C下變性5min、55°C下退火lmin以及72°C下延伸2min，共進(jìn)行30個(gè)這樣的循環(huán)。將72°C下進(jìn)行l(wèi)Omin的最后延伸步驟也加入過(guò)程中。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以驗(yàn)證PCR產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度。使用高純PCR純化試劑盒(RocheDiagnostics)純化PCR產(chǎn)物，并使用Nsil對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行酶切。為構(gòu)建使用AlteredSites系統(tǒng)進(jìn)行SDM的模板，用尸M對(duì)pAlter-1線性化并在連接前去磷酸化。以插入物:載體比為3:1連接插入物和載體。按照廠商說(shuō)明，使用Bio-Rad基因脈沖儀通過(guò)電穿孔將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中。在補(bǔ)充有12.5jig/ml四環(huán)素、80pg/mlX-Gal和ImMIPTG的LM瓊脂培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化株。隨后通過(guò)使用堿裂解法分離DNA、然后酶切并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)篩選由轉(zhuǎn)化平板上獲得的幾種白色菌落。進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)大腸桿菌glnA基因的存在及其序列。除了使用M13/F和M13/R通用引物外，還由已知的基因序列設(shè)計(jì)基因特異性的內(nèi)引物。表2示出了這些引物。表2.對(duì)克隆的大腸桿菌glnA基因進(jìn)行測(cè)序使用的序列特異性引物<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>為使用QuikChangeTM系統(tǒng)構(gòu)建用于SDM的模板，由pAlter構(gòu)建體亞克隆谷氨酰胺合成酶基因作為片段。用手術(shù)刀片將含有g(shù)lnA基因的條帶從凝膠上切下來(lái)，通過(guò)2ml的注射器推入Eppendorf管從而粉碎瓊脂糖。將lml苯酚(平衡至pH8.0)加入該管，然后將混懸液渦旋lmin。在-70。C下冷凍樣品至少30min。樣品一解凍，就將其在Eppendorf微量離心機(jī)中以13000rpm離心15min。將水相移至潔凈管，然后用苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)提取一次，接著用氯仿:異戊醇(24:1)提取一次。用乙醇將DNA沉淀并重懸于TE緩沖液。然后將該片段以插入物:載體比為3:1連接到pBluescriptIISK+中，再用Sacl和H/mffll進(jìn)行酶切。將該連接反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中，并在含有10(^g/ml氨芐青霉素的LM瓊脂平板上進(jìn)行平板培養(yǎng)。通過(guò)堿裂解法分離質(zhì)粒DNA、使用5amHI酶切DNA以及隨后使用瓊脂糖凝膠電泳分析這些片段來(lái)篩選單轉(zhuǎn)化體菌落(singletransformantcolonies)。定點(diǎn)突變(SDM)使用QiagenMidiPrep試劑盒由大腸桿菌JM109分離pAlter-l中的野生型glnA基因的DNA。表3列出了使用該系統(tǒng)進(jìn)行g(shù)lnA基因突變所設(shè)計(jì)的寡核苷酸。把引入限制酶切位點(diǎn)以利于突變初級(jí)篩選的沉默突變構(gòu)建到SDM寡核苷酸中。這些也顯示在表3中。表3.使用AlteredSitesTM系統(tǒng)進(jìn)行的大腸桿菌glnA基因的突變。改變氨基酸殘基的突變以黑體字示出，限制酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>7)突變發(fā)生后，為所選擇的突變篩選單菌落，所述篩選通過(guò)從過(guò)夜培養(yǎng)液中分離DNA，并且使用所篩選的特定突變的酶進(jìn)行限制酶切分析。突變基因的表達(dá)通過(guò)使用和///m/III進(jìn)行酶切，由pAlter-l克隆體分離突變基因。然后對(duì)酶切下來(lái)的物質(zhì)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以分離載體和插入物條帶。如上所述，將含有基因的條帶從凝膠上切下來(lái)并使用苯酚提取DNA。用Sacl和歷"ofin酶切pBluescriptIISK+，然后以插入物:載體為3:1將每個(gè)突變基因連接到載體中。將連接反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化到谷氨酰胺合成酶營(yíng)養(yǎng)缺陷株大腸桿菌YMC11中，并且在補(bǔ)充有50pg/ml氨節(jié)青霉素的LM瓊脂培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化株。通過(guò)使用M13/F和M13/R通用引物的PCR，對(duì)在轉(zhuǎn)化平板上獲得的單菌落實(shí)施篩選步驟。在該步驟中，將單菌落重懸于2(Hil蒸餾水中。將1^1該菌落混懸液加入PCR反應(yīng)體系中，所述的PCR反應(yīng)體系含有2.5^1每種引物(2.5pmol/|il)、2^2.5mMdNTP、2.5^110X緩沖液、2^125mMMgCl2和O.lpl7b《聚合酶(0.5u)。如上所述進(jìn)行PCR循環(huán)。隨后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并且基于正確的條帶大小選擇陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。將陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照引入該步驟以驗(yàn)證獲得的結(jié)果。QuikChangeTM突變使用QiagenMidiPrep試劑盒將所選模板的DNA(pBluescript構(gòu)建體)從大腸桿菌XLl-Blue中分離出來(lái)。表4列出了使用該系統(tǒng)進(jìn)行SDM所設(shè)計(jì)的寡核苷酸。因?yàn)檫@是基于PCR的系統(tǒng)，所以每個(gè)反應(yīng)需要兩種寡核苷酸(正義的和反義的)。表4.使用QuikChange系統(tǒng)進(jìn)行的大腸桿菌glnA基因的突變。改變氨基酸殘基的突變以黑體字示出，限制酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>突變發(fā)生后，為所選擇的突變篩選單菌落，所述篩選通過(guò)從過(guò)夜培養(yǎng)液中分離DNA,并且使用所篩選的特定突變的酶進(jìn)行限制酶切分析。使用QuikChangeTM系統(tǒng)將獲得的正突變株轉(zhuǎn)化到大腸桿菌YMC11中用于表達(dá)。突變的確認(rèn)由外部機(jī)構(gòu)進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)每個(gè)突變。為此目的，由已知的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)正向和反向的基因特異性引物。這些示于表5中。表5.用于確認(rèn)大腸桿菌glnA基因中各種突變的存在所使用的序列特異性引物<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>結(jié)果大腸桿菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆將大腸桿菌野生型glnA基因擴(kuò)增為2.1kb片段，編碼長(zhǎng)度為471個(gè)氨基酸的蛋白。以插入物:載體為3:1將含有iVWI側(cè)翼限制酶切位點(diǎn)的2124bp的PCR擴(kuò)增的glnA基因連接到尸M酶切的SDM載體pAlter-l中。從一些轉(zhuǎn)化體中分離DNA并使用5amHI和五coRI進(jìn)行限制酶切分析。根據(jù)基因和載體的已知序列，用^7mHI對(duì)構(gòu)建體(在所需的正確的5'端至3'端取向上帶有該glnA基因)進(jìn)行限制酶切，會(huì)產(chǎn)生6012bp和1797bp的片段。以這種方式鑒定了正確的構(gòu)建體，并命名為pGln12。為構(gòu)建使用QuikChangeTM系統(tǒng)進(jìn)行突變的野生型模板，將glnA基因從pGlnl2切下來(lái)作為片段，并以插入物:載體為3:1將其連接到經(jīng)過(guò)類(lèi)似酶切的pBluescriptIISK+中。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中，并在補(bǔ)充有100嗎/ml氨節(jié)青霉素、80貼/mlX-Gal和lmMIPTG的LM瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)。為了鑒定出陽(yáng)性亞克隆株，從一些白色菌落中分離DNA并用Sacl、J^mffll和￡。wHI對(duì)其進(jìn)行限制酶切分析。以這種方式鑒定正確的構(gòu)建體并將其命名為pBSK-ECgln。在進(jìn)行任何SDM之前，對(duì)兩個(gè)克隆體進(jìn)行序列分析以驗(yàn)證野生型基因的完整性。定點(diǎn)突變(SDM)AlteredSitesTM系統(tǒng)按照上述方案進(jìn)行定點(diǎn)突變。使用對(duì)突變特異的酶對(duì)從突變體分離出來(lái)的DNA進(jìn)行酶切，并且進(jìn)行大小分級(jí)(size-fractionated)以確認(rèn)存在突變。在任何情況下，使用相同的酶對(duì)野生型構(gòu)建體(pGlnl2)進(jìn)行酶切作為對(duì)比對(duì)照。帶有各自引入的限制酶切位點(diǎn)和所期望的片段長(zhǎng)度的突變?nèi)绫?所列。表6.使用AlteredSites系統(tǒng)引入pGlnl2中的突變的列表，顯示出所期望的限制性片段<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>由于得到所期望的DNA片段長(zhǎng)度，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)存在突變。突變基因的表達(dá)將突變基因(來(lái)自pAlter)亞克隆到pBluescriptlISK+中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌YMC11中，以促進(jìn)蛋白純化和酶研究。通過(guò)PCR篩選確認(rèn)亞克隆基因存在于載體中。經(jīng)檢測(cè)，含有突變glnA基因的轉(zhuǎn)化株菌落為瓊脂糖凝膠上的2170bp條帶。PCR篩選中包括由轉(zhuǎn)化到大腸桿菌YMC11中的載體組成的陰性對(duì)照，并且該陰性對(duì)照作為條帶呈現(xiàn)于凝膠上，該條帶具有載體多克隆位點(diǎn)的大小。PCR篩選還包括也在大腸桿菌YMC11中的pBSK-ECglnDNA的陽(yáng)性對(duì)照。其作為條帶呈現(xiàn)于凝膠上，與任何陽(yáng)性突變亞克隆體的大小相同。然后用對(duì)突變特異的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)以這種方式鑒定的來(lái)自每個(gè)突變體的單亞克隆體的DNA進(jìn)行酶切，以確認(rèn)存在特異性突變。<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>由于得到期望的DNA片段長(zhǎng)度，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)亞克隆體內(nèi)存在突變。QuikChange突變按照如上所述的方案，使用QuikChange系統(tǒng)進(jìn)行SDM。從可能的突變體中分離DNA，使用對(duì)突變特異的酶對(duì)DNA進(jìn)行酶切，并且進(jìn)行大小分級(jí)以確認(rèn)存在突變。使用相同的酶對(duì)由親代模板組成的對(duì)照進(jìn)行酶切作為對(duì)比對(duì)照。帶有各自的限制酶切位點(diǎn)和所期望的片段長(zhǎng)度的突變?nèi)绫?所列。pBSK-ECgln作為模板用于E207T、H269N、H271N和ER355Q突變。在pBSK-Y397V內(nèi)產(chǎn)生雙突變體E207TY397V、H269NY397V、H271NY397V和R355QY397V。表8.使用QuikChange系統(tǒng)引入到各模板中的突變的列表，顯示所期望的限制性片段<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>由于得到所期望的DNA片段長(zhǎng)度，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)存在突變。酶分析使用如StadtmanE.R.等人(1970)AdvEnzymeReg:8:99-118所述的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)定GS，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的酶活性。用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)證明酶的同質(zhì)性。通過(guò)高壓液相色譜法(HPLC)測(cè)量谷氨酰胺和ADP的生成速率來(lái)測(cè)定GS正向反應(yīng)速率。GS正向反應(yīng)包括(除非另有定義)llmM(NH4)HP04、l.OmM谷氨酸和l.OmMM2+-ATP復(fù)合物(即Na2Mn(HC03)2-ATP、Na2Mg-ATP或Na2MnCl2-ATP)。反應(yīng)在pH6.3或pH7.2下進(jìn)行。大腸桿菌谷氨酰胺合成酶的純化在補(bǔ)充有70mML-谷氨酸、5mML-谷氨酰胺和100|ig/ml氨芐青霉素的修飾的M9培養(yǎng)基(6g/lNa2HP04、3g/lKH2P04、0.5g/lNaCl)中，培養(yǎng)用于分離GS的所有重組構(gòu)建體。在37°C、轉(zhuǎn)速為220rpm下對(duì)所有培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。在4。C、10OOOrpm下離心，從培養(yǎng)基中收集細(xì)胞。然后立即使用該生物質(zhì)或在-20。C下存儲(chǔ)直至需要使用時(shí)。此外，由生物質(zhì)純化得到腺苷?；腿ハ佘挣；瘍煞N形式存在的野生型谷氨酰胺合成酶(來(lái)自大腸桿菌pBSK-ECgln)，所述生物質(zhì)從如SeniorP.J.(1975)J.Bact:123(2):407-418所述的連續(xù)培養(yǎng)獲得。在氮過(guò)量和碳限量的條件下生成腺苷?；?，而在氮限量和碳過(guò)量條件下生成去腺苷酰化酶。在4°C、10000rpm下離心10min收集獲得的細(xì)胞，并在-20。C下存儲(chǔ)直至需要使用時(shí)。用于純化谷氨酰胺合成酶的方法由報(bào)道的方法(Shapiro和Stadtman(1970)MethodsEnzymol.17A:910-922.)發(fā)展而來(lái)。將來(lái)自1L培養(yǎng)物的生物質(zhì)重懸于10ml重懸緩沖劑A或(RBA)(10mM咪唑-HCl、2mM卩-巰基乙醇、10mMMnCl2'4H20;pH7.0)中。將細(xì)胞在50%占空比(dutycycle)、6°C下超聲10min。將該超聲溶液在10OOOrpm下離心10min，并保留上清液。加入硫酸鏈霉素(10%w/v的10%)，并在4°C下?lián)璋杌鞈乙?0min。然后在10OOOrpm下離心lOmin并保留上清液。用硫酸調(diào)節(jié)上清液pH至5.15。在4°C下攪拌該混合物15min，然后在13OOOrpm下離心10min。再次保留上清液。添加飽和硫酸銨(體積的30%)并用硫酸調(diào)節(jié)pH至4.6。在4°C下攪拌混懸液15min，然后在13000rpm下離心10min。將獲得的沉淀重懸于2-5mlRBA并用硫酸調(diào)節(jié)pH至5.7。在4°C下攪拌該混懸液過(guò)夜以使得谷氨酰胺合成酶得以重懸，然后在13000rpm下離心10min。保留上清液并將混懸液pH調(diào)節(jié)至7.0。使用AKTAExplorer(AmershamBiosciences)利用親和層析使野生型酶得到進(jìn)一步純化。使用長(zhǎng)度為10cm和內(nèi)徑為10mm的HR10/10柱以5'AMP瓊脂糖4b樹(shù)脂(AmershamBiosciences)實(shí)現(xiàn)分離。將部分純化的谷氨酰胺合成酶制劑(約為2ml)加樣到制備柱上，所述制備柱用10mM咪唑(pH7.0)、150mMNaCl禾口10mMMnCl2'4H20來(lái)平衡。在整個(gè)線性梯度從150mM至500mM的40mlNaCl，使用2.5mMADP將結(jié)合的谷氨酰胺合成酶從柱上洗脫下來(lái)，并收集lml組分。然后收集合并含有純谷氨酰胺合成酶的組分并用RBA透析過(guò)夜。按照標(biāo)準(zhǔn)方案，在7.5MSDS-PAGE凝膠上對(duì)每個(gè)蛋白混懸液的等分試樣進(jìn)行電泳。使用Lowry蛋白檢測(cè)法測(cè)量蛋白濃度，所述的濃度用于測(cè)定所有酶的比活性。大腸桿菌谷氨酰胺合成酶(GS)的定點(diǎn)突變GS序列分析和蛋白分子模擬使用DNAMAN(LynnonBiosoft，Quebec,Canada)進(jìn)行蛋白序列同源性比對(duì)。AccelrysInc.分子模擬軟件(MSIInc.,SanDiego，USA)用于所有使用SiliconGraphicsOctane處理器的蛋白分子模擬。催化機(jī)理的證明-結(jié)果與討論ATP結(jié)構(gòu)分析ATP濃度對(duì)Na4ATP、Mn(HC03-)2-ATP、Mg-ATP和MnCl2-ATP復(fù)合物的NMR分析的影響為測(cè)定溶液中ATP對(duì)ATP的&NMR的堆積效應(yīng)，在Mn(HC03》2-ATP或MnCl2-ATP存在下，測(cè)定ATP濃度(Na4ATP或Mg-ATP)對(duì)Hs、H2、Hi和1120質(zhì)子的L弛豫時(shí)間的影響。以Na4ATP或Mg-ATP濃度的10'3的濃度，將Mn(HCCV)2-ATP和MnCl2-ATP加入Na4ATP和Mg-ATP。以5-120mM的濃度范圍加入ATP。隨著ATP濃度增加到60mmo1，l/pTlp隨濃度的增加呈線性增加。由該數(shù)據(jù)可確定測(cè)定1\和丁2馳豫速率的所有分析應(yīng)當(dāng)在60mmol的Na4ATP和Mg-ATP以及60nmol的MnCl2-ATP或Mn(HC03-)2-ATP的ATP濃度時(shí)進(jìn)行。溫度和頻率對(duì)pT^"和pT2p"弛豫速率的影響使用VarianUNITYplus400MHz核磁共振儀獲得Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物、MnCl2-ATP復(fù)合物和Na4ATP在400MHz的乃和T2馳豫速率。在一定溫度范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并繪制H8、H2、H!和H20質(zhì)子的pT1P"和pT2p"馳豫速率對(duì)1000/K的圖。根據(jù)定義，如果馳豫速率隨溫度的增加而減小，則丁11^和1^1或外層馳豫決定？丁11)-1和？丁21)-1。當(dāng)活化能大于4kcal/mole并且T1P>7/6T2P時(shí)，可排除Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物和MnCl2-ATP復(fù)合物中質(zhì)子H2和&的外層馳豫。Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物和MnCl2-ATP的Hs質(zhì)子行為表現(xiàn)出有所不同。在25°C-35°C之間(1000/K在3.20和3.35之間)，MnClrATP復(fù)合物的H8質(zhì)子的T1P"對(duì)1000/K的圖沒(méi)有表現(xiàn)出溫度效應(yīng)。對(duì)于Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物，T1P"對(duì)1000/K的H8圖在25°C-35°C之間增加，隨后下降。對(duì)該增加的解釋是，如果配體交換決定馳豫速率，則IAcm(結(jié)合和未結(jié)合形式之間的配體交換速率)決定馳豫速率丁11>-1和丁21>-1。如果Tm決定Lp，則TM〉TW，而因?yàn)門(mén)2M《T,M，則TM—定也決定T2p，結(jié)果是T^1三T2P"。當(dāng)T2p力Ti/顯著小于1時(shí)，則情況有所不同。當(dāng)Tm隨溫度增加而減小時(shí)，L/和T2P"—定隨溫度增加而增加。因?yàn)樵赥nT1或T2p"對(duì)頻率的圖中，tm不依賴(lài)于頻率，所以Tw"和T2/應(yīng)該也不依賴(lài)于頻率。如果觀察到的馳豫速率依賴(lài)于頻率，除化學(xué)交換外，速率過(guò)程對(duì)U故出顯著貢獻(xiàn)。Mn(HCCV)2-ATP復(fù)合物和MnCl2-ATP的Tw和T2P對(duì)頻率的測(cè)定顯示了對(duì)頻率的依賴(lài)性。數(shù)據(jù)的線性回歸用于計(jì)算斜率與截距之比從而計(jì)算tc2。因此，除化學(xué)交換外的速率過(guò)程對(duì)T^做出顯著貢獻(xiàn)。Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物和MnCl2-ATP中的質(zhì)子H2和Hi均顯示出頻率依賴(lài)性以及馳豫速率Tn^隨溫度增加而減小。因?yàn)榛瘜W(xué)交換率具有正溫度系數(shù)，溫度系數(shù)的負(fù)依賴(lài)說(shuō)明1/tm不能成為限速過(guò)程。因此Lm決定TV1，而Tw反過(guò)來(lái)由Tr、Ts或Tm決定。通常；和Tm隨溫度升高而減小(1和1/v隨溫度升高而增大)，然而Ml^+復(fù)合物的^卻可能增大或減小。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)H8質(zhì)子的Tn^對(duì)溫度的圖顯示為先上升然后下降，而Tw顯示正的頻率依賴(lài)性，所以可測(cè)定溫度對(duì)Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物和MnCl2-ATP復(fù)合物的電子自旋弛豫時(shí)間的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。發(fā)現(xiàn)電子自旋弛豫時(shí)間的數(shù)量級(jí)為1.5xl0^秒。如果^小于、，則不發(fā)生快速交換，并且不能由^決定Lm。表9列出了由每個(gè)質(zhì)子的T^頻率依賴(lài)性和電子自旋弛豫時(shí)間計(jì)算得到的相關(guān)時(shí)間比較。因?yàn)門(mén)i/是頻率、的函數(shù)，所以由方程l和方程3可計(jì)算q和r。有人認(rèn)為，在所用的溫度范圍內(nèi)理解這些ATP復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)，并且當(dāng)溫度趨于35°C時(shí)，Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物中的錳到達(dá)緊鄰ATP的Cs碳的位置。該情況通過(guò)使用Solomon-Bloemgergen方程計(jì)算的原子間距離得以證實(shí)。因?yàn)樘妓釟涓嬖谙滤@得的C8質(zhì)子行為數(shù)據(jù)不同于氯離子存在下的數(shù)據(jù)，所以還顯示碳酸氫根的存在對(duì)ATP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)起重要作用。這對(duì)于PT2p"尤其正確。在碳酸氫根存在的情況下，C8-H原子間距離也很近。Tw值在通過(guò)化學(xué)鍵來(lái)傳輸?shù)臉?biāo)量相互作用和通過(guò)空間來(lái)傳輸?shù)呐紭O相互作用方面均有重要貢獻(xiàn)。T^只有偶極貢獻(xiàn)。當(dāng)超精細(xì)常數(shù)^很小或所觀察的核子與順磁粒子之間無(wú)化學(xué)鍵時(shí)，T^和T2M幾乎相等。對(duì)于Cs質(zhì)子，Mn(HC03)2-atp復(fù)合物的T^Vt!/值明顯小于MnCl2-atp復(fù)合物的T2p-Vl^"值。有人提出這是Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物的Mn"與腺嘌呤環(huán)的;t-軌道緊密作用的結(jié)果。由原子間距離的數(shù)據(jù)可知，在所有的測(cè)試溫度下，顯示Mi^+和HC(V的存在對(duì)Mi^+靠近C8質(zhì)子發(fā)揮重要作用。表9.溫度對(duì)Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物和MnCl2-ATP復(fù)合物的偶極相關(guān)時(shí)間的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表10.溫度對(duì)Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物和MnCl2-ATP復(fù)合物的Mn^-質(zhì)子的原子間距離的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>Mn(HC03)2-ATP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)基本上不同于MgATP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；特別是金屬離子配位到Q碳上。該結(jié)構(gòu)用于使用Accdrys配套軟件進(jìn)行基于配體的合理藥物設(shè)計(jì)程序中。、[Mg2+]和[HC03']對(duì)ATP的Q氘代和ATP水解的影響在pH6.3，ATP水解速率依賴(lài)于Mi^+的濃度和存在。僅Na2ATP、NaHC03和Na2ATP、NaHC03、MgCl2和Na2ATP均表現(xiàn)出相同的水解速率。在含有MgCh和NaHC03的溶液中，碳酸鎂沉淀導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)臨近結(jié)束時(shí)發(fā)生數(shù)據(jù)錯(cuò)誤。加入Mi^+顯示出能顯著提高水解速率。含有2分子NaHC03和2分子MnCl2的溶液的水解速率高于含有1分子NaHC03和2分子MnCl2溶液的水解速率，因此NaHC03濃度也顯示出發(fā)揮作用。于pH6.3禾n7.3以及37°C下，在336小時(shí)內(nèi)測(cè)定NaHC03、MnCl2、MgCh和020對(duì)ATP水解速率的影響。水解速率由數(shù)據(jù)(表11和表12)的回歸分析計(jì)算。在336小時(shí)內(nèi)，數(shù)據(jù)由對(duì)每個(gè)濃度5個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)、每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)設(shè)4個(gè)樣品來(lái)計(jì)算。以D20為溶劑在每個(gè)pH下進(jìn)行反應(yīng)K和U。咪唑濃度的成倍增大使水解速率有效地成倍提高。在？116.3時(shí)112+濃度對(duì)水解速率差異的影響比在pH7.3時(shí)的影響大。因?yàn)橛蒓H'引起的水解，在pH7.3時(shí)，不存在金屬離子時(shí)的水解速率高于在pH6.3時(shí)的水解速率，然而在較高pH時(shí)，HC(V和Mn"的影響均有所減少。在存在3個(gè)錳離子時(shí)比較反應(yīng)速率，則Mn"的影響很明顯。pH7.3下存在Mg2+時(shí)水解速率的提高大于pH6.3下不存在HC(V時(shí)水解速率的提高。HCCV的存在也提高了pH7.3下存在Mg^時(shí)的水解速率。因?yàn)镸gHC03沉淀，所以不能確定pH6.3下存在Mg"時(shí)HC03'對(duì)水解速率的影響。D20的存在提高了pH6.3下的水解速率。NaHC03濃度的成倍增大提高了在每個(gè)相等Mi^+濃度下的氘代速率。低碳酸鹽濃度下，ATP水解速率明顯依賴(lài)于M^+濃度。因此，氘代依賴(lài)于碳酸鹽濃度。在高NaHC03濃度下，ATP水解速率表現(xiàn)出不依賴(lài)于Mn2+濃度；然而在Mn2+與ATP的濃度比小于3:1，即2Mn2+:ATP和1M^+:ATP時(shí)，水解速率和氖代速率則為非線性。Mn"與ATP的濃度比明顯具有影響。表11.NaHC03、MnCb和MgCl2濃度和D20對(duì)ATP水解速率的影響。分析A-L包括10mM咪唑和lmMATP，而分析M-U包括20mM咪唑和lmMATP。在pH6.3和37。C下進(jìn)行分析。反應(yīng)K和U包括作為溶劑的D20。反應(yīng)進(jìn)行336小時(shí)并且該數(shù)據(jù)由5個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)計(jì)算。在每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，每個(gè)樣品進(jìn)行4個(gè)分析。由于存在Mg^和碳酸鹽，所以反應(yīng)J發(fā)生沉淀。所用的NaHC03、MnCl2或MgCl2濃度如下所示。和[HCOn對(duì)ATP水解速率和ATP在C8-H氘代的影響。在化學(xué)計(jì)量為6HC(V:3Mn2+:lATP時(shí)，水解速率比不存在金屬離子時(shí)更高；然而發(fā)現(xiàn)水解和氘代均不是線性的。在化學(xué)計(jì)量為12HC03—:3Mn2+:lATP時(shí)，發(fā)現(xiàn)水解速率和氘代速率均為線性。在化學(xué)計(jì)量為12HC03—:lMn2+:lATP時(shí)，再次發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)不是線性的。如GS酶數(shù)據(jù)所示，有人認(rèn)為顯示出形成了穩(wěn)定的復(fù)合物Mn2+3(HC03')12-ATP。在腺苷酰化GS酶學(xué)中也發(fā)現(xiàn)該情況(參見(jiàn)下文)。在不存在HC(V或M^+時(shí)，氘代速率和水解速率與只存在HC03.時(shí)相同。通過(guò)H20或通過(guò)涉及配位的C02的另一機(jī)理可發(fā)生ATP的水解?？梢韵氲降氖?，配位的C02在N7形成羧化中間體，然后該羧化中間體進(jìn)攻"磷酸，將其水解從而形成膦甲酸。比較12HC(V和3Mn2+與6HC(V和3Mn2+下的氖代速率說(shuō)明氖代速率在12HCCV存在時(shí)較高。水解速率與氘代速率在兩種條件下均不相等，而兩種條件下的氘代均比水解快。Mn21nHC03—在氘代和水解中均發(fā)揮作用，然而獲得相等的速率依賴(lài)于獲得水解和氘代均需要的Mr^+和HC(V配位的精確的立體化學(xué)。有人提出，通過(guò)谷氨酰胺合成酶存在的主要側(cè)鏈有利于形成Mr^+和HCC^配位的精確的立體化學(xué)。pH對(duì)咪唑緩沖液中NH4HC03離解的影響測(cè)定pH對(duì)含有l(wèi)mMNH4HC03的lOmM咪唑.HCl和10mM咪唑.HCl的比電導(dǎo)率的影響。兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的比電導(dǎo)率差異用于計(jì)算NH4HC03在不同pH水平離解的摩爾電導(dǎo)率對(duì)電導(dǎo)率的貢獻(xiàn)，并測(cè)定咪唑?qū)τ蓀H引起的HC(V向C02轉(zhuǎn)化的影響。然后將其與由下式中的任一個(gè)計(jì)算得到的理論摩爾電導(dǎo)率相比較A=a(;i;[NH4+]+A[HC03—]+義乂[Imi+])或者A=a(^[NH4+]+A[HC03—]基于NH4HC03離解為NH/和HCCV或NH/、HC(V和咪唑銀嘴離子，并且該離解和存在的咪唑^I離子不會(huì)對(duì)NH4C03離解為HC03，C02產(chǎn)生不利影響。該計(jì)算基于由Henderson-Hasselbach方程獲得的HC(V濃度，所述方程用于獲得pH對(duì)[HC03']和[C02]的相對(duì)比例的理論影響。還需要考慮NH/和HCCV的摩爾電導(dǎo)率以及由NH4+形成咪唑銀,離子。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage87</formula>其中，A^H二每個(gè)特定的pH下的摩爾電導(dǎo)率入j:每個(gè)離子的比電導(dǎo)率服/=具有NH/抗衡離子的HC(V濃度。w=具有咪唑銀嘴抗衡離子的HC(V濃度。當(dāng)假設(shè)只將NH4+作為HC(V的抗衡離子進(jìn)行計(jì)算時(shí)，理論數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不相等。當(dāng)假設(shè)HC03—的抗衡離子為NH4+和咪唑銀t離子兩種時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論數(shù)據(jù)相等。由該數(shù)據(jù)，通過(guò)NH4+濃度和咪唑.HCl的pKa可指示咪唑銀,離子的離解，最高比例的咪唑錢(qián),抗衡離子在較低pH值時(shí)出現(xiàn)。通過(guò)溶液中的NH4HC03濃度而不是咪唑.HC1濃度來(lái)指示形成的咪唑龜嘴離子的比例。因此，在咪唑存在下，NH4HC03的離解確實(shí)遵從理論離解，并且當(dāng)pH由pH7.2降低到pH6.3時(shí)，溶液中的C02濃度增加。這對(duì)所提出的谷氨酰胺合成酶反應(yīng)機(jī)理很有意義，因?yàn)楫?dāng)pH6.3時(shí)，在酶分析條件下，會(huì)出現(xiàn)HCCV和C02的摩爾濃度相等。在假設(shè)反應(yīng)機(jī)理中有人提出，當(dāng)谷氨酰胺合成酶以完全腺苷酰化形式存在時(shí)，C02在磷酰基轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到不可缺少的作用。Mi^+或Mg^濃度以及ATP濃度對(duì)腺苷?；腿ハ佘挣；疓S活性的影響在所檢測(cè)的ATP濃度范圍內(nèi)，[Mi^+]對(duì)通過(guò)ADP形成測(cè)量的腺苷?；疓S比活性的影響增加到最優(yōu)的3Mn"/ATP。在存在的NaHC03濃度為12mmole時(shí)進(jìn)行所有的分析。當(dāng)通過(guò)ADP的形成測(cè)量腺苷酰化GS的比活性時(shí)，顯示出隨[Mg^]增加活性沒(méi)有增加。當(dāng)與通過(guò)谷氨酰胺的形成測(cè)量的腺苷酰化GS比活性進(jìn)行比較時(shí)，可看到類(lèi)似趨勢(shì)。在[M,]存在下，腺苷?；疓S的活性在所檢測(cè)的ATP濃度范圍內(nèi)增加到最優(yōu)值3Mn2+/ATP，而在[Mg^]存在下，GS活性在所檢測(cè)的ATP濃度范圍內(nèi)沒(méi)有增加。使用腺苷酰化GS的基于ADP的比活性數(shù)據(jù)，并假設(shè)在每個(gè)所分析的ATP濃度處，形成穩(wěn)定的ATP和Mr^+的復(fù)合物，該復(fù)合物中，對(duì)每個(gè)ATP對(duì)應(yīng)3個(gè)錳離子。例如，當(dāng)將200pMATP加入200pMMnCl2形成"穩(wěn)定的"MnrATP復(fù)合物為66.7|iMMn3-ATP時(shí)。[Mn"3-ATP]對(duì)通過(guò)ADP形成測(cè)量的腺苷?；疓S比活性的影響說(shuō)明實(shí)際上形成"穩(wěn)定的"復(fù)合物且數(shù)據(jù)的RMS偏差約為0.96。還可看出所得曲線呈S形，顯示出具有協(xié)同性(數(shù)據(jù)未顯示)。使用每個(gè)[Mi^+]的[ATP]數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算v/s的Eadie-Hofstee圖表明數(shù)據(jù)是非線性的。使用[Mn3-ATP]復(fù)合物來(lái)計(jì)算v/s的Eadie-Hofstee圖也表明數(shù)據(jù)是非線性的，然而當(dāng)與使用[Mi^+]來(lái)計(jì)算v/s的圖，該顯示數(shù)據(jù)集中在一起。數(shù)據(jù)沒(méi)有線性還說(shuō)明了可能有正協(xié)同性。當(dāng)向每個(gè)ATP加入l當(dāng)量和2當(dāng)量的Mr^+時(shí)，Mn2+-ATP復(fù)合物形成的其它速率常數(shù)使得用于計(jì)算[Mi^-ATP]的數(shù)據(jù)變得復(fù)雜。當(dāng)向每個(gè)ATP加入3當(dāng)量的Mn2+時(shí)，使用得到的活性數(shù)據(jù)確定的Eadie-Hofstee曲線的微分來(lái)計(jì)算v/s值范圍內(nèi)的^n(表13)。由該數(shù)據(jù)可看出，隨著溶液中MnrATP濃度的提高，酶對(duì)Mn3-ATP的親和力增加，因而也顯示出正協(xié)同性。表13.由Eadie-Hofstee活性圖的曲線斜率計(jì)算得到的腺苷?；劝滨０泛铣擅傅膇^。向每個(gè)ATP加入3當(dāng)量的Mi^+。<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>因?yàn)閿?shù)據(jù)顯示了酶的Mn3-ATP結(jié)合位點(diǎn)之間的正同促協(xié)同性，所以使用Hill方程繪制數(shù)據(jù)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage89</formula>發(fā)現(xiàn)由Hill圖的斜率獲得的Hill系數(shù)(/O為2.0，表明2個(gè)酶亞基相互作用。使用Mg^作為ATP的抗衡離子，沒(méi)有從Hill圖發(fā)現(xiàn)腺苷?；疓S的活性影響的相關(guān)性。使用分子模擬技術(shù)，通過(guò)將T397殘基手動(dòng)腺苷?；瘉?lái)評(píng)價(jià)GS晶體結(jié)構(gòu)，表明通過(guò)兩個(gè)亞基進(jìn)行酶腺苷?；慕Y(jié)果是實(shí)際上可能發(fā)生正協(xié)同。正協(xié)同可通過(guò)兩個(gè)亞基(例如亞基A和H)之間呈對(duì)角的腺苷?；劝滨０泛铣擅傅膬蓚€(gè)AMP殘基發(fā)生。正協(xié)同還可只在2個(gè)活性位點(diǎn)亞基之間發(fā)生，這可由Hill圖的數(shù)據(jù)得到證實(shí)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)[Mg^]與[ATP]之比由1增加到4對(duì)通過(guò)ADP的形成測(cè)量的去腺苷酰化GS比活性產(chǎn)生重要影響。通過(guò)ADP的形成測(cè)量的去腺苷酰化GS的比活性還顯示活性不隨[Mn"]的增加而增加，然而，[Mn"]存在下的去腺苷酰化GS的比活性卻顯著小于Mg^存在下所測(cè)量的活性。當(dāng)與通過(guò)谷氨酰胺的形成測(cè)量的去腺苷酰化GS比活性進(jìn)行比較時(shí)，可看到類(lèi)似趨勢(shì)。當(dāng)繪制[Mg"]與[ATP]不同濃度比下的[ATP]對(duì)以基于ADP的比活性以及基于谷氨酰胺的比活性表示的去腺苷?；疓S活性的影響的圖時(shí)，也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似趨勢(shì)。在1[Mg^]與[ATP]的濃度比下，發(fā)現(xiàn)偏離線性，這可能因?yàn)?[Mg^]與[ATP]形成的平衡常數(shù)不精確為1。在[Mt^+]與[ATP]不同濃度比下對(duì)去腺苷酰化GS的基于ADP的活性和基于谷氨酰胺的活性的比活性的影響顯示隨[ATP]增加活性沒(méi)有顯著增加；然而，在該兩種情況下，隨[M^+]與[ATP]濃度比增加，活性均減小。所用酶的腺苷?；潭葹?%左右。在該腺苷?；潭认?，亞基的別構(gòu)作用可能不明顯。碳酸氫根濃度對(duì)腺苷酰化GS比活性的影響由于GS腺苷?；幕钚院统潭扰c細(xì)胞內(nèi)的代謝通量有聯(lián)系，因此測(cè)定[NaHC03]對(duì)腺苷酰化GS比活性的影響。在ATP濃度為600pM和Mn"濃度為180(HiM的條件下來(lái)測(cè)定比活性。在12NaHC03與1ATP的濃度比下，出現(xiàn)了活性的明顯最優(yōu)值。因此，腺苷?；疓S活性的Mn-ATP復(fù)合物最優(yōu)值顯示出包括12HC(V:3Mn":lATP。在比率為8NaHC03/ATP及小于該比率下，通過(guò)ATP對(duì)ADP活性與谷氨酸對(duì)谷氨酰胺活性的轉(zhuǎn)化比來(lái)測(cè)量的反應(yīng)效率顯示其受到顯著影響，因?yàn)榉磻?yīng)效率由100%降到65%。在比率為8NaHC03/ATP時(shí)，碳酸氫根還使比活性增加五倍。在Q位置氘代的ATP和13CHCCV對(duì)腺苷酰化GS比活性的影響測(cè)定在Cs位置氘代的ATP濃度對(duì)腺苷?；疓S活性的影響，并與在相同條件下使用未氘代的ATP對(duì)腺苷?；疓S活性的影響相比較。ATP在Cs位置氘代的結(jié)果是發(fā)現(xiàn)顯著的催化同位素效應(yīng)。由這些數(shù)據(jù)明顯看出，ATP在C8位置的氘代顯著影響腺苷?；劝滨０泛铣擅傅拇呋钚?。ATP在Cs位置的氘代導(dǎo)致了通過(guò)ADP形成速率測(cè)量的酶活性的增加。然而，由轉(zhuǎn)化效率顯示谷氨酰胺的形成效率更低。有假設(shè)認(rèn)為，在(Mn2+)HHC03-)12-ATP存在下進(jìn)行的腺苷?；劝滨０泛铣擅傅牧柞；D(zhuǎn)移反應(yīng)是通過(guò)金屬卡賓來(lái)調(diào)節(jié)的。參見(jiàn)圖1。反應(yīng)的第一步是將N7質(zhì)子化或羧化從而在N7形成亞胺正離子。還可能通過(guò)配位于一個(gè)Mi^+離子上的C02使與的N7羧化。一旦通過(guò)二氧化碳鰲合形成ATP的亞胺正離子，則配位的羧酸鹽就會(huì)協(xié)助Q的去質(zhì)子化，生成能結(jié)合Mi^+的卡賓體物質(zhì)。Mi^+的結(jié)合依賴(lài)于卡賓體物質(zhì)IV的壽命(圖1)。該物質(zhì)的壽命可能依賴(lài)于在分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移步驟中形成的氨基甲?；?氫鍵的離解速率。因此，以氘替代氫使物質(zhì)IV獲得穩(wěn)定，促進(jìn)了物質(zhì)V的形成，允許磷?；D(zhuǎn)移到鄰近的氨基甲酰殘基上。事實(shí)是，腺苷?；冈趐H6.3發(fā)揮功能最好，在該pH，NaHC03離解為等摩爾濃度的HCCV和C02，這可能在促進(jìn)通過(guò)存在的HC(V和C02調(diào)節(jié)的催化步驟中起重要作用。此時(shí)，羧基可進(jìn)攻ATP的"磷酸，形成膦甲酸，然后使谷氨酸的S-羧基磷?；瘡亩纬蒠-谷氨酰磷酸。為了證明HC(V在所調(diào)節(jié)的反應(yīng)中的作用，測(cè)定"CHC03—的影響；參見(jiàn)表14。在每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，很明顯兩種重同位素形式的谷氨酰胺合成酶對(duì)腺苷酰化谷氨酰胺合成酶的比活性均有影響。因?yàn)閷?duì)"CHCCV的催化同位素效應(yīng)十分明顯，所以當(dāng)活性增加很顯著時(shí)，碳酸鹽在反應(yīng)中必須發(fā)揮超出溶質(zhì)效應(yīng)的作用。表14.13CHC03和12CHC03以及氘代和未氘代的ATP對(duì)腺苷酰化谷氨酰胺合成酶的比活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>有人認(rèn)為co2(或其水合形式)從機(jī)理上參與了磷?；D(zhuǎn)移過(guò)程，因此可合理地提出，磷?；D(zhuǎn)移速率應(yīng)該受制于由所用的二氧化碳形式產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng)?？赡艿那闆r是，導(dǎo)致物質(zhì)II生成的二氧化碳鰲合的速率很慢，并且平衡可能向左移-離解速率高。因此，復(fù)合物的聚集由速率決定。所以，使用重的二氧化碳同位素將導(dǎo)致正反應(yīng)和逆反應(yīng)均滯后。如果隨后的通過(guò)氨基甲?；贑s的去質(zhì)子化(和隨后的反應(yīng))很快，則重同位素將延長(zhǎng)該物質(zhì)壽命-增加了能進(jìn)行的級(jí)聯(lián)中的進(jìn)一步反應(yīng)的可能性。實(shí)際上，當(dāng)使用二氧化碳源的13C變體檢驗(yàn)谷氨酰胺形成和ATP消耗時(shí)，可觀察到這種情形。速率效應(yīng)是二氧化碳(或水合的等同物)在磷?；D(zhuǎn)移機(jī)理中的從機(jī)理上參與的表現(xiàn)。HCCV存在下ATP的氨基甲酸鹽中間體的證明在溶解于D20的濃度為20mM的KH2HPCVK2HP04緩沖液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所用的ATP、NaHC03、MnCl2和MgCl2的濃度是變化的，ATP在0-lmM、NaHC03在0-12mM，MnCl2禾卩MgCl2在0-3mM范圍內(nèi)變化。為了證明腺嘌呤環(huán)的N7的作用，還通過(guò)加入腺苷或殺結(jié)核菌素替代ATP進(jìn)行反應(yīng)分析。在殺結(jié)核菌素中，以碳原子替代N7。將連二硫酸鈉(Na2S202)加入樣品至濃度為4mM并且將pD調(diào)節(jié)到pD6.3。48小時(shí)后，加入EDTA至其濃度為4.0mM，將樣品離心10min除去二價(jià)金屬離子。然后獲得iHNMR譜圖，因?yàn)槿绻纬砂被姿猁}中間體，則該中間體將還原為通過(guò)NMR即可鑒定的甲酸。HC(V存在下ATP的氨基甲酸鹽中間體的證明假設(shè)反應(yīng)混合物中存在HCO"ATP在Na2S202存在下生成甲酸。有人提出該甲酸是由在位置N7形成的氨基甲酸鹽中間體生成的。通過(guò)Powers和Meister(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.73:(9)，3020-3024)所述的類(lèi)似機(jī)理可發(fā)生該還原，然而，在該情況下是通過(guò)>^28202而不是KBH4發(fā)生還原。ATP結(jié)合C02的ATP-氨基甲酸鹽中間體的鑒定通過(guò)如下來(lái)證明將ATP亞胺正離子誘導(dǎo)為在N7的氨基甲酸鹽，即通過(guò)在Na2S202存在下使ATP、HCCV、Mn2+或Mg^反應(yīng)，顯示氨基甲酸鹽中間體被還原從而形成甲酸。所有分析均在溶解于D20的pD6.3的20mM磷酸緩沖液中進(jìn)行，并且所有試劑均溶解于D20中制備。表15列出了所進(jìn)行的分析。反應(yīng)混合物包括濃度為4mM的Na2S204。加入甲醇直至其濃度為2mM作為內(nèi)標(biāo)物。加入Na2S204時(shí)，用1MDC1將pD調(diào)節(jié)為pD6.3。反應(yīng)進(jìn)行48小時(shí)，這時(shí)加入U(xiǎn)SBEDTA使EDTA的最終濃度為4mM。將樣品在10000xg下離心從而除去Mn2+，得到NMR&譜圖。通過(guò)甲酸相對(duì)于甲醇內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)位移強(qiáng)度來(lái)測(cè)定生成的甲酸濃度。分析(1)lmMATP、3mMMnCl2、12mMNaHC03和4mMNa2S204;(2)0mMATP、0mMMnCl2、12mMNaHC03和4mMNa2S204;(3)lmMATP、0mMMnCl2、12mMNaHC03和4mMNa2S204;(4)0mMATP、3mMMnCl2、12mMNaHC03和4mMNa2S204;(5)lmMATP、3mMMnCl2、12mMNaCl和4mMNa2S204;(6)lmMATP、3mMMgCl2、12mMNaHC03和4mMNa2S204;(7)lmM腺苷、3mMMnCl2、12mMNaHC03和4mMNa2S204;(8)lmM殺結(jié)核菌素、3mMMnCl2、12mMNaHC03和4mMNa2S204;(9)含有加入的2mM甲酸的反應(yīng)物1;以及(10)2mM甲酸標(biāo)準(zhǔn)品。<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>通過(guò)還原為甲酸(在8.55ppm時(shí)有NMR位移)可證明確實(shí)形成了氨基甲酸鹽中間體。甲酸的形成依賴(lài)于碳酸氫根、ATP和Mi^+的存在。分析7和分析8分別包括腺苷和殺結(jié)核菌素。建立這兩個(gè)分析以證明氮位置7對(duì)形成氨基甲酸鹽以及其還原為甲酸的必要性。由該數(shù)據(jù)可看出，Mr^+配位到ATP的多磷酸上是發(fā)生反應(yīng)所必需的。當(dāng)使用Mg^替代Mn^時(shí)，可看出形成了少量的甲酸。實(shí)施例2分子模擬和合理藥物設(shè)計(jì)GS晶體結(jié)構(gòu)的分析由Brookhaven蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)lf52.pdb)獲得來(lái)自大腸桿菌的去腺苷?；疓S的晶體結(jié)構(gòu)(Gill,H.S.和D.Eisenburg(1994)Biochemistry,40:1卯3-1912)。因?yàn)樗龅鞍滓驯唤Y(jié)晶且每個(gè)活性位點(diǎn)內(nèi)都具有ADP殘基，所以使用該結(jié)構(gòu)。由該結(jié)構(gòu)產(chǎn)生GS多肽四聚體從而形成單活性位點(diǎn)。ATP結(jié)構(gòu)分析中提出的"封閉"形式的(Mn2+)HHCCV)12-ATP復(fù)合物是基于iHNMR數(shù)據(jù)的Mn2+鄰近以及Mn2+的配位化學(xué)要求以在Q氘代中發(fā)揮作用。使用InsightII(Accelrys)軟件構(gòu)建(M^+》(HC03':h2-ATP結(jié)構(gòu)并進(jìn)行能量最小化。產(chǎn)生的模擬結(jié)構(gòu)具有位于磷酸尾部之上和之下的2個(gè)Mi^+以及鄰近腺嘌呤環(huán)配位的第三個(gè)Mn2+。然后使用Accelrys軟件將(Mn2+)HHC(V;h2-ATP復(fù)合物的腺嘌呤環(huán)疊加到活性位點(diǎn)中ADP的腺嘌呤環(huán)上，從而將該結(jié)構(gòu)插入活性位點(diǎn)。將組裝體進(jìn)行能量最小化，并鑒定與ATP相關(guān)的氨基酸側(cè)鏈從而能對(duì)這些殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，以便可以闡明它們?cè)诠劝滨０泛铣擅刚{(diào)節(jié)的催化中的作用。經(jīng)鑒定的氨基酸殘基來(lái)自相鄰亞基的Glul29、Glu207、His269、His271、Arg224和Arg355以及Lys47'。大腸桿菌GS的定點(diǎn)突變和酶分析對(duì)來(lái)自大腸桿菌的GS在Glu207、His269、His271和Arg355上進(jìn)行定點(diǎn)突變。當(dāng)從每個(gè)克隆體分離和純化GS并使用GS的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法測(cè)定酶的比活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些突變破壞了酶的功能性。這些氨基酸殘基表現(xiàn)出在GS活性位點(diǎn)內(nèi)發(fā)揮重要作用，有假設(shè)認(rèn)為His269和ffis271殘基在磷酰基轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。當(dāng)基于ADP和谷氨酰胺形成使用HPLC測(cè)量酶活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似結(jié)果。使用兩種酶分析法來(lái)評(píng)價(jià)谷氨酰胺合成酶活性。所用的第一種分析法Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法，測(cè)量"逆"反應(yīng)作為谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性。在該逆反應(yīng)中，在ADP、砷酸鹽和錳或鎂的存在下，羥胺和谷氨酰胺反應(yīng)生成"谷氨酰羥肟酸和游離氨(Shapiro禾nStadtman(1970)MethodsinEnzymol.17A:910-922)。這形成了谷氨酰胺合成酶活性分析法的基礎(chǔ)。在測(cè)定酶等電點(diǎn)所得的正確pH下，谷氨酰胺合成酶的腺苷?；腿ハ佘挣；瘍煞N形式的轉(zhuǎn)移酶活性相同。然而，這兩種形式的酶可以得到區(qū)分，因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)時(shí)，完全腺苷?；墓劝滨０泛铣擅副?0mMMg^完全抑制，而去腺苷?；拿竸t不受影響(BenderRA，KAJanssen，ADResnick，MBlumberg，F(xiàn)Foor禾口BMagasanik，(1977)JournalofBacteriology129:1001-1009)。因此，可基于它們?cè)趐H7.15下、Mn2+或Mg2+存在時(shí)其活性的差異，將兩種形式酶的活性區(qū)分開(kāi)來(lái)。在兩種不同的分析混合物中測(cè)量谷氨酰胺合成酶活性一種只含有Mn，而第二種含有Mn和Mg。所有試劑在咪唑緩沖液(pH7.0)中制備。在總體積600^1中實(shí)施兩種分析法。如下表16所示，建立Mn分析法，以及如表17所示，建立組合分析法。表16.基于Mi^+的谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法的分析混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>表17.基于Mn2lBMg^的谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析法的分析混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>以與Mn"反應(yīng)相同的方式制備空白反應(yīng)物，但是用等體積的水替代ADP和砷酸鹽溶液。在37°C下使分析混合物平衡5min，然后添加50pi酶制劑開(kāi)始反應(yīng)。使該反應(yīng)進(jìn)行30min，然后添加900piStopMix(1MFeCl3.6H20、0.2M三氯乙酸和7.1%v/vHC1)終止該反應(yīng)。接下來(lái)，將樣品在Eppendorf微量離心機(jī)中于13000rpm下離心2min以除去可能形成的任何沉淀，并在540nm下測(cè)量吸光度。所有結(jié)果表示為以pmole谷氨酰異羥肟酸復(fù)合物/min/mg蛋白表示的比活性?？紤]亞基的數(shù)目，由去腺苷?；痀-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性與總Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性(Mi^+反應(yīng))之比來(lái)計(jì)算腺苷?；潭?。此外，使用HPLC來(lái)評(píng)價(jià)由ATP、谷氨酸和氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺和ADP的轉(zhuǎn)化率。這稱(chēng)為"正"反應(yīng)或"生物合成"反應(yīng)，并使用兩種不同的分析法來(lái)分析一種是測(cè)量在ATP存在下，谷氨酰胺合成酶將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺的能力，而第二種測(cè)定在相同的分析混合物中ATP向ADP和AMP的轉(zhuǎn)化。建立該分析以測(cè)量谷氨酰胺合成酶的正反應(yīng)。分析法測(cè)量在MnHC03-ATP(第一種反應(yīng)的基礎(chǔ))和MgATP(第二種反應(yīng)的基礎(chǔ))存在下由L-谷氨酸形成的谷氨酰胺的量，并且還測(cè)量ATP、形成的ADP和AMP的量。同一分析混合溶液用2種HPLC法進(jìn)行，一種用于谷氨酸/谷氨酰胺分析，而另一種用于ATP/ADP/AMP分析。如表18所示，建立該分析法。表18.用于HPLC分析法以測(cè)定谷氨酸和ATP轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺和ADP的轉(zhuǎn)化率的分析組分。<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>在pH6.3下進(jìn)行Mi^+分析法，在pH7.3下進(jìn)行Mg^分析法。將所有酶制劑以50pl的體積加入分析混合物中。酶的添加啟動(dòng)了反應(yīng)，然后使其反應(yīng)l小時(shí)。加入6^1150%三氯乙酸溶液終止該反應(yīng)。然后將每個(gè)分析物均分到4個(gè)HPLC小瓶(150nl/小瓶)進(jìn)行分析，在Agilent100HPLC設(shè)備上使用PhenomenexLuna5nC18柱對(duì)其中的兩個(gè)進(jìn)行谷氨酸和谷氨酰胺分析以及ATP/ADP分析。所有分析平行進(jìn)行三次。由該數(shù)據(jù)可看出H271連接到腺苷?；问降拿干?，因?yàn)楫?dāng)包括雙突變Y397V，生成完全去腺苷?；问降拿笗r(shí)，所有活性將喪失。因此有人提出His271在腺苷?；问矫傅募俣ǖ牧柞；D(zhuǎn)移反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Histidine269顯示發(fā)揮重要作用，但其影響闡述的不夠明確。表19.大腸桿菌WT和構(gòu)建的突變體的谷氨酰轉(zhuǎn)移酶分析結(jié)果。WT酶是指在修飾的M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株，WT(AD)和WT(DD)分別是指連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)生的腺苷?；负腿ハ佘挣；?。<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>表20.顯示使用HPLC測(cè)定的谷氨酸和ATP轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺和ADP的轉(zhuǎn)化率的分析結(jié)果。WT酶是指在修飾的M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株，而WT(AD)和WT(DD)是指在連續(xù)培養(yǎng)中產(chǎn)生的腺苷?；腿ハ佘挣；?。所示值代表三次不同分析的平均值，其中該值的偏差小于5%。<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>從機(jī)理上參與的數(shù)據(jù)給定pH6.3時(shí)ATP與酶的比率和濃度，將體系的錳含量和二氧化碳(或其水合形式)含量確定為主要參數(shù)?？疾炝嗽诖嬖诿负筒淮嬖诿傅臈l件下這些參數(shù)的影響。文獻(xiàn)已經(jīng)證明了在不存在酶的條件下，在由ATP生成ADP方面，與重要參數(shù)的改變相關(guān)的定量效果，即主要參數(shù)對(duì)C8氘結(jié)合有影響(其中，已經(jīng)在作為體溶劑基質(zhì)的D20中檢驗(yàn)了該參數(shù)的影響)。在酶存在的條件下，可將磷?；D(zhuǎn)移效率(可看作是由ADP的生成形成谷氨酰胺的可能性)的檢驗(yàn)作為機(jī)理的探針。在不存在酶的條件下，ATP水解為ADP的速率很大程度上依賴(lài)于錳離子與ATP的比。相反，ADP生成速率(在穩(wěn)定的錳水平下)基本上與碳酸鹽的化學(xué)計(jì)量無(wú)關(guān)。該觀察產(chǎn)生的結(jié)論是碳酸鹽(或二氧化碳)對(duì)ATP水解的作用很小。因?yàn)閜H為常數(shù)6.3，氫氧根離子的絕對(duì)濃度是常數(shù)，因此ATP水解唯一的決定因素是金屬離子濃度，而該金屬離子濃度反過(guò)來(lái)決定在磷酸骨架附近的金屬-氧復(fù)合物(在該例子中可能是金屬結(jié)合于咪唑)的水平。當(dāng)使用D20作為溶劑基質(zhì)進(jìn)行水解研究時(shí)，觀察氘結(jié)合到Cs的另外的結(jié)果。相比于與水解相關(guān)的數(shù)據(jù)，所觀察到在穩(wěn)定的錳離子濃度下的氘代速率隨碳酸鹽濃度增加而增加(表11中的第O和R、P和S、Q和T項(xiàng))，而不伴隨水解速率的提高。該觀察說(shuō)明氖結(jié)合依賴(lài)于碳酸鹽。當(dāng)以類(lèi)似方式檢驗(yàn)酶催化和ATP調(diào)節(jié)的谷氨酸向谷氨酰胺轉(zhuǎn)化時(shí)，這些觀察結(jié)果的從機(jī)理上的參與變得顯而易見(jiàn)?，F(xiàn)在ADP由水解(不生成谷氨酰胺)和磷?；D(zhuǎn)移(產(chǎn)生谷氨酰胺)生成。谷氨酰胺形成速率與ADP形成速率的差異闡明了水解速率。很顯然，谷氨酰胺形成速率依賴(lài)于錳離子和碳酸鹽的化學(xué)計(jì)量。因此得出的結(jié)論是碳酸鹽在ADP生成中發(fā)揮主要作用，其中ADP的生成導(dǎo)致了磷?；某晒D(zhuǎn)移(在本底水解中，沒(méi)有觀察到碳酸鹽的作用)。該事實(shí)也通過(guò)"CHCCV對(duì)腺苷酰化形式的谷氨酰胺合成酶活性的正的催化同位素效應(yīng)得到證實(shí)。因?yàn)楫?dāng)不存在酶時(shí)，在020基質(zhì)中Q位置的氘代遵循類(lèi)似的趨勢(shì)，因此暗示很有可能由類(lèi)似于參與磷酰基成功轉(zhuǎn)移的過(guò)渡態(tài)產(chǎn)生氘代。這提示在結(jié)合到酶活性位點(diǎn)之前，復(fù)合物發(fā)生一定程度的初步自聚集，這是造成磷?；脑?。因?yàn)樘妓猁}磷?；D(zhuǎn)移機(jī)理有機(jī)理上的牽連，因此使用"CC02(或其水合形式)觀察到動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng)是合理的。實(shí)際上，可觀察到對(duì)谷氨酰胺形成的影響。然而，觀察到ATP消耗的相應(yīng)增加提示在適合于磷?；D(zhuǎn)移的條件下，通過(guò)與不存在酶時(shí)觀察到的類(lèi)似機(jī)理，酶促進(jìn)Y-磷?；鶜埢幕罨?。簡(jiǎn)言之，可以得出的結(jié)論是錳離子濃度(直至達(dá)到最優(yōu)值)是造成ATP的y-磷?；鶜埢罨闹饕?。然而，造成谷氨酰胺形成原因的磷?；D(zhuǎn)移機(jī)理與碳酸鹽有牽連并涉及C8-H殘基的斷裂。當(dāng)從機(jī)理上不需要碳酸鹽(但有足夠的錳離子)時(shí)，酶能活化Y-磷?；鶜埢?，但缺乏將殘基有效轉(zhuǎn)移到谷氨酸的能力。討論提出一種通過(guò)假定的Mn2+3(HC03-)12-ATP復(fù)合物來(lái)調(diào)節(jié)的新反應(yīng)機(jī)理(圖1)。有人提出通過(guò)配位的HC03—進(jìn)行質(zhì)子化或通過(guò)N7羧化在N7處誘導(dǎo)亞胺正離子。有人認(rèn)為將反應(yīng)pH和HC(V在pH6.3時(shí)離解為C02緊密聯(lián)系，則很有可能產(chǎn)生羧化中間體。由含有HCCV的反應(yīng)物中捕獲的甲酸所得到的數(shù)據(jù)也暗示了氨基甲酸鹽中間體生成了亞胺正離子。以此方式鰲合二氧化碳(或其水合形式例如碳酸氫根)類(lèi)似于Ashman，L.K和D.B.Keech，(1975)J.Biol.Chem.250:14-21所記載的方式，該方式在研究生物素調(diào)節(jié)酶羊腎丙酮酸羧化酶的ATP水解和二氧化碳固定之間關(guān)系中提出，其中提出膦甲酸為過(guò)渡中間體。于是，在N7處形成亞胺正離子使得可以通過(guò)所形成的去質(zhì)子化的氨基甲酸或另一配位的HC03'(去質(zhì)子化的)使Cs去質(zhì)子化，所生成的中間體(IV)通過(guò)Mn^和Cs之間形成的假定結(jié)合得到穩(wěn)定。所形成的物質(zhì)(V)引起末端的磷酰基殘基靠近氨基甲?；⒁鹪摿柞；鶜埢话被柞埢椇希苫罨陌被柞；柞；?VI)(原ATP的P-磷酸的靠近使得該步驟具有可逆性，正如Kaziro等人(1962)J.Biol.Chem.237:(5)，1460-1468)在研究關(guān)于丙?；然钢兴岢龅哪菢?。羧化所需的C02來(lái)自配位的C02(或其水合形式)。pH6.3下，HC(V與C02之比為50:50對(duì)獲得腺苷?；劝滨０泛铣擅傅淖顑?yōu)反應(yīng)速率至關(guān)重要。pH最優(yōu)值pH6.3顯示對(duì)于該過(guò)程容易獲得C02和HC(V并且這兩種物質(zhì)在催化中均發(fā)揮作用。于是，羧化的N7通過(guò)ATP的？磷酸水解可用于膦甲酸的形成中。然后，在反應(yīng)中，磷酸通過(guò)His271以及可能通過(guò)His269移位到谷氨酸的Y-羧基，形成Y-谷氨酰磷酸。然后"谷氨酰磷酸在另一個(gè)機(jī)理中受到親核進(jìn)攻，形成谷氨酰胺。E207和Arg355殘基通過(guò)氫鍵在穩(wěn)定磷?；D(zhuǎn)移中間體中發(fā)揮作用。在Mn2+3(HC(V)12-ATP復(fù)合物中發(fā)生的可能的配位如下2個(gè)Mi^+離子位于磷酸尾部平面之上和之下，一個(gè)Mn^離子配位到腺嘌呤環(huán)?？傊?，所提出的催化機(jī)理基于以下幾點(diǎn)"當(dāng)存在Mi^+時(shí)，顯示ATP的磷酸鏈配位到Mn2+，而Mr^+反過(guò)來(lái)又配位到腺嘌呤環(huán)的C8碳。'當(dāng)存在HC03'然后又存在Cl—時(shí)，Mr^+與C8質(zhì)子靠得更近。"當(dāng)不存在酶時(shí)，ATP的水解速率依賴(lài)于Mn2lQHC(V的濃度和存在。"當(dāng)不存在酶時(shí)，顯示ATP的水解速率與以12HC03':3Mn2+:lATP的比例存在的Mi^+和HC03—有關(guān)。"腺苷酰化ATP所用的反應(yīng)機(jī)理需要Mi^+用于反應(yīng)，而去腺苷酰化ATP需要Mg^用于反應(yīng)。"腺苷?；劝滨０泛铣擅冈诜磻?yīng)中可以使用Mg2+，但ATP水解形成谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化效率卻受到影響。"腺苷?；劝滨０泛铣擅该總€(gè)ATP需要3個(gè)Mr^+離子以達(dá)到最優(yōu)活性。"腺苷?；劝滨０泛铣擅感枰狧C03—和C02以達(dá)到最優(yōu)活性。"pH為6.3確定碳酸氫鹽離解為HCCV和C02。'腺苷?；劝滨０泛铣擅甘褂肕n2+、HC03，ATP的比值為3:12:1。"C8質(zhì)子顯示對(duì)腺苷?；问降墓劝滨０泛铣擅傅幕钚云鸫呋饔?。實(shí)施例3試驗(yàn)抑制劑的合成和評(píng)價(jià)制備嘌呤和嘧淀類(lèi)似物并研究它們對(duì)GS磷?；D(zhuǎn)移酶活性的作用，包括對(duì)ATP水解、ADP形成、谷氨酰胺形成、，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性和轉(zhuǎn)化效率的作用。靶向磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的嘌呤和嘧啶類(lèi)似物的合成反應(yīng)方法ATP與GS活性位點(diǎn)的結(jié)合主要依賴(lài)于氫鍵在分子的嘌呤部分周?chē)呐帕幸约皫追N疏水相互作用?？墒褂煤笠惶卣鱽?lái)增加任何基于嘌呤型骨架的給定小分子的特異性，因?yàn)橐阎腁TP結(jié)合位點(diǎn)的疏水區(qū)域由單獨(dú)的氨基酸序列構(gòu)建而成。合成具有疏水部分的這些分子將使得小分子與特異性酶活性位點(diǎn)的結(jié)合較緊密，但在很大程度上排斥所有相似的ATP結(jié)合口袋(最緊密聯(lián)系的家族成員除外)，所述的疏水部分伸入這些位點(diǎn)或口袋，所述的位點(diǎn)或口袋具有恰當(dāng)?shù)目臻g特征和電子特征從而能與口袋內(nèi)的氨基酸殘基發(fā)生最適宜的作用。只要?dú)滏I可與ATP結(jié)合口袋的主要氨基酸作用，則這種情況也同樣適用于基于非嘌呤的結(jié)構(gòu)。為了生成這些化合物，研究了幾組通用化合物，起始組的化合物均包括具有以特征性鄰二胺為環(huán)取代部分的芳基或雜芳基。雜芳基體系均基于嘧啶骨架?？梢栽O(shè)想的是，依賴(lài)于所用的特定二胺，這些體系可轉(zhuǎn)化為嘌呤(n，X,Y=N)、喹喔啉(III，X,Y=CH)、蝶啶(III，X，Y=N)或卡賓體(II,X,Y=N)物質(zhì)。后一物質(zhì)已參與ATP酶的抑制(E.Piers和J.Y.Roberge，TetrahedronLetters,1992，33，6923-6926和其中的參考文獻(xiàn))。還包括以苯并咪唑形式存在的、在六元環(huán)周?chē)鷽](méi)有任何氫鍵的體系(11，X,Y=CH),因?yàn)楸M管沒(méi)有偶氮取代，已知這些物質(zhì)卻具有生物活性(參見(jiàn)例如V.KlimeSovd等人，丄MedCZzem.，2002，37，409-418)。****蝶*體該研究中還包含其它體系，包括相關(guān)的咪唑并[l,2-a]吡啶(V)和飽和嘧啶結(jié)構(gòu)(IV)。這兩種體系均有所需的氫鍵模式，以及可能具有設(shè)計(jì)所需抑制劑需要的大量的取代基變化，使得可能以抑制所需磷?；D(zhuǎn)移的方式結(jié)合?；?雜)芳基-l，2-二胺的分子可商購(gòu)得到所需的二胺，例如1,2-苯二胺1和6-羥基-2，4,5-三氨基嘧啶2，或者如下文所述合成得到(J.A.VanAUen，Sj^/kCo仏Fo/.F/，N.Rabjohn等人(編輯)，JohnWileyandSons，Inc.(NewYork),1963，pp.245-246;W.R.Sherman和E.C.Taylor,同上，pp.247-249)。如果使用二鹽酸丙二酰胺作為原料直接合成5,不能干凈地生成所需的4，6-二氨基嘧啶4(G.W.Kenner等人丄C&m.1943，574)。4的另一種制備(涉及硫脲與丙二腈的反應(yīng))，得到4,6-二氨基-2-巰基嘧啶3(方案1)(A.Bendich，J.F.Tinker禾口G.B.Brown,丄C/z亂Soc，1948，3109)。硫醇3的雷尼鎳(Raneynickel)還原被證明是較好的選擇，而且4,6-二氨基嘧啶4以很好的收率獲得分離(D.J.Brown，丄C/z亂嵐1950,69,353)。義H2NNH2X=CNY=SX=C02EtY=SNH7OH8Z=NH29Z=NONH2NH25Z=NH26Z=NO叫10X=C02EtY=012Z=NO方案l雖然已有大量文獻(xiàn)記載了嘧啶在乙酸中的亞硝化，但已報(bào)道特別是4的亞硝化的收率很低，并且需要存在無(wú)機(jī)酸[(a)B.Lythgoe，A.R.Todd和A.Topham，丄CTzew.&c，1944，315;(b)J.Baddiley，B.Lythgoe,D.McNeil和A.R.Todd，丄C/zem.Soc，1943，383]。雖然亞硝化在酸性條件下順利進(jìn)行，但是發(fā)現(xiàn)亞硝基產(chǎn)物6在分離時(shí)不穩(wěn)定。對(duì)潮濕的6立即進(jìn)行連二亞硫酸鹽還原，生成不穩(wěn)定的三胺5，然而，可將其分離為穩(wěn)定的硫酸氫鹽。以類(lèi)似方式合成4，5-二氨基-6-羥基嘧啶10，這時(shí)用氰乙酸乙酯處理硫脲以形成硫醇7(W.Traube，C/zem.，1904，331，64)，然后亞硝化為穩(wěn)定的亞硝基硫醇9、連二亞硫酸鹽還原為二氨基硫醇8(A.R.Pagano，W.M.Lajewski禾卩R.A.Jones，CTzem.Soc，1995，117，11669)以及用雷尼鎳在氨水中脫硫得到二胺10。直接由硫醇9通過(guò)雷尼鎳還原生成10的嘗試并不成功(A.Laxer，D.T.Major,H.E.Gottlieb和B.Fischer,Og.C/zem,，2001，66，5463)。類(lèi)似地，通過(guò)用氰乙酸乙酯處理尿素(得到6-氨基尿嘧啶11)獲得5，6-二氨基尿嘧啶鹽酸鹽13，進(jìn)行亞硝化(得到12)和連二亞硫酸鹽還原得到二胺13。游離堿不穩(wěn)定，容易氧化為高度著色的嘧啶并蝶啶。在此期間，使用可商購(gòu)得到的6-氨基-l,3-二甲基尿嘧啶14來(lái)進(jìn)行閉環(huán)反應(yīng)試驗(yàn)從而由N-取代的尿嘧啶得到黃嘌呤，目的是以后將相同的方法應(yīng)用到N-芐基衍生物。用亞硝酸鈉對(duì)14進(jìn)行亞硝化得到15,然后用連二亞硫酸鈉還原，得到5,6-二氨基-1,3-二甲基尿嘧啶16(方案2)。方案25，6-稠合的雙環(huán)體系a)苯并咪唑衍生物(11，X、Y=CH，R卜R4=H)將一些N1或C2取代的苯并咪唑制備成帶有非極性六元環(huán)的簡(jiǎn)化的腺嘌呤類(lèi)似物。\C-2取代的苯并咪唑的最直接的合成方法涉及苯二胺1與適合的羧酸反應(yīng)(方案3)。方案3在150°C下、85%磷酸中，對(duì)兩個(gè)組分(苯二胺和相應(yīng)的羧酸)進(jìn)行稠合，然后進(jìn)行適合的氨基保護(hù)，從而能夠分離和純化化合物(除了5-溴戊酸衍生物之外)，得到化合物17-20，所有這些在室溫下均為固體。對(duì)保護(hù)后的產(chǎn)物沒(méi)有嘗試進(jìn)行水解。17181920例如，在60-100。C下，通過(guò)使用處于干燥的二甲基甲酰胺中的氫化鈉和烯丙基溴對(duì)苯并咪唑21處理18h，生成烯丙基苯并咪唑22來(lái)獲得Nl-取代的苯并咪唑(方案4)(K,L.Yu等人B/oorg.Me丄C7zem.丄e"era，2003，13，2141-2144)。使用二溴甲烷和糠醇的雙垸基化方法的類(lèi)似方案來(lái)得到糖基化產(chǎn)物23(A.Hc#等人，丄Me丄CTzem.，1999，42，2064-2086;A.Khalafi-Nezhad等人，r"ra/zet/ra"，2002，58，10341-10344]。222123方案4b)取代的嘌呤衍生物(//,I、r=AOC-8取代使用常規(guī)方法由二胺2、5、10和13制備8位取代的嘌呤(方案5)。使用Schotten-Baumann條件，使用所選的商購(gòu)?；冗x擇性地在堿性最強(qiáng)的5-氨基處對(duì)2、5、10和13進(jìn)行?；玫?-胺基嘧啶24。在某些情況下，使用改性的溶劑體系來(lái)實(shí)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化。使用三氯氧化磷或甲醇鈉進(jìn)行2、10和13的酰胺環(huán)化，形成酚類(lèi)(25,X=OH)或氯化物(25，X=Cl)(G.B.Elion，E.Burgi和GH.Hitchings，丄C/z亂Soc，1951，73，5235-5239)。由三胺5的酰胺只與甲醇鹽環(huán)化，獲得6-氨基嘌呤(25，X=NH2)(B.Lucas，N.Rosen和G.Chiosis，丄Com6.Oiem.,2001，3，518-520)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage105</formula>方案510和13的?；拖鄳?yīng)的環(huán)化結(jié)果如表21所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>表21:取代的4,5-二氨基嘧啶的取代和閉環(huán)(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>各種8-取代嘌呤的另一制備方法包括由2與S-甲基異硫脲硫酸鹽的反應(yīng)制備氨基甲酸酯55(P.RShildneck和W.Windus，Og.柳.Co//.阮//，A.H.Blatt(ed.)，1943，JohnWileyandSons(NewYork),411)(方案6)。通過(guò)使用芐胺和濃鹽酸水溶液來(lái)處理5-亞硝基-6-氨基-l,3-二甲基尿嘧啶15，也可制備黃嘌呤48(方案7)(C.E.Miiller，M.Thorand，R.Qurishi，M.Diekmann，K.A.Jacobson，W丄.Padgett禾卩J.W.Daly，Me丄CZzem.，2002，45，3440)。N-6和N-9取代眾所周知，4,6-二氯嘧啶56對(duì)氮和氧親核試劑的親核取代尤為敏感。第一個(gè)氯基的取代很容易，而第二個(gè)氯則需要更多的強(qiáng)制性條件(C.W.Whitehead禾BJ.J.Traverso，」w.C/zem.Soc,，1958,80,2185-2189;M.H.Norman等人，MedOze肌，2000,43,4288-4312)。然而，嘧卩定環(huán)可被活化。通過(guò)在C-5引入吸電子基團(tuán)可實(shí)現(xiàn)該活化，該吸電子基團(tuán)例如是通過(guò)親電取代的硝基或亞硝基。允許用胺單取代一個(gè)氯取代基，然后亞硝化并隨后取代第二個(gè)氯取代基的方案可得到如方案8所述的三氨基嘧啶前體。先還原亞硝基，然后再閉環(huán)，可得到所希望的腺嘌呤衍生物。方案6方案756方案8選擇各種胺來(lái)取代氯基，以覆蓋盡可能多的分子"范圍"，包括烷基胺、芳基胺和雜芳基胺。組合使用一伯胺和一仲胺以確保在環(huán)化為嘌呤化合物時(shí)產(chǎn)物單一。選擇以下胺伯胺初始的取代反應(yīng)包括在沸騰的異丙醇中用兩倍過(guò)量胺處理56(C.Temple,C.L.Kussner禾口J.A.Montgomery,Me丄CTzem.，1962,5,866-870;M.Israel等人Me丄CTzem.，1964，7,792-799)，或者，另一種是當(dāng)存在一當(dāng)量的三乙胺時(shí)，只使用一當(dāng)量的胺即可進(jìn)行該反應(yīng)(N.Baindur,N.Chadha禾卩M.R.Player,Com6.C/zem.,2003,5,653-659)。在單胺產(chǎn)品57-61的粗混合物或分離產(chǎn)物中，均未分離或檢測(cè)出雙取代的產(chǎn)品。用伯胺對(duì)56進(jìn)行單取代的結(jié)果如表22所示。令人驚異的是，由苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽衍生而來(lái)的嘧啶60生成的收率非常低，可能由于形成的酯鹽酸鹽中間體非常少。如所期望的，堿性非常弱的芳基胺需要強(qiáng)制性條件。然而，2-氨基吡啶不能與56反應(yīng)。很容易發(fā)生仲胺57-59的亞硝化，得到收率很好的產(chǎn)品62-64(D.E.O'Brien等人，/.C/亂，1962,5,1085-1103)。令人困惑的是，苯丙氨酰衍生物60在該條件下不能反應(yīng)。類(lèi)似地，證明在不同條件下，很難活化苯胺衍生物61進(jìn)行亞硝化(表22)。然后，在假設(shè)亞硝化已充分活化嘧啶的條件下，用仲胺處理亞硝基產(chǎn)物62-64。在該階段將不易反應(yīng)的芳香胺引入這些化合物的嘗試并不成功。表22:用伯胺取代56、亞硝化、然后用仲胺取代<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>在連二亞硫酸鈉和硫酸水溶液存在的條件下，使亞硝基化合物65-71還原以得到取代的三氨基嘧啶72-78(表23)。通過(guò)在乙酸酐和原甲酸三乙酯的1:1混合物中加熱嘧啶來(lái)進(jìn)行嘧啶72、73、75、76和78的環(huán)化，分別得到取代的腺嘌呤79-83(C.Temple,C.LKussner和J.A.Montgomery,丄Mec.C/iem.,1962,5,866-870)。然而，均用羥乙基鏈取代的嘧啶74和77,得到了產(chǎn)物的復(fù)合物混合物，顯示該復(fù)合物混合物含有所希望的產(chǎn)物以及環(huán)化反應(yīng)的中間體。<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>首先，以與伯胺類(lèi)似的方式用仲胺處理56，然后進(jìn)行與前述方案相同的方案。結(jié)果如表24所示。表24:在強(qiáng)制性條件下，使56與仲胺反應(yīng)，進(jìn)行亞硝化試驗(yàn)以及用伯胺進(jìn)行第二次取代<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>四個(gè)叔胺84-87的亞硝化均失敗，機(jī)理反應(yīng)需要仲胺以形成使反應(yīng)發(fā)生的未帶電荷的亞硝化的N-亞硝基中間體，且在鄰位發(fā)生亞硝化(J.H.Boyer，7TzeC7zew&^yo//Ae7V/Yro/^Yro^oGnM;w，H.Feuer(ed.)，JohnWileyandSons(NewYork),1969,pp.223-225)。叔胺有助于對(duì)位的直接亞硝化，這使親電取代在這些情況下不能進(jìn)行(R.G.Coombes，Compw/^w/veOg聽(tīng)'cC7ze油^y，D.Barton和W.D.Ollis(eds.),PergamonPress(Oxford),1979，pp.308-309)。因此，使用強(qiáng)制性條件將伯胺直接引入產(chǎn)物84-87，可在不同程度上取得成功，如表24所總結(jié)的。利用這些條件，使用吡咯垸和二甲胺也可成功地使苯丙氨酰衍生物60直接氨基化，從而分別得到雙氨基化產(chǎn)物100和101。100101102為了使用2-氨基吡啶衍生物99，取而代之進(jìn)行硝化以得到102。但可使用雷尼鎳還原，因此證明該產(chǎn)物不穩(wěn)定并且快速分解。使用稍微過(guò)量的溴，在二氛甲垸中進(jìn)行二胺89-96的溴化，得到溴嘧啶103-110(表25)。使用過(guò)量胺中的無(wú)水碘化亞銅用于插入，將溴化物105和108處于Ullmann氨基化條件下，所有均溶解于含有水合磷酸鉀的N,N-二甲基乙醇胺(螯合溶劑)作為堿(F.Y.Kwong和S.L.Buchwald，Org.2003,5，793-796，J.P.^Wolfe，S.Wagaw，J.-F.Mar匿x和S.L.Buchwald,^ce.C7z亂紋，1998,31，805-818)。在惰性氣氛下于100°C將混合物加熱18h。在該取代所試驗(yàn)的胺中，只有芐胺獲得成功，得到三氨基嘧啶111和112。表25:4,6-二氨基化嘧啶89-96的衍生化。<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>咪唑并[l,2-ct]吡啶(V，X、Y=CH，R^H)由于咪唑并吡啶、咪唑并吡嗪和咪唑并嘧啶廣泛治療種類(lèi)上顯示出的有趣的生物活性，已受到制藥業(yè)的極大關(guān)注(A.R.Katritzky,Y.-JXu和H.Tu,CAem.,2003，68，4935]。雖然有一些合成途徑能得到咪唑并[l,2-cc]吡啶環(huán)體系，但是最普通的方法涉及將2-氨基吡啶與a-鹵代羰基化合物(halocarbonylcompound)偶聯(lián)。在最初的研究中，通過(guò)2-氨基吡啶分別與苯甲酰甲基溴和對(duì)溴苯甲酰甲基溴反應(yīng)來(lái)制備咪唑并吡啶113和114。更通用的方法是使用涉及醛、2-氨基吡啶和異氰化物縮合的三組分偶聯(lián)(3CC)[(a)C.Blackburn,B.Guan，P.Fleming,K.Shiosaki和S.Tsai，r"ra/ze^/raw1998,39,3635;(b)C.Blackburn,r"ra/zeflfra"丄e".，1998,39,5469;(c)C.Blackburn和B.Guan，r"ra/ze^o"2000,41，1495](方案9)。盡管還使用過(guò)量的乙醛酸(M.A.Lyon和T.S.Kercher，Og.丄e".，2004，6,4989)或蒙脫土(R.S.Varma和D.Kumar,r"ra/ze(ira"丄e"，1999,40,7665)，但是在酸催化劑存在下，經(jīng)常使用三氟甲烷磺酸鈧(III)[(a)C.Blackburn,B.Guan,P.Fleming,K.Shiosaki禾口S.Tsai，r"ra/ze<in31998,39，3635;(b)C.Blackburn,r"ra/ze^cw1998,39,5469;(c)C.Blackburn和B.Guan,r"ra/2W腦丄e".，2000,41,1495;(d)S.M.Ireland,H.Tye禾口M.Whittaker,7^ra/zedrow^e".，2003,44,4369;(e)G.S.Mandair,M.Light,A.Russell,M.Hursthouse禾卩M.Bradley,r"ra/edra"2002，43,4267]進(jìn)行3CC反應(yīng)。酸催化劑促進(jìn)了3CC中的第一步反應(yīng)，形成亞胺。通?？墒褂贸Ｒ?guī)的加熱或微波反應(yīng)器在室溫下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間(48h)的反應(yīng)。方案9以氯化鋅或蒙脫土K10為催化劑，由2-氨基吡啶制備一些咪唑并吡啶115-131。這些結(jié)果總結(jié)在表26中。表26:2-氨基吡啶的3CC反應(yīng)a蒙脫土K10，回流，5hbZtiCI2,微波，2h'蒙脫土KIO，微波，2h6,6-稠合的雙環(huán)體系特別以乙二醛(得到132-134)(H.B,Gillespie,F.Spano和S.Graff,丄Og.CZzem.，1960,25，942-944;L.G.Fr6lich等人丄C/em.,1999，42,4108-4121)和草酰乙酸二乙酯鈉鹽(得到135-137)[D.Farquhar和T.L.Loo,丄Me丄C/zew.,1972,15,567-568]為二羰基組分，目標(biāo)是形成基于1，2-二羰基體系和二胺1、2和13縮合的一小組6,6-稠合的雙環(huán)體系(表27)。證明基于1的反應(yīng)異乎尋常地不易進(jìn)行，主要是因?yàn)樵噭┲g的接觸很差，而三胺2卻在過(guò)量乙二醛中得到了有趣的三環(huán)化合物133。表27:使用乙二醛或草酰乙酸二乙酯形成喹喔啉和蝶啶<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>6,6-雙環(huán)體系為了得到具有延伸的氫鍵網(wǎng)絡(luò)的非芳香性質(zhì)的嘧啶衍生物，使用Biginelli首先記載的制備3，4-二氫嘧啶-2(li/)-酮的三組分反應(yīng)(J.C.Bussolari禾口P.A.McDonnell,/.O".CZzem.，2000,65，6777禾口其中的參考文獻(xiàn))。該多組分反應(yīng)包括處于酸性乙醇溶液中的芳香醛、尿素和乙酰乙酸乙酯的縮合反應(yīng)，生成高度官能化的嘧啶酮。使用與Bussolari和McDonnell有關(guān)的修改后的Biginelli反應(yīng)，使用處于無(wú)水1,2-二氯乙烷中的含有尿素的草酰乙酸二乙酯鈉鹽、各種醛和三氟乙酸，得到嘧啶酮138-141(表28)。表28:草酰乙酸二乙酯鈉鹽的環(huán)化縮合和138的水解<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>通過(guò)用無(wú)水乙醇中的氫氧化鉀溶液處理無(wú)水乙醇中的138混懸液，實(shí)現(xiàn)氫氧化物誘導(dǎo)的138的乙酯的水解，得到脫水的嘧啶酮142。具有金屬配位能力的腺苷基于腺苷?；问降墓劝滨０泛铣擅傅牧柞；葾TP轉(zhuǎn)移到谷氨酸的性質(zhì)的機(jī)制預(yù)測(cè)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，有人提出，通過(guò)在可能的抑制劑分子的該區(qū)域內(nèi)并入金屬結(jié)合位點(diǎn)，可非常好地模擬金屬向腺嘌呤C-8的靠近。有人提出，在該位置含有兩個(gè)或更多鄰近的雜原子(例如嗎啉代部分)的取代基，可同時(shí)發(fā)揮配位位點(diǎn)的作用并將第二個(gè)雜原子置于空間區(qū)域，該空間區(qū)域類(lèi)似于ATP復(fù)合物的擬環(huán)狀磷酸骨架占據(jù)的區(qū)域。然后，包埋在該復(fù)合物中的金屬離子能獲得水或二氧化碳(以水合形式)從而推測(cè)以類(lèi)似于母體ATP相似的方式完成配位層?？赏ㄟ^(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)所需物質(zhì)的合成，g卩使腺苷143(溴水溶液)溴化以得到8-溴腺苷144，然后使用2，2-二甲氧基丙烷和丙酮(等體積)的混合物和5當(dāng)量的甲苯磺酸作為2',3'-異亞丙基縮醛145進(jìn)行保護(hù)(方案10)。在過(guò)量嗎啉存在下使用微波照射，在1,4-二噁烷溶劑中對(duì)鹵化物進(jìn)行取代，從而得到146。在四氫呋喃和濃鹽酸中于室溫下進(jìn)行脫保護(hù)以生成所需物質(zhì)147,用制備液相色譜處理147以獲得可信樣品(T.Sasaki,K.minamoto和H，Itoh,丄Org.C/zem.,1978,43,2320-2325)。方案IO采用類(lèi)似的方案可在8-位引入另一取代基，從而改變空間特征和結(jié)合特征。合成方案的材料和方法所有起始原料均通過(guò)商購(gòu)獲得并從供應(yīng)商得到后直接使用，沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步純化。使用MerckKiesel凝膠60(粒子大小0.040-0.063mm)進(jìn)行柱色譜，使用Merck鋁基硅膠板60254進(jìn)行薄層層析。在VarianGemini200核磁共振儀上于200MHz記錄NMR譜圖。以ppm記錄化學(xué)位移數(shù)據(jù)，而以Hz記錄偶合常數(shù)。在Waters液相色譜系統(tǒng)上，使用Varian9050UV/VTS檢測(cè)器于254nm記錄HPLC數(shù)據(jù)。使用等度洗脫系統(tǒng)在PhenomenexLunaTM5pC-18(2)150mmx4.60mm柱上進(jìn)行所有分離。所用溶劑為所示的pH4下的甲醇和25mM乙酸銨緩沖水溶液的混合物，在流速為lcmVmin下進(jìn)行洗脫。標(biāo)準(zhǔn)制備是用有機(jī)溶劑提取，然后用硫酸鎂干燥并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行溶劑的真空蒸餾。在ReichertHotplate上記錄熔點(diǎn)且未作校正。4，6-二氨基嘧啶-2-硫醇(3)在氮?dú)鈿夥障率菇饘兮c(1.8g，0.078mol)溶解于無(wú)水乙醇(40cm3)。向其加入硫脲(6.0g，0.079mol)，然后再加入丙二腈(5.0g，0.076mol)。將所得非均質(zhì)混合物回流加熱2h，然后使其冷卻至室溫。加入水(120cm3)以促進(jìn)其完全溶解，用冰醋酸中和該均質(zhì)混合物(至pH6.0)。將混合物冷卻至0°C并過(guò)濾。將所收集的產(chǎn)物真空干燥以得到4,6-二氨基嘧啶-2-硫醇3(7.80g,69%)。(5H(200MHz，^-DMSO)5.01(1H，s，H-6)，6.4-6.7，(4H，brs，麗2);mp〉280。C。4，6-二氨基嘧啶鹽酸鹽(4)將4，6-二氨基嘧啶-2-硫醇3(4.10g，0.029mol)溶解于2M氫氧化鈉水溶液(18cm3)中，并在冰浴中冷卻至10°C。以保持溫度低于15°C的速率，攪拌中逐滴加入過(guò)氧化氫水溶液(3%，62cm3)。加入結(jié)束(約20min)后，在無(wú)需冷卻的條件下進(jìn)一步攪拌反應(yīng)物30min，在這段時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)混合物變?yōu)椴煌该?，然后用冰醋酸酸化到pH4.0。將所得漿狀物冷卻，通過(guò)過(guò)濾收集產(chǎn)物，真空干燥，得到4,6-二氨基嘧啶-2-亞磺酸(3.48g，69%)，熔點(diǎn)為164-170。C(文獻(xiàn)值為168-170°C)。將該酸(3.40g，0.020mol)加入在5°C下用氯化氫氣體飽和過(guò)的干燥乙醇中，在室溫下攪拌所得混合物30min，在此期間形成稠的漿狀物。形成該漿狀物后，將混合物冷卻至0。C并攪拌lh。將產(chǎn)物過(guò)濾分離，用乙醚洗滌并真空干燥，得到2.78g(97%)4，6-二氨基嘧啶鹽酸鹽4。SH(200MHz，^-DMSO)5.60(1H，s，H-5)，7,40-7.81(4H，brs，Ni/2)，8.20(1H，s，H-2);熔點(diǎn)194-196。C(文獻(xiàn)值為196-198。C)。4，6-二氨基嘧啶(4)的另一制備方法將4,6-二氨基-2-巰基嘧啶3(24.85g，0.18mol)混懸于5%氨水(1.2L)中，并加熱到85°C以促使其溶解。將雷尼鎳(50g濕的漿狀物)在10min內(nèi)一份份小心加入熱混合物中。將所得混合物回流加熱lh。將熱反應(yīng)混合物過(guò)濾并用熱水(200cm3)洗滌濾餅。將濾液減壓濃縮，得到4,6-二氨基嘧啶4U5.9g，83%)。3H(200MHz，D20)7.82(1H，s，H-2)和5.55(1H，s，H-5)。(5C(50MHz，^隱DMSO)159.6(C國(guó)4和C-6)，149.9(C陽(yáng)2)和81.2(C-5)。4，5，6-三氨基嘧啶硫酸氫鹽(5)將4，6-二氨基嘧啶4(15.卯g，0.14mol)混懸于鹽酸水溶液(1M，500cm3)并冷卻至2°C。以保持反應(yīng)溫度低于4°C的速率，將亞硝酸鈉U4.90g，0.22mol)的水溶液(35cm3)逐滴加入冷卻溶液中(以此速率進(jìn)行30min)。使混合物在lh內(nèi)自然升溫至室溫。此后，以固體形式一份份加入碳酸氫鈉，將綠褐色混合物中和至pH7.0。將形成的藍(lán)綠色沉淀過(guò)濾，但不完全干燥。不穩(wěn)定的亞硝基化合物在水(220cm3)中立即變成漿狀物，在室溫下使用一份份加入的連二亞硫酸鈉(52.80g，0.25mol)處理。用50%硫酸水溶液(150cm3，1.4mol)處理黃色混合物并加熱至80。C保持3min，然后在冰浴中冷卻至室溫。將形成的沉淀過(guò)濾，用乙醇水溶液(30cm3)洗滌并干燥，得到4，5,6-三氨基嘧啶硫酸氫鹽5(23.0g，71%)。&(200MHz，D20)7.61(1H，s，H-2);<5C(50MHz，^-DMSO)148.1(C-4和C-6)，140.4(C-2)和105.9(C-5)。通過(guò)將硫酸氫鹽溶解于最少量的2M熱的氫氧化鈉水溶液中可制備游離胺。在冷卻過(guò)程中游離胺沉淀，并且可從水中重結(jié)晶出來(lái)。4-氨基-6-羥基-2-巰基嘧啶(7)將金屬鈉(4.60g，0.20mol)在氮?dú)鈿夥障氯芙庥跓o(wú)水乙醇(150cm3)，并且用氰乙酸乙酯(22.0g，0.19mol)和硫脲U6.0g，0.21mol)處理。將所得混合物在氮?dú)鈿夥障禄亓骷訜?h。此后，將混合物冷卻至室溫，形成白色沉淀并過(guò)濾該白色沉淀。將濾餅溶解于水(150cm3)并用50%乙酸水溶液酸化至pH4.0。將所形成的沉淀過(guò)濾，得到4-氨基-6-羥基-2-巰基嘧啶7(28.0g，100%)白色固體。SH(200MHz，D20)5.06(1H，s，H-5);&(50MHz，D20)177.4(C國(guó)6)a，170.0(C-2)a，164.9(C-4)3和82,1(C-5)。4，5-二氨基-6-羥基-2-巰基嘧啶(8)將4-氨基-6-羥基-2-巰基-5-亞硝基嘧啶9(17.60g，O.lOmol)在飽和碳酸氫鈉水溶液(400cm3)中變成漿狀物，并且在10min內(nèi)用一份份加入的連二亞硫酸鈉(42.7g，0.25mol)處理。將淺黃色混合物在5°C下攪拌7h，然后用乙酸(24cm3)處理。開(kāi)始逐漸形成白色沉淀。將沉淀過(guò)濾，用乙醇水溶液(30cm3)洗滌并干燥，得到4,5-二氨基-6-羥基-2-巰基嘧啶8(18.3g，100%)。&(50MHz，D20)168.3(C-6)a，158.7(C-2)a，142.3(C-4)3和103.1(C-5)。4-氨基-6-羥基-2-巰基-5-亞硝基嘧啶(9)將4-氨基-6-羥基-2-巰基嘧啶7(16.80g，0.12mol)混懸于水(300cm3)中并用乙酸(60cm3)處理。通過(guò)逐滴加入溶解于水(35cm3)的亞硝酸鈉(15.0g，0.22mol)處理該混懸液。將所得的橙色混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。16h后，將混合物過(guò)濾，依次用水(20cm3)和乙醇(20cm3)洗滌濾餅并干燥，得到4-氨基-6-羥基-2-巰基-5-亞硝基嘧啶9(17.6g，87%)磚紅色固體。無(wú)需表征或進(jìn)一步純化，即可在隨后反應(yīng)中使用該粗產(chǎn)物。4，5-二氨基-6-羥基嘧啶(10)將4,5-二氨基-6-羥基-2-巰基嘧啶8(16.20g，O.lOmol)溶解于5%氨水(440cm3)中，并在5min內(nèi)用一份份加入的雷尼鎳(45.3g濕的漿狀物)來(lái)處理。將所得混合物回流加熱L5h。將熱反應(yīng)混合物過(guò)濾，將濾液減壓濃縮，得到4,5-二氨基-6隱羥基嘧啶10(11.5g，88%)。(5H(200MHz，D20)7.54(1H，s，H誦2);&(50MHz，D20)157.0(C-6)a，147.8(C-4)%138.7(C-2)和111.1(C-5)。5，6-二氨基脲嘧啶鹽酸鹽(13)將鈉(3.9g，0.17mol)以小塊加入多口圓底燒瓶?jī)?nèi)的無(wú)水乙醇(100cm3)中。當(dāng)所有的鈉都消失后，向其加入氰乙酸乙酯(9.8g，0.087mol)和尿素(5.2g，O術(shù)mol)，并將反應(yīng)物回流加熱4h。此時(shí)反應(yīng)混合物相當(dāng)程度上為固體，向其加入熱水(100cm3)溶解該物質(zhì)，并在80°C下加熱該混合物15min。用冰醋酸小心中和反應(yīng)物，另外加入冰醋酸(7.5cm3)，然后再加入溶解于水(7cm3)中的亞硝酸鈉(6.5g，0.094mol)。將該溶液冷卻，通過(guò)過(guò)濾除去粉紅色固體12并用冰水洗滌。將該過(guò)濾后的物質(zhì)轉(zhuǎn)移回初始燒瓶并加入溫水(40cm3)。邊攪拌邊加熱該漿狀物至100°C，加入固體連二亞硫酸鈉(約20g)直至紅色的亞硝基化合物消失。另外加入幾克連二亞硫酸鹽并繼續(xù)加熱15min。使混合物冷卻，過(guò)濾二氨基尿嘧啶亞硫酸鹽并用水洗滌。將濃鹽酸(20cm3)加入錐形瓶?jī)?nèi)的亞硫酸鹽中，在電熱板上攪拌加熱lh。過(guò)濾并用丙酮充分洗滌，得到5，6-二氨基尿嘧啶鹽酸鹽13黃褐色固體(7.53g，49%)。&(50MHz，D20/NaOH)96.0(C-5)，158.0(C-6)，159.3(C陽(yáng)2)禾口162.2(C-4)。6-氨基-l，3-二甲基-5-亞硝基尿嘧啶(15)將6-氨基-l，3-二甲基尿嘧啶14(5.0g，32mmo1)溶解于50%乙酸水溶液(150cm3)中。向其加入溶解于水(20cm3)中的亞硝酸鈉(4.4g，64mmo1)。反應(yīng)物幾乎立即變成亮紫色，在室溫下攪拌lh。將混合物冷卻并通過(guò)過(guò)濾收集沉淀，用冷水充分洗滌，得到6-氨基-l,3-二甲基-5-亞硝基尿嘧啶15亮紫色固體(5.8g，98%)。&(200MHz，^-DMSO)3.26(3H，s，C/f3N)，3.28(3H，s，C柳)，9.05和12.97(2H，2xbrs，麗2)。5，6-二氨基-1，3-二甲基尿嘧啶亞硫酸氫鹽(16)將6-氨基-l,3-二甲基-5-亞硝基尿嘧啶15(3.5g，19mmo1)混懸于溫水中，并向其加入連二亞硫酸鈉直至紫色消失。在此階段，所有物質(zhì)均在溶液中。通過(guò)蒸發(fā)除去水直至獲得漿狀物，將固體過(guò)濾并用水洗滌，得到5，6-二氨基-1，3-二甲基尿嘧啶亞硫酸氫鹽16淺黃色固體(2.2g，46%)。3H(200MHz，.^-DMSO)3.14(3H，s，C耶)，3.30(3H，s，C//3N)，3.36(2H，brs，Ni72)和6.13(2H，brs，Ni/2);&(50MHz,A-DMSO)28.3和30.5(2xCH3)，96.7(C-5)，145.6(C-6)，150.5(C-2)和159.7(C-4)。羧酸與鄰苯二胺(1)縮合的一般方法將鄰苯二胺1(1當(dāng)量)和所需的羧酸(1.2當(dāng)量)引入不帶冷凝器的圓底燒瓶?jī)?nèi)的2cm385%磷酸中。將該混合物加熱至150-200°C，最少加熱2h，通常是18h，隨著時(shí)間推移得到深藍(lán)色溶液。然后將熱混合物傾析到100cmS飽和碳酸鉀水溶液中，得到pH大于7的藍(lán)色溶液。不變的是，向其加入等體積的乙酸乙酯以提取不溶解于水的所有有機(jī)組分。以下給出各制備方法。(2Q-2-(l仏苯并咪唑-2-基)吡咯垸-l-甲酸叔丁酯(17)如上述一般方法所述處理鄰苯二胺1(l.OOg,9.21mmol)和L-脯氨酸U.31g，11.35mmol)。將水相濃縮為含有紅色斑塊的白色顆粒狀糊狀物。用三份10ci^冷水小心溶解該白色糊狀物，去除斑塊。使其溶解于3:1(v/v)甲醇:乙酸乙酯中，將所得任何固體濾掉并將紅色溶液濃縮為紅色泡沫。使該殘?jiān)芙庥诤袣溲趸c(1.36g，33.88mmo1)和二碳酸二叔丁酯(4.84g，22.19mmo1)的水(25cm3，0.4M)中，在室溫下攪拌18h。用乙酸乙酯(2x25cm3)提取，將有機(jī)層干燥(MgS04)并濃縮，得到清澈的膠狀物，用3:10(v/v)乙酸乙酯:己垸研碎，得到細(xì)的白色粉末(2Q-2-(lW-苯并咪唑-2-基)-吡咯烷-l-甲酸叔丁酯17(經(jīng)過(guò)2步反應(yīng)得到0.5lg，19%)。&(200MHz，CDC13)7.49-7.68(2H,m，芳基H-4和H-7)，7.18-7.30(2H，m，芳基H誦5和H誦6)，5.09-5.18(1H，brdm，吡咯H-2，J7.2)，3.36-3.57(2H，brt，吡咯H-5)，2.98-3.21(1H，brs，吡咯H-3a)，1.95-2.39(3H，2xbrm，卩比咯H-3a和H-4)和1.53[9H，s，OC(C//》3];&(50MHz，CDC13)156.8(NCO)，155.1(苯并咪唑C-2)，122.7(芳基C-4，C國(guó)5，C-6和C-7)，115.5(brs，季芳基C-3a和C-7a)，80.9(吡咯C-2)，54.9[OC(CH3)3]，47,6(吡咯C-5)，28.8[OC(CH3)3]，28.4(吡咯C-3)和25.2(吡咯C-4)。7V-乙酰基-7V-[(l-乙?；?l好-苯并咪唑-:2-基)甲基乙酰胺(1S)以上述一般方法處理甘氨酸(1.68g，22.08mmo1)和鄰苯二胺1(1.96g，18.11mmo1)18h。在中和并加入乙酸乙酯后，使水層分離并濃縮為米色(beige)膠狀物。在160。C下，用乙酸(10cm3)中的1:1(v/v)乙酸酐處理0.31g膠狀物18h。將溶液傾析到100cmS飽和碳酸鉀水溶液中，用乙酸乙酯(2xl00cm3)提取，干燥(MgS04)并濃縮為膠狀物。在乙酸乙酯/己垸中使其研碎，得到白色粉末^-乙酰基-7\4(1-乙酰基-17/-苯并咪唑-2-基)-甲基]乙酰胺18(0.22g，4%)。&(200MHz，CDC13)7.29-7.80，7.60-7.68和7.35-7.45(4H，3xm,芳基H)，5.38(2H，s，C仏)，2.89(3H，s，苯并咪唑C0C/f3)，2.52[6H，s，N(COCi^3)2];&(50MHz，CDC13)173.4[N(COCH3)2]，169.6(苯并咪唑COCH3)，152.8(苯并咪唑C-2)，143.1(季芳基C-3a)，132.8(季芳基C-7a)，125.1和124.8(芳基C-4和C-7)，121.4(芳基C-6)，113.3(芳基C-5)，45.9(CH2)，26.9(苯并咪唑C0CH3)禾Q26.6[N(COCH3)2]。2-U(叔丁氧羰基)氨基]甲基卜lH-苯并咪唑-l-甲酸叔丁酯(19)將制備18中所用的部分膠狀物(1.04g)溶解于含有氫氧化鈉(4.51g)和二碳酸二叔丁酯(2.43g，11.14mmo1)的水(50cm3)中，在室溫下攪拌18h。用乙酸乙酯(2x25cm3)提取，將有機(jī)層干燥(MgS04)并濃縮，得到清澈的膠狀物。進(jìn)行柱色譜(洗脫液為1:10-1:5(v/v)乙酸乙酯:己垸)純化該產(chǎn)物，得到淺黃色油狀物，將該油狀物經(jīng)過(guò)放置固化為米色固體，2-{[(叔丁氧羰基)氨基)甲基}-1//-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯19(1.20g，基于原料二胺為19%)，&(200MHz，CDC13)7.92-7.98，7.65-7,74和7.26-7.39(4H，3xm，芳基H)，5.85(1H，brs，N/f)，4.81(2H，d，C仏，/5.4)，1.73[9H，s，苯并咪唑OC(C^)3]和1.51[9H，s，OC(C/f3)3]。2-(4-溴丁基)-lH-苯并咪唑(20)將鄰苯二胺1(l.OOg，9.27mmo1)和5-溴戊酸(2.15g，11.85mmo1)置于配有冷凝器的圓底燒瓶中，在150。C下單純攪拌加熱3h。將所得紫色固體粉碎，用10cm3乙酸乙酯洗滌，以沉淀得到紫色粉末2-(4-溴丁基)-l/f-苯并咪唑20(1.28g，73%)。&(200MHz，CDC13)7.61-7.68和7.18-7.32(4H，芳基H)，6.26(1H，brs，NH)，4.09(2H，t，=CC//2，76.0)，3.11(2H，t，C7/2OH,和1.95-2.22[4H，m，(Ci/2)2CH2Br]。堿調(diào)節(jié)的苯并咪唑垸基化的一般方法21在氮?dú)鈿夥障?，用氫化鈉處理處于干燥的AyV-二甲基甲酰胺中的苯并咪唑21(1當(dāng)量)與烷基化劑(1.1-1.3當(dāng)量)的混合物。然后，將溶液加熱至100°C并持續(xù)18h。將所得棕色溶液傾析到乙酸乙酯中，用等量的水提取三次。干燥并濃縮后，通過(guò)柱色譜(洗脫液為1:10-1:2(v/v)乙酸乙酯:己烷)純化該殘?jiān)?。l-烯丙基-l好-苯并咪唑(22)按照上述一般方法，用氫化鈉(60%的油溶液，0.23g，5.66mmo1)處理處于干燥的7VJV-二甲基甲酰胺(10cm3)中的苯并咪唑21(0.49g，4.15mmo1)與烯丙基溴(0.40cm3，4.62mmo1)的混合物。通過(guò)柱色譜得到米色油狀物l-烯丙基-liZ-苯并咪唑22(0.56g，86%)。(5H(200MHz，CDC13)7.92(1H，brs，H-2)，7.77-7.89和7.24-7.45(4H，2xm,芳基H)，6.02(1H，ddt，CH2C//=，《/17.0，10.0和5.8)，5.31(1H，dq，CH=Cf/ai/b，J10.2和l,8)，5.21(1H，dq，CH=CHaHb，J17.0禾口1.6)和4.79(2H，NCi/2，J5.4和1.8)。l-[(2-呋喃甲氧基)甲基]-l仏苯并咪唑(23)按照上述一般方法，用氫化鈉(0.38g,9.25mmo1)處理處于干燥的7V,7V-二甲基甲酰胺(10cm3)中的苯并咪唑21(0.51g，4.24mmo1)、二溴甲烷(0.33cm3，4.6mmo1)和糠醇(0.40cm3,4.6mmo1)。通過(guò)柱色譜得到黃色油狀物l-[(2-呋喃甲氧基)甲基]-l/f-苯并咪唑23(0.39g，40%)。&(200MHz，CDC13)8.00(1H，s，苯并咪唑H-2)，7.79-7.88和7.47-7.59(2H，2xm，苯并咪唑H-4和H-7)，7.43-7.47(1H，m，呋喃基H-5)，7.26-7.40(2H，m，苯并咪唑H-5和H-6)，6.38(1H，dd，呋喃基H-4，73.2禾卩1.8)，6.33(1H，brdd，呋喃基H-3，/3.0和1.8)，5.57(2H，s，NCfi^O)禾口4.41(2H，s，OCi^呋喃基)。制備?；奏さ囊话惴椒?V-(2，4-二氨基-6-羥基嘧啶-5-基)苯甲酰胺(26)將2,4，5-三氨基-6-羥基嘧啶2(l.Og，4.2mmo1)溶解于2M氫氧化鈉溶液(25cm3)中，用冰浴將溶液冷卻至0°C。然后用注射器在5min內(nèi)將苯甲酰氯(0.6g，4.2mmol)加入溶液中。在0。C下攪拌混合物15min，以類(lèi)似方式加入另一部分苯甲酰氯(0.6g，4.2mmo1)。在冰浴中再攪拌混合物1小時(shí)。然后從冰浴中移去反應(yīng)混合物并將其加熱至室溫。用冰醋酸將溶液調(diào)到pH5，此時(shí)產(chǎn)物由溶液中沉淀出來(lái)。用布氏漏斗過(guò)濾淺棕色沉淀并用去離子水(3xl0cm3)洗滌。最初在漏斗上干燥濾餅3h，然后轉(zhuǎn)移到燒瓶并真空干燥。AK2,4-二氨基-6-羥基嘧啶-5-基)苯甲酰胺26(0.78g，56%)。&(200MHz，D20)7.79(2H，d，J6.6，2xArC//)和7.35-7.58(3H，m，3xArC//)。可直接用于后面的步驟。以類(lèi)似方式得到以下產(chǎn)物7V-(2，4-二氨基-6-羥苯基)辛酰胺(28)(0.34g，35%)。3H(200MHz，D20)2.36(2H，t，".7，COC//2)，1.45-1.70(2H，m，COCH2C//2)，1.10-1.40(8H，m，4xC//2)禾卩0.82(3H，brs，CV3)0iV-(2，4-二氨基-6-羥苯基)-2，2-二甲基丙酰胺(29)C0.38g，43%)。&(200MHz，D20)1.24(9H，s，3xCH3)。A41-U(2，4-二氨基-6-羥基嘧啶-5-基)氨基]羰基)-2-甲基丙基)苯甲酰胺(30)在室溫下，用苯甲酰氯(18.7cm3，0.16mol)處理溶解于水(150cm3)中的L-纈氨酸U5.75g，0.13mol)和氫氧化鉀(12.00g，0.21mol)，并攪拌72h。用氯仿(200cm3)提取，然后先用等體積的1M鹽酸洗漆，再用飽和碳酸鉀水溶液洗滌。干燥(MgS04)并濃縮后，使米色固體溶解于氯仿(200cm3)。在氮?dú)鈿夥障拢脕喠蝓Ｂ?14.7cm3,0.21mol)和三滴二甲基甲酰胺處理該溶液。將混合物加熱lh，然后濃縮為粘性的黃色物質(zhì)。在0°C下將兩份酰基氯(每份4.01g)在2h內(nèi)加入處于1M氫氧化鈉水溶液(50cm3)中的13(2.00g，8.38mmol)溶液中，此后，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至約為4。米色固體30從溶液中沉降下來(lái)，然后過(guò)濾，干燥，無(wú)需表征即可直接使用。甲醇鈉調(diào)節(jié)的酰化嘧啶的環(huán)化的一般方法2-氨基-8-苯基-9好-嘌呤-6-醇(31)將AK2,4-二氨基-6-羥基嘧啶-5-基)苯甲酰胺26(0.3g，1.2mmo1)加入溶解于甲醇(10%m/m，5cm3)的甲醇鈉中。將所得混合物在油浴中回流加熱5h。然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入水(5cm3)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)甲醇。用冰醋酸將所得水溶液酸化至pH5，此時(shí)，固體從溶液中沉淀出來(lái)。將固體過(guò)濾并用水(3xl0cm3)洗滌。在漏斗上將濾餅干燥過(guò)夜，得到2-氨基-8-苯基-9//-嘌呤-6-醇31(0.78g，60%)&(200MHz,D20)7.96(2H，d，《/7.0，2xArC/f)和7,28-7.46(3H，m，3xArC/f)。以類(lèi)似方式制備以下產(chǎn)物2-氨基-8-庚基-9好-嘌呤-6-醇(33)(0.12g，46%)。&(200MHz，D20)2.59(2H，t，".7，ArCi/2)，1.52-1.70(2H，m，ArCH2C//2)，1.08-1.35(8H，m，4xC//2)和0.78(3H，brs，C//3)。2-氨基-8-叔丁基-9仏嘌呤-6-醇(34)(O.llg，53%)。(5H(200MHz，D20)1.30(9H，s，3xCH3)。三氯氧化磷調(diào)節(jié)的?；奏さ沫h(huán)化的一般方法6-氯-8-苯基-9及-嘌呤-2-胺(35)將溶解于三氯氧化磷(35cm3)的苯甲酰胺26(L66g，6Z75mmo1)在氮?dú)鈿夥障禄亓骷訜?8h。在真空下除去過(guò)量溶劑，將碎冰加入殘?jiān)?，攪拌狀態(tài)下得到黑色混懸液。將固體濾掉，并且用濃氨溶液使濾液堿化。形成米色固體。將固體過(guò)濾，用水、乙醇和丙酮洗滌，然后干燥，得到6-氯-8-苯基-9/f-嘌呤-2-胺35(0.39g，24%)。(5H(200MHz，^-DMSO)8.02-7.95禾口7.62-7.38(5H，3xm,芳基H),7.12(1H，brs,Ni7)，6.25和6.32(2H，2xbrs，N//2);&(50MHz,^誦DMSO)161.2(C-6)，156.4(C-4)，154.2(C-8)，153.4(C-2)，130.13(季芳基C),129.13，128.7和125.9(芳基CH)和108.5(C陽(yáng)5)。6-氯-8-庚基-9仏嘌呤-2-胺(36)按照上述一般方法，用P0C13(35cm3)處理酰胺28(1.71g，6.38mmol)，得到6-氯-8-庚基-9H-嘌呤-2-胺36(0.19g，11%)橙色固體。3h(200MHz，A-DMSO)6.39(~1H，brs，N//)，1.12(12H，brs，6xC迅)禾口0.83(3H，brm，C//3);&(50MHz，^-DMSO)160.2(C-6)，150.6(C-8)，146.1(C-4)，144.3(C-2)，112.7(C-5)，31.4,28.9，28.7，28.6，27.6和22.3(6xCH2)和13.8(CH3)。AK4-氨基-6-羥基嘧啶-5-基)苯甲酰胺(37)按照上述?；囊话惴椒?，用苯甲酰氯(1.84cm3，15.85mmo1)處理溶解于2MNaOH水溶液(20cm3)中的二胺IO(l.OOg，7.93mmo1)，得到AK4-氨基-6-羥基嘧啶-5-基)苯甲酰胺37(1.35g，74%)黃色粉末。無(wú)需表征即可直接使用。A44-氨基-6-羥基嘧啶-5-基)油酰胺(38)按照上述?；囊话惴椒ǎ糜王Ｂ?5.24cm3，15.85mmo1)處理溶解于2MNaOH水溶液(20cm3)中的二胺IO(l.OOg，7.93mmo1)，得到7V-(4-氨基-6-羥基嘧啶-5-基)油酰胺38(0.33g，11%)棕色膠狀物。無(wú)需表征即可直接使用。A44-氨基-6-羥基嘧啶-5-基)辛酰胺(39)按照上述?；囊话惴椒?，用辛酰氯(2.71cm3，15.88mmo1)處理溶解于2MNaOH水溶液(20cm3)中的二胺IO(1.06g，8.43mmo1)，得到7V-(4-氨基-6-羥基嘧啶-5-基)辛酰胺39(0.16g，8%)米色粉末。無(wú)需表征即可直接使用。8-庚基-9/f-嘌呤-6-醇(40)按照甲醇鈉調(diào)節(jié)的閉環(huán)的上述一般方法，用溶解于甲醇(15cm3)的甲醇鈉(1.97g，36.53mmo1)處理酰胺39(0.18g，0.72mmo1)，得到8-庚基-9//-嘌呤-6-醇40(0.13g，77%)白色粉末。&(200MHz,A-DMSO)8.54(~1H，brs，N//)，7.74(~1H，brs，H-2)，6.02(1H，brs，Oi7)，2.17-2.41，1.01-1.82和0.75-1.12[15H，6xm，(Cf/2)5Cf/3];3c(50MHz，A-DMSO)171.6(C-6)，159.2(C-8)，158.5(C-4)，146.9(C-2)，98.9(C-5)，35.3，31.2，28.7，28.5，27.4，25.1和22.0(6xCH2)和13.9(CH3)。A46-氨基-2，4-二羥基嘧啶-5-基)苯甲酰胺(41)使用上述酰化的一般方法，將5,6-二氨基尿嘧啶鹽酸鹽13(0.50g，2.8mmo1)溶解于10%氫氧化鈉水溶液(12cm3)中，在冰浴中冷卻，在1.5h內(nèi)用兩份苯甲酰氯(0.33cm3，2.8mmo1)處理。用乙酸調(diào)節(jié)pH至7-8，產(chǎn)物從溶液中沉淀出來(lái)，通過(guò)過(guò)濾收集并用水洗滌，得到W-(6-氨基-2，4-二氧代-l，2,3，4-四氫嘧啶-5-基)苯甲酰胺41黃色固體(0.68g，99。/。)。&(200MHz，A匿DMSO)10.37(1H，s，N//)，10.19(1H，s，Ni7)，8.79(1H，s,麗OO)，7.94-8.00(2H，m，芳基H)，7.41-7.55(3H，m，芳基H)和6.10(2H，brs，N//2)。6-氨基-5-{[(1五,2￡)-3-苯基-2-亞丙烯基]氨基}嘧啶-2，4-二醇(42)將5，6-二氨基尿嘧啶鹽酸鹽13(0.50g，2.8mmo1)溶解于甲醇(10cm3)，向其加入肉桂醛(0.35cm3，2.8mmo1)并在室溫下攪拌反應(yīng)物2h。加入水，得到粘性固體，用醚研碎該固體，然后通過(guò)過(guò)濾收集，得到6-氨基-5-{[(1￡，2￡)-3-苯基-2-亞丙烯基]氨基}嘧啶-2,4-二醇42鮮橙色固體(0.64g，89%)。&(200MHz，^j國(guó)DMSO)10.92(1H，s，N//)，10.76(1H，s，NiO，9.44禾口9.69(1H，2xd/8，N=Ci/)禾口7.10-7.80(7H，m，芳基H，C/f=C/f);3c(50MHz，c^-DMSO)159.9153.8，152.7和149.2(C-2，C-4，C誦5和C-6)，136.3，130.5和131.9(OC和C=N)，129.8，129.4,129.2和128.3(芳基C)。黃嘌呤(43)用原甲酸三乙酯(5cm3)、三乙胺(0.39cm3，2.8mmo1)和iV,iV-二甲基甲酰胺(2cm3)回流加熱5，6-二氨基尿嘧啶鹽酸鹽13(0.50g，2.8mmo1)19h。將固體物質(zhì)過(guò)濾并用醚洗滌，得到黃嘌呤43米色固體(0.45g，90n/c)。&(200MHz，A-DMSO)7.9(1H，s，H-8);<5C(50MHz，斗DMSO)156.2(C-6)，152.1(C-2)，149.5(C-4)，141.2(C-8)和107.4(C-5)。6-氯-8-苯基-9好-嘌呤-2-醇(44)將iV-(6-氨基-2，4-二羥基嘧啶-5-基)苯甲酰胺41(0.14g，0.057mmo1)在POCl3(5cm3)中沸騰回流4h。在通風(fēng)櫥內(nèi)，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去過(guò)量P0C13，將碎冰加入殘?jiān)Ｍㄟ^(guò)過(guò)濾收集沉淀并用水洗滌，得到6-氯-8-苯基-9i7-嘌呤-2-醇44棕色固體(0.17g，產(chǎn)物加上外來(lái)的磷化合物)。c5H(200MHz，A-DMSO)10.85(1H，s,NH)，8.02-8.10(2H，m，芳基H)和7.38-7.60(3H，m，芳基H);&(50MHz,4j-DMSO)156.0(C-6)，152.0(C-2)，150.6和150.2(C-4和C-8)，130.8,129.7，129.5和126.9(芳基C)和108.7(C-5)。8-[(￡)-2-苯乙烯基-9好-嘌呤-2，6-二醇(45)將6-氨基-5-{[(1五，2￡)-3-苯基-2-亞丙烯基]氨基}嘧啶-2,4-二醇42(0.27g,l.lmmol)溶解于亞硫酰氯(10cm3)并回流加熱6.5h,在反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行HPLC分析。原料峰消失后，將反應(yīng)物冷卻并減壓除去過(guò)量亞硫酰氯，得到粗產(chǎn)物8-[(五)-2-苯乙烯基]-9H-嘌呤-2,6-二醇45。&(50MHz，4j-DMSO)155.8和152.0(C-6和C-2)，150.0(同時(shí)發(fā)生的C-8禾口C-4)，136.1和135.6(CH=CHPh和芳基C)，129.8，129.7禾口127.8(芳基C)，116.4(CH=CHPh)和108.1(C-5)。7V-(6-氨基-l，3-二甲基-2，4-二氧代-l，2，3，4-四氫嘧啶-5-基)苯甲酰胺(46)將5,6-二氨基-1,3-二甲基尿嘧啶亞硫酸氫鹽16(0.25g，0.99mmo1)混懸于10%氫氧化鈉(4cm3)并在冰浴中冷卻至0°C。向其加入苯甲酰氯(l當(dāng)量，0.12cm3)，攪拌15min后再加入另一份等量的苯甲酰氯。使反應(yīng)物自然升溫至室溫并攪拌過(guò)夜。用乙酸酸化反應(yīng)混合物，通過(guò)過(guò)濾收集沉淀并用水洗滌，得到AK6-氨基-l,3-二甲基-2,4-二氧代-l，2，3,4-四氫嘧啶-5-基)苯甲酰胺46黃色固體(0.10g，37%)。(5H(200MHz，^-DMSO)8.90(1H，s，麗OO)，7.95-8.02(2H，m，芳基H)，7.42-7.55(3H，m，芳基H)，3.35(3H，s，C//3N)和3.15(3H，s，Cf/3N)。7V-(6-氨基-l，3-二甲基-2，4-二氧代-l，2，3,4-四氫嘧啶-5-基)辛酰胺(47)將5，6-二氨基-1,3-二甲基尿嘧啶亞硫酸氫鹽16(0,25g，0.99mmo1)溶解于吡啶(2cm3)并將溶液冷卻至0°C。向其加入辛酰氯(1當(dāng)量，0.17cm3),使反應(yīng)物自然升溫至室溫并攪拌過(guò)夜。向其加入體積很少的乙酸，反應(yīng)混合物在乙酸乙酯和水之間分配。將水層除去并用1M鹽酸洗滌有機(jī)層兩次。用MgS04干燥有機(jī)層并除去溶劑，得到粗產(chǎn)物叢(6-氨基-l，3-二甲基-2，4-二氧代-l,2，3，4-四氫嘧啶-5-基)辛酰胺47黃色固體(0.05g，17%)。(5H(200MHz，4j誦DMSO)8.91(1H，s，N//C=0)，8.24和6.47(2H，2xs，麗2)，3.31(3H,s，C//3N)，3.12(3H，s，C巧N)，2.14-2.30[2H，m，CH3(CH2)5C//2C=0]，1.40-1.61禾卩1.17-1.38[IOH，2xm，CH3(C/f2)5CH2C=0;^d0.80誦0.92[3H，m，Cff3(CH2)6]。1，3-二甲基-8-苯基-3，9-二氫-1好-嘌呤-2，6-二酮(48)將叢(6-氨基-1，3-二甲基-2，4-二氧代-1，2,3,4-四氫嘧啶-5-基)苯甲酰胺46(O.lOg，0.36mmo1)混懸于2M氫氧化鈉(2cm3)和甲醇(lcm3)中。將反應(yīng)物沸騰回流3h。在反應(yīng)過(guò)程中所有物質(zhì)均溶解，接著形成白色沉淀。將反應(yīng)混合物冷卻并向其加入水(lcm3)，然后用乙酸酸化至pH5。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀并用水洗滌，得到1，3-二甲基-8-苯基-3,9-二氫-1仏嘌呤-2,6-二酮48白色固體(0.06g，65%)。3H(200MHz，^-DMSO)8.12-8.19(2H，m，芳基H)，7.48-7.57(3H，m，芳基H)，7.28(1H，s，N//)，3.52(3H，s，C//3N)禾卩3.28(3H，s,C順)。另一種制備方法在175°C下，將6-氨基-l,3-二甲基-5-亞硝基尿嘧啶15(0.50g，2.7mmo1)和已經(jīng)用濃鹽酸(0.16g，4.3mmo1)處理過(guò)的節(jié)胺(2cm3)加熱3h。使反應(yīng)物冷卻，使物質(zhì)固化并混懸于乙醇(5cm3)。將其過(guò)濾并用水(2cm3)攪拌固體2h。通過(guò)過(guò)濾收集固體并用水洗滌，得到48白色固體(0.12g，17%)。1，3-二甲基-8-庚基-3,9-二氫-1仏嘌呤-2，6-二酮(49)將7V-(6-氨基-l，3-二甲基-2，4-二氧代-l，2,3，4-四氫嘧啶-5-基)辛酰胺47(0.29g，0.99mmo1)在2M氫氧化鈉(3cm3)和甲醇(1.5cm3)中沸騰回流4h。冷卻后，向其先加入水(lcm3)再加入幾滴乙酸。將所得白色沉淀過(guò)濾，并用水和丙酮洗滌，得到1,3-二甲基-8-庚基-3,9-二氫-1仏嘌呤-2,6-二酮49白色固體(0.19g，70%)。<5H(200MHz，^-DMSO)3.41(3H，s，C學(xué))，3.22(3H，s，CfiT3N)，1.60-1.73和1.17-1.35[12H，2xm，CH3(CZ/2)6]和0.82-0.卯[3H，m，CH3(C//2)6]。4，5,6-三氨基啼啶酰胺化的一般方法AT-(4，6-二氨基嘧啶-5-基)苯甲酰胺(50)使4,5,6-三氨基嘧卩定5(0.36g，2.88mmo1)在四氫呋喃/水[l:l(v/v)，30cmS]中變成漿狀物，并用三乙胺(1.2^1，8.63mmo1)處理。將混合物在冰浴中冷卻至0°C，向其逐滴加入溶解于四氫呋喃(5cm3)的苯甲酰氯(0.33cm3，2.88mmo1)中。加完后，將混合物自然升溫至室溫后過(guò)夜。減壓除去四氫呋喃并將所得沉淀過(guò)濾，得到AK4,6-二氨基嘧啶-5-基)苯甲酰胺50(97mg，15%)。<5H(200MHz，^-DMSO)9.20(1H，brs，N//)，8.03(2H，dd，/8.2和1.8，2x芳基CH)，7.82(1H，s，H陽(yáng)2)，7.44-7.56(3H，m，3x芳基CH)，6.23(2H，brs，N//2)和6.04(2H，s,N//2);&(50MHz，A-DMSO)166.3(PhCONH)，160.5(C-4和C-6)，156.1(C-2)，135.1(芳基C)，131.8，128.9和128.6(芳基CH)和96.1(C-5)。ES-MSw/z230.1(M+H)，212.1和104.9。用上述一般方法制備以下化合物7V-(4，6-二氨基嘧啶-5-基)油酰胺(51)(0.26g，17%)。<5H(200MHz，^-畫(huà)SO)8.55(1H,brs,麗)，7.76(1H，s，H-2)，5.77(4H，brs，2x,)，5.25-5.38(2H，m，C//=C//)，2.32(2H，t，《/7.5，NHCOC//2)，1.88-2.09(4H，m，2xCH2CH=C)，1.48-1.63(2H，m，C//2)，1.15-1.46(20H，m，10xCif2)和0.86(3H，t,/6.6，C/f3);(5C(50MHz，^-DMSO)173.0(CONH)，159.5(C-4和C-6)，154.4(C-2)，130.3(CH=CH),96.2(C-5)，35.9，32.0，29.8，29.6，29.3，27.3和25.4(7xCH2)，22.8(CH2CH3)禾卩14.6(CH3)。AL(4，6-二氨基嘧啶-5-基)辛酰胺(52)(0.37g，36%)。(5H(200MHz，4j隱畫(huà)S0)8.59(1H，brs，冊(cè))，7.82(1H，s，H-2)，5.99(4H，brs,2xNi/2)，2.33(2H，t，《/7.4，NHCOCi/2)，1.50-1.68(2H，m，C仏)，1.13-1.40(8H，m，4xC仏)和0.84(3H，t，76.6，Cif3);<5C(50MHz，^曙DMSO)173.0(CONH)，158.2(C-4和C-6)，151.8(C-2)，95.8(C-5)，36.0(COCH2)，31.9，29.6，29.3，25.4和22.8(5xCH2)和14.6(CH3);(ES)CT/zm/z252.2(M+H)，234.2和126.0。甲醇鈉調(diào)節(jié)的4，5,6-三氨基嘧啶的閉環(huán)的一般方法8-苯基-9H-嘌呤-6-胺(53)將溶解于甲醇(0.5cm3)的iV-(4，6-二氨基嘧啶-5-基)苯甲酰胺50(0.17g，0.72mmo1)加入甲醇鈉(25%,6cm3)的甲醇溶液中。將混合物在氮?dú)鈿夥罩杏谠摐囟认禄亓骷訜岵嚢?6h。將混合物冷卻至室溫，并用1M鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至4。形成沉淀，將該沉淀過(guò)濾并干燥，得到8-苯基-9if-嘌呤-6-胺53(0.12g，77%)。&(200MHz，4畫(huà)S0)9.13(2H，brs，NH2)，8.55(1H，s，H-2)，8.20-8.25(2H，m，2x芳基CH)和7.60-7.63(3H，m，3x芳基CH)。&(50MHz，^-DMSO)153.5(C-6)，152.1(C-4)，150.8(C-8)，146.3(C-2)，132.2和130.0(每個(gè)芳基CH)，128.7(芳基C)，127.5(芳基CH)和110.1(C-5).ES-MSw々212.2(M+H)。8-庚基-9好-嘌呤-6-胺(54)按照上述一般方法制備，得到(82mg，65%)。200MHz，4j-DMSO)8.87(2H，brs，NH2)，8.46(1H，s，H-2)，2,87(2H，t，J7.6，C//2(CH2)5CH3)，1.70-1.87(2H，m，CH2)，1.17-1.23(8H，m，4xCH2)和0.86(3H，t，/6.6，CH3);&(50MHz，t/6-DMSO)157.7(C-6)，151.3(C陽(yáng)4)，150.2(C-8)，145.4(C-2)，110.0(C-5)，31.8，29.3，29.2，29.0，27.7和22.8(6xCH2)和14.6(CH3)。2-氨基-6-羥基-9H-嘌呤-8-基氨基甲酸甲酯(55)將溶解于水(2cm3)的S-甲基異硫脲硫酸鹽(0.97g，3.48mmo1)和氯甲酸甲酯(0.36cm3，4.7mmo1)的混合物在冰浴中冷卻至0°C，并通過(guò)逐滴加入25%氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。在該溫度下攪拌混合物10min，此后，用冰醋酸將pH調(diào)回5.0。然后向其先加入處于水(2cm3)中的漿狀物2,4,5-三氨基-6-羥基嘧啶2(l.OOg，4.18mmo1)，再加入固體乙酸鈉(0.29g，4.18mmo1)。在85°C下將反應(yīng)混合物加熱1.5h。此后，將混合物冷卻至室溫，將產(chǎn)物過(guò)濾并真空干燥，得到2-氨基-6-羥基-9//-嘌呤_8_基氨基甲酸甲酯55(0.90g，96%)。(5H(200MHz，D20)3.61(3H，s，C02C//3)。4，6-二氯嘧啶單胺化的一般方法(56)將溶解于含胺(2.1當(dāng)量)或胺(1.2當(dāng)量)與三乙胺(1.2當(dāng)量)的混合物的異丙醇(1.0M)中的56的溶液沸騰回流l-5h，直至耗盡所有原料。將溶劑在真空下除去，將所得粘性物質(zhì)在水和乙酸乙酯或二氯甲垸之間分配。提取并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)制備，然后通過(guò)柱色譜得到純品。6-氯-iV-甲基嘧啶-4-胺(57)按照上述一般方法，用鹽酸甲胺(5.06g，74.97mmo1)和三乙胺(10.3cm3，73.8mmo1)處理溶解于異丙醇(168cm3)中的56(10.03g，67.12mmo1)，然后進(jìn)行制備并使用1:10(v/v)乙酸乙酯:己垸作為洗脫液進(jìn)行柱色譜分離，得到白色晶狀固體6-氯-7V-甲基嘧啶-4-胺57(7.26g，75.2%,通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99.9%)。&(200MHz，CDC13)8.33(IH,s，H-2)，6.35(m，s，H-5)，5.72(1H，brs，麗)和2.94(3H，d，NHj/e，J5.2);<5C(50MHz,CDC13)164.0(C-6)，160.8(C-4)，158.2(C-2)，101.3(br'C-5)禾口28.2(NHMe);/R3.10min(50。/。甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)w/z116(93)，119(32)，144(100，M+，C5H635C1N3要求是144)和146(42，M+.<:511637(:11^3要求是146)。7V-芐基-6-氯嘧啶-4-胺(58)使用上述一般方法，用芐胺(8.07cm3，73.84mmo1)和三乙胺(10.3cm3，73.8mmo1)處理溶解于異丙醇(168cm3)中的56(10.04g，67.36mmo1)，然后進(jìn)行制備并使用1:10(v/v)乙酸乙酯:己烷作為洗脫液進(jìn)行柱色譜分離，得到橙色固體W-芐基-6-氯嘧啶-4-胺58(12.66g，85.5%，通過(guò)HPLC測(cè)定其為99.7%)。5H(200MHz,CDC13)8.09(1H，s，H-2)，7.19-7.43(5H，m，芳基H)，6.42(1H，brs，N//)，6.36(1H，s，H-5)和4.50(2H，d，PhC//2，■/5.4);5C(50MHz，CDC13)163.2(C-6)，159.7(C-4)，158.2(C-2)，136.8(季芳基C)，128.8，127.9和127.4(芳基C)，101.9(br，C-5)和45.6(PhCH2);&14,28min(50。/o甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)m/z141(10)，201(12)，220(100，M+.CuHh^CINs要求是220)，221(15)和222(30，M+.CuHk^CINs要求是222)。2-(6-氯嘧啶-4-基)氨基]乙醇(59)使用上述一般方法，用乙醇胺(4.25cm3，70.48mmo1)和三乙胺(10.3cm3，73.8mmo1)處理溶解于異丙醇(168cm3)中的56(10.08g，67.64mmo1)，然后進(jìn)行制備并使用1:10(v/v)乙酸乙酯:己烷作為洗脫液進(jìn)行柱色譜分離，得到米色固體2-[(6-氯嘧啶-4-基)氨基]乙醇59(9.19g，78.3%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為98.9%)。(5H(200MHz，CDC13+A-DMSO)8.22(1H，s，H-2)，6,45(1H，brs，麗)，6.35(1H，s，H-5)，3.70(2H，t，OCH2，J5.0)禾口3.41(3H，brs，0//和NHC//2);3c(50MHz，CDCl3+^rDMSO)163.8(C-6)，158.4(C-2和C-4)，103.3(br，C-5)，61.1(OCH2)和44.2(NHCH2);&2.40min(50。/o甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)m/z110(64)，128(100)，129(43)，130(32)，132(17)，156(100，M+-H20)，158(36，M+-H20)，174(68，M+.C6H835C1N30要求是174)和176(23，M+.C6H837C1N30要求是176)。(2及)-2-[(6-氯嘧啶-4-基)氨基-3-苯基丙酸甲酯(60)使用上述一般方法，用L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(由溶解于甲醇(75cm3)的L-苯丙氨酸(12.32g，74.57mmol)新鮮制備得到，該甲醇用氯化氫氣體處理過(guò))和三乙胺(19.6cm3，0.14mol)處理溶解于異丙醇的(168cm3)56(10.04g，67.38mmol),然后進(jìn)行制備并使用1:10(v/v)乙酸乙酯:己垸作為洗脫液進(jìn)行柱色譜，得到橙色油狀物(2"-2-[(6-氯嘧啶基-4-基)氨基]-3-苯基丙酸甲酯60(2.08g，11.0%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99.5%)。(5H(200MHz,CDC13)8.35(1H，s，H陽(yáng)2)，7.01-7.35(5H，m，芳基H)，6.36(1H，s，H-5)，5.79(1H，brd，NW，《/7.6)，4.68-5.21(1H，brm，CaCO)，3.75(3H，s，OC//3)3.24(1H，dd，PhC//ai/b，J5.6禾口13.8)禾口3.41(1H，dd，PhCHai/b，J6.4禾口14.0);&(50MHz，CDC13)172.0(CO)，162.1(C-6)，159.1(C-4)，158.3(C-2)，135.5(季芳基C)，129.1，128.5和127.1(芳基C)，103.9(br，C-5)，54.6(OCH3)，52.3(PhCH2)和37.8(CHCO);&1.87min(甲醇);(ES)m/zl20(13)，169(17)，205(21)，232(100，M+-C02Me)，233(28)，234(73，M+-C02Me)，292(45，M+.C14H1435C1N302要求是292)和294(18，M+.<:14111437(:刖302要求是294)。al(4-溴苯基)-6-氯嘧啶-4-胺(61)使用上述一般方法，用4-溴苯胺(12.10g，69.50mmol)和三乙胺(10.3cm3，73.8mmol)處理溶解于異丙醇(168cm3)的56(9.98g，67.01mmol)。加熱后，向其加入等體積的水和乙酸乙酯，將所得混懸液過(guò)濾，得到米色粉末AK4-溴苯基)-6-氯嘧啶-4-胺61U2.73g，67.0%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度〉99.9。/。)。3H(200MHz，CDC13)9.11(1H，brs，H隱2)，8.05(1H，s，N/D，7.17(2H，d，芳基H,J8.8),7.05(2H，d，芳基H，J9.0)禾卩6.40(1H，s，H國(guó)5);&(50MHz，CDC13+^曙DMSO)169.4(C-6)，161.9(C-4)，158.1(C-2)，137,6(季芳基C)，131.7和122.7(芳基C)，116.3(季芳基C)和104,6(C-5);^2.15min(甲醇);(ES)m/z204(80)，205(100，M+-Br)，206(42)，207(35)，210(10)，213(10)，259(10)，284(78，M+，C10H779Br35ClN3要求是284)，286(100,M+.ck)H,Br35ciN3要求是286)和288(29)。6-氯-al甲基-5—亞硝基嘧瞎-4-胺(62)按照上述一般方法，在30min內(nèi)，將溶解于水(84cm3)的亞硝酸鈉(6.31g，91.38mmo1)逐滴加入來(lái)處理溶解于乙酸(25cm3)的氯化物57(7.26g，50.58mmo1)。經(jīng)2h形成固體后，將固體分離，得到黃色粉末6-氯-AL甲基-5-亞硝基嘧啶-4-胺62(7.68g，88%,通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為97.4%)。(5H(200MHz，CDC13)8.83(1H，s，H-2)，8.06(1H，s，Ni/)和3.45(3H，s，NH^fe);<5C(50MHz，CDC13)161,9(C-4和C-6)，158.4(C-2)，107.9(C-5)和27.6(NHMe);fR9.10min(50。/。甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)m/z130(18，C4H435C1N3)，143(39)，144(100，M+-NO),145(21)，146(33，M+-NO)禾卩173(1，M+.C5H535C1N40要求是173)。W-節(jié)基-6-氯-5-亞硝基嘧啶-4-胺(63)使用上述一般方法，在30min內(nèi)，將溶解于水(95cm3)的亞硝酸鈉(7.11g，O.lOmol)逐滴加入來(lái)處理溶解于濃鹽酸(28cm3)的氯化物58。經(jīng)18h沉淀出固體，將該固體分離，得到淺米色粉末W-芐基-6-氯-5-亞硝基嘧啶-4-胺63(12.75g，90.2%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為96.3%)。(5H(200MHz，CDC13)8,91(1H，brs，H-2)，8.08(1H，s，則，7.29(5H，brs，芳基H)和5.37(2H，s,PhCi72);&(50MHz，CDC13)162.1(C-4和C-6)，158.4(C-2)，134.2(季芳基C)，128.6，128.3和127.9(芳基C)，108.0(C-5)和43.6(PhCH2);&2.12min(甲醇);(ES)m/zl06(12)，218(80，CUH935C1N3)，219(65)，220(100，CH937C1N3)，221(26)和222(23)。沒(méi)有M+(CH935C1N40要求是249)。2-[(6-氯-5-亞硝基嘧啶-4-基)氨基乙醇(64)使用上述一般方法，在30min內(nèi)，將溶解于水(132cm3)的亞硝酸鈉(6.65g，96.32mol)逐滴加入來(lái)處理溶解于乙酸(26cm3)的氯化物59(9.19g，52.96mmol)。在18h內(nèi)形成固體，將該固體分離并用乙酸乙酯提取溶液。用2M氫氧化鈉水溶液洗滌有機(jī)相，部分濃縮為橙色油狀物。將該油狀物析出并與過(guò)濾出的固體合并，得到淺橙色粉末2-[(6-氯-5-亞硝基嘧啶-4-基)氨基]乙醇64(8.54g，79.6%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為86.0%)。(h(200MHz,CDC13)8.86(1H，brs，H曙2)，8.05(1H，s，麗)，4.36(2H，t，0C//2，J5.5)，3.73(2H，t，NHC//2，/5.6)和2.25(IH，brs，0/n;3C(50MHz,CDC13)162.5(C畫(huà)6)，158.2(C-2和C-4)，108.1(C-5)，59.6(OCH2)和42.7(NHCH2);^4.52min(甲醇);(ES)w/z130(24)，142(95)，143(100，C5H635C1N3)，144(36)，145(32)，156(10，C6H735C1N3)，172(29)，174(64，C6H837C1N30)，176(16)和203(13，M+.(:611735(:1^[402要求是203)。嘧啶亞硝化的一般方法用溶解于水(6.3M)的亞硝酸鈉(1.8當(dāng)量)溶液逐滴處理溶解于乙酸或鹽酸(2M)的嘧啶溶液。在加入過(guò)程中產(chǎn)生棕色氣體，并隨時(shí)間推移形成固體沉淀。將固體過(guò)濾，用水洗滌并進(jìn)行抽吸干燥。iV，7V，7V'-三甲基-5-亞硝基嘧啶-4,6-二胺(65)逐滴加入二甲胺(33%的醇溶液，1.74cm3，12.75mmo1)來(lái)處理溶解于二氯甲烷(2.9cm3)的嘧啶62(0.97g，5.65mmo1)的混合物，引起自發(fā)加熱。在室溫下攪拌混合物18h。使用1:10-3:10(v/v)乙酸乙酯:己垸作為洗脫液，對(duì)所得到的橙色溶液進(jìn)行柱色譜純化，得到黃色固體A^V,iV'-三甲基-5-亞硝基嘧啶-4,6-二胺65(0.60g，59.0%)。&(200MHz，CDC13)8.52(1H，s，H-2),7.02(1H，s，則，3.47(3H，s，NC//3)和3.18[H，s，N(C//3)2];(5c(50MHz，CDC13)163.1(C-6)，160.1(C-4)，157.4(C-2)，87.4(C誦5)，37.5[N(CH3)2，28.0(NHCf/3)。AL節(jié)基-A^vv'-二甲基-5-亞硝基噴啶-4，6-二胺(66)使用類(lèi)似于65的方法，逐滴加入二甲胺(溶解于醇中，濃度為33%，l.OOcm3，7.32mmo1)來(lái)處理溶解于二氯甲烷(lcm3)的嘧啶63(0.51g，2.04mmo1)的混合物，引起自發(fā)加熱。將混合物在室溫下攪拌2h。使用1:10-3:10(v/v)乙酸乙酯:己垸作為洗脫液，對(duì)所得到的橙色溶液進(jìn)行柱色譜純化，得到淺黃色固體4-芐氨基-6-二甲氨基-5-亞硝基嘧啶66(0.48g，90.7%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99.6%)。SH(200MHz，CDC13)8.57(1H，s，H-2)，7.21-7.31(5H，m，芳基H)，7.05(1H，s，麗)，5.39(2H，s，PhC/f2)和3.18[6H，s，N(C//3)2];&(50MHz，CDC13)163.2(C-6)，159.9(C-4)，157.5(C-2)，135.1(季芳基C)，128,3，128.2和127.4(芳基C)，87.6(C-5)，43.7(PhCH2)和37.5[N(CH3)2];fR2.17min(甲醇)；(ES)m/z105(12)，123(31)，151(11)，199(12)，227(94)，228(100，C13H16N4)，229(83)和258(1，MH+.C13H16N50要求是258)。2-{6-(二甲基氨基)-5-亞硝基嘧啶-4-基氨基}乙醇(67)使用類(lèi)似于65的方法，逐滴加入二甲胺(溶解于醇中，濃度為33%，1.48cm3，10.86mmol)來(lái)處理溶解于二氯甲烷(2.5cm3)的嘧啶64(1.02g，5.03mmo1)的混合物，引起自發(fā)加熱。將混合物在室溫下攪拌18h。使用1:10-3:10(v/v)乙酸乙酯:己垸作為洗脫液，對(duì)所得到的橙色溶液進(jìn)行柱色譜純化，得到黃色固體2-{[6-(二甲氨基)-5-亞硝基嘧啶-4-基]氨基}乙醇67(0.76g，72.0%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99.5%)。(5H(200MHz，CDC13)8.48(1H，s，H-2)，6.97(1H，s，麗)，4.30(2H，t,OC仏，/4.9)，3.69(2H，t，NHC//2，凡9)和3.19[6H，s，N(C//3)2];5C(50MHz，CDC13)163.1(C-6)，159.9(C-4)，157.0(C-2)，88.0(C-5)，60.3(OCH2)，44.1(NHCH2)和37.5[N(CH3)2];ZR3.87min(50。/o甲醇:25mM乙酸銨);(ES)m/zl51(100，C7HUN4)，152(14)，182(10，C8H14N40)和183(25)。沒(méi)有]VT((:81113>^02要求是211)。7V-甲基-5-亞硝基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-胺(68)將嘧啶62(0.97g，5.61mmol)和吡咯垸(1.16cm3，13.91mmol)的純混合物加熱至150°C，并持續(xù)加熱lh。使用1:10-3:10(v/v)乙酸乙酯:己垸作為洗脫液，對(duì)所得到的黑色溶液進(jìn)行柱色譜純化，得到黃色固體N-甲基-5-亞硝基-6-妣咯烷-l-基嘧啶-4-胺68(0.97g，83.1%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99.9%)。3H(200MHz,CDC13)8.44(1H，s，H-2)，6.80(1H，s，N//)，3.48[4H，brs，N(C//2)2]，3.40(3H，s，NHC/f3)和1.78-2.13[4H，brm，(C//2)2];c5c(50MHz,CDC13)160.7(C-6)，159.5(C-4)，157.8(C-2)，88.1(C曙5)，46.5[N(C恥]，27.8(NHCi/3)和25.1[(CH2)2];,R11.57min(50。/o甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)m/z123(12)，149(15)，150(51)，177(49，M+-NO),178(89，MH+-NO),179(100)，180(10)和208(1，MH+.C9H13N50要求是208)。7V-芐基-5-亞硝基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-胺(69)逐滴加入吡咯烷(0.34cm3，4.02mmol)處理溶解于二氯甲烷(1cm3)的嘧啶63(0.50g，2.00mmol)的混合物，引起自發(fā)加熱。將混合物在室溫下攪拌10min。使用1:10-3:10(v/v)乙酸乙酯:己垸作為洗脫液，對(duì)所得到的棕色溶液進(jìn)行柱色譜純化，得到淺黃色固體^-節(jié)基-5-亞硝基-6-吡咯垸-l-基嘧啶-4-胺69(0.53g，94.1%,通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為96.6%)。5H(200MHz,CDC13)8.56(1H，s，H-2)，7.15-7.31(5H，m，芳基H)，6.90(IH，s,Ni/)，5.39(2H，s，PhC2)，3.53[4H，brs，N(Ci/2)2]和1.87-2.21[4H，brm，(C恥];3c(50MHz，CDC13)160.9(C陽(yáng)6)，159.4(C-4)，157.7(C-2)，135.1(季芳基C)，128,3，128.1和127.3(芳基C)，88.5(C-5)，46.7[N(CH2)2]，43.6(PhCH2)和25.2[(CH2)2];^2.28min(甲醇);(ES)m/zl49(17)，226(22)，253(78，M+-NO),254(100，MH+-NO),255(86)，256(14)和284(1，MH+.C15H18N50要求是284)。2-[(5-亞硝基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-基)氨基]乙醇(70)使用類(lèi)似于68的方法，將嘧啶64(0.96g，4.76mmo1)和吡咯烷(0.98cm3，11.85mmo1)的純混合物加熱到150°C，并繼續(xù)加熱lh。使用1:10-3:10(v/v)乙酸乙酯:己烷作為洗脫液，對(duì)所得到的黑色溶液進(jìn)行柱色譜純化，得到米色固體2-[(5-亞硝基-6-吡咯垸-l-基嘧啶-4-基)氨基]乙醇70(0.41g，36.6°/。，HPLC通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99.7%)。3H(200MHz，CDC13)8.49(1H，s，H-2)，6.84(1H，s，Ni/)，4.31(2H，t，OC仏，/4.8)，3.70(2H，~t，NHCi/2，《/4.9)，3.11-3.85[4H，brm，N(Ci/2)2]和1.82-2.23[4H，brm，(CfiT2)2];<5c(50MHz，CDC13)160.9(C-6)，159.5(C-4)，157.3(C-2)，89.0(C-5)，60.4(OC/^2)，46.8[br，N(CH2)2]，44.1(NHCH2)和25.3[br，(C//2)2];&6.43min(50。/o甲醇:25mM乙酸銨)。AL節(jié)基-6-嗎啉-4-基-5-亞硝基嘧啶-4-胺(71)使用類(lèi)似于66的方法，逐滴加入嗎啉(1.23g，14.1mmo1)來(lái)處理溶解于二氯甲烷溶液(10cm3)的嘧啶58(1.46g，5.87mmo1)的混合物，引起自發(fā)加熱。將混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。將所得深黃色溶液倒入乙酸乙酯(20cm3)并用等體積水洗滌。將溶劑除去得到粘性固體，在己垸中研碎該固體。通過(guò)過(guò)濾收集黃色固體W-芐基-6-嗎啉-4-基-5-亞硝基嘧啶-4-胺71[1.42g，85%，在l:l(v/v)乙酸乙酯:己烷中的R,為0.43]。&(200MHz，CDC13)8.60(1H，s，H隱2)，7.26(5H,brs，芳基H)，7.14(1H，s，麗)，5.39(2H，s，PhCi/2)，3.80(4H，m，2xOCi/2)禾口3.72(4H，m，2xNCff2);&(50MHz，CDC13)163.5(C-6)，161.0(C-4)，157.5(C-2)，135.0(季芳基C)，128.7，128.5和127.7(芳基C)，87.8(C-5)，66.5(2xOCH2)，45.0(2xNCH2)和43.5(PhCH2)。亞硝基還原的一般方法W-芐基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4，5-二胺(76)將叢芐基-5-亞硝基-6-卩比咯烷-1-基嘧啶-4-胺69(0.41g，1.45mmo1)混懸于水(1.45cm3)中，用一份份加入的固體連二亞硫酸鈉(0.53g，3.04mmol)處理。向其逐滴加入硫酸水溶液(50%v/v，4.08g)，在130°C下將所得混合物攪拌加熱5min。此后，反應(yīng)混合物變成無(wú)色，在冰中冷卻。用2M氫氧化鈉水溶液將混合物pH調(diào)至pH>10，并用二氯甲烷(3x50cm3)提取。將合并的有機(jī)提取物減壓濃縮，從二氯甲烷/己垸重結(jié)晶出粗產(chǎn)物，得到^-芐基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4,5-二胺76(0.34g，87%)。&(200MHz，CDC13)8.10(1H，s，H-2)，7.25-7.35(5H，m，芳基H)，5.35(1H，brs，Ni/2)，5.14(1H，s，N仏)，4.41(2H，d，J5.8，Ci/2Ph)，3.36(4H，brs，2xC耶)和1.卯-1.96(4H，m，2xCi/2CH2N);<5C(50MHz，CDC13)162.5(C-4)a，160.9(C-6)a，157.9(C-2)，138.7(季芳基C)，128.7,127.6和127.5(芳基C)，80.9(C-5)，46.4(2xCH2N)，46.1(CH2Ph)和25.5(2xCH2CH2N);(ES)w/z255.2[(M-N)+H]，228.2，163.1和138.0。使用該方法制備以下化合物iVVvVv^三甲基嘧啶-4，5，6-三胺(72)(31mg，81%)。&(200MHz，CDC13)8.16(1H，s，H-2)，5.28(1H，s，麗2)，4.82(1H，brs，麗2)，3.09[6H，s，即//3)2]和2.89[H，d，J5.4,N(C瑪)2]。A^-節(jié)基-7VVv^二甲基嘧啶-4，5，6-三胺(73)(91.9mg，80%)。3h(200MHz，CDC13)8.16(1H，s，H-2)，7.26-7.35(5H，m，芳基H),5.30(1H，s，Ni/2)，5.10(1H，brs，N//2)，4.45(2H，d，《/5.8，C//2Ph)，3.01(6H，s，2xNC//3)禾口1.78(1H，brs，麗);(5C(50MHz，CDC13)163.0(C-4和C-6)，157.6(C-2)，138.7(季芳基C)，128.8和127.5(芳基C)，80.2(C-5)，46.0(CH2Ph)和37.4(2xNCH3);(ES)m/z229.2[(M-N)+H]，202.1，137.1和138.0。2-5-氨基-6-(二甲基氨基)嘧啶-4-基]氨基乙醇(74)(0.29g，54%)。JH(200MHz，CDC13)8.15(1H，s，H-2)，5.36(1H，s，NW2)，5.00(1H，brs，NZ/j),3.80(2H，t，J4.9，C/f2OH)，3.42-3.50(2H，m，C//2NH)，3.05(6H，s，2xNC巧)和2,87(1H，brs，麗)；(5C(50MHz，CDC13)162.9(C-4)a，162.0(C-6)a，157.3(C-2)，80.9(C-5)，62.9(CH2OH)，44.8(CH2NH)和37.5(2xNCH3);(ES)m/z183.1[(M-N)+H〗，165.1，139.0和110.9。A^甲基-6-吡咯垸-l-基嘧啶-4，5-二胺(75)(0.66g，86%)。3H(200MHz，CDC13)8.11(1H，s，H陽(yáng)2)，5.13(m，s，冊(cè)2)，4.76(1H，brs，麗2)，3.36-3.48(4H，m，2xCf/2N)，2.85(3H，d，/5.4，NCi73)和1.94-2.00(4H，m，2xC7/2CH2N);3C(50MHz，CDC13)163.4(C-4)a，161.8(C-6)a，157.8(C-2)，79.9(C-5)，46.5(2xCH2N)，28.7(NCH3)4口25.5(2xCH2CH2N)b;(ES)m/z179.1[(M-N)+H]，137.0和120.9。2-(5-氨基-6-吡咯垸-l-基嘧啶-4-基)氨基乙醇(77)(0.23g，71%)。<5H(200MHz,CDC13)8.12(1H，s，H-2)，5.22(IH，s，麗2)，5.06(1H，brs，麗2)，3.79(2H，t，J4.9，C//2OH)，3.30-3.48(7H，m，Ci/2NH，2xC//2N禾卩N^)禾口1.94-2.01(4H，m，2xC//2CH2N);<5C(50MHz，CDC13)162.6(C-4)a，160.7(C-6)a，157.5(C-2)，81.4(C-5)，62.5(CH2OH)，46.5(2xCH2N)，44.7(CH2NH)和25.5(2xCH2CH2N);(ES)m/z209.1[(M-N)+H]，191.1，182.1，165.1和138.0。V-節(jié)基-6-嗎啉-4-基嘧啶-4，5-二胺(78)使用類(lèi)似于76的方法，將亞硝基化合物71U.35g，4.63mmoD混懸于水(50cm"中，用一份份加入的固體連二亞硫酸鈉(1.70g，9.74mmo1)處理。在3min內(nèi)，將硫酸水溶液(50%w/w，9.09g)逐滴加入，將所得混合物在140。C下攪拌加熱5min。此后，反應(yīng)混合物變成無(wú)色，使其冷卻至40。C。用2M氫氧化鈉水溶液將混合物pH調(diào)至pH〉10，用乙酸乙酯(2x50cm3)提取所得溶液。將合并的有機(jī)提取物減壓濃縮，從二氯甲烷/己垸重結(jié)晶出粗產(chǎn)物，得到A^-芐基-6-嗎啉-4-基嘧啶-4，5-二胺87(0.90g，70%)白色固體。<5H(200MHz，CDC13)8.20(1H，s，H-2)，7.35(5H，brs，芳基H)，5.41(1H,s，Ni/)，5.35(br，N//2)，4.48(2H，d，J5.8Hz，Cfir2Ph)，3.75(4H，m，2xC//20)和3.51(4H，m，2xNCi^2);&(50MHz，CDC13)164.5(C-6)，163.0(C-4)，157.5(C-2)，138.5(季芳基C)，129.0，128.0和127.5(芳基C)，81.5(C-5)，66.5(2xOCH2)，46.0(PhCH2)和44.5(2xNCH2)。三氨基嘧啶72-78閉環(huán)的一般方法9-節(jié)基-6-卩比咯烷-l-基-9好-嘌呤(82)將5-氨基-4-芐氨基-6-(吡咯烷-l-基)嘧啶76(39.6mg，0.15mmol)混懸于乙酸酐(5質(zhì)量當(dāng)量，143mg，130//1)和原甲酸三乙酯(5質(zhì)量當(dāng)量，143mg,160//1)的混合物并攪拌回流加熱。在加熱過(guò)程中所有原料均溶解?；亓?h后，將混合物冷卻，將過(guò)量乙酸酐和原甲酸三乙酯減壓除去。通過(guò)硅膠柱色譜(使用乙酸乙酯作為洗脫液)將粗殘?jiān)兓?，得?-節(jié)基-6-批咯烷-l-基-9/7-嘌呤82(32.8mg,80%)。<5H(200MHz，CDC13)8.45(1H，s，H-2)，7,24-7.28(5H，m，芳基H)，6.19(1H，s,H-8)，5.11(1H，s，C/f2Ph)，3.18-3.62(4H，brs，2xC//2N，1.90-2.06(4H，m，2xCi/2CH2N);&(50MHz,CDC13)171.2(C-6)a，161.3(C-4)a，158.4(C-8)a，158.4(C-2)，138.0(季芳基C)，128.7，127.7和127.4(芳基C)，98.1(C-5)，50.5(2xCH2N)，46.7(CH2Ph)和25.5(2xCH2CH2N);(ES)m/z291.2[M+NH4+]，255.2，205.1禾卩166.1。使用該方法制備以下化合物AyV，9-三甲基-9好-嘌呤-6-胺(79)C0.12g，100%)。&(200MHz，CDC13)8.47(1H，s，H曙2)，6.50(1H，s，H-8)，3.36(3H,s，NC//3)和3.13[6H，s，N(C7/3)2];&(50MHz，CDC13)171.3(C-6)a，163.5(C-4)a，161.7(C-8)，157.8(C-2)，96.1(C-5)，37.6(2xNCH3)和35.0(NCH3)。9-節(jié)基-iV,W,-二甲基-9好-嘌呤-6-胺(80)(46.0mg，88%)。<5H(200MHz，CDC13)8.16(1H，s，H-2)，7.26-7.35(5H，m，芳基H)，6.33(1H，s，H-8)，5.30(1H，s，麗2)，5.10(1H，brs，N/72)，4.45(2H，d，J5.8，C//2Ph)，3.01(6H，s，2xNC/f3)和1.78(1H，brs，N//);(ES)m/z229.2[(M-N)-KH]，202.1，137.1和138.0。9-甲基-6-口比咯烷-l-基-9好-嘌呤(81)(47.1mg，67%)。3H(200MHz，CDC13)8.41(1H，s，H-2)，6.29(1H，s，H-8)，3.34-3.56(4H，m，2xC顯)，3.31(3H，s，NC/3)和1.92-2.04(4H，m，2xCi/2CH2N)。&(50MHz，CDC13)171.2(C隱6)a，161.3(C-4)a，158.4(C-8)，158.1(C-2)，96.9(C-5)，46.8(2xCH2N)，35.0(NCH3)和25.4(2xCH2CH2N)。(ES)w/z221.2[M+NH4+]，179.1和166.1。9-節(jié)基-6-嗎啉-4-基-9丑-嘌呤(83)(59.7mg，68%)。(5H(200MHz，CDC13)8.49(1H，s，H-2)，7.21-7.35(5H，m，芳基H)，6.66(1H，s，H-8)，5.18(2H，s，C//2Ph)，3.74-3.80(4H，m，2xC//20)，3.56-3.61(4H，m，2xC//2N)禾口1.78(1H，brs，Ni7);&(50MHz，CDC13)171.6(C-6)a，163.5(C陽(yáng)4)a，161.35(C陽(yáng)8)，158.0(C-2)，137.9(季芳基C)，128.8，127.5和127.4(芳基C)，96.9(C-5)，66.6(2xCH20)，50.4(CH2Ph)禾卩44.6(2xCH2N);(ES)m/z221.2[M+NH4+]，312.1，268.9和91.1。6-氯-AyV-二甲基嘧啶-4-胺(84)按照上述一般方法處理溶解于異丙醇(100cm3)中的56(15.03g，O.lOmol)、二甲胺(60%的水溶液，9.20cm3，0.12mol)和三乙胺(17.07cm3，0.12mol)溶液。通過(guò)色譜(使用1:10-1:5(v/v)乙酸乙酯:己烷作為洗脫液)，得到米色晶體6-氯-A/;7V-二甲基嘧啶-4-胺84(量為16.73g;通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99.1%)。&(200MHz，CDC13)8.38(1H，s，H-2)，6.39(m，s，H-5)禾口3.14(6H，s，NMe2);&(50MHz，CDC13)159.2(C-6),158.9(C-4)，158.0(C-2)，101.3(C-5)禾口37,8(NMe2);ZR4.48min(50%甲醇:25mM乙酸銨)；(TSP)m/z158(100，M+.C6H835C1N3要求是157.6)和160(35，C6H837C1N3)。6-氯-4-吡咯烷-l-基嘧啶(85)按照上述一般方法處理溶解于異丙醇(100cm3)中的56(15.00g，O.lOmol)、卩比咯烷(9.37cm3，0.112mol)和三乙胺(17.1cm3，0.12mol)溶液。通過(guò)色譜(使用1:10-1:5(v/v)乙酸乙酯:己垸作為洗脫液)得到米色晶體6-氯-4-吡咯烷-l-基嘧啶85U7.85g，98.3%;通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為98%)。(5H(200MHz，CDC13)8.36(1H，s，H-2)，6.25(IH，s，H-5)，3.58和3.31[4H，2個(gè)重疊的brs，N(C仏)2]和2.12[4H，brs，(C//2)2];&(50MHz，CDC13)160.9(C-6)，158.9(C-4)，158.0(C-2)，101.0(C-5)，46.3[N(CZ/2)2]和25.3[(CH2)2];&7.13min(50。/。甲醇:25mM乙酸銨)；(TSP)m/z184(100，M+.C8H1035C1N3要求是184)和186(28，M+.C8H1037C1N3)。l-(6-氯嘧啶-4-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(86)用氯化氫氣體處理溶解于甲醇(100cm3)中的L-脯氨酸G4.26g，0.12mol)30min，然后將其攪拌lh。然后將溶液濃縮至干燥，無(wú)需表征即可使用該甲酯鹽酸鹽。按照上述一般方法處理溶解于異丙醇(100cm3)中的上述甲基酯、56(15.01g，O.lOmol)和三乙胺G1.3cm3，0.23mol)。通過(guò)色譜(使用1:5(v/v)乙酸乙酯:己垸作為洗脫液)得到粘性橙色油狀物l-(6-氯嘧啶-4-基)吡咯垸-2-甲酸甲酯86(19.74g，81%;通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為89.3%)。&(200MHz，CDC13)8.39(1H，s，H-2)，6.39(1H，brs，H曙5)，4.63(1H，brs，COC/f)，3.73(3H，s，OMe)，3.81-3.28(2H，2個(gè)重疊的brs，NC^)和2.41-1.95[4H，m，(C//2)2〗；3c(50MHz，CDC13)172.8(CO)，160.9(C-6)，159.8(C-4),158.0(C隱2)，101.2(C-5)，59.8(OMe)，52.2(COCH)，46.5(NCH2)，30.1和24.1[(CH2)2];/R5.27min(50%甲醇25mM乙酸銨)；(TSP)m/z242(100，M+.(:10111435(:^302要求是241.7)，243(10)和244(25，M+.C10H1437ClN3O2)。4-(6-氯嘧啶-4-基)嗎啉(87)按照上述一般方法處理溶解于異丙醇(100cm3)中的56(15.00g，O.lOmol)和嗎啉(18.00g，0.21mol)。將提取物濃縮得到晶狀固體。用飽和碳酸氫鈉水溶液在布氏漏斗上洗滌該晶體，然后用最少量的乙酸乙酯除去水，得到米色晶體4-(6-氯嘧啶-4-基)嗎啉87(18.30g，92%)。&(200MHz，CDC13)8.39(1H，s，H-2)，6.48(1H，s，H-5)，3.91-3.72[4H，m，0(C^2)2]和3.70-3.41[4H，m，N(C//2)2];Jc(50MHz，CDC13)162.6(C-6)，160.2(C-4)，158.0(C-2)，101.4(C-5)，66.3和44.2[N(CH2)2]。iV-甲基-6-吡咯垸-l-基嘧啶-4-胺(89)將氯化物85(1.45g，lO.llmmol)和吡咯烷(1,86cm3,22.24mmo1)在250。C下稠合lh。繼續(xù)在乙酸乙酯(50cm3)中處理，用水(50cm3)洗滌，干燥(MgS04)，濃縮為棕色膠狀物。通過(guò)通過(guò)柱色譜(1:9(v/v)甲醇:乙酸乙酯作為洗脫液)得到淺棕色固體叢甲基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-胺89(0.63g，35%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99%)。&(200MHz，CDC13)8.11(m，s，H-2)，5.13(1H，s，H陽(yáng)5)，4.89(1H，brs，Ni7)，3.52-3.28[4H，m，0(CH2Ci/2)2N],2.85(3H，d，NHCi/3，J5.2)和2.09-1.81[4H，m，0(Cff2CH2)2N];&(50MHz，CDC13)162.8禾n160.7(C-4和C-6)，157.2(C-2)，79.5(C-5)，46.3[(CH2CH2)2N]，28.5(NHO/3)和25.3[(CH2CH2)2N];&2.25min(50。/。甲醇:25mM乙酸銨)。AL甲基—6-嗎啉-4-基嘧啶-4-胺(卯)將氯化物87(1.45g，lO.llmmol)和嗎啉(2.28cm3，22.23mmo1)在250。C下稠合lh。繼續(xù)在乙酸乙酯(50cm3)中處理，用水(50cm3)洗滌，干燥(MgS04)，濃縮為棕色膠狀物。通過(guò)柱色譜(1:9(v/v)甲醇:乙酸乙酯作為洗脫液)得到黃色粉末7V-甲基-6-嗎啉-4-基嘧啶-4-胺90(1.51g，77%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為96%)。3H(200MHz，CDC13)8.14(1H，s，H-2)，5.37(1H，s，H-5)，5.05(1H，brs，N//)，3.77[4H，t，0(Cff2CH2)2N，J4.9]，3.54[4H，t，0(C772CH2)2N，J4.9]和2.87(3H，d，NHC//3，J5.2);&(50MHz，CDC13)163.7和163.1(C-4和C-6)，157.2(C-2)，79.9(C-5)，66.5，44.5和1.卯-2.05[4H，m，(C//2)2];(5c(50MHz，CDC13)162.1(C-6)，160.6(C隱4)，157.5(C-2)，138.4(季芳基C)，128.6，127.3和127.2(芳基C)，80.6(C-5)，46.2[N(CH2)2]，45.9(PhC仏)和25.3[(CH2)2];&10.13min(50。/。甲醇:25mM乙酸銨);(ES)m/z138(38)，163(51)，228(22)，255(100，MH+.C^H^N4要求是255)和256(27)。7V-芐基-l-[6-(芐氨基)嘧啶-4-基吡咯烷-2-甲酰胺(92)使用類(lèi)似于91的方法，將氯化物86(1.67g，6.92mmo1)、芐胺(2.17cm3，20.0mmo1)和甲苯(20cm3)置于玻璃管內(nèi)，密封并在130°C下加熱18h。在30min內(nèi)，在溶液中形成一層結(jié)晶。冷卻后，使用乙酸乙酯從水中提取溶液，并且進(jìn)行制備從而得到橙色油狀物。通過(guò)柱色譜(乙酸乙酯一甲醇在乙酸乙酯中的比例為1:10(v/v)作為洗脫液)得到米色固體A^芐基-l-[6-(芐氨基)嘧啶-4-基]吡咯垸-2-甲酰胺92(1.73g，62%)。3H(200MHz，CDC13)8.12(1H，s，H-2),7.15-7.44(5H,m，芳基H)，5.30(2H，brm，H-5和N//)，4.53-4.66(1H，m，NC7/C0)，5.27-4.52(4H，m，2xPhC//2)，3.42-3.56(1H，brdd，NC//aHb，J6.8和9.4)，3.19-3.38(1H，brq，NCHa//b，《/9.0)，2.38-2.52和1.94-2.20[4H，2xm,(C仏)2];&(50MHz，CDC13)172.2(CO)，162.7(C-6)，161.3(C-4)，157.5(C-2)，138.3和138.1(2x季芳基C)，128.7，128.5，127.5，127.4，127.3和127.2(芳基C)，81.7(C-5)，61.1(NCHCO)，47.5(PhC//2)，45.8(NCH2)，43.3(PhCH2)，29.2禾口24.3[(CH2)2];(ES)m/z201(19)，205(13)，253(100,CuHwNsOz),254(52)，281(100，C13H23N502)，282(22)，361(18)，388(80，MH+.C23H25N502要求是388)和389(28)。AL節(jié)基-6-嗎啉-4-基嘧啶-4-胺(93)在250。C下，將氯化物87(2.29g，10.44mmol)和嗎啉(2.00cm3，23.00mmol)在叔丁醇鉀(1.28g，11.48mmol)存在下稠合lh。繼續(xù)在乙酸乙酯(50cm3)中處理，用水(50cm3)洗滌，干燥(MgS04)，濃縮為棕色膠狀物。通過(guò)柱色譜(甲醇:乙酸乙酯為1:9(v/v)作為洗脫液)得到粘性的黃色固體。將其溶解于丙酮并用己垸來(lái)沉淀固體，得到黃色粉末7V-芐基-6-嗎啉-4-基-嘧啶-4-胺(93)(1.56g，55%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為95%)。5H(200MHz，CDC13)8.16(1H，s，H-2)，7.48-7.05(5H，m，芳基H)，5.39(2H，brm，H-5和N//)，4.46(2H，d，PhC//2，/6.0)，3.74[4H，t，0(Ci/2CH2)2N，J4.9]和3.48[4H，t，0(CH2C//2)2N,J4.9];&(50MHz，CDC13)162.9和162.8(C-4和C-6)，157.3(C-2)，138.0(季苯基C)，128.8，127.5和127.2(苯基CH)，81.0(C-5)，66.5，45.8(PhCH2)和44.5;R6.82min(50%甲醇:25mM乙酸銨)。2-[(6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-基)氨基乙醇(94)將氯化物85(1.95g，5.10mmo1)、乙醇胺(1.89cm3，31.37mmo1)和甲苯(20cm3)的混合物置于玻璃管內(nèi)，密封并在130。C下加熱18h。隨著時(shí)間推移，在管底形成棕色油狀物。冷卻后，使用乙酸乙酯從水中提取溶液，并且進(jìn)行制備從而得到橙色油狀物。通過(guò)柱色譜(乙酸乙酯—甲醇在乙酸乙酯中的比例為1:10(v/v)作為洗脫液)得到米棕色固體2-[(6-吡咯垸-1-基嘧啶-4-基)氨基]乙醇94(l.lOg，50.6%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為94.1%)。&(200MHz，CDC13)8.07(1H，s，H-2)，5.30(1H，brt，N//),5.18(1H，s，H-5)，4.08(1H，brs，Oi/)，3.78(24H,t，C//2OH，《/4.6)，3.22-3.49[6H，brm，N(C//2)2和0/2011]和1.90-2.05[4H，m，(C^2)2];(5c(50MHz，CDC13)162.2(C國(guó)6)，160.4(C-4),157.1(C-2)，80.8(C-5)，61.6(CH2OH)，46.3[N(CH2)2〗，44.3(CH2NH)和25.2[(CH2)2];tR2.17min(50。/o甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)m/z110(15)，121(13)，165(15)，191(85)，209(100，MH+.CuH16N40要求是209)和210(22)。A42-羥乙基KH6-[(2-羥乙基)氨基嘧啶-4-基)U比咯烷-2-甲酰胺(95)使用類(lèi)似于91的方法，將氯化物86(1.61g，6.67mmo1)、乙醇胺(1.21cm3，20.0mmo1)和甲苯(20cm3)置于玻璃管內(nèi)，密封并在130°C下加熱18h。隨著時(shí)間推移，在管底形成棕色油狀物。冷卻后，使用乙酸乙酯從水中提取溶液，并且進(jìn)行制備從而得到橙色油狀物。通過(guò)柱色譜(乙酸乙酯一甲醇在乙酸乙酯中的比例為1:10(v/v)作為洗脫液)得到棕色油狀物^-(2-羥乙基)-1-{6-[(2-羥乙基)氨基]嘧啶-4-基}吡咯烷-2-甲酰胺95(1.02g，54%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99.9%)。&(200MHz，CDC13)7.97(1H，s，H-2)，7.43(1H，brt，CO麗，《/5.0)，5.90(1H，brt，N仏《/5.6),5.27(1H，s，H-5)，4.20-4.35(1H，brm，NC/fCO)，3.18-3.38和3.39-3.75[IOH，2xm，2xNH(C//2)2OH和NC仏]和1.74-2.20[4H，m，(C/f2)2];3C(50MHz，CDC13)172.5(CO)，162.1(C-6)，160.1(C-4),156.4(C隱2),81.3(C-5)，60.4(NCHCO)，60.2[2x(CH2)2OH]，46.6(NCH2)，45.02)2]，41,3[NH(C恥]，29.4和23.2[(CH2)2];fR1.77min(50。/o甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)w/z207(10),235(52，CuH函。2)，269(11)，296(100，MH+.C13H21N503要求是295)和297(19)。2-[(6-嗎啉-4-基嘧啶-4-基)氨基乙醇(96)按照類(lèi)似于91的方法，將氯化物59(1.88g，10.84mmo1)和嗎啉(2.08cm3，23.84mmo1)在250°C下加熱lh，然后用乙酸乙酯(3x50cm3)從飽和氯化鈉水溶液(50cm3)和甲醇(10cm3)的混合物中提取。將提取物濃縮并通過(guò)柱色譜(1:9-2:8(v/v)甲醇:乙酸乙酯作為洗脫液)純化。得到蠟狀米色固體2-[(6-嗎啉-4-基嘧啶-4-基)氨基]乙醇(96)(1.82g，75%)。3H(200MHz,CDC13)7.96(1H，s，H-2)，5.65(1H，brm，N/f)，5.35(1H，s,H-5)，4.68(1H,brs，OZf)，3.59[6H，t和不明顯的m，0(C/f2CH2)2N，《/4.8和Cif2OH]，3,34[4H，t，0(CH2CH2)2N，■/4.9]和3.24(2H，q，NHC//2，J5.0);c5c(50MHz，CDC13)169.2和162.4(C-4和C-6)，156.8(C-2)，81.2(C-5)，66.1，61.0(C//2OH)，44.1和1.88-1.98[4H，m，(C//2)2];3C(50MHz,CDC13)160.4(C-6)，159.7(C-4)，157.4(C-2)，138.8(季芳基C)，131.8和122.5(芳基C)，115.2(季芳基C)，82.8(C-5)，46.1[N(CH2)2和25.0[(CH2)2];&2.23min(甲醇)；(ES)m/z319(100，M+.C15H1679BrN4要求是319)，320(12)，321(100，M+.CuHw"BrN4要求是321)和322(13)。1-{6-[(4-溴苯基)氨基]嘧啶-4-基}吡咯烷-2-羧酸(98)使用類(lèi)似于97的方法，在室溫下，用叔丁醇鉀(2.26g，20.14mmo1)在反應(yīng)管內(nèi)處理溶解于甲苯(20cm3)的氯化物86(1.61g，6.66mmo1)和4-溴苯胺(1.75g，10.18mmo1)的混合物。進(jìn)行瞬時(shí)加熱，形成濃稠的棕色沉淀。如91所述的那樣，對(duì)反應(yīng)管進(jìn)行密封和處理，然后通過(guò)柱色譜(乙酸乙酯一甲醇在乙酸乙酯中的比例為1:10(v/v)作為洗脫液)得到米色粉末1-{6-[(4-溴苯基)氨基]嘧啶-4-基}吡咯垸-2-羧酸98(0.47g，19.5%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99.2%)。3H(200MHz，CDC13+^隱DMSO)9.73(1H，brs，N//)，7.67(1H，m，H隱2)，7.46(2H，m，芳基H)，7.28(2H，m，芳基H)，5.07(1H，d，H-5，《/3.2)，4.23-4.61(1H，brm，NCHCO)，3.18-3.39和3.39-3.62(2H，2xbrm，NC//2)和1.82-2.25[4H，m，(C//2)2〗;3C(50MHz，CDC13)170.3(CO)，161.6(C-6)，159.6(C-4)，147.2(C-2)，137.0(季芳基C)，130.3和120.4(芳基C)，114.6(季芳基C)，85.7(C-5)，60.3(NCHCO)，46.5(NCH2)，29.4和22.7[(CH2)2];&11.30min(50。/o甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)m/z164(88)，192(100)，363(87，M+.C15H1579BrN402要求是363)，364(14)，365(86，M+.CuHi,BrN402要求是365)和366(15)。7V-吡啶-2-基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-胺(99)使用類(lèi)似于97的方法，在室溫下，用叔丁醇鉀(3.54g，3L51mmo1)在反應(yīng)管內(nèi)處理溶解于甲苯(20cm3)的氯化物85(1.91g，10.40mmo1)和2-氨基吡啶(1.51g，16.07mmo1)的混合物。進(jìn)行瞬時(shí)加熱，形成濃稠的棕色沉淀。如91所述的那樣，對(duì)反應(yīng)管進(jìn)行密封和處理，然后通過(guò)柱色譜(乙酸乙酯一甲醇在乙酸乙酯中的比例為1:10(v/v)作為洗脫液)得到米色粉末W-吡啶-2-基-6-卩比咯烷-l-基嘧啶-4-胺99(0.38g，15.3%,通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為94.0%)。JH(200MHz，CDC13)8.35(1H，s,H-2)，8.30(m，dd，吡啶H隱6，J2.0和7.0)，7.60(1H，ddd，卩比啶H-4，/1.8，6.8和7.2)，7.32(1H，d，吡啶H-3，J8.2)，6.87(1H，dd，吡啶H隱5，J6.0禾卩7.2)，6.78(1H，s，H-5)，3.52[4H，brs，N(Ci/2)2和1.90-2.18[4H，m，(C//2)2];(5C(50MHz，CDC13)161.0(C-6)，158.1(C-4)，157.5(C-2)，153.8(B比啶C-2),147.7(妣啶C-6)，137.6(吡啶C國(guó)4)，116.7(吡啶C-3)，112.6(吡錠C-5)，86.7(C-5)，46.4[N(CH2)2]和25.3[(CH2)2];^5.17min(50o/o甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)m/z138(65)，146(11)，171(15)，242(100，M+.C13H15N5要求是242)和243(31)。iV-(l-芐基-2-氧代-2-吡咯烷-l-基乙基)-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-胺(100)按照類(lèi)似于97的方法，在吡咯垸(0.57cm3，6.89mmo1)存在下，將密封于玻璃管內(nèi)的溶解于甲苯(7cm3)的氯化物60(1.00g，3.43mmo1)于130°C下加熱72h。濃縮后，通過(guò)柱色譜分離(使用甲醇:乙酸乙酯為2:8(v/v)作為洗脫液)后，得到橙色固體叢(1-芐基-2-氧代-2-吡咯烷-1-基乙基)-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-胺100(0.33g，26%)。3H(200MHz，CDC13)8.18(1H，brs，H-2)，7.41-7.09(5H，m，芳基H)，5.45(1H，brd，N//，《/8.8),5.25(1H，s，H-5)，5.03(1H，dt，NHC//，《/14.2禾卩6.0)，3.62-3.19[3H，m，CONC//aHb(C//2)-]，3.38[4H，t，N(C//2)2-，J7.0]，3.13(1H，dd，PhC//aHb,J13.2和7.2)，3.02(1H，dd，PhCHa//b，和9.2)，2.80-2.42[1H，m，CONCHaFb(CH2)-]，2.13-1.82和1,82-1.44[8h，2xm，2xN(CH2C/f2)2];(5C(50MHz，CDC13)170.6(CO)，161.2和160.2(C-4和C-6)，157.5(C曙2)，137.0(季苯基C)，129.4，128.2和126.7(苯基CH),82.9(C-5)，53.8(NHCH)，46.3和45.7[CON(CH2)2〗，46.2[N(CH2)2]，39.7(PhC//2)，25.1和24.0[CON(CH2CH2)2]和25.3[N(CH2CH2)2]。2-{[6-(二甲氨基)嘧啶-4-基氨基}-3-苯基丙酸甲酯(101)按照類(lèi)似于100的方法，在二甲胺(33%的乙醇溶液，3.0cm3，22.0mmo1)存在下，將密封于玻璃管內(nèi)的溶解于甲苯(7cm3)的氯化物60(0.98g，3.37mmo1)于130°C下加熱72h。濃縮后，通過(guò)柱色譜(使用甲醇:乙酸乙酯為1:9-2:8(v/v)作為洗脫液)得到橙色固體2-{[6-(二甲氨基)嘧啶-4-基]氨基}-3-苯基丙酸甲酯101(0.21g，17%)。(5H(200MHz，CDC13)8.20(1H，brs，H-2)，7.38-7.11(5H，m，芳基H)，5.47(1H，brd，NH，/8.4)，5.38(1H，s，H-5)，5.31(1H，dt，NHC//，《/8.2和6.0)，3.10(1H，dd，PhCf/aHb，J"13.2和5.8)，3.08(3H，s，OCi/3)，3.02(1H，不明顯的dd，PhCHai/b，■/13.2禾口3.4)，2.08和2.73(6H，2xs，2xC/^);&(50MHz，CDC13)172.3(CO)，162.5和161.6(C-4和C-6)，157.3(C-2)，136.9(季苯基C)，129.4，128.3和126.7(苯基CH)，82.5(C-5)，51.4(OCH3)，39.8(NHCH)，37.1(PhCi^2)，36.9和35.6[N(CH3)2]。嘧啶硝化的一般方法將處于錐形瓶?jī)?nèi)的、溶解于濃硫酸(3-4當(dāng)量)中的嘧噴的快速攪拌混懸液在冰-鹽浴中冷卻至-10。C。然后將硝酸(65%，1-2當(dāng)量)逐滴加入混合物中，隨著時(shí)間推移，得到亮黃色共混物，并逐漸變成深橙色。然后在18h內(nèi)將該共混物自然升溫至室溫。接著將混合物傾析到碎冰上，并根據(jù)需要通過(guò)過(guò)濾或提取進(jìn)行制備。5-硝基-7V-吡瞎-2-基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-胺(102)使用上述硝化的一般方法，在0°C下混合嘧啶99(0.28g，1.16mmo1)、硝酸(65%,0.24cm3，2.4mmo1)和濃硫酸(2.3cm3)，得到黃橙色溶液。制備后，使用乙酸乙酯:己烷為1:10(v/v)進(jìn)行柱色譜分離，得到黃色固體5-硝基-AM比啶-2-基-6-吡咯垸-l-基嘧啶-4-胺102(0.28g，83.1%)。&(200MHz，CDC13)10.2(1H，brs，麗)，8.42(1H，dd，吡啶H-6，70.8和8.4)，8.35(1H，dt，吡啶H-4，■/1.0和4.8)，8.23(1H，s，H-2)，7.71(1H，ddd，H-5，J1.9，7.8禾口8.8)，7.04(1H，dd，H-3，《/4.8和7.2)，3,47[4H，brs，N(Cf/2)2]和1.96-2.05[4H，m，(OT2)2〗;&(50MHz，CDC13)156.9(吡啶C-2)，153.5(C-6)，151.5(C誦4)，148.2(吡啶C-6)，137.8(吡啶C-4)，119.6(C-2),115.8(吡啶C-5)，109.7(吡啶C-3)，80.2(C-5)，50.0[N(CH2)2]和25.2[br，(CH2)2];(ES)m/z213(10)，241(65)，242(125)，287(100，MH+.C13H15N602要求是287)和288(18)。4,6-二氨基嘧啶溴化的一般方法將處于室溫下的、溶解于二氯甲垸的嘧啶溶液用溴(1.5-2當(dāng)量)處理，通常獲得放熱曲線，如果該操作過(guò)快，則伴隨二氯甲垸溶液的快速沸騰，得到紅色至黑色的溶液。將該混合物蓋上塞子放置18h，然后傾析到1M氫氧化鈉水溶液中，并用二氯甲垸提取。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)制備和柱色譜分離，得到固態(tài)或油狀的溴化物。5-溴-7V-甲基—6-吡咯烷-l-基嘧啶-4-胺(103)按照上述一般方法，用溴(0.17cm3，3.33mmo1)處理溶解于二氯甲烷(7.0cm3)中的嘧啶89(0.50g，2.78mmo1)溶液。通過(guò)柱色譜分離(乙酸乙酯:己垸為1:4-1:1(v/v)作為洗脫液)后，得到米色固體基-6-吡咯垸-l-基嘧啶-4-胺103(0.54g，75%;通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為100%)。&(200MHz，CDC13)8.09(1H，s,H-2)，5.31(1H，brs，Ni7)，3.72[4H，t，(-Ci/2)2N，J6.7]，3.01(3H，d，NHCi^3，和2.02-1.75[4H，m，0(C//2)2-];<5C(50MHz，CDC13)160.0和158.1(C-4和C-6)，154.8(C-2)，83.2(C-5)，50.0[(CH2CH2)2N]，28.7(NHCi^)和25.7[(CH2CH2)2N];&2.15min(甲醇)。5-溴-7V-甲基-6-嗎啉-4-基嘧啶-4-胺(104)按照上述一般方法，用溴(0.48cm3，9.34mmo1)處理溶解于二氯甲垸U9.5cm3)中的嘧啶90(1.51g，7.78mmo1)溶液。通過(guò)柱色譜分離(乙酸乙酯:己烷為1:4-1:1(v/v)作為洗脫液)后，得到米色固體5-溴-7^-甲基_6-嗎啉-4-基嘧啶-4-胺104(1.66g，78%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99%)。&(200MHz，CDC13)8.22(1H，s，H-2)，5.39(1H，brs，N/f)，3.79[4H，t，0(C/72CH2)2N，J4.6]，3.44[4H，t，0(Ci/2CH2)2N，/4.7]和3.03(3H，d，NHCf/3，■/5.0);&(50MHz，CDC13)162.3和160.5(C-4和C隱6)，157.3(C-2)，卯.6(C-5)，66.8，49.1和1.85-1.98[4H，m，(C//2)2];&(50MHz，CDC13)159.4(C-6)，158.2(C-4)，154.8(C-2),139,1(季芳基C)，128.6，127.5和127.5(芳基C),83,1(C-5)，50.1[N(CH2)2]，45.6(PhCH2)和25.7[br，(CH2)2];^2.38min(甲醇)；(ES)m/z241(41)，243(42)，333(100，M+.C15H1779BrN4要求是333)，334(14)，335(100，M+.CjsHn"BrN4要求是335)和366(15)。W畫(huà)芐基-l-[6-(芐氨基)-5-溴嘧啶-4-基]吡咯垸-2-甲酰胺(106)按照上述溴化的一般方法，對(duì)溶解于二氯甲烷(4.5cm3)中的產(chǎn)物92(1.69g，4.35mmo1)和溴C0.27cm3，5.2mmo1)進(jìn)行處理，以乙酸乙酯:己垸為1:10-1:5(v/v)作為洗脫液進(jìn)行柱色譜分離后，得到黃橙色油狀物W-芐基-l-[6-(芐氨基)-5-溴嘧啶-4-基]fl比咯烷-2-甲酰胺106(1.52g，75%)。<5H(200MHz，CDC13)8.01(1H，s，H-2)，7.02-7.34(IOH，m，芳基H)，6.65(1H，brt，CONH，《/5.8)，5.69(1H，brt，芳基N//，</5.7)，4.88(1H，dd，NCHCO，和7.4)，4.63(2H，d,PhC//2，《/5.8)，4.37(2H，dd，PhCf^，J2.0禾口5.8)，4.02(1H，ddd，NCi/aHb，J7.2，9.2和16.2)，3.68(1H，ddd，NCHa//b，《/7.6，10.2和13.4)和1.70-2.31[4H，m，(C//2)2];(5C(50MHz，CDC13)172.8(CO),159.6(C-6)，158.9(C-4)，154.8(C-2)，138.6和138.3(季芳基C)，128.5，128.4，127.3，127.2，127.2和127.1(芳基C)，85,2(C-5)，63.1(NCHCO)，52.0(NCH2)，45.4和43.0(2xPhC迅)，29.8禾口25.3[(CH2)2];(ES)m/z255(11)，283(10)，345(100，C16H1779BrN4)，346(15)，347(98，C16H1781BrN4)，348(16)，373(58，C16H1679BrN50)，375(58，C16H1681BrN50)，376(12)和388(1，M+-Br)。沒(méi)有M+(C23H2479BrN50要求是466)。W-芐基-5-溴-6-嗎啉-4-基嘧啶-4-胺(107)按照上述一般方法，用溴(0.31cm3，6.06mmol)處理溶解于二氯甲烷(13.0cm3)中的嘧啶93(1.37g，5,05mmol)。經(jīng)過(guò)柱色譜(乙酸乙酯己垸為1:4-1:1(v/v)作為洗脫液)，得到橙色油狀物7V-節(jié)基-5-溴-6-嗎啉-4-基嘧啶-4-胺107U.07g，61%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99%)。<5H(200MHz，CDC13)8.23(1H，s，H-2)，7.48-7.12(5H，m，芳基H)，5.70(1H，brm，N/f)，4.71(2H，d，PhC//2，/5.8)，3.81[4H，t，0(CF2CH2)2N，J4.6]禾口3.48[4H，t，0(CH2C//2)2N，J4.6];&(50MHz，CDC13)162.7和159.9(C-4和C-6)，155.4(C-2)，138.5(季苯基C)，128.7，127.5和127.4(苯基CH)，90.4(C-5)，66.8，49.1(PhCH2)和45.5;^2.10min(甲醇)。2-[(5-溴-6-吡咯垸-l-基嘧啶-4-基)氨基]乙醇(108)使用上述溴化的一般方法，對(duì)溶解于二氯甲烷(23cm3)中的嘧啶94C0.96g，4.96mmol)和溴(0.26cm3,5.1mmol)進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)制備和柱色譜分離(乙酸乙酯:己烷為1:10-1:5(v/v)作為洗脫液)后，得到黃色油狀物2-[(5-溴-6-吡咯垸-l-基嘧啶-4-基)氨基]乙醇108U.04g，79.0%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為99%)。3H(200MHz，CDC13)7.93(1H，s，H-2)，5.74(1H，brm，麗)，4.49(1H，brs，0//")，3.42-3.76[8H，2xm，HO(Ci/2)2NH和N(Ci/2)2]和1.82-1.97[4H，m，(C/f2)2];(5c(50MHz，CDC13)159.7(C-6)，158.0(C-4)，154.1(C-2)，82.6(C-5)，62.9(OCH2)，49.9[N(CZ/2)2]，44.7(CH2NH)和25.5[(CH2)2];&8.40min(50。/o甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)m/z162(12)，189(79)，190(18)，207(27)，269(47，M+-H20),271(48，M+-H20)，287(100，M+.C10H1579BrN4O要求是287)和289(96，M+.C1()H1581BrN40要求是289)。叢(2-羥乙基)-1-{6-[(2-羥乙基)氨基-5-溴嘧啶-4-基}吡咯烷-2-甲酰胺(109)使用上述溴化的一般方法，對(duì)溶解于二氯甲烷(23cm3)中的嘧啶95(0.968g，4.96mmol)和溴(0.26cm3，5.17mmol)進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)制備和柱色譜分離(乙酸乙酯:己垸為1:10-1:5(v/v)作為洗脫液)后，得到黃色油狀物AK2-羥乙基)-l-(6-[(2-羥乙基)氨基]-5-溴嘧啶-4-基)吡咯垸-2-甲酰胺109U.04g，79.0%)。3H(200MHz,CDC13)7.93(1H，s，H-2)，5.74(1H，brm，N//)，4.49(1H，brs，0//)，3.42-3.76[8H，2xm，HO(C//2)2NH和N(CZ/2)2]和1,82-1.97[4H,m，(C//2)2];<5C(50MHz，CDC13)159.7(C-6)，158.0(C陽(yáng)4)，154.1(C-2),82.6(C-5)，62.9(OCH2)，49.9[N(CH2)2]，44.7(CH2NH)禾口25.5[(CH2)2]。2-[(5-溴-6-嗎啉-4-基嘧啶-4-基)氨基]乙醇(110)按照上述一般方法，用溴(0.43cm3，8.37mmo1)處理溶解于二氯甲烷(17.0cm3)中的噴啶96(1.57g，6.98mmo1)。通過(guò)柱色譜分離(以乙酸乙酯:己烷為1:4(v/v)-甲醇:乙酸乙酯為1:9(v/v)作為洗脫液)后，得到米色固體2-[(5-溴-6-嗎啉-4-基嘧啶-4-基)氨基]乙醇110(1.04g，49%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為98%)。3H(200MHz，CDC13)8.12(1H，s，H-2)，5.81(1H，brm，麗)，3.90-3.67(7H，brt和不明顯的m，0仏0(Ci/2CH2)2N，J4.0禾口C//2OH)，3.63(2H,~dt,NHC//2，J5.5禾口4.2)和3.46[4H，t，0(CH2C//2)2N，J4,2];&(50MHz，CDC13)162.5和160.3(C-4和C誦6)，154.9(C-2)，90.1(C-5)，66.8，62.8(C//2OH)，49.044.7(NHCH2);&3.87min(50%甲醇:25mM乙酸銨)。5-溴嘧啶催化氨基化的一般方法在室溫下，將待用的5-溴嘧啶和所需的胺(4當(dāng)量)、磷酸鉀水合物(2當(dāng)量)以及商購(gòu)的AUV-二甲基乙醇胺(0.1M)置于反應(yīng)管內(nèi)。然后用氮?dú)饬鞔祾呋旌衔锛s15min,此后，向其加入無(wú)水、白色的碘化亞銅(Cul，1.1當(dāng)量)，通常得到綠色混合物。將反應(yīng)管在氮?dú)鈿夥障旅芊猓缓蠹訜岬?00。C，并繼續(xù)加熱18h。混合物隨反應(yīng)進(jìn)行逐漸呈現(xiàn)紫黑色。冷卻后，用濃氨溶液處理混合物以除去銅殘余物，并用二氯甲烷提取。進(jìn)行濃縮并以甲醇:乙酸乙酯為1:10(v/v)作為洗脫液，若需要，則使用少量氨進(jìn)行柱色譜，得到純化的產(chǎn)物。y，A^二芐基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4，5-二胺(111)使用上述一般方法，使溴化物105(0.19g，0.58mmol)、節(jié)胺(0.26cm3，2.4mmol)、磷酸鉀水合物(0.29g，1.28mmo1)、碘化亞銅(0.15g，0.78mmo1)和AUV-二甲基乙醇胺(lcm3)—起沸騰，產(chǎn)生棕色溶液。進(jìn)行制備和色譜分離，得到黃色固體A^vS-二節(jié)基-6-吡咯烷-l-基嘧啶-4,5-二胺111(0.15g，69%，通過(guò)HPLC測(cè)定其純度為78.0%)。&(200MHz，CDC13)8.15(1H，s，H-2)，7.12-7.45(IOH，m，芳基H)，5.17和5.42(2H，brs和brm，2x麗)，4.44(2H，d，PhC//2，J4.8)，3.89(2H，brs，PhC/f2)，3.39[4H，brm，N(Ci/2)2]和1.75-2.05[4H，m，(C/f2)2];50MHz，CDC13)162.2(C-6)，160.6(C-4)，157.6(C曙2)，138.4(季芳基C)，128.6，128.5，127.3，127.2，127.0和126.8(芳基C)，80.6(C隱5)，46.2[N(CH2)2]，45.8(2xPhC仏)和25.2[br，(CH2)2]"R9.78min(50。/。甲醇:25mM乙酸銨)；(ES)m/z138(29)，163(48，C8H12N4)，228(21)，255(100，C15H18N4)和256(25)。沒(méi)有M+(C22H25N5要求是360)。2-{[5-(芐氨基)-6-吡咯烷-1-基嘧啶-4-基]氨基}乙醇(II2)使用上述一般方法，使溴化物108(0.30g，1.04mmol)、芐胺(0.47cm3，4.32mmo1)、磷酸鉀水合物(0.59g，2.57mmo1)、碘化亞銅(0,23g，1.21mmo1)和WW-二甲基乙醇胺(1.8cm3)—起沸騰，產(chǎn)生紫棕色溶液。進(jìn)行制備和色譜分離，得到黃色固體2-{[5-(芐氨基)-6-吡咯烷-1-基嘧啶-4-基]氨基}乙醇112(0.30g，92.3%)。&(200MHz，CDC13)8.10(1H，brs，H-2)，7.12-7.40(5H，m，芳基H)，4.41和5.13(4H，2xbrs，2x麗禾口PhC//2)，3.80(1H，brs，Oif)，3.54-3.68(2H，m，OCiy2)，3.19-3.42[4H，brm，N(C//2)2]，2.05(2H，s，NHC迅)禾口1.86-1.95[4H，m，(C//2)2〗；&(50MHz，CDC13)162.3(C-6),160.3(C-4)，157.2(C-2)，140.1(季芳基C)，128.2，127.6和126.4(芳基C)，80.8(C-5)，61.1(OCH2),55.3(PhCH2)，46.1[N(Cif2)2]，44,1(CH2NH)禾B25,1[(CH2)2]。2-苯基咪唑并[1，2-吡啶(113)將苯甲酰甲基氯(2.03g，13.1mmol)和2-氨基吡啶(1.24g，13.1mmo1)在二甲基甲酰胺(25cm3)中加熱至120。C，并繼續(xù)加熱5h。然后將混合物冷卻，在室溫下攪拌過(guò)夜。將混合物倒入水(50cm3)中，用乙酸乙酯(2x50cm3)提取。將溶劑從有機(jī)相中除去，生成發(fā)黑的油狀物，將該油狀物進(jìn)行快速色譜分離(以乙酸乙酯:己烷為1:2-2:1(v/v)作為洗脫液)。對(duì)淺棕色結(jié)晶物質(zhì)進(jìn)行分離(R/0.23，乙酸乙酯:己烷為1:1(v/v))，確定為標(biāo)題化合物113(0.79g，31%)。3H(CDC13，200MHz)8,13(1H，d，H國(guó)5，■/6.6)，7.98(2H，d,苯基H，《/6.8)，7.87(1H，s，H-3)，7.67(1H，d，H-8,/9.0)，7.43(3H，m，苯基H)，7.19(1H，dd，H-7，J9.0禾口7.8)和6.79(1H，dd，H-6，J7.8和6.6)。2-(4-溴苯基)咪唑并l，2-a吡啶(114)將4-溴苯甲酰甲基氯(2.44g，10.9mmo1)和2-氨基吡啶(1.03g，10.9mmo1)在二甲基甲酰胺(20cm3)中加熱至120°C，并繼續(xù)加熱5h。然后將混合物冷卻，在室溫下攪拌過(guò)夜。將混合物倒入水(40cm3)中，用乙酸乙酯(2x40cm3)提取。將溶劑從有機(jī)相中除去，生成發(fā)黑的油狀物，將該油狀物進(jìn)行快速色譜分離(以乙酸乙酯:己垸為2:3(v/v)作為洗脫液)。對(duì)黃色結(jié)晶物質(zhì)進(jìn)行分離(R/0.35，乙酸乙酯:己垸為l:l(v/v))，確定為標(biāo)題化合物1"(2.14g，72%)。(5h(CDC13，200MHz)8.15(1H，d，H-5，《/6.7)，7.87(1H，s，H-3)，7.85(2H，d，苯基H-3和H-5，78.5)，7.66(1H，d，H-8，J9.1)，7.57(2H，d，苯基H陽(yáng)2和H-6,J8.5)，7.22(1H，dd，H-7，J9.1和7.1)和6.80(1H，dd，H-6，J6.7和7.1)。使用氯化鋅制備咪唑并[1，2-吡啶的一般方法將2-氨基吡啶(0.13mg，1.33mmo1)溶解于二噁烷中，用氯化鋅(5mol%，0.07mmol)、醛(1.0當(dāng)量，1.33mmol)和異氰化物(1.0當(dāng)量，1.328mmol)處理并密封于微波反應(yīng)器中。將混合物在(600W的)40%功率下照射1.5h。此后，將反應(yīng)混合物濃縮，并用乙酸乙酯/己垸處理粗混合物以得到產(chǎn)物沉淀。使用蒙脫土K10制備咪唑并[1，2-吡啶的一般方法將2-氨基吡啶(0.13mg，1.33mmol)溶解于二噁垸中，用蒙脫土KIO(l質(zhì)量當(dāng)量，0.13mg)、醛(1.0當(dāng)量，1.33mmo1)和異氰化物(l.O當(dāng)量，1.33mmo1)處理并密封于微波反應(yīng)器中。將混合物在(600W的)40%功率下照射1.5h。此后，將反應(yīng)混合物過(guò)濾并用甲醇或二氯甲烷洗滌蒙脫土幾次。將濾液減壓濃縮并用乙酸乙酯/己烷處理粗混合物以得到產(chǎn)物沉淀?；蛘撸墒褂贸Ｒ?guī)方法攪拌加熱反應(yīng)混合物5小時(shí)。使用上述兩種方法中的一種或使用常規(guī)加熱制備以下化合物W-(2，6二甲基苯基)-2-苯基咪唑并1，2-]吡啶-3-胺(115)(0.29g,72%)。&(200MHz，CDC13)8.12(2H，d，2x芳基H)，7.61(2H，d，2x芳基H)，7,24-7.41(3H，m，3x芳基H)，7.16(1H，m，芳基H)，7.00(2H，d，/7.6,2x芳基H)，6.78-6.86(2H，m，2x芳基H)，6.67-6.74(2H，m，2x芳基H)，5.43(1H，brs，Ni/)和2.02(6H，s，2xCi/3);<5C(50MHz，CDC13)141.5(C-8)a，140.5(C-3)a，133.8(C誦2)，130.1(2x二甲苯基C-3)，128.6(2x苯基C-2)，127.8(苯基C國(guó)4)，127.3(2x苯基C-3)，125.7(C-4)，124.5(C-5)，122.6(2x二甲苯基C-2)，121.3(二甲苯基C-4)，117.8(C-6)，112.5(C-7)和18,5(2xCH3);(EI)w/z313.2，220.1，194.0和79.1。iV-(2，6-二甲苯基)-2-(4-甲氧基苯基)咪唑并[l，2-a吡啶-3-胺(116)(0.20g，48%)。(5H(200MHz，CDC13)8.04(2H，d，《/8.4，芳基H)，7.58(2H，d，幾0，芳基H)，7.16-6.63(7H，m，7x芳基H)，5.41(1H，s，麗)，3.82(3H,s，OC/f3)和2.01(6H，s，2xCi/3);3c(50MHz，CDC13)149.2(吡啶基C-2'和C國(guó)6')，141.3(C-8)a，140.6(芳基C)a，138.5(C-3)，137.5(吡啶基C陽(yáng)4')，130.1(2x二甲苯基C國(guó)3')，128.5(2x苯基C-2)，125.4(C畫(huà)4)，124.3(C-5)，122.4(2x二甲苯基C-2')，121.1(二甲苯基C陽(yáng)4')，117.3(C-6)，112.3(C-7)55.4(OCH3)和18.7(2xCH3);(EI)m/z343.4，224.9，210.9，79.0和77.7。iV-叔丁基-2-苯基咪唑并[l，2-a吡啶-3-胺(117)(0.25g，60%)。&(200MHz，CDC13)8.55(1H，d，J9.2，芳基H)，8.15(1H，d，/6.6芳基H)，7.47(2H，brd，2x芳基H)，7.28(1H，brt,芳基H)，6.89-7.04(4H，m，4x芳基H)和0.79(9H，s，3xC//3);&(50MHz，CDC13)142.0(C-8)a，137.9(C-3)a，131.4(C-2)，129.9(2x苯基C-2)，127.7(苯基C-4)，127.4(2x苯基C-3)，127.0(C-4)，124.7(苯基C-l)，123.4(C-5)，118.0(C陽(yáng)6)，113.5(C-7)，56.6[C(CH3)3]禾口30.2[C(CH3)3];(EI)m/z265.1，208.1，181.0禾口78.1。7V-叔丁基-2-(4-甲氧基苯基)咪唑并[l，2-a吡啶-3-胺(118)(0.14g，28%)。3H(200MHz，CDC13)8.05(1H，brm，芳基H)，7.61-7.70(1H，brm，芳基H)，7.29(2H，brd，《/7.2，2x芳基H)，7.16(1H，brt，《/7.1，芳基H)，6.72-7.00(4H，m，4x芳基H)，5.42(1H，brs，麗)，3.828(3H，s，OCff3)和2.01(9H，s，3xCH3);3C(50MHz，DMSO)159.2(C-3)，158(C-2)，148.20(2x苯基C-2)，127.7(苯基C-4)，137.40(2x苯基C-3)，135.26(C-4)，128.49(苯基C-l)，114.22(C-5)，113.02(C-6)，109.11(C-7)，61.63[C(CH3)3，55.84(OCH3);(EI)w/z295.0，238.9，237.8，210.9，212.2，94.0，77.9，66.9,55.6和50.7。iV-(2-嗎啉-4-基乙基)-2-苯基咪唑并[l，2-al吡啶-3-胺(119)C0.12g，14%)。<5H(200MHz，CDC13)8.11(1H，d，《/7.0，芳基H)，8.03(2H，d，《/8.4，2x芳基H),7.56(2H，d，/9.2，2x芳基H)，7.34-7.48(3H，m，3x芳基H)，7.18(1H，brt，芳基H)，6.79(1H，brt，芳基H)，4.08(1H,brs，Ni/)，3.72(4H，t，/4.5，2xCff20)，3.07-3.10(2H，m，C/^NH)，2.52-2.58(2H，m，C仏N)和2.44(4H，t，J4.5，2xC7/2N);&(50MHz，CDC13)141.6(C-8)a，135.17(C-3)a，134.7(C-2)，128.8(2x苯基C-2)，127.5(苯基C-4)，127.3(2x苯基C-3)，126.7(苯基C-1)，123.9(C畫(huà)4)，122.6(C-5)，117.8(C-6)，111.8(C誦7)，67.2(2xCH20)，58.5(CH2N)，53.9(2xCH2N)和44.4(CH2NH);(EI)m/z322.1，220.0，99.9和78.1。AL(2-嗎啉-4-基乙基)-2-(4-甲氧基苯基)咪唑并[l，2-a]吡啶-3-胺(120)(0.10g，20%)。3H(200MHz,CDC13)8.30(1H，d，《/6.6，芳基H)，8.10(2H，d，J8.4，2x芳基H),7.60(2H，d，2x芳基H)，7.14-7.32(3H，m，3x芳基H)，6.93(2H，brt，/8.6,芳基H)，4.14(1H，brs,麗)，3.92(3H，d，J8.4，C//30)，3.76(4H，t，《/4.1，2xC/f20)，3.07-3.10(2H，m，C/^NH),2.52-2.58(2H，m,C耶)和2.44(4H，t，/4.0，2xC耶)；&(50MHz，CDC13)133.1(C-8)a，128.5(C-3)a，127.5(C-2)，122.0(2x苯基C-2)，127.5(苯基C-4)，127.3(2x苯基C-3)，126.7(苯基C-1)，123.9(C-4)，122.6(C-5)，118.9(C-6)，116.4(C-7)，71.9(2xCH20)，60.3(CH2N)，58.7(2xCH2N)，49.1(OCH3)和45.0(CH2NH);(EI)m/z352.2，251.9，225.0，224.0，211.0，128.0，114.0，113.0，101.0，99.7，78.9，77.9,55.7禾口50.6。iV-環(huán)己基-2-苯基咪唑并[l，2-a]吡啶-3-胺(121)(0.60g，78%)。&(50MHz,CDC13)141.7(C-8)a，136.7(C-3)a，134.6(C-2)，129.6(苯基C-l)，128.7(2x苯基C-2)，127.5(苯基C-4)，127.3(2x苯基C-3)，124.1(C陽(yáng)4)，122.9(C-5)，117.6(C-6)，111.8(C-7)，57.2(CHNH)，34.4(2x環(huán)己基C-2')，26.0(2x環(huán)己基C-3')和25.1(環(huán)己基C-4');(EI)m/z2卯.9，208.0，180.9和78.2。7V-(環(huán)己基)-2-(4-甲氧基苯基)咪唑并[l，2-a吡啶-3-胺(122)(0.18g，42%)。&(200MHz，CDC13)8.11(2H，d，《/6.8，芳基H)，8.02(2H，d，J8.6，芳基H)，7.16-7,08(1H，m，芳基H)，7.02-6.98(2H，d，《/8.6，芳基H)，6.80-6.73(1H，m,芳基H)，3.87(3H，s，OC/f3)和1.80-1.59(IOH，brm，5x環(huán)己基CH2);&(50MHz，CDC13)141.6(C-8)，134.6(C匿2)，128.6(2x苯基C-2)，127.3(苯基C-4)，124.3(2x苯基C-3)，123.9(C-4)，122.9(C-5)，117.3(C-6)，111.7(C-7)，57.1(CHNH)，55.5(OCH3)，34.4(2x環(huán)己基C-2')，26.0(2x環(huán)己基C國(guó)3')和25.1(環(huán)己基C-4');(EI)m/z231.2，237.8，210.8和78.0。7V-(2，6-二甲基苯基)-2-嘧啶-3-基咪唑并[l，2-a]吡啶-3-胺(123)(0.22g，54%)。3H(200MHz，CDC13)9.29(1H,d，J1.6，卩比啶基H-2')，8.48(1H，dd，/5和1.6，吡啶基H-6')，8.33(1H，dt，J8和1.8，H-4)，7.59-7.69(2H，m，2x芳基H)，7.15-7.30(2H，m，2x芳基H)，6.98(2H，d，《/7.4，2x二甲苯基H-3'),6.72-6.86(2H，m，2x芳基H)，5.49(1H，brs，則和2.01(6H，s，2xC//3);3C(50MHz，CDC13)148.5(吡啶基C-2'和C-6')，141.9(C-8)a，140.1(芳基C)a，134.7(C-3)，134.5(B比啶基C-4'),130.1(2x二甲苯基C-3')，129.8(C-2)，125.9(C-4)，125.0(C-5)，123.5(吡啶基C曙5')，122.6(2x二甲苯基C-2')，122.1(吡啶基C-3')，121.8(二甲苯基C隱4')，117,8(C-6)，112.9(C-7)和18.7(2xCH3);(EI)m/z314,1，221.0，194.9和78.0。^V-叔丁基-2-吡啶-3-基咪唑并[l，2-a吡啶-3-胺(124)(0.21g，57%)。3H(200MHz，CDC13)9,23(1H，d，《/1.6，卩比咬基H-2')，8.56(1H，dd，《/5禾口1.6，吡啶基H-6')，8.31(1H，dt，/8和1.6，吡啶基H-4')，8.23(1H,dt，/7.0和1.2，H-4)，7.56(1H,dd，79.0和1.1，H-7)，7.38(1H，ddd，《/8.0，5.0和1.0，卩比啶基H-5')，7.17(1H，ddd，J9.0，7.0和1.2，H-6)，6.81(1H，dt，J7.0禾口1.1，H-5)，3.09(1H，brs，N//)禾口1.02(9H，s，3xCi73);&(50MHz，CDC13)149.3(吡啶基C-2')a，148.5(吡啶基C-6')a，142.80(C-8)a，135.6(C-3)，135.5(吡腔基C-4')，131.6(C-2)，124.7(C-4)，123.7(C-5)，123.6(吡啶基C-5')，122.5(吡啶基C-3')，117.8(C-6)，111.9(C誦7)，55.7[C(CH3)3〗和30.7[C(CH3)3];(EI)m/z266.1，210.0，181.9和78.0。7V_(2-嗎啉-4-基乙基)-2-吡啶-3-基咪唑并[1，2-吡啶-3-胺(125)(49.5mg，11%)。3H(200MHz,CDC13)9.30(1H，d，/1.0，吡啶基H-2')，8.56(1H，dd，J5.0禾Q1.6，吡啶基H-6')，8.38(1H，dt，77.9和1.6，卩比啶基H-4')，8.16(1H，d，《/6.8，H-4)，7.58(1H，d，/9.4，H-7)，7.38(1H，dd，《/7.9，5.0，卩比啶基H-5')，7.18(1H，brt，78.0，H-6)，6.84(1H，brt，《/6.8，H-5)，4.01(1H，brs，Ni^)，3.76(4H，t，J4.6，2xC//20)，3.14(2H，brd，J5.7，Ci72NH)，2.60(2H，t，J5.7，C耶)和2.50(4H，t，《/4.6，2xC顯)；&(50MHz，CDC13)148.4(吡啶基C-2')a，148.3(吡啶基C-6')%142.07(C-8)，140.4(C-2)a，134.5(U比啶基C-4')a，130.7(C-3)a，127.1(枇啶基C-3')，124.4(C-4)，123.8(C-5)，122.6(吡啶基C-5')，118.0(C-6)，112.2(C-7)，67.1(2xCH20)，58.5(CH2N)，53.9(2xCH2N)和44.5(CH2NH);(EI)m/z323.3，223.2，100.0禾卩78.2。A4環(huán)己基)-2-吡啶-3-基咪唑并Il，2-a吡啶-3-胺(126)(0.23g，59%)。<5H(200MHz,CDC13)9.33(1H，dd，幾8和0.8，吡啶基H-2')，8.55(1H，dd，>/4.7和1.8，卩比啶基H-6')，8.41(1H，dt，77.9禾口1.8，卩比啶基H-4')，8.10(1H，dt，《/6.8和1.1，H-4)，7.56(1H，dt，禾口1.1，H-7)，7.38(1H，ddd，".9，4.7和0.8，卩比淀基H-5')，7.17(1H，ddd，J9.1，6.8和U，H-6)，6.82(1H，dt，J6.8和1.1，H-5)，3.11(1H，brs，N//)，2.86-3.08(1H，m，Cf/NH)，1.46-1.92禾口1.00-1.40(IOH，2xm，5x環(huán)己基C//2);&(50MHz，CDC13)148.4(吡啶基C-2')a，148.3(吡啶基C-6')a，142.3(C-8)a，134.7(吡啶基C國(guó)4')a，134.6(C-3)a，130.9(C陽(yáng)2)，125.6(吡啶基C-3')，124.6(C-4)，123.7(C誦5)，122.9(吡啶基C-5')，117.8(C畫(huà)6)，112.1(C-7)，57.2(CHNH)，34.5(2x環(huán)己基C-2')，25.9(2x環(huán)己基C-3')和25.1(環(huán)己基C隱4');(EI)m/z292.1，209.0，181.9禾卩78.0。A42，6-二甲基苯基)-2-(2-呋喃基)咪唑并[l，2-"]吡啶-3-胺(127)(99,4mg，25%)。t5H(200MHz，CDC13)7.65(1H，d，《/7.0，H-4)，7.55(1H，d，J9.0，H-7)，7.43(1H，brs，呋喃基H-5')，7.06-7.18(1H，m，H隱6)，6.99(2H，d,/6.9，2x二甲苯基H-3')，6.80-6.91(1H，m，H-5)，6.70(1H，d，J6.9，二甲苯基H-4')，6.59(1H，d，/3.3，呋喃基H-3')，6.42(1H,dd，/3.3和1.6，呋喃基H曙4')和2.03(6H，s，2xC/f3)。N-叔丁基-2-(2-呋喃基)咪唑并[l，2-a吡啶-3-胺(128)(0.20g，60%)。3H(200MHz，CDC13)8.27(1H，d，/6.8，H-4)，7.44-7.58(2H，m，H-7和呋喃基H隱5')，7.06-7.22(1H，m，H-6)，6.93(1H，d，《/3.4，呋喃基H-3')，6.78(1H，t，J6.8，H-5)，6.53(1H，dd，J3.4禾口1.6，呋喃基H-4')，3.54(1H，brs，麗)和1.18[9H，s，C(C柳。AH環(huán)己基)-2-(2-呋喃基)咪唑并[l，2-a吡啶-3-胺(129)(0.27g，73%)。3H(200MHz，CDC13)8.07(1H，dd，J6.7和1.2，H-4)，7.53(1H，d，《/9.0，H-7)，7.51(1H，d，/1.6，呋喃基H-5')，7.15(1H，ddd，J9.0，6.7和1.2，H-6)，6.91(1H，d，/3.3，呋喃基H-3'),6.79(1H，td，J6.7和1.0，H-5)，6.55(1H，dd，《/3.3和1.6，呋喃基H-4')，3.62(1H，brs，麗)，2.85-3.10(1H,m，C/ZNH)，1.50-2.00和1.05-1.45(IOH，m，5x環(huán)己基C/^)。4-{3-(2,6-二甲苯基)氨基咪唑并[1，2-吡啶-2-基}苯-1，3-二醇(130)(O.llg，23%)。<5H(200MHz，CDC13)8.04(1H，d，/8.6，H-4)，7.69(1H，d，J7.0，H-6')，7.56(1H，d，J9,4，H-7)，7.15-7.28(1H，m，H-6)，7.02(2H，d,J7.4，2x二甲苯基H-3')，6.72-6.92(2H，m，H-5和二甲苯基H-4')，6.53(1H，d，幾7，H-3')，6.33(1H，dd，和1.7，H-5')，5.36(1H，brs，N/f)和2.04(6H，s，2xCi/3)。4-(3-環(huán)己基氨基)咪唑并[1，2-吡啶-2-基)苯-1，3-二醇(131)(0.13g，26%)。(5H(200MHz，CDC13)8.04(1H，d，《/6.8，H-4)，7.76(1H，d，J8.0，H-6')，7.28-7.38(1H，m，H-7)，6.96-7.10(1H，m，H-5')，6.71(m，t，J6.8，H-5)，6.21-6.38(2H，m，H-6和H-3')，3.51(1H，brs，歴)，2.71-2.95(1H，m，Ci^NH)，1.30-1.75和0.85-1.28(IOH，2xm，5x環(huán)己基C/2)。二胺與乙二醛水溶液縮合的一般方法將所需量的1，2-二胺置于3cm3水中，向其加入40%乙二醛水溶液(以標(biāo)示量)。然后加入氫氧化鉀(2.1-3.1當(dāng)量)(除不需要加堿的鄰苯二胺l之外)，使二胺立即溶解。在室溫下，將混合物在規(guī)定時(shí)間內(nèi)攪拌，在此過(guò)程中，生成固體沉淀。用冰醋酸將pH降到約為5，通過(guò)真空過(guò)濾收集固體。用水、乙酸乙酯或丙酮洗滌，然后真空干燥。2-氨基-4-羥基蝶啶(132)按照上述一般方法，用乙二醛(0.68cm3，4.66mmo1)和氫氧化鉀(0.52g，9.31mmo1)處理4-羥基-2，5，6-三氨基嘧啶硫酸鹽2(1.06g，4.43mmo1)。當(dāng)加入乙二醛時(shí)，從溶液中沉降下來(lái)少量的棕色固體。由黃色溶液中過(guò)濾出該固體，該黃色溶液在18h反應(yīng)期間逐漸形成細(xì)的黃色沉淀。酸化后，將黃色粉末過(guò)濾，用水和丙酮洗滌并干燥真空，得到2-氨基-4-羥基蝶啶132(0.49g，67%)。3H(200MHz，D20/NaOD)8.47(1H，d，N:Ci/aCH^N，J2.4)和8.27(1H，d，N=CHaC/fb=N，J2.4);3c(50MHz，D20/NaOD)173.4(C-4)，156.7(C畫(huà)2)，148.6(C-7)，138.7(C-8)和129.6(C-IO)。8，9-二羥基-8，9-二氫咪唑并[1,2-1蝶啶-5(7^)-酮(133)按照上述一般方法，用乙二醛(2cm3)和氫氧化鉀(O.llg，1.97mmo1)處理4-羥基-2，5,6-三氨基嘧啶硫酸鹽2(0.23g，0.99mmo1)。在18h反應(yīng)過(guò)程中，粉紅色溶液一直存在，酸化后得到粉紅色粉末。固體分離，將其干燥并再次使用相同步驟，將黃色粉末過(guò)濾，用水和丙酮洗滌并真空干燥，得到8,9-二羥基-8,9-二氫咪唑并[l,2-a]蝶啶-5(7巧-酮133(0.16g，77%)。(5H(200MHz，c/6-DMSO)9.34(1H，brs，可交換的D20，NH)，8.72(1H，d，N=C^3CHb=N，J1.8)，8.48(1H，d，N=CHaCi/b=N，《/2.0)，7.48[1H，d，可交換的020，N芳基HCHa(OH)，J6.8〗，6.59[1H，d，可交換的020，NHCHb(0//)，J7.8]，5.58[1H，d，N芳基HC仏(OH)，和4.97[1H，d，NHCi/b(OH)，《/8.0];&(50MHz，i/6-DMSO)159.1(C-5)，158.2(C-6a)，155.2(C-4a)，150.1(C-3)，140.3(C-2)，130.8(C-9b)，85.5(C-8)和84.1(C-9)。蝶啶-2，4(Lff，3^)-二酮(134)按照上述一般方法，用乙二醛(2cm勺和氫氧化鉀(0.11g，1.90mmo1)處理5,6-二氨基尿啼啶硫酸鹽13(0.22g，0.91mmo1)18h。此時(shí)形成黃色沉淀。向其加入乙酸后，將濃稠的黃色沉淀過(guò)濾，用水和丙酮洗漆并真空干燥，得到黃色粉末蝶啶-2,4(1//,3//)-二酮134(89.0mg，60%)。&(200MHz，^-DMSO)11.73(2H，brs，麗)，8.64(1H，d，N=C//aCHb=N，72.2)和8.52(1H，d，N=CHaC//b=N，J2.2)。(2-氨基-4，7-二羥基蝶啶-6-基)乙酸乙酯(136)將6-羥基-2,4，5-三氨基噴啶2(0.25g，1.03mmo1)置于預(yù)熱到90°C的冰醋酸(7cm3)中，之后立即加入草酰乙酸二乙酯鈉鹽(0.27g，1.27mmo1)。然后將溶液快速回流加熱，使混合物沸騰18h。得到細(xì)?；鞈乙骸＠鋮s至5。C后，通過(guò)過(guò)濾收集沉淀的固體，用水洗滌并真空干燥，得到細(xì)的茶色粉末(2-氨基-4,7-二羥基蝶啶-6-基)乙酸乙酯136(0.22g，79%)。^h(200MHz,A-DMSO)7.01(1H，brs，OH)，6.39和6.29(1H，2xbrs)，4.09(2H，q，OCi/2CH3，/7.0)，3.61(2H，s，Ci/2CO)和1.18(3H，t，OCH2C//3，J7.0);&(50MHz，^-DMSO)170.2(CO)，166.1和159.3(C-4和C-7)，157.5(C-6)，155.6(C-8a)，152.1(C-4a)，146.0(C-6)，61.0(OCH2CH3)，40.1(CH2CO)和14.8(OCH2CH3)。(7-羥基-2，4-二氧代-l，2，3，4-四氫蝶啶-6-基)乙酸乙酯(137)將4，5-二氨基尿嘧啶硫酸鹽13(0.31g，1.3Ommo1)置于預(yù)熱到卯。C的冰醋酸(25cm3)中，之后立即加入草酰乙酸二乙酯鈉鹽(0.35g，1.65mmo1)。然后將溶液快速回流加熱，使混合物沸騰5h。得到細(xì)?；鞈乙?。冷卻至5。C后，通過(guò)過(guò)濾收集沉淀的固體，用10cmS熱乙醇洗滌并真空干燥，得到細(xì)的茶色粉末(7-羥基-2,4-二氧代-1,2，3，4-四氫蝶啶-6-基)乙酸乙酯137(0.21g，71%)。(5H(200MHz，d6-DMSO)11.23(1H，brs，OH)，4.10(2H，q，OCi/2CH3，《/7.0)，3.72(2H，s，C//2CO)和1.19(3H，t，OCH2C//3，J7.0);&(50MHz，^-DMSO)170.2(CO)，160.9和160.7(C隱2和C-4),150.8(C-7)，148.2(C-6)，61.1(OCH2CH3)，39.3(CH2CO)和14.8(OCH2CH3)。2，4-二羥基-4，5-(二乙氧羰基)-6-(4-硝基苯基)-3，4，5，6-四氫嘧啶(138)將三氟乙酸(3.2cm3，41.54mmol)加入溶解于無(wú)水1,2-二氯乙烷(92cm3)的尿素(4.17g，99.37mmol)和4-硝基苯甲醛(7.84g，51.91mmo1)的混合物中。將草酰乙酸二乙酯鈉鹽(95%，10.23g，46.24mmo1)加入反應(yīng)混合物中，將反應(yīng)物回流加熱23h。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，隨后真空濃縮，得到棕色粘性油狀物。用乙酸乙酯(150cm3)繼續(xù)處理殘?jiān)⒂盟?3xl50cm3)洗滌。用乙酸乙酯(200cm3)提取合并的水性洗滌液。將有機(jī)提取物合并并真空濃縮至初始體積約150cm3。將含有不溶沉淀的所得混合物轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，回流加熱直至所有不溶物質(zhì)溶解。向熱溶液加入足量的己烷以誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀。在15min內(nèi)將使混合物攪拌冷卻至室溫。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀，得到蠟狀固體，該固體在己垸中變成漿狀物。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀并用己垸洗滌。將濾餅減壓干燥，重量為約20.31g。將固體由乙酸乙酯-己垸混合物重結(jié)晶，得到米色無(wú)定形固體，對(duì)其進(jìn)行光譜分析，發(fā)現(xiàn)其為2,4-二羥基-4，5-(二乙氧羰基)-6-(4-硝基苯基)-3，4,5，6-四氫嘧啶138(11.61g，66%)的6:1.4:1的非對(duì)映異構(gòu)體混合物(通過(guò)NMR光譜法；參見(jiàn)下文)；4i(50MHz;DMSO-^)8.26-8.18和8.20(3x2H，m和d，J約為8.5，6x芳基H)，7.71-7.57(3x2H，m禾口d，J約為8.5，6x芳基H)，7.37，7.06,6.94，6,71，6.63禾口6.52(6xlH，6xs，6xNH)，5.20(1H，d，J5.2，H-6)，4.95-4,89和4.92(2xlH，2個(gè)重疊的d,/11.5，H-6)，4.28-4.04(3x2H，2個(gè)重疊的q，《/約為7.0，3xOCH2CH3)，4.00-4.62(3x2H,2個(gè)重疊的q，《/約為7.0，3xOC/f2CH3)，3.25-3.10和3.20(3xlH，3個(gè)重疊的d，/11.5，H-5)，1.30-1.22，1.27禾口1.26(2x3H，2個(gè)重疊的t，J約為7.1，2xOCH2Ci73)，1,67(3H，t，</約為7.2，OCH2Ci/3)，1.02-0.93，0.98和0.96(2x3H，2個(gè)重疊的t，77.0和7.1，2xOCH2CH3)，0.747(3H，t，《/7.2，OCH2C//3);&(50MHz;DMSO-^)169.8(C02Et)，167.7(C02Et)，154.2(NHCONH)，148.7，147.8，130.5和124.0(芳基C)，81.7(C-4)，62.4(C-5)，61.3(C-6)，52.9禾卩52.7(OCH2CH3)，14.6禾口14.2(OCH2CH3)。2,4-二羥基-4，5-(二乙氧羰基)-6-(3,5-二甲氧基-4-羥苯基)-3，4，5，6-四氫嘧據(jù)(139)將三氟乙酸(2.1cm3，27.26mmo1)加入溶解于無(wú)水1，2-二氯乙垸(62cm3)中的尿素(2.66g，44.29mmo1)和丁香醛(6.04g，32.48mmo1)的混合物中。再將草酰乙酸二乙酯鈉鹽(95%,6.53g，29.53mmo1)加入反應(yīng)混合物中，將反應(yīng)物回流加熱19h。在加熱過(guò)程中，明顯出現(xiàn)棕色不溶的粘性油狀物。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并將溶劑從不溶解于油狀物中傾析出來(lái)。用水洗滌傾析后的反應(yīng)混合物，干燥(MgS04)并真空濃縮，得到粗的棕色油狀物，通過(guò)TLC分析，該油狀物主要由未反應(yīng)的丁香醛組成。用水(50cm3)和乙酸乙酯(50cm3)的混合物處理殘余的棕色粘性油狀物，并劇烈攪拌數(shù)分鐘，直至油狀物完全溶解于水-乙酸乙酯混合物中。將混合物轉(zhuǎn)移至分液漏斗，在此過(guò)程中分成三層。將底層水相從剩余的乙酸乙酯相和乳化相中分離出來(lái)。將該兩相轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，向該錐形瓶中加入足量的己烷以誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀。將漿狀物攪拌數(shù)分鐘，此后，通過(guò)過(guò)濾收集沉淀。對(duì)濾餅進(jìn)行減壓干燥，得到2,4-二羥基-4,5-(二乙氧羰基)-6-(3，5-二甲氧基-4-羥苯基)-3,4,5，6-四氫嘧啶139的6:1的非對(duì)映異構(gòu)體混合物(3.57g，29%);3H(50MHz;DMSO-^)8.30(1H，brs，PhO/f)，7.81(1H，brd，《/3.3，則，7.46(1H，brd，《/1.6，麗)，6.73(1H，s，麗)，6.82(1H，s，麗)，6.58(2xlH，s，芳基H)，6.54(2xlH，s，芳基H)，6.44(1H，brs，OH)，5.10(1H，brd，《/3.0，H-6)，4.70(1H，d，/11.5，H-6)，4.28-3.78(4x2H，4個(gè)重疊的q，OC//2CH3)，3.78和3.77(2x3H，2xs，2x芳基OCH3)，3.10(1H，d，《/11.5，H-5)，1.31-1.22，1.28和1.26(2x3H，2個(gè)重疊的t,J7.0和7.2，OCH2Cif3)，1.11(3H，t，/7.0，OCH2C//3)，0.98(3H，t，J7.2，OCH2Cif3);(5c(50MHz;DMSO-A)170.1(C02Et)，168.3(C02Et)，154.4(NHCONH)，148.3,136.1，130.7和106.2(芳基C)，81.7(C-4)，62.3(C-5)，60.9(C-6)，56.8(芳基OCH3)，53.4(OCH2CH3)，14.6和14.4(OCH2CH3)。2，4-二羥基-4，5-(二乙氧羰基)-6-(4-溴苯基)-3，4，5，6-四氫嘧啶(140)將三氟乙酸(3.2cm3，41.54mmol)加入溶解于無(wú)水1，2-二氯乙烷(90cm3)中的尿素(4.09g，68.02mmol)和4國(guó)溴苯甲醛(9.32g，49.88mmol)的混合物中。再將草酰乙酸二乙酯鈉鹽(95%，10.03g，45.34mmoD加入反應(yīng)混合物中，將反應(yīng)物回流加熱41h。使反應(yīng)混合物冷卻至室溫，隨后真空濃縮，得到粘性橙色油狀物。在劇烈攪拌的條件下用乙酸乙酯(100cm3)和水(100cm3)繼續(xù)處理該殘?jiān)；旌衔镫S后分相，用水(2xl00cm3)洗滌有機(jī)相。用乙酸乙酯(2xl00cm3)提取合并的水性洗滌液。將有機(jī)提取物合并，真空濃縮，得到粗的橙色固體，該固體溶解于沸騰的乙酸乙酯。使溶液冷卻至室溫，然后加入己烷以誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀。將所得槳狀物攪拌15min。此后，將沉淀過(guò)濾并用己垸洗滌。將濾餅減壓干燥，得到2,4-二羥基-4,5-(二乙氧羰基)-6-(4-溴苯基)-3,4,5,6-四氫嘧啶140的4:1的非對(duì)映異構(gòu)體混合物(4.92g，26%);3H(50MHz;DMSO-^)7.61-7.51禾n7.53(4xlH，2個(gè)重疊的m和d,J8.4，芳基H),7.35-7.20和7.33(4xlH，2個(gè)重疊的m和d，J8.4，芳基H)，7.09(1H，s，Nif)，6.91(1H，brd,/1.4，麗)，6.58(1H，brd，《/1.0，麗)，6.50(1H，s，麗)，5.03(1H，brd，《/4.5，H-6)，4.76(1H，d，/11.5，H-6)，4.25-4.05(2x2H，2個(gè)重疊的q，OC//2CH3)，3.93-3.65(2x2H，2個(gè)重疊的q，OC^2CH3)，3.20-3.10和3,13(2xlH，重疊的d和brdd，J"11.5和0.8，2xH-5)，1.26(3H，t，J約為7.1，OCH2Ciy3)1.16(3H，t，".0，OCH2C^3)，0.97(3H，t，《/約為7.1，OCH2Ci/3)和0.78(3H，t，J"約為7.1，OCH2Cff3);(5c(50MHz;DMSCW6)169.9(C02Et)，167.8(C02Et)，154.9(NHCONH)，154.2(NHCONH)，140.5，131.8，131.1，129.6和121.6(芳基C)，81.7禾卩80.3(C-4)，62.4(C-5)，61.1禾卩60.5(C-6)，53.0和52.8(OCH2CH3)，14.6禾口14.4(OCH2CH3)。2，4-二羥基-4，5-(二乙氧羰基)-6-(反式-2-苯乙烯)-3，4，5，6-四氫嘧啶(141)將三氟乙酸(3.2cm3，41.54mmo1)加入溶解于無(wú)水1，2-二氯乙烷(91cm3)中的尿素(4.10g，68.31mmol)和反式肉桂醛(6.62g，50.09mmo1)的混合物中。再將草酰乙酸二乙酯鈉鹽(95%，10.07g，45.54mmo1)加入反應(yīng)混合物，將反應(yīng)回流加熱22h。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，隨后真空濃縮，得到粘性橙色油狀物。用乙酸乙酯(150cm3)繼續(xù)處理殘?jiān)⒂盟?2xl00cm3)洗滌。用乙酸乙酯(2xl50cm3)提取合并的水性洗滌液。將有機(jī)提取物合并，干燥并真空濃縮，得到粗的橙色粘性油狀物，由于從乙酸乙酯-己烷混合物直接晶體的嘗試并不成功，所以將該油狀物通過(guò)柱色譜進(jìn)行純化。得到粗的蠟狀橙色固體，該固體從乙酸乙酯和最少體積的己烷中重結(jié)晶出來(lái)，得到白色粉末2,4-二羥基-4,5-(二乙氧羰基)-6-(反式-2-苯乙烯)-3，4,5,6-四氫嘧啶141的4:l的非對(duì)映異構(gòu)體混合物(1.82g，11%);<5H(50MHz;DMSO-A)7.50-7.25(2x5H，m，芳基H)，6.96(1H，brs，N//)，6.77(1H，brs，N//)，6.63(2xlH，d，J約為16.0，PhC//=CH)，6.47(1H，brs，NH)，6.18(2xlH，dd，《/約為16.0和8.0，PhCH=C//)，4.64-4.56(1H，m，H-6)，4.38(1H，dd，《/約為11.0和8.0，H誦6)，4.24-4.07(2x2H，2個(gè)重疊的q，OC//2CH3)，4.07-3.卯(2x2H，2個(gè)重疊的q，OC//2CH3)，6.05(1H，brd，J約為4.0，H-5)，2.97(1H，d，J約為11.0，H-5)，1.30-1.16，1.27禾口1.19(2x3H，2個(gè)重疊的t，J約為7.1和7.0，OCH2CfiT3)，1.11-1.07，1.07和1.06(2x3H，2個(gè)重疊的t，/7.0，OCH2Ci/3);(5C(50MHz;DMSO-d6)170.0(C02Et)，168.2(C02Et)，154.2(NHCO麗)，137.0，133.0，131.7，128.4禾卩127.4(芳基C),129.3(CH=CHPh)，128,9(CH=CHPh)，127.1(CH=CHPh)，127.0(CH=CHPh)，81.6(C-4)，62.3(C-5)，61.1(C-6)，51.4和51.2(OCH2CH3)，14.6和14.5(OCH2CH3)。6-(4-硝基苯基)-2-氧代-l,2,3,4-四氫吡啶-4，5-二羧酸(142)將溶解于無(wú)水乙醇(2cm3)的氫氧化鉀(0.13g，2.24mmol)溶液加入溶解于無(wú)水乙醇(3cm"的二乙氧羰基-四氫嘧啶138(0.22g，0.56mmo1)混懸液中。將反應(yīng)混合物回流加熱10min。在該過(guò)程中，沉淀幾乎一直存在。將暗棕色反應(yīng)混合物冷卻至室溫，在冷卻過(guò)程中，用鹽酸水溶液(10%)將混合物酸化至pH約為1-2，使顏色變?yōu)槊鞒壬?。通過(guò)過(guò)濾簡(jiǎn)單收集產(chǎn)物，用幾小部分無(wú)水乙醇洗滌，然后減壓干燥，得到6-(4-硝基苯基)-2-氧代-l，2,3，4-四氫吡啶-4，5-二羧酸142(0.16g，90%);(5h(50MHz;DMSO-^)11.26(2xlH，brs，2xC02//)，8.31(2H，d，J約為8.5，芳基H)，8.18(1H，brs，N//)，7.99(2H，d，《/約為8.5，芳基H)，5.95(1H，s，H-6)。8-嗎啉并腺苷(147)將嗎啉(2.0cm3)加入異亞丙基保護(hù)的8-溴腺苷145(0.15g，0.43mmo1)二噁垸(5cm3)溶液中，對(duì)所得溶液進(jìn)行微波照射(600W的50%功率下)40min。將嗎啉的氫溴酸鹽沉淀過(guò)濾除去，并將溶劑從濾液中除去。將所得溶液用醚(2x5cm3)研碎，生成異亞丙基保護(hù)的8-嗎啉代腺苷146的膏狀(creamcollared)的固體(0.12mg，71%)。(5H(200MHz，CDC13)8.18(1H，s，H-2)，5.90(1H，d，H-l'，《/5.6)，5.27(1H，dd，H-2'，J5.6和5.4)，5.08(1H，d，H-3'，J5.4)，4.42(1H，s，H陽(yáng)4')，3"0(2H，m，H-5')，3.78[4H，m，0(C//2CH2)2N]，3.39[2H，m，0(CH2C^aHb)2N]，3.15[2H，m，0(CH2CHai/b)N]，1.60禾Q1.38[6H，2xs，C(Cf/3)2];(EI)m/z392(CnH24N60s要求是392)。通過(guò)在鹽酸水溶液(2M，5滴)中攪拌過(guò)夜，將所得物質(zhì)U0mg)在四氫呋喃中脫保護(hù)。此時(shí)，樣品中和后進(jìn)行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有原料殘余。將溶劑除去后，粗的147可用于抑制研究。實(shí)施例4抑制劑的體外評(píng)價(jià)通過(guò)在氮過(guò)量和碳限量(腺苷?；问?或氮限量和碳過(guò)量(去腺苷酰化形式)的條件下連續(xù)培養(yǎng)大腸桿菌，可生成腺苷酰化和去腺苷?；问降腉S酶。使用AMP-瓊脂糖親和色譜純化兩種形式的酶，進(jìn)行分析以檢測(cè)谷氨酰胺合成酶的抑制。通過(guò)ATP水解為ADP和由谷氨酸形成谷氨酰胺來(lái)測(cè)量酶活性。材料和方法由谷氨酰胺合成酶缺陷型宿主菌株大腸桿菌YMC11的重組谷氨酰胺合成酶構(gòu)建體pBSK-ECgln生成兩種形式的酶。通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)來(lái)使生物體生長(zhǎng)，其中對(duì)于腺苷?；福诘^(guò)量和碳限量條件下培養(yǎng)，而對(duì)于去腺苷?；福诘蘖亢吞歼^(guò)量的條件下培養(yǎng)，如文獻(xiàn)(Senior,P.J.(1975)，J.Bact:123(2)，407-418)所述的那樣。在氮過(guò)量和碳限量條件下進(jìn)行的發(fā)酵，其生長(zhǎng)的初始生長(zhǎng)速率為0.07小時(shí)"，在經(jīng)過(guò)5個(gè)保留時(shí)間后，生長(zhǎng)速率減小到0.01小時(shí)"，從而達(dá)到穩(wěn)態(tài)。使用NewBrunswick3000(N丄，USA)發(fā)酵罐，在37°C、pH7.15、空氣流速為lv/v/m和攪拌速率為600rpm下進(jìn)行所有的發(fā)酵。連續(xù)收集生物質(zhì)，并在6°C下保存，此后，將其在10,000xg下離心20min并在-20。C下冷凍。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)物吸光度(600nm)和細(xì)胞存活率以及通過(guò)測(cè)定生物質(zhì)濃度來(lái)持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵以確保穩(wěn)定，其中細(xì)胞存活率通過(guò)對(duì)平板計(jì)數(shù)瓊脂進(jìn)行平板計(jì)數(shù)得到。在發(fā)酵過(guò)程中，每隔一段時(shí)間從發(fā)酵體系中取出單菌落分離體，并且通過(guò)PCR篩選和質(zhì)粒分離驗(yàn)證含有GS基因的質(zhì)粒的完整性。將生物質(zhì)重懸于重懸緩沖劑A或RBAU0mM咪唑-HCl、2mM卩-巰基乙醇、10mMMnCl2.4H20;pH7.0)中。將細(xì)胞在50%占空比下超聲10min。將該超聲溶液在12000xg下離心10min，并保留上清液。加入硫酸鏈霉素(10%w/v的10%),并在4°C下攪拌混懸液10min。然后在12000xg下離心10min，并保留上清液。用硫酸調(diào)節(jié)上清液pH至5.15。在4°C下攪拌該混合物15min，然后在20000xg下離心10min。再次保留上清液。添加飽和硫酸銨(體積的30%)并用硫酸調(diào)節(jié)pH至4.6。在4°C下攪拌混懸液15min,然后在20000xg下離心10min。將獲得的沉淀重懸于RBA并用硫酸調(diào)節(jié)pH至5.7。在4°C下攪拌該混懸液過(guò)夜以使得谷氨酰胺合成酶得以重懸，然后在20000xg下離心10min。保留上清液并將混懸液pH調(diào)節(jié)至7.0。使用AKTAExplorer(AmershamBiosciences),利用親和層析使兩種形式的酶得到進(jìn)一步純化。使用長(zhǎng)度為10cm和內(nèi)徑為10mm的HR10/10柱以5'AMP瓊脂糖樹(shù)脂實(shí)現(xiàn)分離。將谷氨酰胺合成酶制劑(約為2ml)加樣到制備柱上，所述制備柱用10mM咪唑(pH7.0)、150mMNaCl和10mMMnCl"H2O來(lái)平衡。在整個(gè)線性梯度從150mM至500mM的40mlNaCl，使用2.5mMADP將結(jié)合的谷氨酰胺合成酶從柱上洗脫下來(lái)，并收集lml組分。然后收集合并含有純谷氨酰胺合成酶的組分并用RBA透析過(guò)夜。按照標(biāo)準(zhǔn)方案，在7.5%SDS-PAGE凝膠上對(duì)每個(gè)蛋白混懸液的等分試樣進(jìn)行電泳。使用Lowry蛋白檢測(cè)法測(cè)量蛋白濃度，所述的濃度用于測(cè)定所有酶的比活性。使用從測(cè)量酶正反應(yīng)發(fā)展而來(lái)的分析法評(píng)價(jià)每種抑制劑對(duì)谷氨酰胺合成酶活性的影響。在每種情況下，對(duì)每種抑制劑均檢測(cè)酶的腺苷?；问胶腿ハ佘挣；问健Ｋ蟹治銎叫羞M(jìn)行兩次。在抑制劑濃度為lmM下進(jìn)行初篩。分析物組分如表29所示。表29.分析物組分<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table>將所有抑制劑制備成二甲亞砜(DMSO)的10mM儲(chǔ)備液。在pH6.3下進(jìn)行腺苷?；傅姆治?，而在pH7.2下進(jìn)行去腺苷酰化酶的分析。將所有酶制劑以5(Hil的體積加入分析混合物中。酶的加入啟動(dòng)了反應(yīng)，然后，對(duì)于腺苷?；福蛇M(jìn)行2.5小時(shí)的反應(yīng)，對(duì)于去腺苷酰化酶，可進(jìn)行45min的反應(yīng)。通過(guò)加入三氯乙酸使其濃度為0.5%m/v來(lái)終止反應(yīng)。然后將每個(gè)分析物均分到HPLC小瓶，在Agilent100HPLC設(shè)備上使用PhenomenexLunaC18柱對(duì)其中的兩個(gè)進(jìn)行谷氨酸和谷氨酰胺分析，而另外的兩個(gè)進(jìn)行ADP和ATP分析。酶的抑制分析以pmole/min/mg蛋白來(lái)計(jì)算每種抑制劑分析的酶比活性。然后將每種抑制劑分析與未受抑制的酶的分析(即不含抑制劑的對(duì)照分析)相比，計(jì)算酶活性的降低，然后以百分?jǐn)?shù)進(jìn)行報(bào)告?；钚越档偷姆秶蛇x擇80-100%、60-80%、30-60%和0-30%。這些結(jié)果如表30所示。表30.所檢測(cè)的抑制劑化合物對(duì)腺苷?；腿ハ佘挣；问降拿府a(chǎn)生的相對(duì)抑制水平。<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table>基于表30所示的結(jié)果，選擇一些抑制劑化合物進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。表31顯示了這些抑制劑化合物及它們的相對(duì)抑制水平。表31.用于進(jìn)一步檢測(cè)的抑制劑化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage177</column></row><table>可基于GS活性的抑制百分?jǐn)?shù)選擇有用的抑制劑。相對(duì)于去腺苷?；疓S，對(duì)腺苷?；疓S的ADP或谷氨酰胺形成活性的選擇抑制性尤其有用。此外，相對(duì)于谷氨酰胺，對(duì)ADP合成顯示更高抑制性的抑制劑可能也是有用的。實(shí)施例5結(jié)核分枝桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的抑制劑活性評(píng)價(jià)材料和方法將BACTEC系統(tǒng)設(shè)計(jì)成用于監(jiān)測(cè)緩慢生長(zhǎng)物種的分枝桿菌生長(zhǎng)。使細(xì)菌在放射性基質(zhì)上生長(zhǎng)，生成的放射性二氧化碳與分枝桿菌生長(zhǎng)速率直接成正比(Siddiqi，S.H.，BACTEC460TBsystem,Productandproceduremanual(1995))。將讀取值表示為生長(zhǎng)指數(shù)(GI)。在富含ADC(BiolabartC70)的7H9分枝桿菌培養(yǎng)基(Difco)上，將結(jié)核分枝桿菌參照菌株H37Rv(ATCC25618)在37°C持續(xù)攪拌下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)A600nm值為0.4-0.6之間時(shí)，對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)可以接受。當(dāng)培養(yǎng)物的A600nm值達(dá)到約為0.16的密度時(shí)(oneMcFarland)，取0.1ml接種到Bactec小瓶中。在37°C下培養(yǎng)這些原代培養(yǎng)物直至生長(zhǎng)指數(shù)達(dá)到500(+/-50)。將這些原代培養(yǎng)物用于抑制劑檢測(cè)。通過(guò)具有孔徑為0.22微米孔(Millex-LG)的13mm耐有機(jī)溶劑針頭過(guò)濾器對(duì)二甲亞砜(DMSO)中的檢測(cè)化合物進(jìn)行滅菌。對(duì)未稀釋樣品的生長(zhǎng)抑制活性進(jìn)行檢測(cè)。將顯示活性的未稀釋樣品在無(wú)菌DMSO中順次稀釋從而測(cè)定持續(xù)生長(zhǎng)抑制活性的稀釋因子。檢測(cè)的抑制劑如表32所表32.BACTEC分析中檢測(cè)的抑制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage178</column></row><table>將0.1ml原代培養(yǎng)物和抑制劑化合物加入BACTEC小瓶中，在37°C下培養(yǎng)小瓶，并每隔24小時(shí)監(jiān)測(cè)一次其生長(zhǎng)。對(duì)照包括有抑制劑和沒(méi)有抑制劑以及有溶劑和沒(méi)有溶劑的培養(yǎng)物。繼續(xù)進(jìn)行GI讀數(shù)直至對(duì)照的最大GI值達(dá)到999。為了檢測(cè)樣品對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性，使用對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)分析法。每種情況下，對(duì)所有樣品平行檢測(cè)三次。使用MTT-分析法對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活進(jìn)行比色分析并與其它所用的分析法(Mosman等人，1983和Rubinstein等人，1990)相比較。使用四唑鹽MTT測(cè)量所有的生長(zhǎng)和化學(xué)敏感性。由CSIR獲得100%DMSO中的10mM儲(chǔ)備液。如果溶解不好則以混懸液形式檢測(cè)樣品，并儲(chǔ)存于-20。C下直至使用。在5(HiM下篩選所有的試驗(yàn)樣品。選擇該濃度以確保分析中所用的溶劑濃度不影響細(xì)胞存活。細(xì)胞所接觸的最高溶劑濃度對(duì)細(xì)胞存活沒(méi)有可測(cè)到的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。在所有實(shí)驗(yàn)中，將依米丁用作對(duì)照藥。依米丁的初始濃度為100嗎/ml，在完全培養(yǎng)基中用10倍稀釋液逐級(jí)稀釋?zhuān)玫搅鶄€(gè)濃度，最低濃度為0.001ng/ml。通過(guò)GraphPadPrismv.4軟件的非線性劑量-響應(yīng)曲線擬合分析，由劑量-響應(yīng)曲線得到這些樣品的50%抑制濃度(IC5Q)值。結(jié)果和討論在不同抑制劑存在下進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的Bactec生長(zhǎng)響應(yīng)曲線。然后通過(guò)測(cè)定抑制劑濃度對(duì)結(jié)核分枝桿菌Bactec生長(zhǎng)的影響，來(lái)檢測(cè)抑制劑的LCso濃度，所檢測(cè)的那些抑制劑是發(fā)現(xiàn)能抑制結(jié)核分枝桿菌的抑制劑。LC5o濃度如表33所示。表33.結(jié)核分枝桿菌抑制劑的LC5o濃度()iM)<table>tableseeoriginaldocumentpage179</column></row><table>然后檢測(cè)所有抑制劑對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)的細(xì)胞毒性。先在濃度為5(HiM下開(kāi)始檢測(cè)所有樣品。由所得結(jié)果可知，所有樣品在該濃度對(duì)CHO細(xì)胞系均顯示沒(méi)有顯著的細(xì)胞毒性(表34)。表34.在50pM下的細(xì)胞存活百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage180</column></row><table>本文已經(jīng)描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方式。然而，可以理解的是，在不偏離本發(fā)明精神和保護(hù)范圍的條件下，可作出各種修改。因此，其它實(shí)施方式也落在以下權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)生腺苷?；劝滨０泛铣擅?GS)多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的試驗(yàn)抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助方法，所述方法使用包括處理器和輸入設(shè)備的程序式計(jì)算機(jī)，所述方法包括(a)向所述輸入設(shè)備輸入包括GS多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)；(b)使用所述處理器將試驗(yàn)抑制劑分子對(duì)接到所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)內(nèi)；以及(c)基于所述對(duì)接，確定所述試驗(yàn)抑制劑分子是否抑制所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將(Mr^+)3《HC03—)12ATP復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元對(duì)接到所述磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)內(nèi)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括基于所述對(duì)接，確定所述試驗(yàn)抑制劑分子是否抑制所述(Mn"V(HCOO^ATP復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元與所述磷酰基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的結(jié)合。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括設(shè)計(jì)由步驟(c)確定的試驗(yàn)抑制劑以抑制所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的活性并體外評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述體外評(píng)價(jià)包括使用能測(cè)量ATP水解、ADP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，進(jìn)一步包括體外評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)去腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性，以評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)所述腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的特異性抑制活性。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括生成所述試驗(yàn)抑制劑并評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)含有GSI-P谷氨酰胺合成酶基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制活性。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)菌選自白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌、傷寒沙門(mén)氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門(mén)螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyelladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步包括評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)抑制劑對(duì)真核細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述分析法包括在pH約為6.0-6.5的條件下，使所述腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯呐c所述試驗(yàn)抑制劑接觸。12.—種產(chǎn)生抑制腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的化合物的方法，所述方法包括(a)提供谷氨酰胺合成酶多肽的三維結(jié)構(gòu)；以及(b)基于所述三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)能抑制所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)與(Mn2+)3'(HC03—)12'ATP復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元之間相互作用的試驗(yàn)化合物。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述谷氨酰胺合成酶多肽的三維結(jié)構(gòu)包括結(jié)合到所述磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)的(Mn"3.(HCCV;h2.ATP復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，進(jìn)一步包括生成所述步驟(b)的試驗(yàn)化合物并體外評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)化合物對(duì)腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡囊种苹钚?。15.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，進(jìn)一步包括生成所述步驟(b)的試驗(yàn)化合物并評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)化合物對(duì)含有GSI-P谷氨酰胺合成酶基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制活性。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細(xì)菌選自白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌、傷寒沙門(mén)氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門(mén)螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremyelladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)化合物對(duì)真核細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。19.一種產(chǎn)生抑制腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡牧柞；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的試驗(yàn)化合物的方法，所述方法包括(a)提供(Mn2+)3'(HC(V:h2'ATP復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；以及(b)基于所述三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)具有類(lèi)似于所述(Mn")3《HC(V;h2ATP復(fù)合物結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元的試驗(yàn)化合物。20.—種體外篩選試驗(yàn)化合物以確定所述試驗(yàn)化合物是否抑制腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的方法，所述方法包括(a)在對(duì)磷?；D(zhuǎn)移酶活性有效的條件下，使腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯呐c試驗(yàn)化合物接觸；以及(b)確定相對(duì)于還沒(méi)有與所述試驗(yàn)化合物接觸過(guò)的腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡幕钚?，所述腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶的活性是否有所降低。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括確定相對(duì)于還沒(méi)有與所述試驗(yàn)化合物接觸過(guò)的去腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的活性，所述去腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡牧柞；D(zhuǎn)移酶的活性是否有所降低。22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中使用能測(cè)量ATP水解、ADP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法來(lái)測(cè)量所述磷?；D(zhuǎn)移酶的活性。23.—種用于抑制腺苷酰化GS多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的體外方法，所述方法包括使腺苷?；疓S多肽與含有本文所述的式I、II、III、IV、V、VI或VII表示的化合物的組合物接觸。24.—種用于抑制含有GSI-P基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的體外方法，其中所述方法包括使所述細(xì)菌與含有本文所述的式I、II、III、IV、V、VI或VII表示的化合物的組合物接觸。25.—種用于治療、預(yù)防或改善與哺乳動(dòng)物細(xì)菌感染有關(guān)的一種或多種癥狀或障礙的方法，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-(3基因的細(xì)菌引起，所述方法包括將含有本文所述的式i、n、in、iv、v、vi或vn表示的化合物的組合物給予所述哺乳動(dòng)物。26.—種用于抑制腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡牧柞；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的體內(nèi)方法，所述方法包括(a)將含有本文所述的式I、II、III、IV、V、VI或VII表示的化合物的組合物給予受到細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-j3基因的細(xì)菌引起。27.—種設(shè)計(jì)腺苷?；劝滨０泛铣擅?GS)多肽的基于膦甲酸的磷酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的試驗(yàn)抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助方法，所述方法使用包括處理器和輸入設(shè)備的程序式計(jì)算機(jī)，所述方法包括(a)使用計(jì)算機(jī)輔助方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)抑制劑分子，所述試驗(yàn)抑制劑分子含有類(lèi)似于所述(Mn"MHC(V;h2，ATP復(fù)合物或基于膦甲酸的磷?；D(zhuǎn)移反應(yīng)中間體的所述過(guò)渡態(tài)中間體的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基元；以及(b)使用計(jì)算機(jī)輔助的對(duì)接方案確定所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)抑制劑分子是否抑制基于膦甲酸的磷?；D(zhuǎn)移酶的活性或是否與所述腺苷酰化谷氨酰胺合成酶多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸相互作用。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中與所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸相互作用是通過(guò)活性位點(diǎn)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)氫鍵或范德華相互作用。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括使用能測(cè)量ATP水解、ADP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法來(lái)體外評(píng)價(jià)所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)抑制劑分子對(duì)腺苷?；疓S多肽的抑制活性。30.根據(jù)權(quán)利要求23-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物含有選自化合物97、105、111和117的化合物。31.根據(jù)權(quán)利要求24或25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含有GSI-p基因的細(xì)菌選自白喉棒狀桿菌、淋球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌、傷寒沙門(mén)氏桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、普通變形桿菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、銅綠假單孢菌、糞產(chǎn)堿桿菌、幽門(mén)螺桿菌、流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎博德特菌、腦膜炎奈瑟菌、羊布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、梅毒密螺旋體、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、衣氏放線菌、星形諾卡菌、氧化亞鐵硫桿菌、巴西固氮螺菌、魚(yú)腥藻、Fremydladiplosiphon和天藍(lán)色鏈霉菌。32.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中所述組合物致使哺乳動(dòng)物GSII多肽的活性降低約0-30%。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。34.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中所述組合物致使去腺苷酰化GSI-p多肽的活性降低約0-30%。35.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中所述含有GSI-(3基因的細(xì)菌是結(jié)核分枝桿菌。36.—種如式I<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中:Rl是氫、鹵基、ORs或NR6R7;R2是氫、鹵基或NR7Rs;R3是氫、鹵基或NReR7;R4是SR5、戰(zhàn)117或H;Rs是H、取代的或未取代的C1-C20垸基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或是取代的或未取代的芳基或雜芳基；以及R6、R7和Rs每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；涣u基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)垸基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)垸基、雜芳基或雜環(huán)基；或NR7Rs可以是N-0的形式，其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的化合物，其中116和/或]^7和/或118可以是取代的烷基或環(huán)烷基。38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的化合物，其中Ri是氯。39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的化合物，其中Ri是NR6R7，其中116是H和R7是甲基、芐基、2-羥乙基、4-溴苯基或2-吡啶基。40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的化合物，其中R2是亞硝基、氨基、溴、氨垸基或氨芳基。41.根據(jù)權(quán)利要求36所述的化合物，其中R3是氯、二甲氨基、吡咯垸基、嗎啉基或2-(吡咯烷-l-基)羧酸酯。42.—種如式IIR6表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中Ri是氫、鹵基、OR5或NR6R7;R4是氫、SR5、NR6R7或ORs;115是H，取代的或未取代的C1-C20的垸基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；R6、R7和Rs每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；涣u基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)垸基、雜芳基或雜環(huán)基；或NR7Rs可以是N:0的形式；R9是H、鹵基或取代的或未取代的烷基、芳基、雜環(huán)基、雜芳基、ORs或NR6R7;X和Y可以獨(dú)立地是N或CH;以及其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的化合物，其中Ri是OH或NH2。44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的化合物，其中R4是H、OH或NH2。45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的化合物，其中R9是取代的烷基、烯基、炔基或芳基。46.—種如式III表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中R,是氫、鹵基、OR5或NR6R"R4是氫、SR5、NRsR7或OR5;Rs是H、取代的或未取代的C1-C20烷基、烯基或炔基，其中所述垸基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；R6和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;酰基、羥基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)垸基、芳基或雜芳基；或Re和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)垸基、雜芳基或雜環(huán)基；X、Y可以獨(dú)立地是CH或N;以及其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的化合物，其中&是OH或H。48.—種如式IV<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中Ru是氫或取代的或未取代的Cl-C20垸基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；其中l(wèi)-3個(gè)取代基允許在任何取代的Rn部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、卣基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、0R5、酮基、SH和S03H;以及Ri2是未取代的或取代的烷基或烯基、或未取代的或取代的芳基，其中Ri2取代基可選自NH2、OH、COOH、CHO、NCHO、CONH2、鹵基、OR5、C02Rs禾卩NR6R7，其中Rs是H、取代的或未取代的C1-C20垸基、烯基或炔基，其中所述垸基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；以及R6和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；⒘u基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)垸基、芳基或雜芳基；或Re和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)垸基、雜芳基或雜環(huán)基；以及其中1-3個(gè)取代基允許獨(dú)立地在Rs、R6或R7取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S。3H。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的化合物，其中Ru是烷基或H。50.—種如式V表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中R!是氫、鹵基、OR5或NR6R"Rs是H、取代的或未取代的C1-C20烷基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；R6和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；?、羥基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)垸基、雜芳基或雜環(huán)基；Ri3獨(dú)立地是取代的或未取代的烷基、芳基、雜芳基或環(huán)烷基；Rm是H或NHR^其中R^獨(dú)立地是取代的或未取代的垸基、芳基、雜芳基或環(huán)垸基；X和Y可以獨(dú)立地是N或CH;以及其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的化合物，其中Rn是取代的或未取代的芳基。52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的化合物，其中Rw是取代的或未取代的芳基、烷基或環(huán)垸基。53.—種如式VI表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中Ru是氫或取代的或未取代的Cl-C20烷基、烯基或炔基，其中所述垸基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；其中l(wèi)-3個(gè)取代基允許在任何取代的Ru部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、卣基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、0R5、酮基、SH和S03H;以及Ru是未取代的或取代的垸基或烯基、或未取代的或取代的芳基，其中Ri2取代基可選自NH2、OH、COOH、CHO、NCHO、CONH2、鹵基、OR5、C02RJNR6R7，其中人R5是H、取代的或未取代的C1-C20垸基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基可以是直鏈的、支鏈的、或環(huán)狀的；或取代的或未取代的芳基或雜芳基；以及R6和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;酰基、羥基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)垸基、雜芳基或雜環(huán)基；以及其中l(wèi)-3個(gè)取代基允許獨(dú)立地在R5、R6或R7取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S。3H。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的化合物，其中Ru是取代的或未取代的芳基或烯基。55.—種如式VII<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，其中R6和R7每個(gè)獨(dú)立地選自H;?；⒘u基；以及取代的或未取代的烷基、環(huán)垸基、芳基或雜芳基；或R6和R7可一起形成取代的或未取代的環(huán)垸基、雜芳基或雜環(huán)基；以及R"是H;?；⑷〈幕蛭慈〈耐榛h(huán)烷基、芳基或雜芳基；其中1-3個(gè)取代基允許在任何取代的部分上，其中取代基可獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、鹵基、羧酸酯、酰胺、NR7R8、OR5、酮基、SH和S03H。56.—種藥物組合物，其包括與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合的如式I、II、III、IV、V、VI或VII表示的化合物。57.—種如式I、II、III、IV、V、VI或VII表示的化合物用于治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物的細(xì)菌感染。58.—種如式I、II、III、IV、V、VI或VII表示的化合物在制備用于治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物細(xì)菌感染的藥物中的應(yīng)用。59.—種化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物，所述化合物選自下表中的化合物，其中所述化合物具有所述編號(hào)的化合物的結(jié)構(gòu)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>60.—種藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求59的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。61.根據(jù)權(quán)利要求59的化合物在制備用于治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物細(xì)菌感染的藥物中的應(yīng)用。62.—種根據(jù)權(quán)利要求59的化合物用于治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物的細(xì)菌感染。63.—種用于抑制腺苷酰化GS多肽的磷?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的體外方法，所述方法包括使腺苷酰化GS多肽與含有根據(jù)權(quán)利要求59的化合物的組合物接觸。64.—種用于抑制含有GSI-|3基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的體外方法，所述方法包括使所述細(xì)菌與含有根據(jù)權(quán)利要求59的化合物的組合物接觸。65.—種用于治療、預(yù)防或改善與哺乳動(dòng)物細(xì)菌感染有關(guān)的一種或多種癥狀或障礙的方法，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-P基因的細(xì)菌引起，所述方法包括將含有根據(jù)權(quán)利要求59的化合物的組合物給予所述哺乳動(dòng)物。66.—種用于抑制腺苷?；劝滨０泛铣擅付嚯牡牧柞；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)活性的體內(nèi)方法，所述方法包括(a)將含有根據(jù)權(quán)利要求59的化合物的組合物給予受到細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物，其中所述細(xì)菌感染由含有GSI-(3基因的細(xì)菌引起。全文摘要本發(fā)明提供一種篩選和設(shè)計(jì)作為谷氨酰胺合成酶抑制劑的化合物的方法，所述谷氨酰胺合成酶包括腺苷?；劝滨０泛铣擅?。本發(fā)明還提供用于治療、預(yù)防和/或改善細(xì)菌感染的化合物和組合物，所述細(xì)菌包括結(jié)核分枝桿菌。文檔編號(hào)G01N33/68GK101438288SQ200680054592公開(kāi)日2009年5月20日申請(qǐng)日期2006年3月15日優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日發(fā)明者克里斯托弗·約翰·帕金森,克里斯蒂安·韋南德·范德-韋斯特許仁,林登·凱里·奧德菲爾德,科林·彼得·凱尼恩,阿曼達(dá)·路易絲·魯索申請(qǐng)人:Csir公司