專利名稱：用于消除丙肝病毒的吸附劑、吸附器和吸附方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于去除丙肝病毒的吸附劑，它能夠選擇性地吸附例如血液、血漿等體液中的丙肝病毒，加速丙肝患者的痊愈。本發(fā)明還涉及包含上述吸附劑的吸附設(shè)備，以及去除丙肝病毒的吸附方法。
現(xiàn)有技術(shù)1989年人們成功地克隆了丙肝病毒的RNA病毒基因組(Q.L.Choo等Science，244，359，1989)，用重組蛋白來(lái)檢驗(yàn)抗丙肝病毒的抗體由此成為可能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以往被認(rèn)為非甲非乙肝炎中大多數(shù)是丙肝。由此估計(jì)，日本目前有約2,000,000HCV攜帶者，其中1,400,000患有慢性肝炎，300,000患有肝硬化(ShiroIinoMedical Practice in Gastroenterology-2，Hepatitis C，11-17，1993)。
根據(jù)衛(wèi)生和公眾福利部的人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，1992年原發(fā)性肝癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)是27,000(1992年人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，衛(wèi)生和福利部統(tǒng)計(jì)信息局，卷1，1993)，其中約70％死于與丙肝病毒感染相關(guān)的肝細(xì)胞癌，目前認(rèn)為，這種癌發(fā)生于慢性肝炎發(fā)展為肝硬化之后(S.Kaneko等，Intervirology，37108，1994；Eiki Matsushita等Japanese Journal of Clinics，53727，1995 Special Issue)。所以，可以說(shuō)丙肝是一種難以治愈的疾病，會(huì)發(fā)展成肝硬化再發(fā)展為肝癌。
治療丙肝的常規(guī)方法主要是圍繞休息、飲食控制和使用護(hù)肝藥和/或中藥的藥物治療。但是，由于這些療法都不能消除丙肝病毒，所以治愈率極低。這就是為什么臨床上將重點(diǎn)放在通過(guò)緩解局部組織壞死來(lái)阻止慢性肝病的發(fā)展。所以，隨著病程的拖延，如前所述，許多患者死于肝硬化的嚴(yán)重后果即肝細(xì)胞癌。
同時(shí)，最近已經(jīng)能夠大量生產(chǎn)干擾素，而且發(fā)現(xiàn)，這些蛋白不僅具有抗丙肝病毒活性和能夠在體外識(shí)別RNA病毒(Yasuyuki Ninomiya等The ClinicalReport，19，231，1985)而且對(duì)小鼠受RNA病毒感染具有保護(hù)活性(M.Kramer等J.Interferon Res.，3425，1983)。所以，干擾素在丙肝臨床治療中的應(yīng)用變成了關(guān)注的焦點(diǎn)。
實(shí)際上，接受重組α干擾素治療的有些非甲非乙肝炎病例(J.H.Hoofnagel等N.Eng.J.Med.，3151575，1986)和部分接受干擾素治療的丙肝病例的血清轉(zhuǎn)胺酶變得正常，有些病例對(duì)血液中的丙肝病毒RNA持續(xù)陰性(K.Chayama等Hepatology，13，1040，1991；Hideki Ogiwara等Japanese Journal of Gastroentology，88，1420，1991)。根據(jù)以上結(jié)果，干擾素開始被廣泛用于臨床。所以，丙肝治療獲得了從對(duì)癥治療向病因治療這一決定性的進(jìn)步。
但是，過(guò)去數(shù)年中在日本用于擾素治療的約200,000例丙型慢性活性肝炎中，病毒消除并獲得痊愈的只有約30％，而在其余的70％病例中，病毒仍然存活，或者證明治療無(wú)效，或者發(fā)生復(fù)發(fā)(Migito YanoJapanese Journal of Clinics，53986，1995 Special Issue)。
決定治療是否成功，丙肝病毒的基因類型、血液中的病毒數(shù)量和肝病的所處階段是重要因素，但是血液病毒數(shù)量是所有因素中最重要的。例如，當(dāng)1ml患者血液中的病毒數(shù)量少于1,000,000拷貝時(shí)，約80％這樣的病例可以通過(guò)使用干擾素來(lái)消除體內(nèi)病毒并獲得痊愈，但是當(dāng)病毒數(shù)量超過(guò)1,000,000拷貝時(shí)，治愈率僅為約9％(Fumio Imazeki等，Japanese Journal of Clinics，53，1017，1995)。
除了上述病毒數(shù)量外，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，病毒顆粒在血液中的存在方式也是一個(gè)影響干擾素治療效果的重要因素。已經(jīng)有報(bào)道稱，血液中的丙肝病毒顆?？梢愿鶕?jù)其在血液中的懸浮密度分為高感染性低密度顆粒和低感染性高密度顆粒。所以，發(fā)明人對(duì)不同密度的病毒顆粒與疾病嚴(yán)重程度和干擾素療法之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)，雖然干擾素治療在低密度病毒顆粒比高密度病毒顆粒之比為10∶1的患者中有75％的治愈率，但是在該比為1∶10的患者中，治愈率僅為13％。
還發(fā)現(xiàn)，在血液中，低密度病毒顆粒與脂蛋白結(jié)合而高密度病毒顆粒與免疫球蛋白結(jié)合而以免疫復(fù)合物的形式存在(Akihito Skai等Japanese Journal ofGastroenterology，92(Special Issue)，1488，1995)。
所以，顯然，目前干擾素治療的缺點(diǎn)在于血液中病毒數(shù)量或免疫復(fù)合病毒數(shù)量越低，治療反應(yīng)就越高，相反，血液中病毒數(shù)量或免疫復(fù)合病毒數(shù)量越高，則治療反應(yīng)就越低。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于提供一種用于清除丙肝病毒的吸附劑，它能夠安全、高效和高選擇性地吸附患者體液中的丙肝病毒顆粒，尤其是免疫復(fù)合型丙肝病毒顆粒，由此加強(qiáng)干擾素療法的效果；還提供一種包含所述吸附劑的丙肝病毒吸附設(shè)備，和清除丙肝病毒的吸附方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人努力尋找這樣一種化合物，這種化合物固定于水不溶性載體上與患者血液接觸時(shí)必須表現(xiàn)出對(duì)丙肝病毒的高吸附親和性，但是對(duì)白蛋白之類蛋白質(zhì)則沒有所述親和性。結(jié)果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，能夠吸附丙肝病毒尤其是對(duì)免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物具有結(jié)合親和性的化合物固定于水不溶性載體上構(gòu)成的吸附劑表現(xiàn)出極高的丙肝病毒吸附性能。本發(fā)明就是基于這一發(fā)現(xiàn)形成的。
所以，本發(fā)明涉及用于清除丙肝病毒的吸附劑，它包括固定在水不溶性載體上能夠吸附丙肝病毒的化合物。


圖1顯示用各種水不溶性載體充填的玻璃柱的流速與壓降之間的關(guān)系?？v坐標(biāo)表示流速(cm/min.)，橫坐標(biāo)表示壓降(kg/cm2)；圖2是本發(fā)明丙肝病毒吸附設(shè)備的剖面圖；圖3顯示的是pUCNTMK3P47載體。
數(shù)字符號(hào)表示1.出口2.入口3.吸附劑4、5.防止吸附劑滲漏的裝置6.柱7.設(shè)備發(fā)明詳述以下是對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明用于清除丙肝病毒的吸附劑包含水不溶性載體和固定于其上能夠吸附丙肝病毒的化合物。
對(duì)于能夠吸附HCV的化合物沒有特殊的限定，只要它吸附丙肝病毒，但是優(yōu)選的化合物具有對(duì)免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物的結(jié)合親和性。
在能夠吸附與免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物偶聯(lián)的丙肝病毒的化合物中，優(yōu)選的是這樣的化合物與丙肝病毒顆粒相比，它優(yōu)先并且有效地吸附與免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物偶聯(lián)的丙肝病毒。
更好的是，上述具有對(duì)免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物結(jié)合親和性的化合物是免疫球蛋白結(jié)合蛋白。
這種免疫球蛋白結(jié)合蛋白包括但不限于蛋白A、蛋白G、蛋白H、蛋白L、蛋白M、類風(fēng)濕因子和補(bǔ)體。
更好的是，具有對(duì)免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物結(jié)合親和性的化合物是抗免疫球蛋白抗體。
更好的是，上述能夠吸附丙肝病毒的化合物是所述免疫球蛋白結(jié)合蛋白和/或抗免疫球蛋白抗體的組成部分，即具有免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)的蛋白片段或肽，或者是所述蛋白片段或肽的衍生物。
至于水不溶性載體，較好的例子是多孔性載體。
更好的是，平均孔徑為10至1500nm的多孔性水不溶性載體。
水不溶性載體的另一種較好形式是基本無(wú)孔的載體。而且，水不溶性載體最好是親水性的。
本發(fā)明用于清除丙肝病毒的吸附劑可以用于從包括血液和血漿在內(nèi)的體液中清除丙肝病毒。
用于清除丙肝病毒的吸附劑還可以用于從包括血液和血漿在內(nèi)的體液中清除免疫復(fù)合物形式的丙肝病毒。
本發(fā)明用于清除丙肝病毒的吸附設(shè)備包括一個(gè)容器，該容器具有入口和出口供液體進(jìn)出并裝有上述吸附劑中的任意一種，還包括防止丙肝病毒吸附劑從容器中滲漏的裝置。
清除丙肝病毒的吸附方法包括上述吸附劑與含丙肝病毒體液接觸的步驟。
本發(fā)明清除HCV方法中使用的含HCV體液包括血液和血漿，以及其它體液。
以下說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是本發(fā)明的范圍不局限于這些具體的實(shí)施方式。
本發(fā)明使用的吸附丙肝病毒的化合物是能夠吸附大部分丙肝病毒的化合物，所以在種類上沒有限制。但較好的是特異性結(jié)合免疫球蛋白重鏈或輕鏈和/或免疫球蛋白復(fù)合物的物質(zhì)。
上述能夠結(jié)合免疫球蛋白重鏈或輕鏈和/或免疫復(fù)合物的物質(zhì)具體包括一般稱為免疫球蛋白結(jié)合蛋白的化合物和抗免疫球蛋白抗體，前者例如能夠結(jié)合免疫球蛋白G重鏈中的Fc結(jié)構(gòu)域的蛋白A、蛋白G、蛋白H、蛋白M、類風(fēng)濕因子和補(bǔ)體，以及具有輕鏈結(jié)合特異性的蛋白L(L.BjorckJ.Immunol.140，1194，1988；H.Gomi等J.Immunol.，144，4046，1990；Hisayuki DoiMenekiRinsho(Clinical Immunology)23，896，1991)。
本文還可能提到上述物質(zhì)的片段，它們對(duì)免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物有著實(shí)質(zhì)性的結(jié)合親和性，例如對(duì)應(yīng)于蛋白A中從A至E結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)-的58個(gè)殘基的肽(M.Uhlen等，J.Biol，Chem.，2591965，1984)，F(xiàn)B29肽-蛋白A中B結(jié)構(gòu)域的進(jìn)一步節(jié)略形式(J.S.Huston等Biophysical J.，6287，1992)，對(duì)應(yīng)于蛋白G中C1至C3結(jié)構(gòu)域的55個(gè)殘基的肽(B.Guss等EMBO J.，5，1567，1986)，蛋白H的A結(jié)構(gòu)域肽(H.Gomi等ibid)，蛋白L的B1至B5結(jié)構(gòu)域肽(Bjorck，Laruth等，日本專利公開平成-7-506573)和補(bǔ)體Clq的CBP2肽(M.A.Baumann等J.Biol.Chem.，265，18414(1990))，和所謂免疫球蛋白結(jié)合蛋白的其它免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域肽，以及它們的衍生物。
而且，類風(fēng)濕因子或抗免疫球蛋白抗體的Fab和F(ab)2片段、單鏈Fv多肽等也可以作為代表性實(shí)施例。
對(duì)可以用于本發(fā)明的水不溶性載體沒有特殊的限定，包括玻璃珠和硅膠等無(wú)機(jī)載體，合成的聚合物如交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚丙烯酸酯、交聯(lián)聚丙烯酰胺、交聯(lián)聚苯乙烯等有機(jī)載體，和晶體纖維素、交聯(lián)纖維素、交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖等聚多糖，以及由上述材料構(gòu)成的有機(jī)-有機(jī)或有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合載體。
特別優(yōu)選的是親水性載體，因?yàn)檫@類載體的特征在于非特異性吸附量較小而對(duì)丙肝病毒的特異性吸附量很高。“親水性載體”表示組成載體的化合物在被制成平片層形式時(shí)，其水接觸角不超過(guò)60度。
對(duì)載體的種類沒有特殊限定，包括用以下材料制成的載體纖維素、幾丁質(zhì)、瓊脂糖、葡聚糖等聚多糖，聚乙烯醇，皂化的乙烯乙酸乙烯酯聚合物，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚丙烯酸-聚乙烯合體，聚丙烯酰胺-聚乙烯合體，玻璃等。
尤其是，含有OH基團(tuán)的載體具有更好的吸附能力和選擇性。而且，多孔纖維素凝膠具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)至(4)，就實(shí)施本發(fā)明所用的水不溶性載體而言是最優(yōu)選的載體之一。
(1)由于機(jī)械強(qiáng)度和硬度較高，該凝膠不易因攪拌等作用而崩解成粉塵樣的細(xì)小顆粒，充入柱內(nèi)時(shí)，即使體液高速流過(guò)柱床，它也不會(huì)嚴(yán)重壓縮或堵塞。而且，由于其多孔結(jié)構(gòu)，即使高壓滅菌時(shí)也不易形變。
(2)由于是用纖維素制成，該凝膠是親水性的，具有大量結(jié)合配體的羥基，而非特異性吸附低。
(3)即使提高空隙率仍能保持較高的強(qiáng)度，因而其吸附能力可以如軟凝膠一樣大。
(4)與合成聚合物凝膠或其它凝膠相比，該凝膠的安全性更高。
上述水不溶性載體可以各個(gè)單獨(dú)使用，也可以兩種或兩種以上適當(dāng)混合使用。
考慮到它作為丙肝病毒吸附劑的用途和使用方式，本發(fā)明使用的水不溶性載體宜具有較大的表面積，就此而言，最好是具有大量孔隙即多孔性的載體。
所述多孔性水不溶性載體的平均孔徑宜為10至1500nm。丙肝病毒的粒徑為50至55nm，為了多孔性載體能夠有效吸附這些病毒顆粒，載體的孔徑分布宜大大偏向于大于病毒粒徑的范圍。如果孔徑太大，將有損載體的強(qiáng)度并降低表面積。較好的平均孔徑是50至1250nm。
另一方面，即使是基本上無(wú)孔的載體也能夠吸附病毒。這種載體可利用的優(yōu)點(diǎn)在于體液(血液、血漿、血清等)中對(duì)機(jī)體有用的蛋白和其它組份幾乎不吸附于基本無(wú)孔的載體。
“基本上無(wú)孔”在本說(shuō)明書中包括孔很小(例如小于10nm)的有孔載體。
另外，有關(guān)所述水不溶性載體的孔隙結(jié)構(gòu)，就單位體積吸附劑的吸附能力而言，孔隙最好不局限于表面而是在載體內(nèi)通體分布，而且載體的空隙率不宜低于20％，比表面積不宜低于3m2/g。
對(duì)所述水不溶性載體的形狀沒有特別的限定，包括珠狀、纖維狀(包括中空纖維)和薄膜狀，以及其它。從體液在體外循環(huán)中流體動(dòng)力學(xué)的觀點(diǎn)出發(fā)，宜采用的是珠狀載體。就所述珠狀載體的平均粒徑而言，便于使用的是10至2500μm的微珠。但是，以采用25至800μm的微珠為佳。
帶有將配體固定在水不溶性載體表面的官能團(tuán)將有利于固定化。
這類官能團(tuán)的代表性例子包括羥基、氨基、醛基、羧基、硫醇、硅烷醇、酰氨基、環(huán)氧基、琥珀酰氨基、酸酐、以及其它官能團(tuán)。
上述水不溶性載體既可以是硬凝膠也可以是軟凝膠。對(duì)用作體外循環(huán)治療的吸附劑而言，重要的是在充入柱內(nèi)時(shí)一定不能發(fā)生堵塞阻礙體液通過(guò)-即孔隙的堵塞。所以，為了確保足夠的機(jī)械強(qiáng)度，水不溶性載體以硬凝膠為宜。
在本發(fā)明中，硬載體即這樣的載體當(dāng)例如珠狀的凝膠在下述條件下均勻充入玻璃圓柱(直徑9mm，長(zhǎng)150mm)時(shí)，水相液體能夠通過(guò)充填柱，壓降(ΔP)和0.3kg/cm2以上流速之間存在線性關(guān)系。
例如，在一玻璃圓柱(直徑9mm，長(zhǎng)150mm)的兩端裝配孔徑15μm的濾器，柱中均勻地充填以瓊脂糖凝膠(Bio-Rad，Biogel-A5m，粒徑50至100目)，乙烯聚合物凝膠(Toyo Soda，Toyopearl HW-65，粒徑50-1000μm)或纖維素凝膠(ChissoCorporation，Cellulofine GC-700m，粒徑45-105μm)，利用蠕動(dòng)泵將水引入柱中，制作流速和壓降(ΔP)之間的關(guān)系圖(圖1)。
縱坐標(biāo)為流速(cm/min)，橫坐標(biāo)為壓降(kg/cm2)。圖1中，○代表ToyopearlHW-65，Δ代表Cellulofine GC-700m，●代表Biogel-A5m。
結(jié)果，如果用Toyopearl HW-65和Cellulofine GC-700m，流速升高與壓力增加幾乎成正比，Biogel-A5m因?yàn)榘l(fā)生壓縮所以提高壓力不能加快流速。
在根據(jù)本發(fā)明將免疫球蛋白結(jié)合蛋白或肽固定到水不溶性載體上時(shí)，為了降低蛋白質(zhì)或肽的位阻以改善吸附效率并抑制非特異性吸附，最好通過(guò)有關(guān)親水性臂來(lái)固定。
較好的親水性臂有例如聚氧化亞烴，它是聚亞烴鏈被例如羧基、氨基、醛或環(huán)氧基等取代基在其一個(gè)末端修飾而得的衍生物。
欲固定在所述水不溶性載體上的對(duì)免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物具有結(jié)合親和性的化合物與作為臂的有機(jī)化合物可以用合適的技術(shù)來(lái)固定。這類技術(shù)包括用于將蛋白質(zhì)和肽固定在載體上的常規(guī)技術(shù)，例如利用環(huán)氧反應(yīng)、Nic堿反應(yīng)的方法，利用碳化二亞胺試劑、活潑酯反應(yīng)的縮合反應(yīng)，和利用戊二醛試劑的載體交聯(lián)反應(yīng)。
考慮到本發(fā)明用于清除丙肝病毒的吸附劑主要用于體外循環(huán)療法和清血法，使用的固定方法最好能確保在滅菌和在所述治療過(guò)程中，蛋白質(zhì)等不易從水不溶性載體中釋放出來(lái)。例如，可用以下方法。
(1)載體的羧基與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，取代出一個(gè)琥珀酰亞氨基氧基羰基，使它與蛋白質(zhì)或肽的氨基反應(yīng)(活潑酯法)。
(2)在例如二環(huán)己基碳化二亞胺之類縮合劑存在下，載體的氨基或羧基與蛋白質(zhì)或肽的羧基或氨基發(fā)生縮合反應(yīng)。(縮合法)(3)利用雙官能團(tuán)或多官能團(tuán)化合物-例如戊二醛交聯(lián)發(fā)生蛋白質(zhì)或肽的交聯(lián)(載體交聯(lián)法)。
為了抑制蛋白質(zhì)從載體上釋放和洗脫，最好是通過(guò)共價(jià)鍵來(lái)固定。
帶有能夠吸附丙肝病毒的化合物的載體與例如血液、血漿或血清之類體液接觸，由此從體液中清除丙肝病毒的吸附方法有多種實(shí)施形式。具體地說(shuō)，有以下幾種。
(1)抽取患者體液，收集在儲(chǔ)血袋之類容器中，將吸附劑與體液混合以清除丙肝病毒，濾去吸附劑，將基本上無(wú)丙肝病毒的體液輸回給患者。
(2)提供一個(gè)具有入口和出口的容器，并配以體液可透過(guò)而吸附劑不可透過(guò)的濾器，用吸附劑充填容器，令體液流經(jīng)充填的吸附劑。
雖然兩種方法均可選用，但是方法(2)更便捷。而且，所述的容器或柱被裝配入體外循環(huán)管路中時(shí)，能夠有效而且直接從患者體液中清除丙肝病毒。本發(fā)明用于清除丙肝病毒的吸附劑適用于后一種方法。
以下將結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明包含本發(fā)明清除丙肝病毒的吸附劑的丙肝病毒吸附設(shè)備。
參照?qǐng)D2，設(shè)備7具有液體入口或出口1，液體出口或入口2，本發(fā)明的丙肝病毒吸附劑3，用于防止吸附劑滲漏的裝置4和5，體液及其中成份能夠順利通過(guò)所述裝置而吸附劑則不能，以及柱體6。
對(duì)于設(shè)備的幾何形狀和材料沒有特殊限定。但是，最好使用容量約20至400ml，直徑約2-10cm的圓柱形設(shè)備。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明了本發(fā)明，但是并不是對(duì)其范圍的限定。在本說(shuō)明書中，用以下縮寫代表各種氨基酸殘基AlaL-丙氨酸殘基，AspL-天冬氨酸殘基，AsnL-天冬酰胺殘基，CysL-半胱氨酸殘基，GlnL-谷氨酰胺殘基，GluL-谷氨酸殘基，GlyL-甘氨酸殘基，IleL-異亮氨酸殘基，LeuL-亮氨酸殘基，LysL-賴氨酸殘基，PheL-苯丙氨酸殘基，ThrL-蘇氨酸殘基，TrpL-色氨酸殘基，TyrL-酪氨酸殘基，ValL-纈氨酸殘基。
本說(shuō)明書中，按照常規(guī)方式來(lái)描述肽的氨基酸序列，假設(shè)其氨基端(后文稱N末端)在左，羧基端(后文稱C末端)在右。實(shí)施例1將IgG結(jié)合蛋白(蛋白A)固定到多孔性載體(GCL 2000m)上環(huán)氧活化纖維素凝膠用水將90ml纖維素多孔性硬凝膠(Chisso Corporation，球蛋白截留分子量3×106)定容成180ml，然后加入60ml 2M氫氧化鈉，調(diào)節(jié)凝膠溫度至40℃。在凝膠中加入21ml表氯醇，環(huán)氧化反應(yīng)在40℃進(jìn)行1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用水徹底洗滌凝膠，得到環(huán)氧活化的纖維素凝膠。蛋白A的固定化將4mg蛋白A(Sigma)溶于0.5ml 0.05M硼酸鹽緩沖液(pH10.0)中，加入0.01N的NaOH/水，將pH調(diào)節(jié)至10，并將總體積調(diào)至1.0ml(蛋白A溶液)。將該蛋白溶液(總體積)加入1ml上述環(huán)氧活化纖維素凝膠中，混合物在37℃振搖16小時(shí)，用足量的PBS(10mM磷酸鹽緩沖液，其中補(bǔ)充了150mM的氯化鈉)洗滌后得到GCL 2000m-蛋白A。定量測(cè)定固定化蛋白量在固定化反應(yīng)之前和之后采用HPLC測(cè)定反應(yīng)混合物中蛋白A的濃度，并計(jì)算反應(yīng)速度來(lái)得出固定化的量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每ml蛋白A-GCL 2000m上固定有2.1mg蛋白A。實(shí)施例2將IgG結(jié)合蛋白(蛋白G)固定到多孔性載體(GCL 2000m)上用蛋白G(Pharmacia LKB)代替蛋白A，重復(fù)實(shí)施例1的過(guò)程，得到GCL2000m-蛋白G(3.2mg/ml)。實(shí)施例3將蛋白G的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域固定到多孔性載體(Sepharose 6B)上肽的合成使用4170型肽合成儀(Pharmacia LKB)，用固相法合成一段肽，它具有G蛋白C3結(jié)構(gòu)域的57個(gè)氨基酸殘基序列，并在N末端加有一個(gè)半胱氨酸。
利用0.1mmol帶有C末端谷胺酰胺的樹脂F(xiàn)moc-谷胺酰胺NovaSyn KA朝N末端方向不斷重復(fù)去保護(hù)和縮合反應(yīng)，使得肽鏈根據(jù)輸入上述肽合成儀中的程序來(lái)延伸。
這樣，重復(fù)以下循環(huán)用哌啶去除氨基酸的α-氨基保護(hù)基即9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)，用二甲基甲酰胺(DMF)洗滌，用四氟硼酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基鎓和二異丙基乙胺進(jìn)行縮合反應(yīng)，然后用DMF洗滌。
氨基酸以以下形式使用Fmoc-L-Ala，F(xiàn)moc-L-Asn(Trt)，F(xiàn)moc-L-Asp(OtBu)，F(xiàn)moc-L-Cys(Trt)，F(xiàn)moc-L-Gln(Trt)，F(xiàn)moc-L-Glu(OtBu)，F(xiàn)moc-L-Gly，F(xiàn)moc-L-Ile，F(xiàn)moc-L-Leu，F(xiàn)moc-L-Lys(Boc)，F(xiàn)moc-L-Phe，F(xiàn)moc-L-Thr(tBu)，F(xiàn)moc-L-Trp，F(xiàn)moc-L-Tyr和Fmoc-L-Val，根據(jù)試管中的底物，氨基酸各自的用量為5摩爾當(dāng)量(0.5mmol)。這里，Trt、OtBu、Boc和tBu分別代表三苯甲游基、四丁基酯、四丁基氧羰基和四丁基。肽鏈的去保護(hù)和剪切在完成了所有氨基酸的反應(yīng)后，在3G-3有孔玻璃濾器上順次用四戊基醇、乙酸和乙醚洗滌載體，然后真空干燥得到干的載體。在瓶?jī)?nèi)1g的所得載體中加入20ml三氟乙酸(TFA)，260μl 1，2-乙二醇和780μl茴香醚，室溫下拌混合物1.5小時(shí)。
然后，混合物濾過(guò)3G-3有孔玻璃濾器以去除載體，35℃減壓濃縮濾液。在殘留物中加入事先冷卻的無(wú)水乙醚，直至攪拌下不再產(chǎn)生沉淀，然后離心，回收粗肽顆粒。分幾次用無(wú)水乙醚洗滌粗肽，真空干燥得到目標(biāo)粗肽。肽的純化將上述粗肽溶于0.1％TFA中，濾過(guò)0.2μm的濾膜，對(duì)濾液進(jìn)行高效液相層析。在該HPLC中，反向使用LC-10A模式系統(tǒng)(Shimadzu)和作為層析柱的μBondasphere C18(Nippon Millipore-Waters)。作為移動(dòng)相，以0.1％TFA/H2O作為溶劑A，以0.1％TFA-80％(v/v)乙腈/H2O作為溶劑B，利用由溶劑A向溶劑B的線性梯度進(jìn)行洗脫。
收集對(duì)應(yīng)于層析峰的流份。重復(fù)幾次流份洗脫，冷凍干燥匯集的流份，得到純化肽。用氣相蛋白質(zhì)測(cè)序儀477(Applied Biosystem)和Hitachi Custom離子交換樹脂對(duì)該肽進(jìn)行的氨基酸分析證實(shí)所得肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。肽的固定化如下，將上述肽固定在多孔性Sepharose上制成吸附劑。作為Sepharose，可使用硫代丙基-Sepharose 6B(Pharmacia LKB)。在50g硫代丙基-Sepharose6B中加入50ml蒸餾水，混合物在室溫下靜置15分鐘讓樹脂膨脹。然后，去除蒸餾水代之以0.5M NaCl-0.1M Tris-HCl(pH7.5)偶聯(lián)緩沖液。
另一方面，將4mg上述純化肽溶于400μl 0.5M NaCl-0.1M Tris-HCl(pH7.5)偶聯(lián)緩沖液。將上述膨脹硫代丙基-Sepharose6B加入該溶液，混合物在4℃攪拌12小時(shí)，由此得到帶有純化肽的吸附劑。
抽濾得到這種帶肽的吸附劑，利用絕對(duì)校準(zhǔn)曲線法經(jīng)HPLC測(cè)定濾液中的肽含量，由此得出肽的固定化比率。用150mM NaCl-10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗滌帶肽的吸附劑，并抽濾回收Sepharose6B-C3Ppt，其中每ml載體帶有3.6mg肽。實(shí)施例4將IgG結(jié)合肽(MK3P47)固定到多孔性載體(Kac)上MK3P47肽的生產(chǎn)設(shè)計(jì)并合成編碼氨基酸序列為SEQ ID NO2的MK3P47肽的DNA，使得它能夠通過(guò)5’端的NdeI限制性酶切位點(diǎn)和3’端的HindIII限制性酶切位點(diǎn)與pUCNT載體(日本專利公開平成-4-212692)連接。該合成DNA的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO3中。
根據(jù)Takara Shuzo的DNA連接試劑盒第2版中的說(shuō)明書，將具有上述序列的DNA與經(jīng)限制性酶NdeI和HindIII(Takara Shuzo)剪切的pUCNT載體連接，構(gòu)建pUCNTMK3P47載體(圖3)。
然后，利用已知技術(shù)將pUCNTMK3P47載體DNA亞克隆到大腸桿菌HB101(Irivitrogen)中，并挑選出對(duì)作為指示物的青霉素有抗性的一個(gè)轉(zhuǎn)化體。
抽提該轉(zhuǎn)化體中的DNA并利用常規(guī)方法測(cè)序來(lái)證實(shí)它的DNA序列符合pUCNTMK3P47載體的原設(shè)計(jì)。
然后，該轉(zhuǎn)化體在6L L-肉湯培養(yǎng)基(5g/l NaCl，10g/l細(xì)菌胰蛋白酶，5g/l酵母提取物)中37℃振蕩培育20小時(shí)，然后離心回收(Hitachi RPR9-2轉(zhuǎn)頭，4℃，6000rpm×20min)細(xì)胞。
將獲得的沉積物以300ml TE緩沖液(20ml Tris-HCl，1mM EDTA·pH7.5)重懸，超聲波處理(BRANSON 250，冰浴中，6分鐘，3次)，離心(Hitachi RPR16轉(zhuǎn)頭，4℃，1500rpm×20min)，回收上清液。
上述上清液在70℃加熱10分鐘，然后再離心(Hitachi RPR16轉(zhuǎn)頭，4℃，15000rpm×20min)，得到300ml上清液。如下所示從該上清液中分離目標(biāo)MK3P47肽。采用高效液相層析(層析柱Waters的μBONDASPHERE 5μ C18 300A，19.0×150mm)，40ml乙腈以5ml/min的流速通過(guò)以活化層析柱，然后以相同的流速通過(guò)300ml樣品。層析柱用200ml 0.1％TFA+64％乙腈洗滌，然后用200ml0.1％TFA+40％乙腈洗脫目標(biāo)MK3P47肽。
在蒸發(fā)器上將該流份濃縮至100ml，冷凍干燥成1.2g高純度肽樣品。環(huán)氧活化纖維素凝膠取本申請(qǐng)人制備的球蛋白截留分子量大于5×106的原型纖維素多孔硬凝膠Kac 90ml，用水配制成180ml。然后，加入60ml 2M的氫氧化鈉，將凝膠的溫度升高到40℃。在該凝膠中加入表氯醇，反應(yīng)在40℃攪拌進(jìn)行1小時(shí)。反應(yīng)完全后，用水徹底洗滌凝膠，得到環(huán)氧活化的纖維素凝膠。MK3P47肽的固定和固定化蛋白量的測(cè)定用50mg MK3P47代替4mg蛋白A，用環(huán)氧活化的Kac代替環(huán)氧活化的GCL-2000m，重復(fù)實(shí)施例1的過(guò)程，得到Kac-MK3P47(30mg/ml)。實(shí)施例5將IgG結(jié)合肽(MP47C)固定到多孔性載體(Sephacryl S1000)上制備具有氨基酸序列SEQ ID NO4的肽MP47C。
設(shè)計(jì)并合成一段具有核苷酸序列SEQ ID NO5的DNA(編碼MP47C)，使得它能夠如實(shí)施例4所述與pUCNT載體連接。
利用實(shí)施例4中的過(guò)程，將上述DNA與pUCNT載體連接，制備得到pUCNTMP47C載體。
然后，利用實(shí)施例4中的方法，構(gòu)建大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并從其6升培養(yǎng)物中獲得1.3g高純度的目標(biāo)肽樣品，將其用于各種研究。環(huán)氧活化Sephacryl凝膠用水將90ml纖維素多孔性硬凝膠Sephacryl S1000(孔徑400nm)(PharmaciaKLB)配制成180ml。然后加入60ml 2M氫氧化鈉，將凝膠溫度升至40℃。在該凝膠中加入21ml表氯醇，在40℃攪拌反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完全后，用水徹底洗滌凝膠，得到環(huán)氧活化的Sephacryl凝膠。MP47C的固定和固定化蛋白量的測(cè)定用10mg MP47C代替4mg蛋白A，用環(huán)氧活化的Sephacryl凝膠代替環(huán)氧活化的GCL-2000m，重復(fù)實(shí)施例1的過(guò)程，得到S1000-MP47C(7mg/ml)。實(shí)施例6將IgG結(jié)合肽(MP47C)固定到基本上無(wú)孔的載體(Bac)上環(huán)氧活化纖維素凝膠用水將90ml球蛋白截留分子量小于3×104的原型纖維素硬凝膠無(wú)孔載體(Bac)配制成180ml。然后，加入60ml 2M氫氧化鈉，將凝膠升溫至40℃，在該凝膠中加入21ml表氯醇，40℃攪拌反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完全后，用水徹底洗滌凝膠，得到環(huán)氧活化的纖維素凝膠。MP47C的固定和固定化蛋白量的測(cè)定用30mg MP47C代替4mg蛋白A，用環(huán)氧活化的Bac代替環(huán)氧活化的GCL-2000m，重復(fù)實(shí)施例1中的固定化過(guò)程，得到Bac-MP47C(20mg/ml)。
實(shí)施例7
將抗IgG抗體的Fab片段固定到多孔性載體(CNBr活化的Sepharose 6B)上用少量1mM HCl/H2O讓4g CNBr活化的Sepharose 6B(Pharmacia LKB)膨脹15分鐘，依次用1mM HCl/H2O和偶聯(lián)緩沖液(pH8.3，0.5M NaCl，0.1M NaHCO3)洗滌。
將木瓜蛋白酶消化得到的1mg抗人IgG抗體(Binding Site Co.)的Fab(PIECE，免疫純Fab制備試劑盒)溶解在1ml偶聯(lián)緩沖液中。在溶液中加入上述洗滌后的凝膠，4℃反應(yīng)16小時(shí)。
用偶聯(lián)緩沖液洗滌反應(yīng)混合物后，加入封閉緩沖液(pH8.3，0.2M甘氨酸，0.5M NaCl，0.1M NaCHO3)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。
反應(yīng)產(chǎn)物用兩種后處理緩沖液(pH4.0，0.5M NaCl，0.1M乙酸-乙酸鈉緩沖液，和pH8.0，0.5M NaCl 0.1M Tris-HCl緩沖液)交替各洗滌3次，得到Sepharose4B-抗IgG Fab。實(shí)施例8將抗IgG抗體固定到多孔性載體(tresyl Toyopearl)上將1mg抗人IgG(Fc)抗體(Binding Site Co.)溶于1ml偶聯(lián)緩沖液(0.5M NaCl，0.1M碳酸鈉緩沖液)中，然后加入200mg無(wú)水AF-tresyl-Toyopearl 650。在4℃反應(yīng)通宵。
用0.5M NaCl/水洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，然后加入封閉緩沖液(pH8.0，0.5M NaCl，0.1M Tris-HCl緩沖液)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。
反應(yīng)混合物再用0.5M NaCl/水洗滌后得到Toyopearl-抗IgG。實(shí)施例9評(píng)價(jià)合成吸附劑的丙肝病毒吸附性能吸附實(shí)驗(yàn)各種吸附劑取100μl加入小瓶中，加入100μl含有丙肝病毒的患者血清，混合物在37℃振搖2小時(shí)。吸附丙肝病毒能力的測(cè)定上述懸浮液5000rpm離心1分鐘，測(cè)定上清液中的丙肝病毒即HCVRNA(Nippon Roche，Amplicore HCV檢測(cè)儀)含量。
作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，用100μl生理鹽水代替吸附劑加入小瓶中，重復(fù)上述過(guò)程測(cè)定溶液中丙肝病毒含量。利用以下方程計(jì)算丙肝病毒吸附率(％)吸附率(％)＝[(Vr-Vt)/Vr]×100Vr對(duì)照溶液中的病毒濃度Vt吸附試驗(yàn)上清液中的病毒濃度結(jié)果見表1。
表1

實(shí)施例10合成吸附劑的評(píng)價(jià)吸附測(cè)試各種吸附劑取100μl加入小瓶中，加入100μl含有丙肝病毒的患者血清，混合物在37℃振搖2小時(shí)。高密度HCV/低密度HCV之比的測(cè)定各吸附實(shí)驗(yàn)中獲得的HCV懸浮液和用生理鹽水代替吸附劑重復(fù)相同方法得到的HCV懸浮液分別與抗LDL和抗IgG抗體混合，反應(yīng)在4℃進(jìn)行16小時(shí)。反應(yīng)混合物5000rpm離心15分鐘，回收沉淀，測(cè)定丙肝病毒即HCV RNA(NipponRoche，Amplicore HCV檢測(cè)儀)的量。將用抗LDL抗體沉淀的HCV作為低密度HCV，用抗IgG抗體沉淀的HCV作為高密度HCV，計(jì)算HCV RNA之比(T/B＝低密度HCV/高密度HCV)。
結(jié)果見表2。
表2<

產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性以上實(shí)施例清楚地顯示，本發(fā)明提供了一種新的吸附劑，它能夠選擇性吸附和清除體液中的丙肝病毒，并/或能夠降低高密度HCV與低密度HCV之比。而且，利用上述吸附劑充填的體液處理設(shè)備，可以選擇性地清除例如血液、血漿和血清等體液中的丙肝病毒。
序列表SEQ ID NO1長(zhǎng)度58類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性種類肽Cys Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu15 10 15Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe20 25 30Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp35 40 45Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu50 55SEQ ID NO2長(zhǎng)度60類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈種類肽Met Lys Lys Lys Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu15 10 15Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys20 25 30Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr35 40 45Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu50 55 60
SEQ ID NO3長(zhǎng)度190類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性CATATGAAAA AGAAGACCAC CTATAAACTG GTTATCAACG GTAAAACCCT GAAAGGTGAAGTATACTTTT TCTTCTGGTG GATATTTGAC CAATAGTTGC CATTTTGGGA CTTTCCACTT 60ACCACCACCA AGGCTGTTGA CGCTGAAACC GCTGAAAAAG CATTTAAACA GTATGCTAACTGGTGGTGGT TCCGACAACT GCGACTTTGG CGACTTTTTC GTAAATTTGT CATACGATTG l20GACAACGGTG TCGACGGTGT TTGGACCTAT GACCCCGCTA CCAAAACCTT TACCGTTACCCTGTTGCCAC AGCTGCCACA AACCTGGATA CTGGGGCGAT GGTTTTGGAA ATGGCAATGG 180GAATAAGCTTCTTATTCGAA 190SEQ ID NO4長(zhǎng)度58類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性種類肽Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu15 10 15Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys20 25 30Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Pro35 40 45Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys50 55SEQ ID NO5長(zhǎng)度184類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性CATATGACCA CCTATAAACT GGTTATCAAC GGTAAAACCC TGAAAGGTGA AACCACCACCGTATACTGGT GGATATTTGA CCAATAGTTG CCATTTTGGG ACTTTCCACT TTGGTGGTGG 60AAGGCTGTTG ACGCTGAAAC CGCTGAAAAA GCATTTAAAC AGTATGCTAA CGACAACGGTTTCCGACAAC TGCGACTTTG GCGACTTTTT CGTAAATTTG TCATACGATT GCTGTTGCCA 120GTCGACGGTG TTTGGACCTA TGACCCCGCT ACCAAAACCT TTACCGTTAC CGAATGCTAACAGCTGCCAC AAACCTGGAT ACTGGGGCGA TGGTTTTGGA AATGGCAATG GCTTACGATT 180GCTTCGAA 18權(quán)利要求
1.一種用于清除丙肝病毒的吸附劑，它包含固定在水不溶性載體上的能夠吸附丙肝病毒的化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中能夠吸附丙肝病毒的化合物是具有免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物結(jié)合親和性的化合物。
3.一種用于清除丙肝病毒的吸附劑，它包含固定在水不溶性載體上能夠吸附與免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物結(jié)合的丙肝病毒的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中具有免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物結(jié)合親和性的化合物是免疫球蛋白結(jié)合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中的免疫球蛋白至少是選自以下組中的一種蛋白A、蛋白G、蛋白H、蛋白L、蛋白M、類風(fēng)濕因子和補(bǔ)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中具有免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物結(jié)合親和性的化合物是抗免疫球蛋白抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中能夠吸附丙肝病毒的化合物是免疫球蛋白結(jié)合蛋白和/或抗免疫球蛋白抗體的組成部分，該部分是含有免疫球蛋白和/或免疫復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)的的蛋白質(zhì)片段或肽，或者是所述蛋白質(zhì)片段或肽的衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中的水不溶性載體是多孔性載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中多孔性載體的平均孔徑為10至1500nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中的水不溶性載體是基本上無(wú)孔的載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中的水不溶性載體是親水性載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的清除丙肝病毒的吸附劑，它被用來(lái)清除血液、血漿等體液中丙肝病毒。
13根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的清除丙肝病毒的吸附劑，其中的丙肝病毒是免疫復(fù)合型病毒。
14.一種吸附丙肝病毒的設(shè)備，它包括一個(gè)具有供液體進(jìn)出的入口和出口，以及用于裝載權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的清除丙肝病毒的吸附劑的容器，和用于防止所述清除丙肝病毒的吸附劑從容器中滲漏的裝置。
15.吸附丙肝病毒的方法，它包括將權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的清除丙肝病毒的吸附劑與含有丙肝病毒的液體接觸的步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的吸附丙肝病毒的方法，其中含有丙肝病毒的液體是血液、血漿等體液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種清除丙肝病毒的吸附劑,它具有高度的安全性,利用它能夠有效而且選擇性地清除患者血液中的丙肝病毒,尤其是免疫復(fù)合形式的丙肝病毒;從而加強(qiáng)干擾素治療的效果;并提供用上述吸附劑制成的吸附器;和清除丙肝病毒的吸附方法。所述的吸附劑包含固定在水不溶性載體上的能夠吸附丙肝病毒的化合物。
文檔編號(hào)B01J20/32GK1251048SQ98803661
公開日2000年4月19日 申請(qǐng)日期1998年3月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月25日
發(fā)明者荻野英司, 野村道雄, 旭孝司, 金子周一, 酒井明人 申請(qǐng)人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社