蛋白質(zhì)純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種吸附蛋白質(zhì)的純化方法，該方法使用了蛋白質(zhì)吸附多孔膜，方法中提供一種可抑制蛋白質(zhì)的吸附能力降低的被吸附蛋白質(zhì)的溶出方法。該方法包含吸附工序和溶出工序，在溶出工序中，使至少1種溶出液沿著與原液的通過方向相反的方向進(jìn)行通過，所述原液是吸附工序中的含有吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的原液。
【專利說明】蛋白質(zhì)純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種用具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子包覆基體材料表面而成的多孔膜進(jìn)行的蛋白質(zhì)純化方法。
【背景技術(shù)】
近年來，在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中，期望確立一種可有效地大量生產(chǎn)及大量純化蛋白質(zhì)的技術(shù)。
一般而言，由于蛋白質(zhì)通過使用源自動(dòng)物的細(xì)胞株或大腸桿菌等菌體的培養(yǎng)來生產(chǎn)，因此，需要將作為目標(biāo)的蛋白質(zhì)(以下，有時(shí)記為“目標(biāo)蛋白質(zhì)”。)從培養(yǎng)液中分離且純化。特別是為了將利用了抗體的醫(yī)藥品(抗體醫(yī)藥品)實(shí)用化，需要從細(xì)胞培養(yǎng)液中將細(xì)胞碎片等渾濁成分、及源自細(xì)胞的溶存的蛋白質(zhì)等非渾濁成分除去，將其純化至對(duì)人類的治療用途而言充分的純度。在該純化工序中，使用蛋白質(zhì)吸附多孔膜或空心顆粒(粒子狀的吸附材料)等蛋白質(zhì)吸附材料。
作為這樣的蛋白質(zhì)吸附材料，可以舉出如專利文獻(xiàn)I~5及非專利文獻(xiàn)I中所記載那樣的蛋白質(zhì)吸附多孔膜。
最近，對(duì)抗體醫(yī)藥品的需要迅速增加，意向大量生產(chǎn)作為抗體醫(yī)藥品的蛋白質(zhì)。而且，伴隨培養(yǎng)技術(shù)的迅速進(jìn)步，提高純化工序的能力也成為了課題，特別是對(duì)提高可實(shí)現(xiàn)高流速處理的蛋白質(zhì)吸附多孔膜的能力寄予期待。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開第2009/054226號(hào) 專利文獻(xiàn)2:日本特開2009-53191號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)3:日本特表2006-519273號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)4:美國(guó)專利第6780327號(hào)說明書 專利文獻(xiàn)5:美國(guó)專利第5547575號(hào)說明書 非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) l:Kyoichi Saito, CHARGED POLYPER BRUSH GRAFTED ONTOPOROUS HOLLOff-FIBER MEMBRANE IMPROVES SEPARATION AND REACTION INB10TECN0L0GY，Separation Science and Technology,ENGLAND,Taylar&Francis, 2002，37(3)，535-554

【發(fā)明內(nèi)容】

發(fā)明所要解決的技術(shù)問題
一般而言，使含有作為吸 附對(duì)象的蛋白質(zhì)的原液(以下，有時(shí)記為“原液”)通過蛋白質(zhì)吸附多孔膜通過，使蛋白質(zhì)吸附后，再使吸附的蛋白質(zhì)(以下，有時(shí)記為“被吸附蛋白質(zhì)”)溶出，當(dāng)實(shí)現(xiàn)純化的目的之后，則將蛋白質(zhì)吸附多孔膜廢棄。但是，為了提高純化工序的能力，要求重復(fù)使用蛋白質(zhì)吸附多孔膜。
通過現(xiàn)有技術(shù)的處理使蛋白質(zhì)吸附多孔膜再生而重復(fù)使用時(shí)，則存在吸附能力逐漸降低的傾向。
另外，如上所述，近年來從大量生產(chǎn)、大量純化的需要考慮，則期望進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)吸附多孔膜的吸附能力。作為提高吸附能力的方法，使蛋白質(zhì)多層地吸附于有限的膜的細(xì)孔表面的方法很有效，但越是使更多的蛋白質(zhì)多層地吸附于有限的膜的細(xì)孔表面，則越降低蛋白質(zhì)吸附多孔膜再生而重復(fù)使用時(shí)的吸附能力，結(jié)果使這樣的課題變得更顯著。用于解決問題的方案
吸附能力降低的原因之一，是因?yàn)槿勘晃降牡鞍踪|(zhì)無法完全溶出。因此，如果能夠提高被吸附蛋白質(zhì)的溶出效率，并使蛋白質(zhì)吸附多孔膜再生，就可以抑制因重復(fù)使用而引起的吸附能力的降低。
本發(fā)明人等為了解決上述課題進(jìn)行了潛心研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使至少I種溶出液沿著與吸附工序中的含有吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的原液的通過方向相反的方向通過，可以解決上述課題而完成本發(fā)明。此外，本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)，通過多層地吸附蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)吸附多孔膜，則上述方法可以更有效地發(fā)揮作用，于是完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下所述。
[0001]一種蛋白質(zhì)純化方法，其是利用多孔膜進(jìn)行的蛋白質(zhì)純化方法，所述多孔膜是基體材料表面被具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子覆蓋而形成的多孔膜，
該方法包括:
吸附工序，使含有吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的原液通過所述多孔膜，使該吸附對(duì)象蛋白質(zhì)吸附于所述高分子；· 溶出工序，使溶出液通過所述多孔膜，使吸附于所述高分子的所述吸附對(duì)象蛋白質(zhì)溶出在該溶出液中，
在所述溶出工序中，使至少I種溶出液沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相反的方向通過。
[0002]如[I]所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述溶出液選自:含有鹽的水溶液、調(diào)整了PH的水溶液、水、有機(jī)溶劑及它們的混合溶液。
[0003]如[I]或[2]所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，在所述溶出工序中，使所述溶出液沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相同的方向和相反的方向通過。
[0004]如[I]~[3]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述高分子接枝于所述基體材料表面，且所述高分子的接枝率為5%以上且200%以下。
[0005]如[4]所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述高分子的接枝率為30%以上且90%以下。
[0006]如[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述多孔膜為離子交換膜，且所述溶出液包含含有鹽的水溶液或調(diào)整了 PH的水溶液。
[0007]如[I]~[6]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述多孔膜的多層度為1.1以上。
[0008]如[6]或[7]所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述多孔膜為弱堿性陰離子交換膜或弱酸性陽(yáng)離子交換膜，且所述溶出工序包括:
使PH調(diào)整為所述吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和所述多孔膜的等電點(diǎn)之間以外的水溶液通過的工序、以及
使含有鹽的水溶液通過的工序，
在上述至少一個(gè)工序中，沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相反的方向通過水溶液。
[0009]如[8]所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，在使調(diào)整了 pH的水溶液通過的所述工序及使含有鹽的水溶液通過的所述工序中，沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相反的方向通過水溶液。
[0010]如[6]或[7]所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述多孔膜為弱堿性陰離子交換膜或弱酸性陽(yáng)離子交換膜，并且，
所述溶出工序包含:
使含有鹽的水溶液通過的第一工序；
使PH調(diào)整為所述吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和所述多孔膜的等電點(diǎn)之間以外的水溶液通過的第二工序；以及
使含有鹽的水溶液通過的第三工序，
在所述第一工序中，沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相同的方向通過水溶 液，
在所述第二工序及所述第三工序中，沿著與吸附工序中所述原液的通過方向相反的方向通過水溶液。
[0011]如[I]~[10]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述溶出液被調(diào)整為所述吸附對(duì)象蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH。
[0012]如[I]~[11]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述溶出液為含有0.3mol/L以上的中性鹽的水溶液。
[0013]如[I]~[12]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，其中，所述多孔膜是在通過液體或蒸汽進(jìn)行了濕潤(rùn)化的狀態(tài)下進(jìn)行加熱至50~110°C的處理而制造的。
發(fā)明效果
按照本發(fā)明，可提供一種被吸附蛋白質(zhì)的溶出方法，用于在使用蛋白質(zhì)吸附多孔膜的蛋白質(zhì)純化方法中抑制蛋白質(zhì)的吸附能力的降低。
【具體實(shí)施方式】
下面，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式詳細(xì)地進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明并不限定于以下的實(shí)施方式，可以在其主旨的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變形而實(shí)施。
本實(shí)施方式的蛋白質(zhì)純化方法為如下方法:含有吸附工序和溶出工序，在溶出工序中，使至少I種溶出液沿著與吸附工序中含有吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的原液的通過方向相反的方向通過。
本實(shí)施方式中所使用的多孔膜，是含有基體材料和包覆于該基體材料表面且具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子的膜，有時(shí)記為“蛋白質(zhì)吸附多孔膜”。
另外，在本實(shí)施方式中，所謂“蛋白質(zhì)吸附多孔膜”作為如下概念使用:該概念包含在稱為整塊體的具有一條或多條中空部的圓筒狀多孔燒結(jié)體上包覆具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子而形成的形態(tài)。因此，在本實(shí)施方式中，所謂“用具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子包覆基體材料表面而成的多孔膜”，也包含用具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子包覆表面而成的整塊體(中空?qǐng)A筒狀的多孔燒結(jié)體)。
在本實(shí)施方式中，通過“蛋白質(zhì)吸附多孔膜”這樣的記載的例示，這種用高分子包覆的整塊體(中空?qǐng)A筒狀的多孔質(zhì)燒結(jié)體)也包含在其主旨的范圍內(nèi)。
在本實(shí)施方式中，通過使含有吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的原液通過蛋白質(zhì)吸附多孔膜，使吸附對(duì)象蛋白質(zhì)吸附于蛋白質(zhì)吸附多孔膜。所謂含有吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的原液，是含有將要吸附于蛋白質(zhì)吸附多孔膜的蛋白質(zhì)的溶液，是指通過該膜之前的溶液。
在本實(shí)施方式中，通過該膜后的溶液記為“透過液”。
通常，在制造醫(yī)藥品時(shí)的實(shí)際生產(chǎn)線上，原液中除目標(biāo)蛋白質(zhì)以外，還含有沒有用的蛋白質(zhì)、菌體、病毒、渾濁成分等。也有通過前處理從原液中除去渾濁成分和/或菌體的情況。在本實(shí)施方式中，也可以為如下方法:使目標(biāo)蛋白質(zhì)作為吸附對(duì)象吸附于蛋白質(zhì)吸附多孔膜，并使其它的成分透過后，僅使目標(biāo)蛋白質(zhì)溶出而回收的純化方法；將其它的蛋白質(zhì)(例如沒有用的蛋白質(zhì))作為吸附對(duì)象進(jìn)行吸附，使目標(biāo)蛋白質(zhì)透過而回收的純化方法。即，所謂“吸附對(duì)象蛋白質(zhì)”為吸附于蛋白質(zhì)吸附多孔膜的蛋白質(zhì)，并不限定于目標(biāo)蛋白質(zhì)。根據(jù)純化方法，可以為目標(biāo)蛋白質(zhì)，也可以為沒有用的蛋白質(zhì)。另外，原液中所含的吸附對(duì)象蛋白質(zhì)可以為I種，另外，也可以為I種以上。
在本實(shí)施方式中，所謂“吸附”是指蛋白質(zhì)通過與蛋白質(zhì)吸附多孔膜的細(xì)孔表面的相互作用而粘貼住，與僅接觸的“附著”相區(qū)別。
在本實(shí)施方式中，有時(shí)將使含有吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的原液通過蛋白質(zhì)吸附多孔膜并吸附吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的工序記為“吸附工序”?！? 接下來，有時(shí)進(jìn)行沖洗“附著”于蛋白質(zhì)吸附多孔膜的成分(即，不是吸附對(duì)象的蛋白質(zhì)(非吸附蛋白質(zhì))或渾濁成分)的工序。將該工序記為“清洗工序”，與后述的“溶出工序”相區(qū)別。通過清洗工序，在蛋白質(zhì)吸附多孔膜表面仍存在“吸附”的蛋白質(zhì)。
最后，通過溶出液使吸附于蛋白質(zhì)吸附多孔膜的被吸附蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)吸附多孔膜中溶出而被回收。在此所謂的溶出液是為用于使被吸附蛋白質(zhì)溶出的液體，并不用作通過蛋白質(zhì)吸附多孔膜而流出的溶液的含義。
在本實(shí)施方式中，有時(shí)將使溶出液通過蛋白質(zhì)吸附多孔膜，使被吸附蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)吸附多孔膜溶出的工序記為“溶出工序”。
在本實(shí)施方式中，所謂溶出工序并不僅僅是從蛋白質(zhì)吸附多孔膜中溶出被吸附蛋白質(zhì)，也可以是使溶出液通過蛋白質(zhì)吸附多孔膜從而使蛋白質(zhì)吸附多孔膜再生的工序。即，溶出工序中，被吸附蛋白質(zhì)在溶出液中的含量不特別地視為問題。
在溶出工序中，使至少I種溶出液沿著與吸附工序中原液的通過方向相反的方向通過，從而則可以純化蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)吸附多孔膜再生。
在本實(shí)施方式中，在通過用具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子包覆基體材料表面而成的多孔膜進(jìn)行的蛋白質(zhì)純化方法中，不僅提供抑制蛋白質(zhì)吸附能力降低的被吸附蛋白質(zhì)溶出方法，而且由于被吸附蛋白質(zhì)的溶出為蛋白質(zhì)吸附多孔膜的再生處理的一部分，因此，也可以認(rèn)為可提供一種蛋白質(zhì)吸附多孔膜的再生方法。本實(shí)施方式的蛋白質(zhì)純化方法中的機(jī)理的詳細(xì)情況尚不明確，但可以如下考察。
通常，在溶出工序中，溶出液沿著與吸附工序中原液的通過方向相同的方向通過。
本發(fā)明不拘泥于以下的理論，但認(rèn)為如本實(shí)施方式所示，通過至少I次將溶出液的流動(dòng)方向變?yōu)榕c原液的通過方向相反的方向通過溶出液，并通過導(dǎo)入到蛋白質(zhì)吸附多孔膜中基體材料表面的具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子鏈振動(dòng)的效果，則可以溶出被吸附蛋白質(zhì)。即、蛋白質(zhì)有時(shí)以進(jìn)入相鄰的高分子鏈間的方式以多層堆積并吸附，潛入深處的蛋白質(zhì)不易溶出。認(rèn)為在吸附工序中，高分子鏈在原液的流動(dòng)方向拉長(zhǎng)。因此，認(rèn)為在溶出工序中，通過使溶出液沿著與原液的流動(dòng)方向相反的方向流動(dòng)，則反捋高分子鏈，高效地溶出潛入深處的蛋白質(zhì)，因此，可以得到重復(fù)使用時(shí)吸附能力降低得以抑制的膜，并使蛋白質(zhì)吸附多孔膜再生。
作為蛋白質(zhì)吸附材料，除蛋白質(zhì)吸附多孔膜以外，也有時(shí)使用蛋白質(zhì)吸附球進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化。在使用蛋白質(zhì)吸附球的情況下，在筒狀的容器(柱)中填充有蛋白質(zhì)吸附球的狀態(tài)下進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化。作為再生方法，有時(shí)使液體在容器中沿著與原液通過方向相反的方向流動(dòng)，但這是為了除去渾濁或解開壓密化后的球而進(jìn)行的。即使讓液體在容器中沿著相反方向流動(dòng)，也難以控制各球粒子的表面的液體流動(dòng)，并且從球表面連接至內(nèi)部的細(xì)孔部?jī)?nèi)的蛋白質(zhì)的移動(dòng)擴(kuò)散受到限制，因此，液體在容器中的流動(dòng)方向不會(huì)對(duì)溶出造成影響，可以說本實(shí)施方式對(duì)于蛋白質(zhì)吸附多孔膜為特別有效的再生方法。
作為蛋白質(zhì)吸附多孔膜的形狀，可以舉出:平板膜、中空纖維膜等。
所謂平板膜是指片狀的膜，片材的正面和反面通過作為貫穿孔的細(xì)孔而連續(xù)的平板膜。 所謂中空纖維膜是指具有中空部分的圓筒狀或纖維狀的膜，中空纖維膜的中空側(cè)(內(nèi)側(cè))和外側(cè)通過作為貫穿孔的細(xì)孔而連通。
對(duì)蛋白質(zhì)吸附多孔膜的形狀而言，只要液體或氣體可透過貫穿孔從正面向反面或從反面向正面、或從內(nèi)側(cè)向外側(cè)或從外側(cè)向內(nèi)側(cè)透過就沒有特別限定。
通常，蛋白質(zhì)吸附多孔膜僅有膜是無法有效使用的，為了通過液體，蛋白質(zhì)吸附多孔膜在收納于被稱為組件的捆包容器中的狀態(tài)下使用，從組件成型時(shí)的流路結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且沿著與吸附工序中原液通過方向相反的方向的液體流通變得容易的方面考慮，優(yōu)選中空纖維膜。組件結(jié)構(gòu)只要是與各個(gè)蛋白質(zhì)吸附多孔膜的形狀對(duì)應(yīng)的公知的結(jié)構(gòu)即可，在本實(shí)施方式中沒有特別限定。
在本實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)吸附多孔膜的尺寸可根據(jù)組件設(shè)計(jì)、膜的制造方法、使用用途自由地選擇。例如若為平板膜，則只要可在組件中成型且可通過液體，則可自由地設(shè)計(jì)片材的厚度、大小。若為中空纖維膜或整塊體，則外徑及內(nèi)徑只要可物理上地保持多孔膜的形狀,則可自由地設(shè)計(jì)尺寸。
在本實(shí)施方式中，作為蛋白質(zhì)吸附多孔膜的基體材料，若對(duì)于蛋白質(zhì)的純化中所使用并接觸的液體具有耐受性，則可以使用公知技術(shù)的原材料。
例如可以舉出:高分子材料、無機(jī)材料、及有機(jī)無機(jī)混合材料等，但從成形性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使用了聞分子材料的聞分子基體材料。
在使用聞分子基體材料的情況下，從保持機(jī)械性質(zhì)的觀點(diǎn)考慮，聞分子基體材料優(yōu)選由聚烯烴類聚合物構(gòu)成。作為聚烯烴類聚合物，例如可以舉出:乙烯、丙烯、丁烯等烯烴均聚物、2種以上該烯烴的共聚物等。
在使用堿性溶液作為溶出液的情況下，其中，優(yōu)選機(jī)械強(qiáng)度特別優(yōu)異、具有耐堿性的聚乙烯。
可通過熱誘導(dǎo)相分離法、非溶劑相分離法、電子束照射法等公知技術(shù)將高分子基體材料制成多孔膜。
熱誘導(dǎo)相分離法，是將聚烯烴類聚合物等高分子的溶液在高溫下溶解，之后進(jìn)行冷卻的方法。在冷卻過程中，高分子溶液網(wǎng)狀地相分離為高分子和溶劑，因此，若在冷卻后除去溶劑，則可得到多孔膜。其特征在于，可得到細(xì)孔徑分布較小的多孔膜。
非溶劑相分離法，是將高分子溶液浸潰在非溶劑中的方法。通過非溶劑浸潰在高分子溶液中，高分子的溶解度降低，高分子網(wǎng)狀地析出，從而可得到多孔膜。其特征在于，可得到帶細(xì)孔徑傾斜的多孔膜。
電子束照射法，是對(duì)制成膜狀的高分子照射電子束，形成多個(gè)貫穿孔，從而得到多孔膜的方法?？傻玫骄鶆虻募?xì)孔徑的多孔膜。
在本實(shí)施方式中，可根據(jù)制作的蛋白質(zhì)吸附多孔膜的設(shè)計(jì)從這些方法中適宜選擇。
本實(shí)施方式中的基體材料的平均細(xì)孔徑只要可考慮吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的種類、混合存在的渾濁成分、溶液的粘度等實(shí)現(xiàn)工藝所需要的分離？純化度及通過速度就沒有特別限定。以可除去渾濁成分的方式設(shè)計(jì)平均細(xì)孔徑的上限，以可實(shí)現(xiàn)期望的通過速度的方式設(shè)計(jì)平均細(xì)孔徑的下限，該平均細(xì)孔徑優(yōu)選為0.ΟΟΙμπι~10 μ m，更優(yōu)選為0.014111~1(^111，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1 μ m~I μ m。
基體材料中的細(xì)孔所占的體積比率，即孔隙率只要在可保持蛋白質(zhì)吸附多孔膜的形狀且實(shí)現(xiàn)通過速度的范圍就沒有特別限`定。以可保持形狀的方式設(shè)計(jì)孔隙率的上限，以可實(shí)現(xiàn)期望的通過速度的方式設(shè)計(jì)平均細(xì)孔徑的下限，該孔隙率優(yōu)選為5%~99%，更優(yōu)選為10%~95%，從實(shí)用的方面考慮，進(jìn)一步優(yōu)選為30~90%。
平均細(xì)孔徑及孔隙率的測(cè)定例如可以通過Marcel Mulder著“膜技術(shù)”(株式會(huì)社IPC)中所記載那樣的本領(lǐng)域從業(yè)人員通常采用的方法來進(jìn)行。作為測(cè)定方法的具體例，可以舉出:利用電子顯微鏡的觀察、始沸點(diǎn)法、水銀壓入法、透過率法等。
在本實(shí)施方式中，基體材料的表面優(yōu)選細(xì)孔的至少一部分用具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子包覆。
作為高分子，例如可以舉出直鏈狀高分子、交聯(lián)型的高分子等。從相反方向的溶出液的流動(dòng)可有效地溶出嵌入高分子鏈間的蛋白質(zhì)的方面考慮，優(yōu)選直鏈狀高分子。
蛋白質(zhì)吸附多孔膜根據(jù)包覆基體材料表面的高分子的官能團(tuán)，可分類為離子交換膜、群特異性親和吸附膜、個(gè)別特異性親和吸附膜、疏水性相互作用吸附膜。離子交換膜細(xì)分為強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換膜、弱酸性陽(yáng)離子交換膜、強(qiáng)堿性陰離子交換膜、及弱堿性陰離子交換膜。
在本實(shí)施方式中，這些官能團(tuán)可根據(jù)被吸附蛋白質(zhì)的種類、優(yōu)選目標(biāo)蛋白質(zhì)的種類、要求的純化度等選擇適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)。
作為強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換膜的官能團(tuán)，例如可以舉出:磺酸基(-SO3-)等，作為弱酸性陽(yáng)離子交換膜的官能團(tuán)，例如可以舉出:羧酸基(-C00-)等。作為強(qiáng)堿性陰離子交換膜的官能團(tuán)，例如可以舉出:季銨基(Q、-N+R3)、季銨基乙基(QAE、_ (CH2)2-N+R3)等。在此，R沒有特別限定，與同一個(gè)N鍵合的R可以相同或不同，優(yōu)選為烷基、芳基等經(jīng)基。更具體而目，可以舉出:二甲基氣基(TMA、-N+Me3)等。
作為弱堿性陰離子交換膜的官能團(tuán)，例如可以舉出:伯氨基(-Mg、仲氨基(-NHR)、叔氨基(-NR2)等，具體而言，可以舉出:二乙基氨基乙基(DEAE、-(CH2)2-NEt2)、二乙基氨基丙基(DEAP、-(CH2)3-NEt2)等。在此，R也沒有特別限定，與同一個(gè)N鍵合的R可以相同或不同，優(yōu)選表不烷基、芳基等經(jīng)基。
作為群特異性親和吸附膜的官能團(tuán)，例如可以舉出:Cibacron Blue F3G-A、ProteinA、伴刀豆球蛋白A、肝素、單寧、金屬螯合基團(tuán)等。
作為個(gè)別特異型親和吸附膜的官能團(tuán)，例如可以舉出抗原、抗體類等。
作為疏水性相互作用吸附膜的官能團(tuán)，例如可以舉出:烷基或芳香族類官能團(tuán)。烷基從進(jìn)一步提高疏水性的相互作用、提高吸附能力的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選碳原子為4個(gè)以上。
在本實(shí)施方式中，關(guān)于將包覆基體材料表面的具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子導(dǎo)入基體材料表面的方法，例如可以舉出:化學(xué)反應(yīng)或高分子涂布等。在本實(shí)施方式中，可以根據(jù)基體材料的材質(zhì)、蛋白質(zhì)吸附多孔膜的使用用途、制造方法等觀點(diǎn)選擇最佳的方法，也可應(yīng)用于被稱為整塊體的多孔質(zhì)燒結(jié)體。
作為通過化學(xué)反應(yīng)，用具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子包覆基體材料表面的方法，例如可以舉出:放射線接枝聚合法等。放射線接枝聚合法為對(duì)基體材料照射Y射線等放射線使基體材料表面活化而使單體聚合的方法。與后述的利用高分子涂布的包覆方法相比，可以期待基體材料和包覆基體材料表面的高分子的牢固的結(jié)合。進(jìn)而，由于不需要聚合引發(fā)劑等試劑，因此，從可減輕在反應(yīng)后清洗這些試劑的負(fù)荷的觀點(diǎn)考慮，可優(yōu)選使用?！? 放射線接枝聚合法中包含(I)將包含具有蛋白質(zhì)吸附能力的官能團(tuán)的單體直接接枝聚合于基體材料上接枝聚合的方法、或(2)將含有可導(dǎo)入具有蛋白質(zhì)吸附能力的官能團(tuán)的官能團(tuán)的單體接枝聚合于基體材料上，接下來，導(dǎo)入具有蛋白質(zhì)吸附能力的官能團(tuán)的方法，任一方法均可以采用。
在本實(shí)施方式中，有時(shí)將通過接枝聚導(dǎo)入的高分子稱為“接枝鏈”。
作為上述(I)所示的方法可通過一階段的反應(yīng)得到具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子的包覆層，因此，是簡(jiǎn)便且優(yōu)選的方法。
作為(I)的方法中所使用的上述單體，沒有特別限定，例如可以舉出:甲基丙烯酸酯衍生物、乙烯基化合物、稀丙基化合物等，具體而目，可以舉出:甲基丙稀酸二乙基氣基乙酷、甲基丙烯酸磺丙酯、乙烯基芐基三甲基氯化銨、烯丙基胺等。
作為上述(2)所示的方法，從容易使各種具有蛋白質(zhì)吸附能力的官能團(tuán)的變化一致或容易使具有蛋白質(zhì)吸附能力的官能團(tuán)的導(dǎo)入率(以下，有時(shí)記為“配體轉(zhuǎn)化率”。)的變化一致這樣的觀點(diǎn)考慮，是優(yōu)選的方法。
作為(2)的方法中所使用的上述單體，沒有特別限定，例如可以舉出:具有反應(yīng)性較高的環(huán)氧基的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)等。
在通過放射線接枝聚合法導(dǎo)入具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子的情況下，接枝鏈的量(以下，有時(shí)記為“接枝率”。)及配體轉(zhuǎn)化率有時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)吸附多孔膜的吸附能力及機(jī)械強(qiáng)度造成影響。在本實(shí)施方式中，接枝率(dg[%])基于放射線接枝聚合前后的相對(duì)于基體材料的增加重量而定義，可通過下述式(I)求得。
[數(shù)學(xué)式I]
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)純化方法，其是利用多孔膜進(jìn)行的蛋白質(zhì)純化方法，所述多孔膜是基體材料表面被具有蛋白質(zhì)吸附能力的高分子覆蓋而形成的多孔膜， 該方法包括: 吸附工序，使含有吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的原液通過所述多孔膜，使該吸附對(duì)象蛋白質(zhì)吸附于所述高分子； 溶出工序，使溶出液通過所述多孔膜，使吸附于所述高分子的所述吸附對(duì)象蛋白質(zhì)溶出在該溶出液中， 在所述溶出工序中，使至少I種溶出液沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相反的方向通過。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述溶出液選自:含有鹽的水溶液、調(diào)整了 PH的水溶液、水、有機(jī)溶劑及它們的混合溶液。
3.如權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，在所述溶出工序中，使所述溶出液沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相同的方向和相反的方向通過。
4.如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述高分子接枝于所述基體材料表面，且所述高分子的接枝率為5%以上且200%以下。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述高分子的接枝率為30%以上且90%以下。
6.如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述多孔膜為離子交換膜，且所述溶出液包含含有鹽的水溶液或調(diào)整了 pH的水溶液。`
7.如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述多孔膜的多層度為1.1以上。
8.如權(quán)利要求6或7所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述多孔膜為弱堿性陰離子交換膜或弱酸性陽(yáng)離子交換膜，且 所述溶出工序包括: 使PH調(diào)整為所述吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和所述多孔膜的等電點(diǎn)之間以外的水溶液通過的工序、以及 使含有鹽的水溶液通過的工序， 在上述至少一個(gè)工序中，沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相反的方向通過水溶液。
9.如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，在使調(diào)整了pH的水溶液通過的所述工序及使含有鹽的水溶液通過的所述工序中，沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相反的方向通過水溶液。
10.如權(quán)利要求6或7所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述多孔膜為弱堿性陰離子交換膜或弱酸性陽(yáng)離子交換膜，并且， 所述溶出工序包含: 使含有鹽的水溶液通過的第一工序； 使PH調(diào)整為所述吸附對(duì)象蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和所述多孔膜的等電點(diǎn)之間以外的水溶液通過的第二工序；以及 使含有鹽的水溶液通過的第三工序，在所述第一工序中，沿著與所述吸附工序中所述原液的通過方向相同的方向通過水溶液， 在所述第二工序及所述第三工序中，沿著與吸附工序中所述原液的通過方向相反的方向通過水溶液。
11.如權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述溶出液被調(diào)整為所述吸附對(duì)象蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH。
12.如權(quán)利要求1~11中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述溶出液為含有0.3mol/L以上的中性鹽的水溶液。
13.如權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化方法，其中，所述多孔膜是在通過液體或蒸汽進(jìn)行了濕潤(rùn)化的狀態(tài)·下進(jìn)行加熱至50~110°C的處理而制造的。
【文檔編號(hào)】B01J20/26GK103857692SQ201280047560
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月30日
【發(fā)明者】佐藤優(yōu)太, 篠原直志, 白瀧浩伸 申請(qǐng)人:旭化成化學(xué)株式會(huì)社