專利名稱：一種桔青毒素分子印跡材料及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種桔青毒素分子印跡材料及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分子印跡技術(shù)是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的一門新興的分子識(shí)別技術(shù)，它是以欲識(shí)別 的化合物作為模板分子(或稱印跡分子、目標(biāo)分子)，制備出對(duì)該模板具有特定"記憶功能" 的聚合物。在分子印跡聚合物制備過(guò)程中，首先模板分子與功能單體通過(guò)分子間作用力在 溶液體系中形成主客體復(fù)合物，再通過(guò)光引發(fā)或熱引發(fā)在交聯(lián)劑存在下進(jìn)行自由基聚合反 應(yīng)，將主客體復(fù)合物固定在高度交聯(lián)的高分子母體中，在一定的溶劑中洗去模板分子，得到
具有確定空間構(gòu)型的空穴和功能基在該空穴中精確排列的剛性聚合物，即分子印跡聚合物 (Molecular Imprinting Polymer, MIP)。采用分子印跡技術(shù)制備的某一模板分子的MIP， 對(duì)該模板分子有特異的親和性，能從結(jié)構(gòu)類似的分子中識(shí)別出模板分子。這種特殊的識(shí)別 作用由以下兩方面形成的一是除去模板分子，聚合物上留下與模板分子形狀匹配的作用 空穴；二是在該空穴周圍原來(lái)與模板分子相互作用的功能基團(tuán)仍保留在原來(lái)的位置上，在 隨后的再識(shí)別過(guò)程中，這些固定排列的功能基團(tuán)可與目標(biāo)分子形成一種精確的互補(bǔ)關(guān)系， 這與上述形狀匹配作用的空穴一起，構(gòu)成了對(duì)目標(biāo)分子所特有的高選擇性和識(shí)別能力。
分子印跡技術(shù)的基本思想起源于二十世紀(jì)四十年代Pauling提出的生物體內(nèi) 抗體_抗原、酶_底物相互作用的"鑰匙"原理，盡管他對(duì)于抗體_抗原相互作用的推 測(cè)被證實(shí)是錯(cuò)誤的，但這種學(xué)說(shuō)卻為分子印跡理論奠定了基礎(chǔ)。從Pauling理論出發(fā)， 1949年，Dickey成功地將甲基橙印跡在硅膠表面上，首次提出了"分子印跡"(molecular imprinting)的概念。令人遺憾的是，在之后一段時(shí)間內(nèi)很少有人問津。直到二十世紀(jì)七十 年代，Wulff研究小組報(bào)道成功制備出人工合成的有機(jī)分子印跡聚合物，分子印跡技術(shù)才逐 漸為人們所關(guān)注。 目前，從全球分子印跡研究范圍來(lái)看，已經(jīng)有包括中國(guó)在內(nèi)的十幾個(gè)國(guó)家從事這 方面的研究。在國(guó)內(nèi)，對(duì)于分子印跡的研究是從上個(gè)世紀(jì)90年代開始的。最初局限于中科 院的各個(gè)化學(xué)所，后來(lái)很多高校相繼跟進(jìn)，截至現(xiàn)在，他們都取得了一定的成果，并且在世 界高水平的雜志上發(fā)表論文。 分子印跡技術(shù)之所以發(fā)展迅速，主要是基于它在分子識(shí)別上具有的其它技術(shù)無(wú)法 比擬的優(yōu)點(diǎn)，即構(gòu)效預(yù)定性(Predetermination)、專一識(shí)別性(Specific recognition)和 實(shí)用性(Practicability)，并且制備的分子印跡聚合物具有高親和性和高選擇性、耐高溫、 抗強(qiáng)酸堿、使用壽命長(zhǎng)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。它已經(jīng)用于高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳 色譜(CEC)以及薄層色譜(TLC)的固定相，并且在固相萃取(SPE)、生物傳感器、藥物分離及 分析、膜分離等方面都展現(xiàn)了獨(dú)特的魅力。隨著研究的深入，伴隨著生命科學(xué)、物理學(xué)和化 學(xué)的發(fā)展，分子印跡技術(shù)有望在生物工程、醫(yī)藥、食品、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域擁有更好的應(yīng)用前
旦 足。 桔青毒素(citrinin， CIT)是青霉屬和曲霉屬的某些菌株產(chǎn)生的真菌毒素，于1931年首次被分離純化。桔青毒素純品呈檸檬黃色針狀結(jié)晶，分子式是(:13111405，相對(duì)分子 量為250，熔點(diǎn)為178 179t:。該毒素極難溶于水，在酸性或堿性溶液中皆可熱解。桔青 毒素急性毒性為劇毒。桔青毒素像赭曲霉毒素一樣能夠使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生類似豬腎病的腎損 傷。在丹麥發(fā)現(xiàn)桔青毒素與赭曲霉毒素協(xié)同作用產(chǎn)生豬腎病。 自1931年桔青毒素被首次純化以來(lái)，人們相繼采用了薄層層析法(TLC)、熒光光 度計(jì)法、高壓液相色譜法(HPLC)以及氣相色譜、質(zhì)譜聯(lián)合法用于桔青毒素的分析檢測(cè)。目 前，TLC和HPLC法是最常用的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種桔青毒素分子印跡材料及其制備方法。
本發(fā)明所提供的桔青毒素分子印跡材料是按照包括下述步驟的方法制備得到的
1)將聚合物單體、模板分子和致孔劑混合，得到混合液，并使所述混合液靜置，向所述混合
液中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑并使其溶解，然后脫除混合液中的氧氣，進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚合
產(chǎn)物； 其中，所述聚合物單體選自下述任意一類或兩類丙烯酸類單體、丙烯酸酯類單 體、酰胺類單體和吡啶類單體；所述模板分子選自下述任意一種l-羥基_2-萘甲酸、1-羥 基-4_甲基_2-萘甲酸、1-羥基-4-乙基_2-萘甲酸、1-羥基-5-甲基-2-萘甲酸、l-羥 基-5_乙基_2-萘甲酸、1-羥基-6-甲基_2-萘甲酸、1-羥基-6-乙基-2-萘甲酸、l-羥 基-4，5-二甲基-2-萘甲酸、l-羥基-4，5-二乙基-2-萘甲酸、l-羥基-5，6-二甲基-2-萘 甲酸、l-羥基_5，6-二乙基-2-萘甲酸、1-羥基_4，6-二甲基-2-萘甲酸、1-羥基-4，6-二 乙基-2-萘甲酸、l-羥基-4，5，6-三甲基-2-萘甲酸和l-羥基-4，5，6-三乙基-2-萘甲 酸； 2)去除所述聚合產(chǎn)物中的模板分子，得到桔青毒素分子印跡材料(MIP)。模板分
子1-羥基-2-萘甲酸的結(jié)構(gòu)式如式1所示，桔青毒素的結(jié)構(gòu)式如式2所示。
OH(式l) (式2) 其中，所述丙烯酸類單體具體可為丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸，丁基丙烯酸， 叔丁基丙烯酸或三氟甲基丙烯酸，所述丙烯酸酯類單體具體可為甲基丙烯酸甲酯、甲基丙 烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，二甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸乙酯或二甲基丙烯酸丁酯， 所述酰胺類單體具體可為丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺或乙基丙烯酰胺，所述 吡啶類單體具體可為2-乙烯基吡啶或4_乙烯基吡啶。所述模板分子優(yōu)選為l-羥基-2-萘 甲酸。
所述致孔劑可選自下述任意一種丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷和四氯甲烷；所述交聯(lián)劑可選自下述任意一種乙二醇二異丁烯、三羥甲基丙烷、三甲基丙烯酸酯、乙二醇二 甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯基戊四醇、三丙烯酸酯和季戊四醇四丙烯酸酯；所述引發(fā)劑可為 偶氮二異丁腈。 步驟1)中所述模板分子、所述聚合物單體、所述交聯(lián)劑和所述引發(fā)劑的摩爾比依 次為(0. 30-0. 80)mmo1 : (0.9_2.4),1 : (8-24),1 : (0. 15-0. 40)mmo1 ;所述聚合物 單體與所述致孔劑的比例為(0. 9-2. 4)mmo1 : (4-10)mL。 所述聚合反應(yīng)以熱引發(fā)或光引發(fā)的方式進(jìn)行；所述熱引發(fā)的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫 度為50°C -IO(TC，反應(yīng)時(shí)間為18-24小時(shí)；所述光引發(fā)的反應(yīng)條件為365mm汞燈照射引發(fā)。 步驟2)中去除所述聚合產(chǎn)物中的模板分子的方法具體如下將所述聚合產(chǎn)物粉 碎至粒徑為30-80um，然后用甲醇和乙酸的混合溶液通過(guò)索氏提取對(duì)粉碎后的聚合產(chǎn)物進(jìn) 行洗脫抽提，除去聚合產(chǎn)物中的模板分子，用甲醇洗至中性，干燥，得到桔青毒素分子印跡 材料；其中，所述甲醇和乙酸的混合溶液中甲醇和乙酸的體積比為9 : 1 6 : 4。
為了檢測(cè)桔青毒素分子印跡材料中的模板分子是否完全去除，可采用下述方法進(jìn) 行檢測(cè)將干燥的桔青毒素分子印跡材料顆粒填裝到空的色譜柱中，用甲醇和水的混合液 作為洗脫流動(dòng)相，經(jīng)液相泵進(jìn)行聯(lián)機(jī)洗脫，洗脫效果經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)洗脫至基線平直為 止，說(shuō)明已將模版分子去除。 上述HPLC檢測(cè)條件為日本島津C化柱(lS0mmX4.6mm，Siim)，流動(dòng)相V甲醇V 水=80 : 20， pH(甲醇)4. 1(H3P04)， pH(水)4.6(H3P04)，流速0.9mL'min—、檢測(cè)波長(zhǎng)為 220nm，進(jìn)樣量10iiL。溫度室溫。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種固相萃取柱填料。 本發(fā)明所提供的固相萃取柱填料，由本發(fā)明所制備的桔青毒素分子印跡材料形 成。 以本發(fā)明所制備的桔青毒素分子印記材料為填料制成的固相萃取柱也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。 該固相萃取柱可應(yīng)用于在分離純化桔青毒素或用于檢測(cè)桔青毒素。 本發(fā)明采用虛擬模板合成分子印跡聚合物的方法來(lái)制備桔青毒素分子印跡材料。
因?yàn)榻矍喽舅氐亩拘源?，以其作為模板化合物在操作相?dāng)危險(xiǎn)。在此情況下，"直接的"分子
印跡就不能得到了，而只能采用適當(dāng)?shù)念愃苹衔锎孀鳛槟０?。而l-羥基-2-萘甲酸與
桔青毒素有相似的結(jié)構(gòu)，且毒性較小，因而可接受用作模板化合物。另一方面使用虛擬模板
可以避免在檢測(cè)桔青毒素時(shí)對(duì)結(jié)果造成影響。 本發(fā)明具有下述有益效果 1)本發(fā)明所開發(fā)的制備桔青毒素分子印跡聚合物的方法是以l-羥基-2-萘甲酸 為模板分子，所得的分子印跡材料具有良好的分子識(shí)別性能，為1-羥基_2-萘甲酸及其它 結(jié)構(gòu)類似物分子印跡聚合物的合成提供了一種可行的制備方案。 2)本發(fā)明以l-羥基-2-萘甲酸為模板制備的分子印跡材料為桔青毒素的固相萃 取材料開發(fā)提供了依據(jù)，從而可對(duì)的桔青毒素進(jìn)行分離提純。 3)本發(fā)明制備的桔青毒素分子印跡材料對(duì)桔青毒素具有專一識(shí)別性能，通過(guò)比較 MIP對(duì)l-羥基-2-萘甲酸和桔青毒素的等溫吸附曲線，說(shuō)明可使用本發(fā)明所提供的分子印跡材料實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中桔青毒素含量的快速測(cè)定。


圖1為實(shí)施例2中MIP和NIP對(duì)1-羥基_2-萘甲酸的等溫吸附曲線。
圖2為實(shí)施例2中MIP和NIP對(duì)桔青毒素的等溫吸附曲線。
圖3為實(shí)施例2中MIP對(duì)1-羥基_2-萘甲酸和桔青毒素的等溫吸附曲線比較。
圖4為實(shí)施例4中加標(biāo)濃度為0. 05mg/L的大米樣品的高效液相色譜圖。
圖5為實(shí)施例5中加標(biāo)濃度為0. 05mg/L的桔子樣品的高效液相色譜圖。
圖6為實(shí)施例6中加標(biāo)濃度為0. 05mg/L的小麥樣品的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí) 施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可 從商業(yè)途徑獲得。 實(shí)施例1、桔青毒素分子印跡材料的制備 (1)反應(yīng)物配料處理稱取0. lOOg(O. 532mmol)的1-羥基_2_萘甲酸分子(虛擬 模板)溶于4. 8mL的丙酮(致孔劑)中，加入0. 162mL (1. 88mmol)的MAA (甲基丙烯酸)，超 聲30min，使模板分子與功能單體充分作用，靜置3小時(shí)。 (2)聚合反應(yīng)在上述混合液中加入2. 85mL(14. 39mmol)交聯(lián)劑EDMA(乙二醇二 甲基丙烯酸酯)和0.040g(0.245mmol)AIBN(偶氮二異丁腈)引發(fā)劑，超聲5min，使其充分 溶解后，通N2脫氧5min后密封。在6(TC恒溫水浴中聚合24h，反應(yīng)得到堅(jiān)硬的白色固體聚 合物。 (3)去除模板分子，純化分子印跡聚合物將聚合物粉碎研磨后過(guò)270目篩 (50ym)，所得到的聚合物微粒用甲醇/乙酸(9 : 1，v/v)混合液通過(guò)索氏提取進(jìn)行洗脫抽 提，提取液用紫外分光光度儀檢測(cè)(A 二 220nm)，直至無(wú)模板分子檢出為止，然后用甲醇洗 至中性，7(TC烘干干燥，得到以l-羥基-2-萘甲酸為模板的分子印跡聚合物(MIP)。
(4)檢測(cè)色譜柱洗脫，檢測(cè)分子印跡聚合物將干燥的MIP顆粒填裝到空的色譜 柱(日本島津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim))中，用甲醇和水的混合試劑作為洗脫流動(dòng)相，經(jīng) 液相泵進(jìn)行聯(lián)機(jī)洗脫，洗脫效果經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)洗脫至基線平直為止，說(shuō)明已將模版分子 完全去除。 液相HPLC檢測(cè)條件流動(dòng)相V甲醇V水=80 : 20， pH (甲醇)4. 1 (H3P04)， pH(水)4. 6 (H3P04)，流速為0. 9mL min—、檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，室溫條件下進(jìn)樣10 y L。
為了比較分子印跡聚合物與非分子印跡聚合物對(duì)目標(biāo)分子桔青毒素識(shí)別的差異 性。按照如下方法制備非分子印跡聚合物，與上述制備MIP的區(qū)別在于，下述步驟(1)中沒 有加入模板分子 (1)反應(yīng)物配料處理在4. 8mL的丙酮溶液中，加入0. 162mL的MAA，超聲30min， 使功能單體充分作用，靜置3小時(shí)。 (2)聚合反應(yīng)在上述混合液中加入2. 85mL交聯(lián)劑EDMA和0. 040gAIBN引發(fā)劑， 超聲5min，使其充分溶解后，通N2脫氧5min后密封。在6(TC恒溫水浴中聚合24h，反應(yīng)得到堅(jiān)硬的白色固體聚合物(NIP)。
(3)檢測(cè)色譜柱洗脫，檢測(cè)分子印跡聚合物將干燥的聚合物顆粒填裝到空的色 譜柱中，用甲醇和水的混合試劑作為洗脫流動(dòng)相，經(jīng)液相泵進(jìn)行聯(lián)機(jī)洗脫，洗脫效果經(jīng)檢測(cè) 器檢測(cè)，當(dāng)洗脫至基線平直為止
實(shí)施例2、桔青毒素分子印跡材料的制備(1)反應(yīng)物配料處理稱取0. 056g(0. 3mmo1)的1-羥基_2_萘甲酸分子(虛擬模 板)溶于4. 8mL的二氯甲烷(致孔劑)中，加入2. 4mmo1的甲基丙烯酰胺，超聲30min，使模 板分子與功能單體充分作用，靜置3小時(shí)。 (2)聚合反應(yīng)在上述混合液中加入20mmo1交聯(lián)劑三羥甲基丙烷和 0. 025g(0. 15mmol)AIBN(偶氮二異丁腈)引發(fā)劑，超聲5min，使其充分溶解后，通N2脫氧 5min后密封。在6(TC恒溫水浴中聚合24h，反應(yīng)得到固體聚合物。 (3)去除模板分子，純化分子印跡聚合物將聚合物粉碎研磨后過(guò)270目篩 (80ym)，所得到的聚合物微粒用甲醇/乙酸(6 : 4，v/v)混合液通過(guò)索氏提取進(jìn)行洗脫抽 提，提取液用紫外分光光度儀檢測(cè)(A = 220nm)，直至無(wú)模板分子檢出為止，然后用甲醇洗 至中性，7(TC烘干干燥，得到以l-羥基-2-萘甲酸為模板的分子印跡聚合物(MIP)。
(4)檢測(cè)色譜柱洗脫，檢測(cè)分子印跡聚合物將干燥的MIP顆粒填裝到空的色譜 柱(日本島津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim))中，用甲醇和水的混合試劑作為洗脫流動(dòng)相，經(jīng) 液相泵進(jìn)行聯(lián)機(jī)洗脫，洗脫效果經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)洗脫至基線平直為止，說(shuō)明已將模版分子 完全去除。 液相HPLC檢測(cè)條件流動(dòng)相V甲醇V水=80 : 20， pH (甲醇)4. 1 (H3P04)， pH(水)4. 6 (H3P04)，流速為0. 9mL min—、檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，室溫條件下進(jìn)樣10 y L。
實(shí)施例3、桔青毒素分子印跡材料的制備 (1)反應(yīng)物配料處理稱取0. 15g(0. 8mmo1)的1-羥基-2-萘甲酸分子(虛擬模 板)溶于6mL的氯仿(致孔劑)中，加入2. 26mmol的2-乙烯基吡啶，超聲30min，使模板分 子與功能單體充分作用，靜置3小時(shí)。 (2)聚合反應(yīng)在上述混合液中加入4. 08mL (20. 6mmo1)交聯(lián)劑EDMA (乙二醇二甲 基丙烯酸酯)和0.040g(0.245mmol)AIBN(偶氮二異丁腈)引發(fā)劑，超聲5min，使其充分溶 解后，通N2脫氧5min后密封。在6(TC恒溫水浴中聚合24h，反應(yīng)得到堅(jiān)硬的白色固體聚合 物。 (3)去除模板分子，純化分子印跡聚合物將聚合物粉碎研磨后過(guò)270目篩 (50ym)，所得到的聚合物微粒用甲醇/乙酸(8 : 2，v/v)混合液通過(guò)索氏提取進(jìn)行洗脫抽 提，提取液用紫外分光光度儀檢測(cè)(A 二 220nm)，直至無(wú)模板分子檢出為止，然后用甲醇洗 至中性，7(TC烘干干燥，得到以l-羥基-2-萘甲酸為模板的分子印跡聚合物(MIP)。
(4)檢測(cè)色譜柱洗脫，檢測(cè)分子印跡聚合物將干燥的MIP顆粒填裝到空的色譜 柱(日本島津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim))中，用甲醇和水的混合試劑作為洗脫流動(dòng)相，經(jīng) 液相泵進(jìn)行聯(lián)機(jī)洗脫，洗脫效果經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)洗脫至基線平直為止，說(shuō)明已將模版分子 完全去除。 液相HPLC檢測(cè)條件流動(dòng)相V甲醇V水=80 : 20， pH (甲醇)4. 1 (H3P04)， pH(水)4. 6 (H3P04)，流速為0. 9mL min—、檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，室溫條件下進(jìn)樣10 y L。
實(shí)施例4、桔青毒素分子印跡材料的制備 (1)反應(yīng)物配料處理稱取0. 122g(0. 65mmol)的1-羥基_2_萘甲酸分子(虛擬 模板)溶于6mL的丙酮(致孔劑)中，加入2. 18mmo1的甲基丙烯酸甲酯，超聲30min，使模 板分子與功能單體充分作用，靜置3小時(shí)。 (2)聚合反應(yīng)在上述混合液中加入24mmol交聯(lián)劑EDMA(乙二醇二甲基丙烯酸 酯)和0.049g(0.3mmol)AIBN(偶氮二異丁腈)引發(fā)劑，超聲5min，使其充分溶解后，通N2 脫氧5min后密封。在6(TC恒溫水浴中聚合24h，反應(yīng)得到堅(jiān)硬的白色固體聚合物。
(3)去除模板分子，純化分子印跡聚合物將聚合物粉碎研磨后過(guò)270目篩 (50ym)，所得到的聚合物微粒用甲醇/乙酸(9 : 1，v/v)混合液通過(guò)索氏提取進(jìn)行洗脫抽 提，提取液用紫外分光光度儀檢測(cè)(A 二 220nm)，直至無(wú)模板分子檢出為止，然后用甲醇洗 至中性，7(TC烘干干燥，得到以l-羥基-2-萘甲酸為模板的分子印跡聚合物(MIP)。
(4)檢測(cè)色譜柱洗脫，檢測(cè)分子印跡聚合物將干燥的MIP顆粒填裝到空的色譜 柱(日本島津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim))中，用甲醇和水的混合試劑作為洗脫流動(dòng)相，經(jīng) 液相泵進(jìn)行聯(lián)機(jī)洗脫，洗脫效果經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)洗脫至基線平直為止，說(shuō)明已將模版分子 完全去除。 液相HPLC檢測(cè)條件流動(dòng)相V甲醇V水=80 : 20， pH (甲醇)4. 1 (H3P04)， pH(水)4. 6 (H3P04)，流速為0. 9mL min—、檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，室溫條件下進(jìn)樣10 y L。
實(shí)施例5、 MIP和NIP分別對(duì)1-羥基-2-萘甲酸和桔青毒素的吸附實(shí)驗(yàn)
1)模版分子1-羥基-2-萘甲酸的等溫靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)
(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液 HPLC(紫外檢測(cè))條件日本島津(:18柱(l50mmX4.6mm，5iim);流動(dòng)相V甲醇V 水=80 : 20， pH(甲醇)4. 1 (H3P04) ， pH(水)4. 6 (H3P04);流速為0. 9mL min—、檢測(cè)波長(zhǎng)為 220nm，室溫條件下進(jìn)樣10 y L。 準(zhǔn)確稱取1-羥基-2-萘甲酸標(biāo)準(zhǔn)品50mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，超 聲溶解后稀釋成一定濃度梯度的溶液(濃度分別為0. 01、0. 05、0. 1、0. 5、lmg/L)。按照上 述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定。待儀器基線穩(wěn)定后，由低濃度到高濃度連續(xù)進(jìn)行，每個(gè)濃度各 注入3針，記錄峰面積，由峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得到的l-羥基-2-萘甲酸的標(biāo) 準(zhǔn)曲線方程如下:y = 28. 246x-0. 1525， R2 = 0. 9991。
(2)靜態(tài)吸附 分別稱取20mg實(shí)施例1制備的MIP和NIP(各11份)于干凈的小樣品瓶中，各取 以下濃度(濃度分別為0. 01、0. 03、0. 05、0. 1、0. 3、0. 5、0. 8、1. 0、1. 5、2. 0、2. 7mmol/L)的 l-羥基-2-萘甲酸溶液2ml分別加入樣品瓶中，密封，在室溫下(25°C)恒溫震蕩24h，然后 用0. 22 ii m濾膜過(guò)濾，在同樣條件下用HPLC測(cè)定平衡吸附液中1_羥基_2_萘甲酸的峰面 積，將所得峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出吸附后溶液中l(wèi)-羥基-2-萘甲酸的濃度。然后根據(jù) 吸附前后溶液中l(wèi)-羥基-2-萘甲酸濃度的變化。計(jì)算MIP和NIP對(duì)l-羥基-2-萘甲酸的 吸附量(Q)，計(jì)算公式如下
Q = (C0-C) XV/W 式中Q為吸附量，每克吸附劑所吸附的吸附質(zhì)的摩爾數(shù)，單位為mmol/g ;
C。為原始濃度，單位為mmol/L ;
C為平衡濃度，單位為mmol/L ;
W為印跡聚合物的質(zhì)量，單位為g ;
V為吸附溶液的體積，單位為L(zhǎng)。 以初始1-羥基-2-萘甲酸溶液的濃度對(duì)吸附量作圖，所得到的等溫吸附曲線見圖 1。由圖1可知，本發(fā)明所制備的分子印跡材料對(duì)l-羥基-2-萘甲酸的選擇性高且吸附能 力強(qiáng)。 2、桔青毒素的等溫吸附實(shí)驗(yàn)包括如下步驟
(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液 HPLC(熒光檢測(cè))條件日本島津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim)，流動(dòng)相V乙腈V 水=1 : 1， pH(乙腈)2. 66 (CH3C00H) ， pH(水)2. 48 (CH3C00H)，流速為lmL min—、 Kex = 331nm， Kem = 500nm， 30。C條件下進(jìn)樣20 ii L。 將5mg的桔青毒素標(biāo)準(zhǔn)品(CIT)用甲醇定容于10mL容量瓶中(500mg/L)，超聲 溶解后稀釋成一定濃度梯度的溶液(濃度分別為0. 001、0. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L)。按 照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定。待儀器基線穩(wěn)定后，用HPLC測(cè)定(各濃度自動(dòng)進(jìn)樣3 針)。記錄峰面積，由峰面積對(duì)濃度繪制。所得到的桔青毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下y = 42. 383x+0. 2211， R2 = 0. 9994。
(2)靜態(tài)吸附 分別秤取20mg實(shí)施例1制備的MIP和NIP(各11份)于干凈的小樣品瓶中，各取 以下濃度(濃度分別為0. 008、0. 02、0. 04、0. 08、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 2、1. 6、2. Ommol/L) 的桔青毒素溶液2ml分別加入其中，密封。在室溫下(25°C)恒溫震蕩24h，然后用0. 22 y m 濾膜過(guò)濾，在同樣條件下用HPLC測(cè)定平衡吸附液中CIT的峰面積，將此面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算出吸附后溶液中CIT的濃度。然后根據(jù)吸附前后溶液中CIT濃度的變化，根據(jù)吸附公 式計(jì)算出聚合物對(duì)底物的吸附量。 以初始桔青毒素溶液的濃度對(duì)吸附量作圖，所得到的等溫吸附曲線見圖2。由圖2
可知，以虛擬模板制備的分子印跡材料對(duì)桔青霉素有選擇性吸附能力。 將MIP對(duì)1-羥基-2-萘甲酸和桔青毒素的等溫吸附曲線比較(見圖3)，由圖3可
知本發(fā)明所制備的分子印跡材料對(duì)模板分子的選擇性要高于桔青霉素。 實(shí)施例6、桔青毒素的固相萃取 兩個(gè)3mL的干凈固相萃取小柱中分別裝填250mg實(shí)施例1制備的MIP和NIP，每 次使用前，填料用適量的水和甲醇預(yù)處理。然后用0. 05mg/L桔青毒素標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液5mL通 過(guò)萃取小柱，然后用3ml洗脫液進(jìn)行洗脫。得到的流出液用N2低溫吹干，lmL甲醇溶解定 容，然后通過(guò)HPLC進(jìn)行定量分析，色譜條件與桔青毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液等溫吸附一致。所述洗脫 液可選自下述任意一種1、甲醇；2、甲醇-乙酸混合液(99 : 1， v/v);甲醇-乙酸混合液 (98 : 2，v/v);乙腈?；厥章试?5 98%之間。
實(shí)施例7、在大米樣品中的固相萃取實(shí)驗(yàn)
(1)樣品處理 將500g的大米樣品進(jìn)行研磨(直徑< 0. 2mm)，然后取1. Og樣品用5mL的乙醇/ 水(7 : 3， v/v)的混合液提取，超聲10min，12000rpm離心10min，然后用0.45iim濾器過(guò)
濾上清液。[OO92] (2)大米加標(biāo)回收率測(cè)定 量取10mL上述樣品溶液于小樣品瓶中，共8個(gè)，分為4組，每組中的一個(gè)樣品過(guò) MIP的柱子，另一個(gè)過(guò)NIP的柱子。依次向每組中分別加入O. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4個(gè) 濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。按照以上方法每一組平行做3份，同時(shí)再做一組空白，測(cè)定其回收率，色 譜條件與桔青毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液等溫吸附一致。
(3)大米加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 對(duì)大米分別進(jìn)行了 0. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L4個(gè)濃度的加標(biāo)回收，每個(gè)濃度水
平平行做3份，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，4個(gè)加標(biāo)水平下，樣品的加標(biāo)回收率在86.7%
97. 7%之間，平行3次測(cè)定加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1. 2% 3. 8%之間。圖4為桔青
霉素加標(biāo)濃度為0. 05mg/L的色譜圖。 表1大米樣品4個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果
加標(biāo)濃度mg/L(n=3)
加標(biāo) 0.005 0.01 0.05 0.1
樣品__
回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率 RSD
_(%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
97.8 87.5 96.7 94.7
大米 98.8 1.3 86.6 1.2 96.1 2.3 89.8 3.8
_^__^_^_ 實(shí)施例8、在桔子樣品中的固相萃取實(shí)驗(yàn) [OO"] (1)樣品處理將500g的桔子樣品搗碎，然后以1. Og樣品用5mL的乙醇/水(7 : 3， v/v)的混 合液提取，超聲10min， 12000rpm離心10min，然后用0. 45 y m濾器過(guò)濾上清液。
(2)桔子加標(biāo)回收率測(cè)定 量取10mL上述樣品溶液于小樣品瓶中，共8個(gè)，分為4組，每組中的一個(gè)樣品過(guò) MIP的柱子，另一個(gè)過(guò)NIP的柱子。依次向每組中分別加入O. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4個(gè) 濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。按照以上方法每一組平行做3份，同時(shí)再做一組空白，測(cè)定其回收率，色 譜條件與桔青毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液等溫吸附一致。
(3)桔子加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)大米分別進(jìn)行了 0. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4個(gè)濃度的加標(biāo)回收，每個(gè)濃度水
平平行做3份，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，4個(gè)加標(biāo)水平下，樣品的加標(biāo)回收率在91. 3%
95. 9%之間，平行3次測(cè)定加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2. 1% 3. 8%之間。圖5為桔青
毒素加標(biāo)濃度為0. 05mg/L的色譜圖。表2桔子樣品4個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果加標(biāo)濃度mg/L(n=3)
力口標(biāo) 0.005 0.01 0.05 0.1
樣品_
回收率RSD 回收率RSD 回收率RSD 回收率 RSD
_(%) (%) (%) (%) (%)(%)(%) (%)
91.1 94.3 96.4 89.3 桔子 96.2 3.8 98.3 2.1 93.5 2.9 91.6 2.1 __^_^_^_ 實(shí)施例9、在小麥樣品中的固相萃取實(shí)驗(yàn)
(1)樣品處理 將500g的小麥樣品搗碎，然后以1. 0g樣品用5mL的乙醇/水(7 : 3， v/v)的混 合液提取，超聲10min， 12000rpm離心10min，然后用0. 45 y m濾器過(guò)濾上清液。
(2)小麥加標(biāo)回收率測(cè)定 量取10mL上述樣品溶液于小樣品瓶中，共8個(gè)，分為4組，每組中的一個(gè)樣品過(guò) MIP的柱子，另一個(gè)過(guò)NIP的柱子。依次向每組中分別加入O. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4個(gè) 濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。按照以上方法每一組平行做3份，同時(shí)再做一組空白，測(cè)定其回收率，色 譜條件與桔青毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液等溫吸附一致。
(3)小麥加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)大米分別進(jìn)行了 0. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4個(gè)濃度的加標(biāo)回收，每個(gè)濃度水
平平行做3份，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)表明4個(gè)加標(biāo)水平下，樣品的加標(biāo)回收率在90. 9%
94. 6%之間，平行3次測(cè)定加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1. 2% 3. 7%之間。圖6為桔青
毒素加標(biāo)濃度為0. 05mg/L的色譜圖。表3小麥樣品4個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果
加標(biāo)濃度mg/L(n=3)
力口標(biāo) 0.005 0.01 0.05 0.1
樣品 _
回收率RSD 回收率RSD 回收率RSD 回收率 RSD
_(%) (%) (%) (%) (%)(%)(%) (%)
90.8 卯.2 89.8 98.1 小麥 89.9 1.2 90.8 1.7 90.1 2.193.8 3.7 __^__^_ 實(shí)施例7-9不同樣品的固相萃取實(shí)驗(yàn)回收率結(jié)果表明，以本發(fā)明所提供的桔青毒 素印跡材料為填料制備的固相萃取柱與液相色譜聯(lián)用，可以準(zhǔn)確測(cè)定桔青毒素。
權(quán)利要求
一種桔青毒素分子印跡材料的制備方法，包括下述步驟1)將聚合物單體、模板分子和致孔劑混合，得到混合液，并使所述混合液靜置；然后向所述混合液中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑并使其溶解，然后脫除混合液中的氧氣，進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚合產(chǎn)物；其中，所述聚合物單體選自下述任意一類或兩類丙烯酸類單體、丙烯酸酯類單體、酰胺類單體和吡啶類單體；所述模板分子選自下述任意一種1-羥基-2-萘甲酸、1-羥基-4-甲基-2-萘甲酸、1-羥基-4-乙基-2-萘甲酸、1-羥基-5-甲基-2-萘甲酸、1-羥基-5-乙基-2-萘甲酸、1-羥基-6-甲基-2-萘甲酸、1-羥基-6-乙基-2-萘甲酸、1-羥基-4，5-二甲基-2-萘甲酸、1-羥基-4，5-二乙基-2-萘甲酸、1-羥基-5，6-二甲基-2-萘甲酸、1-羥基-5，6-二乙基-2-萘甲酸、1-羥基-4，6-二甲基-2-萘甲酸、1-羥基-4，6-二乙基-2-萘甲酸、1-羥基-4，5，6-三甲基-2-萘甲酸和1-羥基-4，5，6-三乙基-2-萘甲酸；2)去除所述聚合產(chǎn)物中的模板分子，得到桔青毒素分子印跡材料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述模板分子為l-羥基-2-萘甲酸；所 述丙烯酸類單體為丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸，丁基丙烯酸，叔丁基丙烯酸或三氟甲 基丙烯酸，所述丙烯酸酯類單體為甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，二 甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸乙酯或二甲基丙烯酸丁酯，所述酰胺類單體為丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺或乙基丙烯酰胺，所述吡啶類單體為2-乙烯基吡啶或4-乙烯 基吡啶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述致孔劑選自下述任意一種丙 酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷和四氯甲烷；所述交聯(lián)劑選自下述任意一種乙二醇二異丁烯、三 羥甲基丙烷、三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯基戊四醇、三丙烯酸酯 和季戊四醇四丙烯酸酯；所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中所述模板分子、所述聚合物單體、所述交聯(lián)劑和所述引發(fā)劑的摩爾比依次為(0.30-0. 80)mmol : (0.9-2.4) mmol : (8-24) mmol : (0. 15-0. 40) mmol ;所述聚合物單體與所述致孔劑的比例為 (0.9-2.4),1 : (4-10)mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述聚合反應(yīng)以熱引發(fā)或光引 發(fā)的方式進(jìn)行；所述熱引發(fā)的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度為50°C -IO(TC，反應(yīng)時(shí)間為18-24小 時(shí)；所述光引發(fā)的反應(yīng)條件為365mm汞燈照射。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5中任一所述的方法，其特征在于步驟2)中去除所述聚合產(chǎn)物中 的模板分子的方法如下將所述聚合產(chǎn)物粉碎至粒徑為30-80um，然后用甲醇和乙酸的混 合溶液通過(guò)索氏提取對(duì)粉碎后的聚合產(chǎn)物進(jìn)行洗脫抽提，除去聚合產(chǎn)物中的模板分子，用 甲醇洗至中性，干燥，得到桔青毒素分子印跡材料；其中，所述甲醇和乙酸的混合溶液中甲 醇和乙酸的體積比為9 : 1 6 : 4。
7. 權(quán)利要求1-6中任一所述方法制備得到的桔青毒素分子印跡材料。
8. —種固相萃取柱填料，其由權(quán)利要求7所述的桔青毒素分子印跡材料形成。
9. 以權(quán)利要求7所述的桔青毒素分子印記材料為填料制成的固相萃取柱。
10. 權(quán)利要求9所述的固相萃取柱在分離純化桔青毒素或檢測(cè)桔青毒素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種桔青毒素分子印跡材料及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的桔青毒素分子印跡材料是按照包括下述步驟的方法制備得到的1)將聚合物單體、模板分子和致孔劑混合，得到混合液，并使所述混合液靜置；然后向所述混合液中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑并使其溶解，然后脫除混合液中的氧氣，進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚合產(chǎn)物；其中，所述聚合物單體選自下述任意一類或兩類丙烯酸類單體、丙烯酸酯類單體、酰胺類單體和吡啶類單體；所述模板分子1-羥基-2-萘甲酸；2)去除所述聚合產(chǎn)物中的模板分子，得到桔青毒素分子印跡材料。以所述桔青毒素分子印記材料為填料制成的固相萃取柱可用于分離純化或檢測(cè)桔青毒素。
文檔編號(hào)B01J20/30GK101768238SQ20101003412
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者張丹莉, 李建中, 王會(huì)利, 郭寶元, 金惠芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心