本發(fā)明涉及功能高分子技術(shù)、分析化學(xué)和生物分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種靶向線粒體苝酐熒光探針及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
熒光成像是一種非常有用的檢測手段,它具有非離子低能量輻射、高敏感性、連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測、無創(chuàng)性或微創(chuàng)性等優(yōu)勢,能夠滿足生物醫(yī)學(xué)研究和臨床治療上的需求,在生物組織成像方面發(fā)展迅猛。盡管有時(shí)可以利用細(xì)胞內(nèi)源分子的熒光進(jìn)行熒光成像,但是僅僅依靠蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光還不能滿足研究的需要,因此需要選擇合適的熒光探針進(jìn)行標(biāo)記。熒光成像的核心問題是熒光分子探針的選擇與優(yōu)化。熒光探針的選擇主要考慮以下幾個(gè)方面:水溶性、熒光性、光學(xué)穩(wěn)定性、毒性和pH適用范圍、特異性和標(biāo)記條件等[1]。
苝酐因具有較大的平面共軛結(jié)構(gòu),本身就是一種性能優(yōu)良的紅色染料。兩個(gè)萘單元通過兩個(gè)sp2雜化的C-C單鍵相連而形成的一個(gè)大的共軛平面芳香體系,這種共軛大π鍵電子結(jié)構(gòu)賦予了苝酐優(yōu)異的光電性質(zhì)和化學(xué)穩(wěn)定性,使苝酐具有光化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng),熒光量子產(chǎn)率高等特點(diǎn)。不過,同時(shí)也使苝酐分子的溶解性變得很差,不利于苝酐的在現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中的推廣。經(jīng)過化學(xué)修飾,苝酐類化合物的溶解性和熒光量子產(chǎn)率均能夠得到很大程度的提高。苝酐核的化學(xué)修飾位置可以有兩種方式:第一種是在苝酐環(huán)上的1,6,7,12位(即bay區(qū)域)引入取代基(如鹵素等)。此位置取代基的引入,使得苝類衍生物的熒光性能發(fā)生顯著的變化,同時(shí)它的溶解性能也會得到相應(yīng)的改善。第二種是在酐的O原子上引入不同的取代基。這是一種有效改善苝酐溶解性的手段。此位置取代基的引入并沒有使得苝酐化合物的光電性能發(fā)生明顯改變。研究發(fā)現(xiàn),苝酐衍生物的溶解性,主要取決于酐位取代基的影響。大尺寸取代基團(tuán)(如燕尾取代基)的引入可以減弱苝酐分子間的π-π堆積。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題,并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種靶向線粒體苝酐熒光探針,其在熒光基團(tuán)苝酰亞胺兩側(cè)與兩條水溶性的PEO鏈相連,極大地提高了該探針的親水性;由于連接基團(tuán)的存在,使得整個(gè)共軛平面增大,探針的熒光性能得到提高;在連接基團(tuán)位置引入了三苯基膦陽離子,作為靶向基團(tuán),能夠特異性結(jié)合到線粒體上;
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種靶向線粒體苝酐熒光探針在熒光成像中的應(yīng)用,保證了很高的細(xì)胞上載率,易于檢測完整細(xì)胞形態(tài);
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種靶向線粒體苝酐熒光探針的使用方法,在合適的熒光探針濃度和處理時(shí)間的情況下,其能夠保證該熒光探針的細(xì)胞上載率接近100%,并且不會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn),提供了一種靶向線粒體苝酐熒光探針,其結(jié)構(gòu)式為:
所述靶向線粒體苝酐熒光探針的分子式為C104H108Br2N4O18P2,摩爾質(zhì)量為1923.74。
一種靶向線粒體苝酐熒光探針在活細(xì)胞熒光成像中的應(yīng)用,其中,所述靶向線粒體苝酐熒光探針與線粒體結(jié)合。
一種靶向線粒體苝酐熒光探針的使用方法,包括以下步驟:將活細(xì)胞加入到含有探針濃度n≥1μg/mL的探針溶液中處理一定時(shí)間。
優(yōu)選的是,將活細(xì)胞加入到含有探針濃度n≥10μg/mL的探針溶液中處理至少60min。
優(yōu)選的是,將活細(xì)胞加入到含有探針濃度n≥10μg/mL的探針溶液中處理60-120min。
優(yōu)選的是,所述探針溶液中探針濃度為10μg/mL≤n≤100μg/mL。
優(yōu)選的是,所述探針溶液中探針濃度為n=20μg/mL。
本發(fā)明至少包括以下有益效果:
PEO鏈?zhǔn)撬幬镙斶\(yùn)時(shí)應(yīng)用最廣泛的側(cè)基,它可以降低藥物輸運(yùn)載體與血細(xì)胞的反應(yīng),提高熒光探針的水溶性和生物相容性。本申請?jiān)跓晒饣鶊F(tuán)苝酰亞胺兩側(cè)與兩條水溶性的PEO鏈相連,極大地提高了該探針的親水性;由于連接基團(tuán)的存在,使得整個(gè)共軛平面增大,探針的熒光性能得到提高;在連接基團(tuán)位置引入了三苯基膦陽離子,作為靶向基團(tuán),能夠特異性結(jié)合到線粒體上;在合適的熒光探針濃度和處理時(shí)間的情況下,本發(fā)明提供的熒光探針的細(xì)胞上載率接近100%,說明本發(fā)明提供的熒光探針很容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并與線粒體的內(nèi)膜結(jié)合,細(xì)胞上載率很高,細(xì)胞通透性很好,并且沒有產(chǎn)生細(xì)胞毒性,適用于對活細(xì)胞進(jìn)行顯微成像。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn),部分還將通過對本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的TMAFP探針在不同濃度下對HeLa細(xì)胞活性的影響的柱形圖;
圖2為實(shí)施例2中空白樣的共聚焦檢測成像照片:其中,圖2a為合圖,圖2b為熒光照片和圖2c明場照片;
圖3為實(shí)施例2中熒光探針濃度為0.5μg/ml的共聚焦檢測成像照片:其中,圖3a為合圖,圖3b為熒光照片和圖3c明場照片;
圖4為實(shí)施例2中熒光探針濃度為1μg/ml的共聚焦檢測成像照片;B為熒光譜圖;其中,圖4a為合圖,圖4b為熒光照片和圖4c明場照片;
圖5為實(shí)施例2中熒光探針濃度為10μg/ml的共聚焦檢測成像照片;B為熒光譜圖;其中,圖5a為合圖,圖5b為熒光照片和圖5c明場照片;
圖6為實(shí)施例2中熒光探針濃度為20μg/ml的共聚焦檢測成像照片;其中,圖6a為合圖,圖6b為熒光照片和圖6c明場照片;
圖7為實(shí)施例2中熒光探針濃度為50μg/ml的共聚焦檢測成像照片;其中,圖7a為合圖,圖7b為熒光照片和圖7c明場照片;
圖8為實(shí)施例2中在HeLa細(xì)胞內(nèi)的共聚焦檢測成像照片:其中,8A、明場,8B、TMAFP探針,8C、商用染料Mitotracker Red,8D、ABC合圖,8E、BC合圖,8F、HeLa細(xì)胞TMAFP探針和Mitotracker Red的選定研究區(qū)域(E中白線)的強(qiáng)度空間分布圖;
圖9為實(shí)施例3中探針濃度為0、1、10、20、50、100μg/mL時(shí)得到流式細(xì)胞分析圖,其中,a、b、c、d、e和f分別對應(yīng)六個(gè)熒光探針濃度為0、0.01、0.1、0.2、0.5和1.0μg/mL;
圖10為實(shí)施例3中探針濃度為0、0.01、0.1、0.2、0.5、1.0μg/mL時(shí)得到的直方圖,其中,a、b、c、d、e和f分別對應(yīng)六個(gè)熒光探針濃度為0、0.01、0.1、0.2、0.5和1.0μg/mL。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明,以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
應(yīng)當(dāng)理解,本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。
實(shí)施例1
一種靶向線粒體苝酐熒光探針,其特征在于,其結(jié)構(gòu)式為:
所述靶向線粒體苝酐熒光探針的分子式為C104H108Br2N4O18P2,摩爾質(zhì)量為1923.74。
實(shí)施例2
如上述實(shí)施例1的靶向線粒體苝酐熒光探針在活細(xì)胞熒光成像中的應(yīng)用。
本發(fā)明申請人應(yīng)用本探針對活細(xì)胞標(biāo)記并進(jìn)行了細(xì)胞毒性和成像分析,具體實(shí)驗(yàn)方法如下:
2.1試劑如下表1所示:
表1試劑
2.2儀器如下表2所示:
表2儀器
2.3細(xì)胞培養(yǎng)
(1)將人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)接種在含10%胎牛血清、100U/mL的鏈霉素、100U/mL的青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基上;
(2)在37℃,5%CO2的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng),每24個(gè)小時(shí)更替一次培養(yǎng)基;
(3)當(dāng)細(xì)胞生長到80%后,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。
2.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析:
2.4.1本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8細(xì)胞試劑盒來測定細(xì)胞生存率,步驟如下:
(1)收集細(xì)胞,加細(xì)胞懸液100ul到96孔板,并設(shè)置了一組空白組和三組對照組;
(2)放置在5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,在37℃下孵育過夜,倒置顯微鏡下觀察;
(3)每孔加入10ul濃度為0.1、1、5、20、100μg/mL的探針溶液,37℃孵育時(shí)間為24h、48h、72h;
(4)每孔加入10ulCCK-8溶液,37℃孵育時(shí)間為3h后,利用CCK-8比色法,使用酶標(biāo)儀測定在波長為450nm處吸光度(OD值),根據(jù)如下公式對HeLa細(xì)胞的生存率進(jìn)行計(jì)算。
細(xì)胞生存率/%=(ODtreated/ODcontrol)×100%
2.4.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分析
CCK-8Cell Counting kit基于WST-8,廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測。WST-8與MTT類似,在電子耦合試劑存在情況下,可以被細(xì)胞里線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為高度水溶性的黃色甲染料(Formazan dye),且生成的黃色甲化合物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量是正比關(guān)系。因此,根據(jù)這一原理能夠直接進(jìn)行細(xì)胞的毒性分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表3、表4和表5所示:
表3 24h CCK-8
表4 42h CCK-8
表5 72h CCK-8
我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡單計(jì)算,檢測結(jié)果如圖1所示:
空白組實(shí)驗(yàn)沒有加入探針的HeLa細(xì)胞的活力認(rèn)為是100%,加入探針TMAFP后,探針最終的濃度為0.1、1.0、5.0、25、100μg/mL,孵育時(shí)間為24h、48h、72h,每個(gè)濃度做了三個(gè)平行試驗(yàn),最后測得的生存率取平均值。從圖觀察得知,孵育時(shí)間為24h,最低的生存率為91%,說明對細(xì)胞沒有毒性。孵育時(shí)間48h、72h,細(xì)胞生存率的生存率同樣在90%以上。細(xì)胞的生存率基本上沒有變化,維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的狀態(tài),說明對細(xì)胞沒有毒性。綜上所述,這個(gè)探針在濃度達(dá)到100μg/mL以下時(shí),不會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性,能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。
2.5細(xì)胞成像及結(jié)果分析
2.5.1為了研究探針在活細(xì)胞中熒光成像的具體情況,我們選擇了激光掃描共聚焦顯微鏡這一先進(jìn)的工具,具體的實(shí)驗(yàn)過程為:
(1)選擇處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞,對細(xì)胞懸液密度進(jìn)行調(diào)整,然后在直徑為2cm的玻底培養(yǎng)皿中進(jìn)行接種,接種的密度為1.5×104個(gè)/mL,每個(gè)培養(yǎng)皿要接種2mL,將其置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h,細(xì)胞貼壁生長。
(2)加入超純水溶液使探針的測試濃度為0.5、1、10、20、50μg/ml,不加任何化合物組為空白樣,培養(yǎng)箱中孵育30min。
(3)終止培養(yǎng),使用PBS緩沖溶液洗滌三次,最后再加入1mL的PBS緩沖溶液,利用激光共聚焦顯微鏡掃描成像。
2.5.2細(xì)胞內(nèi)熒光成像分析
利用激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000),設(shè)置采集圖像所用的激發(fā)波長為448nm,主要收集500-600nm區(qū)域之間發(fā)射的熒光,每個(gè)樣品測定分合圖、熒光和明場三種方式,結(jié)果如圖2-圖7所示。
通過對比這一系列的熒光場,我們可以發(fā)現(xiàn)隨著探針濃度的增加,熒光強(qiáng)度顯著增加,說明我們的探針能夠進(jìn)入細(xì)胞并熒光成像;通過觀察如圖2-圖7所示的合圖2a-圖7a,我們發(fā)現(xiàn)熒光圖2b-圖7b的發(fā)光區(qū)域基本與明場2c-7c上的細(xì)胞分布部位重合,并且發(fā)光區(qū)域呈現(xiàn)出短棒狀或圓球狀,很可能是定位在線粒體結(jié)構(gòu)中。
2.5.3細(xì)胞內(nèi)熒光定位分析
為了證實(shí)本探針定位在線粒體中,我們用探針TMAFP與已知的線粒體定位試劑(Mitotracker Red染料)做細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。將探針TMAFP與商用染料Mitotracker Red共同對HeLa細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),用PBS平衡鹽緩沖溶液洗滌三次,在共聚焦顯微鏡下觀察熒光成像情況,結(jié)果如圖8所示:從圖8E上可以觀察到,我們發(fā)現(xiàn)商用染料Mitotracker Red與TMAFP探針在細(xì)胞內(nèi)的熒光成圖像基本重疊,皮爾遜系數(shù)為0.758,該結(jié)果說明了TMAFP探針可以定位到活細(xì)胞線粒體上。此外,從圖8F可以觀察到TMAFP探針和染料Mitotracker Red的強(qiáng)度空間分布是相似的,這結(jié)果進(jìn)一步說明了TMAFP探針能夠定位在線粒體,并實(shí)現(xiàn)線粒體成像。
實(shí)施例3
一種靶向線粒體苝酐熒光探針的使用方法,包括以下步驟:將活細(xì)胞加入到含有探針濃度n≥1μg/mL的探針溶液中處理一定時(shí)間。
在一個(gè)優(yōu)選方案中,將活細(xì)胞加入到含有探針濃度n≥10μg/mL的探針溶液中處理至少60min。
在一個(gè)優(yōu)選方案中,將活細(xì)胞加入到含有探針濃度n≥10μg/mL的探針溶液中處理60-120min。
在一個(gè)優(yōu)選方案中,所述探針溶液中探針濃度為10μg/mL≤n≤100μg/mL。
在一個(gè)優(yōu)選方案中,所述探針溶液中探針濃度為n=20μg/mL。
3.1針對上述方法,本發(fā)明申請人對熒光探針對活細(xì)胞的上載率做了如下具體實(shí)驗(yàn)和分析:
3.1.1細(xì)胞上載率實(shí)驗(yàn)
用對數(shù)期的HeLa細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液的密度,接種在孔培養(yǎng)板中,接種密度是2.5×104個(gè)/mL,每孔接種2mL。⑵待細(xì)胞生長到90%后,加入三種化合物的超純水溶液使每孔測試終濃度為0、1.0、10、20、50、100μg/mL,每個(gè)濃度做3個(gè)平行試驗(yàn),不加任何化合物的孔內(nèi)細(xì)胞作對照,然后在培養(yǎng)箱中孵育1h。⑶取出6孔培養(yǎng)板,用PBS溶液沖洗孔板2遍,用0.05%的胰蛋白酶分別消化細(xì)胞,然后收集在4mLEP管中。⑷轉(zhuǎn)入離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速1000r/min離心4min,倒掉上清液,再用0.5mLPBS緩沖溶液重懸細(xì)胞,根據(jù)該探針的性質(zhì)我們選擇流式細(xì)胞儀在激發(fā)光波長為488nm處,F(xiàn)L2通道收取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),檢測細(xì)胞的上載率。
3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
分析得知當(dāng)探針濃度為1μg/mL時(shí),發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為26.48%,當(dāng)探針濃度為10μg/mL時(shí),發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為99.69%,當(dāng)探針濃度為20μg/mL時(shí),發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為99.88%,當(dāng)探針濃度為50μg/mL時(shí),發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為99.98%,當(dāng)探針濃度為100μg/mL時(shí),發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為99.99%。具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表6:
表6發(fā)光細(xì)胞數(shù)百分比
如圖9并結(jié)合上表6可知,當(dāng)探針濃度不斷增加時(shí),發(fā)光細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的百分比很快接近100%,當(dāng)探針濃度為10μg/mL時(shí),發(fā)光細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的百分比為99.69%,絕大多數(shù)探針已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),隨著探針濃度的繼續(xù)增加,發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比依然非常高。說明該探針很容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞上載率很高,細(xì)胞通透性很好,并且并沒有產(chǎn)生細(xì)胞毒性(壞死細(xì)胞、細(xì)胞碎片等不會發(fā)光,探針進(jìn)入細(xì)胞后,生長正常的細(xì)胞才會發(fā)光)。
3.2針對上述方法,本發(fā)明申請人對熒光探針靈敏度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
通過上一部分的實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)探針能夠很好的進(jìn)入細(xì)胞,因此我們利用流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)對探針在細(xì)胞內(nèi)發(fā)光靈敏度進(jìn)行分析,得到如下結(jié)果:
3.2.1探針靈敏度的檢測
探針靈敏度的檢測與上述步驟相同,只是將終濃度變?yōu)?、0.01、0.1、0.2、0.5、1.0μg/mL,每個(gè)終濃度做3個(gè)平行試驗(yàn)。
3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
分析得知當(dāng)探針濃度為0.01μg/mL時(shí),發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為1.3%,當(dāng)探針濃度為0.1μg/mL后,發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為1.58%,當(dāng)探針濃度為0.2μg/mL后,發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為1.68%,當(dāng)探針濃度為0.5μg/mL后,發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為3.13%,當(dāng)探針濃度為1μg/mL后,發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為4.88%。詳細(xì)數(shù)據(jù)見下表7:
表7發(fā)光細(xì)胞數(shù)百分比
根據(jù)上表7中數(shù)據(jù)可知:隨熒光探針濃度的增加,發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量也隨之增加,而且我們可以看出熒光探針濃度的一個(gè)微小的變化都會使發(fā)光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比產(chǎn)生較大的變化,所以可以說明本發(fā)明提供的熒光探針的靈敏度很高。
3.3針對上述方法,本發(fā)明申請人對熒光探針對細(xì)胞周期影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
3.3.1對細(xì)胞周期影響實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)證明本實(shí)驗(yàn)室合成的靶向線粒體的苝酐探針不僅有很好的靈敏度而且對細(xì)胞幾乎沒有毒性,為了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果我們利用流式細(xì)胞儀研究樣品對細(xì)胞周期的影響。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)與上述步驟也相同,只將終濃度變?yōu)?、0.5、1.0、10、20、50μg/mL,每個(gè)終濃度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。
3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
探針濃度為0(空白)、0.5、1、10、20、50μg/mL時(shí)的HeLa細(xì)胞周期分析結(jié)果如圖10所示:試驗(yàn)組分為5個(gè)劑量組,0.5、1.0、10、20、50μg/mL,利用流式細(xì)胞儀檢測該細(xì)胞周期分布的變化。詳細(xì)數(shù)據(jù)見下表11:
表8各時(shí)期細(xì)胞數(shù)量百分比
相對于正常對照組G1期細(xì)胞比率(60.79%),5個(gè)試驗(yàn)組的G1期細(xì)胞基本趨于穩(wěn)定。同樣,相對于對照組S期(31.75%)、G2期(7.46%)細(xì)胞比率,5個(gè)試驗(yàn)組的S期、G2期細(xì)胞也基本趨于穩(wěn)定。G1、G2、S期的細(xì)胞比例基本穩(wěn)定,上下波動并不大,說明在當(dāng)探針作用到細(xì)胞后該探針的加入并不會影響細(xì)胞各個(gè)周期的DNA含量,即不會影響細(xì)胞周期。
盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上,但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用,它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域,對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言,可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改,因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下,本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。