利用變形梯度凝膠電泳鑒定海洋線蟲的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用變形梯度凝膠電泳鑒定海洋線蟲的方法，其特征是，包括以下步驟：（1）采樣及室內(nèi)分選；（2）形態(tài)學(xué)鑒定；（3）總DNA的提取；（4）PCR引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化；（5）瓊脂糖電泳檢測；（6）變性梯度凝膠的制備；（7）變性梯度凝膠電泳條件的優(yōu)化；（8）運(yùn)用變性梯度凝膠電泳對海洋線蟲進(jìn)行鑒定分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：將DGGE技術(shù)運(yùn)用到了海洋線蟲的鑒定中，并運(yùn)用該技術(shù)對海洋線蟲的群落組成進(jìn)行分析；根據(jù)特征性圖譜，可獲得相關(guān)線蟲在變性梯度凝膠上的遷移率，可以較好的進(jìn)行區(qū)分鑒定，對于難于鑒定的物種，有時(shí)需要采取兩對以上的引物組合使用。
【專利說明】
利用變形梯度凝膠電泳鑒定海洋線蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及到海洋沉積物中海洋線蟲的物種鑒定及群落組成檢測的技術(shù)領(lǐng)域，特 別設(shè)及DGGE技術(shù)在鑒定海洋線蟲中的使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小型底棲生物(meiobenthos)是一類能通過0.5mm孔經(jīng)網(wǎng)篩，但被0.042mm網(wǎng)篩截 留的一類動(dòng)物，其中自由生活線蟲是小型底棲生物的最優(yōu)勢類群。在大多數(shù)生境中，海洋線 蟲的數(shù)量可占整個(gè)小型底棲動(dòng)物數(shù)量的70%-90%，在某些生境中可達(dá)到90%W上。海洋線蟲 高度的物種多樣性和豐度，表明它們是海洋中演化最成功的類群之一。運(yùn)一物種在海洋沉 積物中的作用，不僅在于其數(shù)量和生物量上的優(yōu)勢，還在于它在食物網(wǎng)中與其他物種的關(guān) 系。此外，海洋線蟲W其特有的生殖對策，在水層-底棲生態(tài)系統(tǒng)的能量轉(zhuǎn)換中，在攝食和刺 激微生物的生產(chǎn)方面具有全球性的效應(yīng)。
[0003] 海洋線蟲和其他小型底棲生物類群是海洋環(huán)境質(zhì)量的重要指示者，是評價(jià)群落健 康程度和環(huán)境變化的敏感指示類群。海洋線蟲的物種豐富度相對穩(wěn)定，生活周期短，對生態(tài) 系統(tǒng)的改變具有較高的適應(yīng)性，并且樣品的采集和處理都很簡單，因此，按照水框架指令， 將其定為海洋生態(tài)監(jiān)測評估體系的一個(gè)重要指標(biāo)。運(yùn)類生物對環(huán)境的適應(yīng)度，W及對海水 污染的耐受程度和敏感程度不同，可W依據(jù)其密度、種類組成、群落結(jié)構(gòu)變化對海洋底棲環(huán) 境的健康狀況進(jìn)行診斷。國內(nèi)外已經(jīng)有越來越多的學(xué)者，將海洋線蟲和其它小型底棲生物 作為海洋生態(tài)監(jiān)測評估體系的一個(gè)重要指標(biāo)，應(yīng)用于海洋環(huán)境監(jiān)測中。
[0004] 對海洋線蟲進(jìn)行種類鑒定是線蟲研究中最重要的工作之一。目前，海洋線蟲的鑒 定主要是采用形態(tài)學(xué)的分析方法。運(yùn)種方法W線蟲的形態(tài)特征和超微結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，運(yùn)用顯 微鏡對線蟲進(jìn)行鑒定，是海洋線蟲分類鑒定的基礎(chǔ)。該方法可靠性強(qiáng)，在線蟲的多樣性、時(shí) 空分布等研究中一直起著不可替代的作用。但是海洋線蟲微小的個(gè)體W及外部形態(tài)因發(fā)育 階段的不同常發(fā)生很大的變化，給主要依據(jù)形態(tài)特征來鑒定的經(jīng)典分類工作帶來很大困 難，迫切需要新的研究手段。近些年來，現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展為海洋線蟲的鑒定提供 了新的思路，研究者們相繼從不同角度出發(fā)，利用生物化學(xué)、分子生物學(xué)等多種技術(shù)，探索 對海洋線蟲的種類鑒定。
[0005] 分子多態(tài)性技術(shù)在種質(zhì)鑒定中也有其獨(dú)特的優(yōu)勢。各種多態(tài)性技術(shù)都是基于基因 組DNA水平的差異，具有檢測效率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。運(yùn)些分子標(biāo)記技術(shù)不僅用于遺傳多 樣性、系統(tǒng)進(jìn)化及分類、遺傳育種的研究，還用于種質(zhì)鑒定。尤其是在海洋浮游動(dòng)物遺傳多 樣性研究的應(yīng)用，將生物多樣性研究從物種水平推進(jìn)到了分子水平，反映更多的多態(tài)信息， 為種群遺傳分化、遺傳信息交流和與環(huán)境的關(guān)系提供了新的研究思路。其中，變性梯度凝膠 電泳技術(shù)(DGGE技術(shù))不僅結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好、操作簡便快速，而且可W同時(shí)對大量的樣品 進(jìn)行分析，可W對微生物群落的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測，因此近年來已被廣泛用于海洋生態(tài)系 統(tǒng)中浮游生物多樣性、時(shí)空變化及物種鑒定的研究中。此外，充分了解該技術(shù)的局限性并綜 合使用PCR-DGGE技術(shù)與其它生物學(xué)技術(shù)，可W更加詳盡地了解微生物群落的結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài) 變化，獲得全面可靠的生物學(xué)信息，運(yùn)無疑會(huì)在微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域開拓一個(gè)新景象。
[0006] 青島有機(jī)質(zhì)污染帶海洋線蟲3個(gè)新種的描述是我國首次關(guān)于海洋線蟲分類學(xué)的研 究，此后陸續(xù)有一批關(guān)于黃勸海、廈口島、中國臺(tái)灣海峽W及大亞灣等海域海洋線蟲新種的 描述工作，運(yùn)些為線蟲的生物多樣性研究奠定了很好的基礎(chǔ)。但是目前國內(nèi)研究主要是種 類調(diào)查、種群結(jié)構(gòu)W及監(jiān)測潮間帶有機(jī)質(zhì)污染等方面，并且大多都是基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)研 究，運(yùn)就需要大批海洋線蟲專家，但效率低下，且數(shù)據(jù)整合也比較困難。因此，分子生物學(xué)的 鑒定方法可W對海洋線蟲進(jìn)行高效鑒定和分類，進(jìn)而加速新種的發(fā)掘，為我國海洋生物資 源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。
[0007] 綜上所述，將DGGE技術(shù)運(yùn)用到海洋線蟲的研究中，無疑是對現(xiàn)有鑒定方法的很好 補(bǔ)充，可W解決當(dāng)前線蟲鑒定中存在的問題，高通量、快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行種質(zhì)鑒定及群落組 成的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，將變形梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)應(yīng)用到線蟲的 鑒定中，并運(yùn)用該技術(shù)對線蟲的群落多樣性組成進(jìn)行研究，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供 了一種DGGE技術(shù)在海洋線蟲鑒定及多樣性研究中的使用方法。
[0009] 本發(fā)明利用變形梯度凝膠電泳鑒定海洋線蟲的方法，包括W下步驟： (1) 采樣及室內(nèi)分選 (2) 形態(tài)學(xué)鑒定 (3) 總DNA的提取 (4) PCR引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化 巧)瓊脂糖電泳檢測 (6) 變性梯度凝膠的制備 (7) 變性梯度凝膠電泳條件的優(yōu)化 (8) 運(yùn)用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對海洋線蟲進(jìn)行鑒定分析。
[0010] 所述步驟(1)為:將樣品于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用0.1%虎紅進(jìn)行染色(24小時(shí)），隨后用蒸饋水 進(jìn)行沖洗，使樣品通過孔徑分別為50化m和31叫1的兩層網(wǎng)篩，將截留在31叫1網(wǎng)篩上的樣品， 用Ludox-TM溶液（比重為1.15)轉(zhuǎn)移到離屯、管中并攬拌均勻，ISOOrmp離屯、10分鐘(S次離 屯、）。將所得的上清液再用31ym的網(wǎng)篩過濾，去掉Ludox，將樣品轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿。
[0011] 所述步驟(2)為：向盛有線蟲的培養(yǎng)皿中加入甘油酒精水混合液(體積比分別為 5% : 5% : 90%)，放入干燥箱。大約兩周后，線蟲身體透明。在滅菌的載玻片上，滴甘油一 滴，挑選大小相當(dāng)?shù)木€蟲至甘油中。選取玻璃珠 S粒，均勻放于甘油滴的邊緣，然后加蓋蓋 玻片，并用樹膠封閉，貼標(biāo)簽后置于干燥箱中，待樹膠干澗后即可觀察。在微分干設(shè)顯微鏡 下進(jìn)行觀察和測量，依據(jù)線蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒定。
[0012] 所述步驟(3)為:根據(jù)樣品的性質(zhì)選取不同的DNA提取方法，對于酒精保存的樣品 采用方法a或b，甲醒保存的樣品采用方法C。
[001引（a)蛋白酶K法:挑取單條線蟲，轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有5化d地20的離屯、管中，加入0.5 化10倍PCR緩沖液和0.5化蛋白酶K(20 mg/血），10 000 g 3 min充分混合，-70°C 30 min， 55°C溫浴90 min，95°C30 min(在PCR儀中進(jìn)行）。制備的DNA直接用于PCR反應(yīng)。
[0014] (b)堿裂解法(Bhadu巧et al.，2006a):將線蟲取出，裝入含有0.25 M化OH的 PCR管中，-20°C 8-9 h，60°C過夜，99°C 3 min,隨后冷至室溫；16 000 g 30 S，加入4 化 1 M 肥1、10 化 0.5 M lYis-肥1 (pH 8.0)、5 化 2% Triton X-100,將混合物充分混合，16 OOOg 30 S，99°C 3 min,冷至室溫，制備的DNA可直接用于PCR反應(yīng)。 (C)試劑盒提取法：按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的 提取方法進(jìn)行提取，并將裂解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，W便能得到高質(zhì)量的DNA用于W下研究。
[0015] 所述步驟(4)為:從GenBank中下載常見優(yōu)勢種線蟲的18S rDNA，28S rDNA及 口S區(qū)序列；運(yùn)用DNAStar軟件進(jìn)行MegAlign分析，選擇序列高變區(qū)；針對高變區(qū)兩側(cè) 的保守區(qū)用Primer premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì);然后對所設(shè)計(jì)的引物用Oligo軟件對 各參數(shù)進(jìn)行評估，選出最優(yōu)引物進(jìn)行合成，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0016] 所述步驟(5)為:將加1 PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物與lul Loading buffer混合后上樣， 1%瓊脂糖凝膠電泳，100V恒壓電泳30min，在含0.5iig/ml EB的1XTAE緩沖液中染 色10~30min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。
[0017] 所述步驟(6)進(jìn)一步包括垂直膠的制備(凝膠尺寸：7.5cmX lOcmX 1mm)和平行膠 的制備。
[0018] 所述步驟(7)為對變形梯度凝膠電泳的變性劑梯度及電泳時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。采用垂 直電泳對變性劑梯度進(jìn)行優(yōu)化，垂直電泳的電泳方向與變性劑梯度方向垂直，在低變性劑 濃度區(qū)域，樣品電泳速度較快，高變性區(qū)域則相反，最終形成S形的曲線，因此當(dāng)用于優(yōu)化的 樣品在圖中呈現(xiàn)分開的條帶時(shí)，此時(shí)所對應(yīng)的變性劑濃度即為最佳變性劑濃度;采用時(shí)間 進(jìn)程試驗(yàn)優(yōu)化電泳時(shí)間，即每隔固定時(shí)間上樣，看樣品的分離效果，當(dāng)各樣品在凝膠上的條 帶呈現(xiàn)最佳分離效果時(shí)，此時(shí)的電泳時(shí)間即為最優(yōu)電泳時(shí)間。根據(jù)估算的各擴(kuò)增片段低烙 解區(qū)域的烙解溫度，選取具有最高和最低烙解溫度的物種確定變性梯度，選取具有較為相 近的烙解溫度的物種進(jìn)行電泳時(shí)間的優(yōu)化。
[0019] 所述步驟(8)進(jìn)一步包括DGGE特征性圖譜的構(gòu)建、條帶的穩(wěn)定性分析及DGGE鑒定 分析的步驟。用已經(jīng)優(yōu)化好的PCR條件及DGGE條件對海洋線蟲進(jìn)行分析，計(jì)算各種海洋線蟲 每對引物擴(kuò)增片段在DGGE凝膠上的遷移率。進(jìn)行多樣性分析，使用Quantity One軟件對圖 像進(jìn)行處理。將圖像的背景扣除后，對條帶進(jìn)行自動(dòng)檢測，然后手動(dòng)進(jìn)行確認(rèn)?；贒GGE圖 譜，采用非加權(quán)配對算數(shù)平均法（加 weighted Pair Gro叩Method with Arithmetic averages, UPGMA)聚類分析對各站位間的相似性進(jìn)行分析。根據(jù)各條帶的亮度，運(yùn)用W下 公式計(jì)算化annon-Weaver多樣性指數(shù)（H)，對各站位的物種結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析：H=E (m/N) In (m/N)，其中m為每條帶的亮度峰值，N為每個(gè)泳道中所有條帶亮度峰值的和。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下： 本發(fā)明將DGGE技術(shù)運(yùn)用到了海洋線蟲的鑒定中，并運(yùn)用該技術(shù)對海洋線蟲的群落組成 進(jìn)行分析，主要如下： (1)本發(fā)明分別針對核糖體基因序列的18S rDNA、28S rDNA及ITS區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn) 行PCR條件優(yōu)化，通過垂直電泳和時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化DGGE電泳條件，從而獲得海洋線 蟲的特征性條帶，進(jìn)而建立特征性圖譜，為海洋線蟲的鑒定提供了一種新的手段。
[0021] (2)本發(fā)明根據(jù)特征性圖譜，可獲得相關(guān)線蟲在變性梯度凝膠上的遷移率，可W較 好的進(jìn)行區(qū)分鑒定，對于難于鑒定的物種，有時(shí)需要采取兩對w上的引物組合使用。
[0022] (3)運(yùn)用DGGE技術(shù)對海洋線蟲的多樣性進(jìn)行分析，基于DGGE圖譜的相似性進(jìn)行聚 類分析，并運(yùn)用運(yùn)用典范對應(yīng)分析(Canonical Correspondence Analysis, CCA)對群落多 樣性與理化因子的關(guān)系進(jìn)行探討，了解環(huán)境因子對海洋線蟲群落組成的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步解釋。
[0024] 參考文獻(xiàn)：Diez B.,化dros-Alio C. , Marsh T. L. , et al. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to study the diversity of marine picoeukaryotic assemblages and comparison of DGGE with other molecular techniques. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(7): 2942-2951. 實(shí)施例利用變形梯度凝膠電泳鑒定海洋線蟲的方法，包括W下步驟： (9) 采樣及室內(nèi)分選 (10) 形態(tài)學(xué)鑒定 (11) 總DNA的提取 (12) PCR引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化 (13) 瓊脂糖電泳檢測 (14) 變性梯度凝膠的制備 (15) 變性梯度凝膠電泳條件的優(yōu)化 (16) 運(yùn)用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對海洋線蟲進(jìn)行鑒定分析。
[0025] 所述步驟（1)為:將樣品于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用0.1%虎紅進(jìn)行染色(24小時(shí)），隨后用蒸饋水 進(jìn)行沖洗，使樣品通過孔徑分別為50化m和31叫1的兩層網(wǎng)篩，將截留在31叫1網(wǎng)篩上的樣品， 用Ludox-TM溶液（比重為1.15)轉(zhuǎn)移到離屯、管中并攬拌均勻，ISOOrmp離屯、10分鐘(S次離 屯、）。將所得的上清液再用31ym的網(wǎng)篩過濾，去掉Ludox，將樣品轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿。
[0026] 所述步驟(2)為：向盛有線蟲的培養(yǎng)皿中加入甘油酒精水混合液(體積比分別為 5% : 5% : 90%)，放入干燥箱。大約兩周后，線蟲身體透明。在滅菌的載玻片上，滴甘油一 滴，挑選大小相當(dāng)?shù)木€蟲至甘油中。選取玻璃珠 S粒，均勻放于甘油滴的邊緣，然后加蓋蓋 玻片，并用樹膠封閉，貼標(biāo)簽后置于干燥箱中，待樹膠干澗后即可觀察。在微分干設(shè)顯微鏡 下進(jìn)行觀察和測量，依據(jù)線蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒定。
[0027] 所述步驟(3)為:根據(jù)樣品的性質(zhì)選取不同的DNA提取方法，對于酒精保存的樣品 采用方法a或b，甲醒保存的樣品采用方法C。
[002引（d)蛋白酶K法:挑取單條線蟲，轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有5化d地20的離屯、管中，加入0.5 化10倍PCR緩沖液和0.5化蛋白酶K(20 mg/血），10 000 g 3 min充分混合，-70°C 30 min， 55°C溫浴90 min，95°C30 min(在PCR儀中進(jìn)行）。制備的DNA直接用于PCR反應(yīng)。
[0029] (e)堿裂解法(Bhadu巧et al.，2006a):將線蟲取出，裝入含有0.25 M化0H的 PCR管中，-20°C 8-9 h，60°C過夜，99°C 3 min,隨后冷至室溫；16 000 g 30 S，加入4 化 1 M 肥1、10 化 0.5 M lYis-肥1 (pH 8.0)、5 化 2% Triton X-100,將混合物充分混合，16 OOOg 30 S，99°C 3 min,冷至室溫，制備的DNA可直接用于PCR反應(yīng)。 (f)試劑盒提取法：按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的 提取方法進(jìn)行提取，并將裂解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，W便能得到高質(zhì)量的DM用于W下研究。
[0030] 所述步驟(4)為:從GenBank中下載常見優(yōu)勢種線蟲的18S rDNA，28S rDNA及 口S區(qū)序列；運(yùn)用DNAStar軟件進(jìn)行MegAlign分析，選擇序列高變區(qū)；針對高變區(qū)兩側(cè) 的保守區(qū)用Primer premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì);然后對所設(shè)計(jì)的引物用Oligo軟件對 各參數(shù)進(jìn)行評估，選出最優(yōu)引物進(jìn)行合成，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0031] 本專利所用引物
a 在引物的 5'端加一個(gè) 40 bp 的 GC 夾，序列為 CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGG b 在引物的 5'端加一個(gè) 40bp 的 GC 夾，序列為 CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCG TCCCGCCGCCCCCGCCCG PCR 反應(yīng)體系（50ul)包括：約 50ng 模板 DNA，200咖 dNTP，1.5mM MgC12,0.3iiM 引物，2.5 U Ex TagDNA polymerase (hKaRa), IXEx Taq Buffer。（1)引物 E址lA ~Euk516的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C，變性130 s; 94°C，變性30 s，58°C，退火45 s， 35 個(gè)循環(huán)；72°C，延伸 130 s，72°C，延伸 10 min。
[0032] (2)引物 Eukl209~1649R 的 PCR 反應(yīng)采用降落 PCR: 94°C，變性 4 min; 94 °(：，變性1111111，67~57°(：，退火1111111，10個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)降低1°(：);72°(：，延伸3 min，94°C，變性 1 min，57°C，退火 1 min, 20 個(gè)循環(huán)；72°C，延伸 3 min，72°C，延伸 10 min。（3)引物 28SD1F~28SD1R 的 PCR 反應(yīng)采用降落 PCR: 94°C，變性 4 min; 94 °(：，變性1111111，48~43°(：，退火1111111，10個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)降低1°(：);72°(：，延伸1 min，94°C，變性 1 min,43°C，退火 1 min,20 個(gè)循環(huán)；72°C，延伸 1 min，72°C，延伸 10 min〇
[0033] 所述步驟(5)為:將加1 PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物與lul Loading buffer混合后上樣， 1%瓊脂糖凝膠電泳，lOOV恒壓電泳30min，在含0.5iig/ml EB的IXTAE緩沖液中染 色10~30min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。
[0034] 所述步驟(6)進(jìn)一步包括垂直膠的制備(凝膠尺寸：7.5cmX lOcmX 1mm)和平行膠 的制備，垂直膠具體制備步驟如下， 用洗涂劑徹底擦洗玻璃板，先用自來水沖洗干凈，后用雙蒸水沖洗=遍，驚干； 取相同厚度的隔板，帶槽的一側(cè)面向大玻璃板，兩個(gè)隔板的凹面相對應(yīng);插入梳子，兩 側(cè)及中間的隔板與玻璃板底部平齊； 垂直放置制膠板系統(tǒng)，松梳子襯墊系統(tǒng)的螺絲，將兩系統(tǒng)放置至兩者剛好完全匹配，梓 襯墊系統(tǒng)的螺絲直到碰到玻璃板，再梓1/4圈； 平放壓力夾，松螺絲;帶螺絲的一面朝下，出氣口一面朝上； 將壓力夾放置于制膠板系統(tǒng)中間位置，梓壓力夾的螺絲直到碰到梳子襯墊系統(tǒng)，再梓 兩圈； 再梓梳子襯墊系統(tǒng)的螺絲一圈，移走壓力夾； 按上旋塞，將海綿墊放在制膠架上，把制膠板系統(tǒng)(一定要用校正板進(jìn)行校正，W免漏 膠)垂直放在海綿上方并固定好，將短玻璃的一面對著自己； 一邊梓開旋塞，打開出氣口，另一側(cè)關(guān)上;將傾斜桿調(diào)到最高的刻度線處；用梯度傳送 系統(tǒng)將凝膠注入到兩玻璃板之間，保證整個(gè)過程要恒定勻速且緩慢； 灌膠完畢后，關(guān)上旋塞和出氣口，將傾斜桿放平； 聚合60min后，取下梳子襯墊系統(tǒng)，在另一側(cè)添加含有催化劑的丙締酷胺溶液，聚合 60min，此時(shí)打開循環(huán)累及加熱器，預(yù)熱電泳緩沖液到60°C，迅速清洗用完的設(shè)備。
[0035] 聚合完畢后拔走梳子，將膠放入到電泳槽內(nèi)，用雙蒸水清洗點(diǎn)樣孔=次，隨后加 樣； 20V預(yù)電泳lOmin，隨后按照優(yōu)化的電泳參數(shù)進(jìn)行電泳。
[0036] 電泳完畢后，先撥開一塊玻璃板，然后將膠放入盤中。用去離子水沖洗，使膠和玻 璃板脫罔； 倒掉去離子水，將膠放入0.扣g/ml的邸溶液中，搖床上搖蕩染色15min; 凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0037] 所述平行膠的制備方法如下(凝膠尺寸：16cm X 16cm X 1mm): 用洗涂劑徹底擦洗玻璃板，先用自來水沖洗干凈，后用雙蒸水沖洗=遍，驚干； 將海綿墊放在制膠架上，把制膠板系統(tǒng)(一定要用校正板進(jìn)行校正，W免漏膠)垂直放 在海綿上方并固定好，將短玻璃的一面對著自己； 將兩根長的聚乙締細(xì)管（15.5cm)分別連上30ml注射器，短的(9cm)聚乙締細(xì)管連于Y形 S通的一端； 在兩個(gè)注射器上分別標(biāo)記"高濃度"與"低濃度"，并安裝上相關(guān)的配件，調(diào)整梯度傳送 系統(tǒng)的刻度到適當(dāng)?shù)奈恢?本試驗(yàn)中使用的為16cmX16cmX 1mm的膠板，調(diào)整裝置到體積刻 度為14.5處； 分別將15ml兩種變性濃度的丙締酷胺溶液倒入兩個(gè)塑膠管中，每管加入15iU TEMED (l/1000)，150iil 10%APS(1 /100)，顛倒數(shù)次混勻，吸入到標(biāo)有濃度的注射器中； 分別將標(biāo)有高濃度和低濃度的注射器正確安裝在梯度傳送系統(tǒng)上，再將注射器的聚丙 締管連于Y形=通； 用梯度傳送系統(tǒng)將凝膠注入到兩玻璃板之間，保證整個(gè)過程要恒定勻速且緩慢； 小屯、斜插入梳子，凝膠聚合大約兩小時(shí);待膠凝固一小時(shí)后，打開循環(huán)累及加熱器，預(yù) 熱電泳緩沖液到60°C，迅速清洗用完的設(shè)備。
[0038] 所述步驟(7)為對變形梯度凝膠電泳的變性劑梯度及電泳時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。采用垂 直電泳對變性劑梯度進(jìn)行優(yōu)化，垂直電泳的電泳方向與變性劑梯度方向垂直，在低變性劑 濃度區(qū)域，樣品電泳速度較快，高變性區(qū)域則相反，最終形成s形的曲線，因此當(dāng)用于優(yōu)化的 樣品在圖中呈現(xiàn)分開的條帶時(shí)，此時(shí)所對應(yīng)的變性劑濃度即為最佳變性劑濃度;采用時(shí)間 進(jìn)程試驗(yàn)優(yōu)化電泳時(shí)間，即每隔固定時(shí)間上樣，看樣品的分離效果，當(dāng)各樣品在凝膠上的條 帶呈現(xiàn)最佳分離效果時(shí)，此時(shí)的電泳時(shí)間即為最優(yōu)電泳時(shí)間。根據(jù)估算的各擴(kuò)增片段低烙 解區(qū)域的烙解溫度，選取具有最高和最低烙解溫度的物種確定變性梯度，選取具有較為相 近的烙解溫度的物種進(jìn)行電泳時(shí)間的優(yōu)化。
[0039] 分別采用垂直電泳及時(shí)間進(jìn)程試驗(yàn)對DGGE的變性梯度和電泳時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，具體 電泳所用參數(shù)如下表： DG(iE優(yōu)化的電泳條件*
*電泳溫度均為60°C 所述步驟(8)進(jìn)一步包括DGGE特征性圖譜的構(gòu)建、條帶的穩(wěn)定性分析及DGGE鑒定分析 的步驟。用已經(jīng)優(yōu)化好的PCR條件及DGGE條件對海洋線蟲進(jìn)行分析，計(jì)算各種海洋線蟲每對 引物擴(kuò)增片段在DGGE凝膠上的遷移率。進(jìn)行多樣性分析，使用Quantity One軟件對圖像進(jìn) 行處理。將圖像的背景扣除后，對條帶進(jìn)行自動(dòng)檢測，然后手動(dòng)進(jìn)行確認(rèn)?；贒GGE圖譜，采 用非加權(quán)配對算數(shù)平均法(Unwei曲ted Pair Group Method with Arithmetic averages, UPGMA)聚類分析對各站位間的相似性進(jìn)行分析。根據(jù)各條帶的亮度，運(yùn)用W下公式計(jì)算 Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H)，對各站位的物種結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析:H=E (m/N) In (m/N)，其中m為每條帶的亮度峰值，N為每個(gè)泳道中所有條帶亮度峰值的和。
[0040] 具體實(shí)施方法如下： a. 海洋線蟲特征性圖譜的構(gòu)建 運(yùn)用 BioNumerics (BN)軟件（Applied Maths, St.-Ma;rtens-Latem, Belgium)對 DGGE圖譜進(jìn)行分析，用優(yōu)化好的DGGE電泳條件對所研究線蟲的每對引物擴(kuò)增片段進(jìn)行電 泳，從而獲得特征性圖譜庫。得到各種線蟲每對引物擴(kuò)增片段在DGGE凝膠上的遷移率，遷 移率公式如下：Rf=畑/LX 100%(畑為點(diǎn)樣孔到目的片段的距離，L為整塊凝膠的長度） b. 條帶穩(wěn)定性分析方法選取所研究海域優(yōu)勢種線蟲如化JcAoJaimt/s sinensis、 AfetoncAoJaimusmoJesvI/etacAromac/ora sp.等，采用引物 28SD1F~28SD1R 按照已經(jīng)建 立的DGGE方法，對W上實(shí)驗(yàn)再做兩次重復(fù)，比較不同批次電泳之間存在的誤差大小，確定 條帶的穩(wěn)定性。
[0041 ] C.目標(biāo)線蟲的DGGE鑒定 取待鑒定線蟲，進(jìn)行DNA提取及PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用W上優(yōu)化所得DGGE電泳條件 進(jìn)行電泳，獲得DGGE條帶的遷移率，將該遷移率與已建立的DGGE特征性圖譜庫中的數(shù)據(jù)進(jìn) 行對比，W此鑒定線蟲。
[0042]本發(fā)明的完成得益于山東省自然科學(xué)基金(ZR2014DM008)和聊城大學(xué)博±基金 (3180500)資助。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用變形梯度凝膠電泳鑒定海洋線蟲的方法，其特征是，包括以下步驟：（1)采樣及 室內(nèi)分選；（2)形態(tài)學(xué)鑒定；（3)總DNA的提??；（4)PCR引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化；（5)瓊脂糖電泳檢測； (6)變性梯度凝膠的制備；（7)變性梯度凝膠電泳條件的優(yōu)化；（8)運(yùn)用變性梯度凝膠電泳對 海洋線蟲進(jìn)行鑒定分析。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟（1)為:將樣品于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用0.1%虎 紅進(jìn)行染色(24小時(shí)），隨后用蒸餾水進(jìn)行沖洗，使樣品通過孔徑分別為500μπι和31μπι的兩層 網(wǎng)篩，將截留在31μπι網(wǎng)篩上的樣品，用Ludox-TM溶液（比重為1.15)轉(zhuǎn)移到離心管中并攪拌 均勾，1800rmp離心10分鐘(三次離心）；將所得的上清液再用31μηι的網(wǎng)篩過濾，去掉Ludox， 將樣品轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(2)為：向盛有線蟲的培養(yǎng)皿中加入 甘油酒精水混合液(體積比分別為5% : 5% : 90%)，放入干燥箱;兩周后，線蟲身體透明；在 滅菌的載玻片上，滴甘油一滴，挑選大小相當(dāng)?shù)木€蟲至甘油中；選取玻璃珠三粒，均勻放于 甘油滴的邊緣，然后加蓋蓋玻片，并用樹膠封閉，貼標(biāo)簽后置于干燥箱中，待樹膠干涸后觀 察;在微分干涉顯微鏡下進(jìn)行觀察和測量，依據(jù)線蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒定。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(3)為:根據(jù)樣品的性質(zhì)選取不同的 DNA提取方法，對于酒精保存的樣品采用方法a或b，甲醛保存的樣品采用方法c: 蛋白酶K法:挑取單條線蟲，轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有5 yL ddH20的離心管中，加入0.5 yL10倍 PCR緩沖液和0.5 yL蛋白酶K(20 mg/mL)，10000 g 3 min充分混合，-70°C 30 min，55°C溫 浴90 min，95°C30 min(在PCR儀中進(jìn)行）；制備的DNA直接用于PCR反應(yīng)； 堿裂解法（Bhadury et al·，2006a):將線蟲取出，裝入含有0.25 M NaOH的PCR管 中，-20°C 8-9 h，60°C過夜，99°C 3 min，隨后冷至室溫；16000 g 30 S，加入4 yL 1 Μ HC1、10 yL 0.5 M Tris-HCl (pH 8·0)、5 yL 2% Triton Χ-100,將混合物充分混合，16 000g 30 S，99°C 3 min，冷至室溫，制備的DNA直接用于PCR反應(yīng)； 試劑盒提取法：按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的提 取方法進(jìn)行提取，并將裂解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以得到高質(zhì)量的DNA用于研究。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(4)為:從GenBank中下載常見優(yōu) 勢種線蟲的18S rDNA，28S rDNA及ITS區(qū)序列；運(yùn)用DNAStar軟件進(jìn)行MegAlign分 析，選擇序列高變區(qū)；針對高變區(qū)兩側(cè)的保守區(qū)用Primer premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)； 然后對所設(shè)計(jì)的引物用Oligo軟件對各參數(shù)進(jìn)行評估，選出最優(yōu)引物進(jìn)行合成，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(5)為:將5ul PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物與 lul Loading buffer混合后上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳，100V恒壓電泳30min，在含0.5 μg/ml EB的1XTAE緩沖液中染色10~30min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(6):包括垂直膠的制備(凝膠尺寸： 7 · 5cm X 10cm X 1mm)和平行膠的制備。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(7)為對變形梯度凝膠電泳的變性 劑梯度及電泳時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化;采用垂直電泳對變性劑梯度進(jìn)行優(yōu)化，垂直電泳的電泳方向 與變性劑梯度方向垂直，在低變性劑濃度區(qū)域，樣品電泳速度較快，高變性區(qū)域則相反，最 終形成S形的曲線，當(dāng)用于優(yōu)化的樣品在圖中呈現(xiàn)分開的條帶時(shí)，此時(shí)所對應(yīng)的變性劑濃度 即為最佳變性劑濃度;采用時(shí)間進(jìn)程試驗(yàn)優(yōu)化電泳時(shí)間，即每隔固定時(shí)間上樣，看樣品的分 離效果，當(dāng)各樣品在凝膠上的條帶呈現(xiàn)最佳分離效果時(shí)，此時(shí)的電泳時(shí)間即為最優(yōu)電泳時(shí) 間；根據(jù)估算的各擴(kuò)增片段低熔解區(qū)域的熔解溫度，選取具有最高和最低熔解溫度的物種 確定變性梯度，選取具有較為相近的熔解溫度的物種進(jìn)行電泳時(shí)間的優(yōu)化。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(8)進(jìn)一步包括DGGE特征性圖譜的 構(gòu)建、條帶的穩(wěn)定性分析及DGGE鑒定分析的步驟;用已經(jīng)優(yōu)化好的PCR條件及DGGE條件對海 洋線蟲進(jìn)行分析，計(jì)算各種海洋線蟲每對引物擴(kuò)增片段在DGGE凝膠上的迀移率;進(jìn)行多樣 性分析，使用Quantity One軟件對圖像進(jìn)行處理;將圖像的背景扣除后，對條帶進(jìn)行自動(dòng)檢 測，然后手動(dòng)進(jìn)行確認(rèn)；基于DGGE圖譜，采用非加權(quán)配對算數(shù)平均法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages, UPGMA)聚類分析對各站位間的相似性進(jìn)行分 析;根據(jù)各條帶的亮度，運(yùn)用以下公式計(jì)算Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H)，對各站位的物 種結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析:Η=Σ (m/N) In (m/N)，其中m為每條帶的亮度峰值，N為每個(gè)泳 道中所有條帶亮度峰值的和。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048047SQ201610557840
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月15日
【發(fā)明人】孫靜
【申請人】聊城大學(xué)