一種適用于高通量測序平臺的微生物多樣性檢測樣品制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物多樣性檢測領域，具體涉及一種適用于高通量測序平臺的微生 物多樣性檢測樣品制備方法。
【背景技術】
[0002] 目前，微生物多樣性研究的方法主要是變性梯度凝膠電泳，即DGGE技術。該方法與 基于高通量測序方法的微生物多樣性研究相比，周期長、成本高、主觀性強，因此越來越多 的研究者傾向使用高通量測序平臺進行微生物多樣性研究。
[0003] 基于高通量測序平臺的微生物多樣性研究方法分為以下幾個步驟:DNA提取、PCR 擴增、文庫構建、上機測序和數(shù)據(jù)分析。其中DNA提取和PCR擴增為樣品的準備階段。DNA的提 取效率和PCR擴增循環(huán)數(shù)的選擇直接影響最終的數(shù)據(jù)分析，即微生物的原始群落組成分析。 目前尚沒有基于高通量測序平臺的樣品準備標準方法。尤其在不同樣品的DNA提取方 法和后續(xù)PCR擴增循環(huán)數(shù)的選擇上，各種參數(shù)均有涉及，對于分析結果的評價也尚無標準。 而微生物的樣品準備，如DNA提取和可變區(qū)的擴增等，對于測序完成后的數(shù)據(jù)分析以及微生 物原始群落組成的影響是至關重要的。本發(fā)明針對樣品準備過程中的缺陷，對DNA的提取方 法和PCR擴增循環(huán)數(shù)的選擇進行了探索和優(yōu)化。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明確定了一套可用于指導高通量測序前期樣品準備，包括DNA提取及擴增條 件的技術參數(shù)。
[0005] 本發(fā)明提供了一種適用于高通量測序平臺的微生物多樣性檢測樣品制備方法，包 括以下步驟： (1) 將含微生物的樣品加入CTAB緩沖液并振蕩； (2) 加入至少兩種不同粒徑的研磨珠并振蕩； (3) 37-90°C孵育5-60min后離心取上清； (4) 在步驟(3)得到的上清加入RNAase并孵育； (5) 加入苯酚/氯仿/異戊醇的混合物，振蕩后離心取上清； (6) 在步驟(5)得到的上清中加入乙醇或異丙醇沉淀DNA; (7) 以步驟(6)得到的DNA為模板，進行PCR擴增，得到用于檢測的樣品。
[0006] 在一個實施方案中，所述不同粒徑的研磨珠為至少兩種不同粒徑的研磨珠，其粒 徑各自獨立地在〇.〇5 mm至1 mm的范圍內且相鄰大小的粒徑相差0.1至0.6 mm。
[0007] 在一個實施方案中，在步驟（3)中，60-80 °C孵育10-30min后離心取上清；更優(yōu)選 地，70°C孵育20min后離心取上清。
[0008] 在一個實施方案中，步驟(5)中所述苯酚/氯仿/異戊醇的混合物的體積為步驟(4) 中的上清體積的1-1.5倍;優(yōu)選地，所述苯酚/氯仿/異戊醇的混合物的體積與步驟(4)中的 上清體積相等;優(yōu)選地，所述苯酚/氯仿/異戊醇的混合物中苯酚/氯仿/異戊醇的體積比為 10-50:10-50:0.5-2;更優(yōu)選地，苯酚/氯仿/異戊醇的體積比為20-30: 20-30:1;最優(yōu)選地， 苯酚/氯仿/異戊醇的體積比為25:24:1。
[0009]在一個實施方案中，步驟(7)中所述PCR擴增進行25個循環(huán)。
[0010]在一個實施方案中，步驟(7)中所述PCR擴增進行30個循環(huán)。
[0011] 在一個實施方案中，步驟(7)中所述PCR擴增的目的片段為所述微生物的16s V3 區(qū);優(yōu)選地，其中所述PCR擴增的擴增引物為： F:5，-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' R:5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3,。
[0012] 在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種適用于高通量測序平臺的微生物多樣性 檢測樣品制備方法，包括： (1) 將含微生物的固體樣品加入CTAB緩沖液中并振蕩； (2) 加入0.1mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振蕩； (3) 70°C孵育20min后離心取上清； (4) 將上清加入RNAase并孵育； (5) 加入等體積的25:24:1的苯酚/氯仿/異戊醇的混合物，振蕩后離心取上清； (6) 重復步驟(4)和(5); (7) 加入乙醇或異丙醇沉淀DNA; (8) 離心得到白色DNA沉淀，用乙醇洗滌后溶解在去離子水中； (9) 以步驟(8)得到的DNA為模板，進行PCR擴增25或30個循環(huán)，得到用于檢測的樣品。
[0013] 在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種適用于高通量測序平臺的微生物多樣 性檢測樣品制備方法，包括： (1) 將含微生物的液體樣品離心除去上清，加入PBS充分重懸后，再次離心除去上清后 向沉淀中加入CTAB緩沖液中并振蕩； (2) 加入0.1mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振蕩； (3) 70°C孵育20min后離心取上清； (4) 將上清加入RNAase并孵育； (5) 加入等體積的25:24:1的苯酚/氯仿/異戊醇的混合物，振蕩后離心取上清； (6) 重復步驟(4)和(5); (7) 加入乙醇或異丙醇沉淀DNA; (8) 離心得到白色DNA沉淀，用乙醇洗滌后溶解在去離子水中； (9) 以步驟(8)得到的DNA為模板，進行PCR擴增25或30個循環(huán)，得到用于檢測的樣品。
[0014] 特別優(yōu)選地，上述PCR擴增的目的片段為所述微生物的16s V3區(qū)； PCR擴增的擴增引物為： F:5，-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' R:5,-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3，；
有益效果 本發(fā)明與變性梯度凝膠電泳，即DGGE技術相比，降低了單條序列的測序費用、縮短了測 序時間、簡化了實驗操作、增加了痕量菌的檢測效率。
[0015] 本發(fā)明與其他目前使用的基于高通量測序方法的微生物多樣性研究相比，考慮了 樣品準備過程對最終數(shù)據(jù)分析，即微生物群落組成分析的影響，形成了一套既能如實反應 樣品的群落組成，又能最大程度的獲得盡可能多的微生物種類的樣品準備方法，對其中的 DNA提取和擴增循環(huán)數(shù)的選擇做了標準化規(guī)定。
【附圖說明】
[0016] 圖1示出了不同方法提取的土壤和食糜樣品DNA膠圖；S-TG:天根提取的土壤樣品 DNA; S-N:新方法提取的土壤樣品DNA; C-TG:天根提取的食糜樣品DNA; C-N:新方法提取的食 糜樣品DNA。
[0017] 圖2示出了不同提取方法和擴增循環(huán)數(shù)對測序數(shù)據(jù)0TU和稀釋曲線的影響:A.不 同提取方法和擴增循環(huán)數(shù)對土壤樣品0TU產出的影響;B.不同提取方法和擴增循環(huán)數(shù)對土 壤樣品稀釋曲線的影響;C.不同提取方法和擴增循環(huán)數(shù)對食糜樣品0TU產出的影響;D.不 同提取方法和擴增循環(huán)數(shù)對食糜樣品稀釋曲線的影響。
[0018] 圖3示出了不同提取方法對微生物數(shù)量的影響:A.不同提取方法對土壤樣品微生 物數(shù)量的影響;B.不同提取方法對食糜樣品微生物數(shù)量的影響。
[0019] 圖4示出了不同擴增循環(huán)數(shù)對微生物數(shù)量的影響。
[0020] 圖5示出了不同提取方法對微生物門水平種類的影響:A.擴增循環(huán)數(shù)為20時，不 同提取方法對土壤樣品微生物種類的影響;B.擴增循環(huán)數(shù)為25時，不同提取方法對土壤樣 品微生物種類的影響；C.擴增循環(huán)數(shù)為30時，不同提取方法對土壤樣品微生物種類的影 響;D.擴增循環(huán)數(shù)為20時，不同提取方法對食糜樣品微生物種類的影響;E.擴增循環(huán)數(shù)為 25時，不同提取方法對食糜樣品微生物種類的影響;F.擴增循環(huán)數(shù)為30時，不同提取方法 對食糜樣品微生物種類的影響。
[0021] 圖6示出了不同擴增循環(huán)數(shù)對微生物門水平種類的影響:A.不同擴增循環(huán)數(shù)對土 壤樣品微生物種類的影響;B.不同擴增循環(huán)數(shù)對食糜樣品微生物種類的影響。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明主要涉及一種適用于高通量測序平臺的微生物多樣性檢測樣品制備方法。 該方法對DNA的提取方法和PCR擴增循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化，并提供一套相輔相成的技術方案，以 下分別對這兩個方面進行詳細闡述： (1) DNA提?。?與市場上普遍使用的商品化微生物DNA提取試劑盒(天根土壤微生物基因組提取試劑 盒)進行比較，本發(fā)明采取一種新的提取方法，結果發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明提取到的DNA質量更 高，0D260/280的值均在1.7-2.0之間，而天根提取的樣品0D260/280的值均大于2.0。瓊脂糖 凝膠電泳的結果同樣表明，天根提取的樣品質量較差，有較多RNA等雜質存在。
[0023]具體方案是： a. 如果是固體樣品，則直接稱取250mg進行后續(xù)操作；如果是液體樣品，則首先吸取 1.5ml置于離心管中，12000g離心5min，除去上清，然后加入1.5ml PBS，充分重懸后，12000g 離心5min，再次除去上清后保留沉淀進行后續(xù)操作； b. 加入800μ1 CTAB緩沖液，在渦旋振蕩器上擊打2min(CTAB的配方：CTAB 4g，NaCl 16.364g，lM Tris-HCl 20ml (ρΗ8·0), 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH20溶解，再定容至 200ml滅菌）； c. 加入0.3g 0.1mm研磨珠和O.lg 0.5mm研磨珠，在禍旋振蕩器上擊打30min; d. 70°C解育20min后，10000g離心10min; e. 將上清轉移到新的離心管中，加入5μ1 RNAase (10mg/ml)，37°C孵育30min; f. 加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)，渦旋震蕩30s至液體呈白色乳濁液； g. 12000g 4°C離心10min，取上清液至新的離心管中； h. 重復步驟e、f和g-次； i .加入0.8倍體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫放置5min，然后于-80°C放置30min或過夜 沉淀DNA(視DNA沉淀情況而定，若DNA量很少，則需過夜處理）； j · 12000g離心15min，可以看到白色DNA沉淀； k. 小心倒出上清，加入750μ1 70%的乙醇，充分重懸白色沉淀； l. 12000g離心15min，倒出上清，倒置離心管室溫放置10min; m. 加入50-100μ1 70°C預熱的去離子水，充分溶解。
[0024] (2)PCR 擴增： a. 選取PCR擴增的起始量為25ng; b. 擴增片段選擇16s V3區(qū)，擴增引物： 338F:5'-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' 518R:5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'
本發(fā)明的關鍵點有兩個:一個是DNA的提取方法。針對環(huán)境樣品中成分復雜、雜質較多、 菌體細胞壁堅硬程度不同等特點，本發(fā)明對CTAB法提取環(huán)境微生物DNA的過程進行了改良， 在此過程中加入不同粒徑的研磨珠，以增加機械破碎力；增加苯酚/氯仿/異戊醇的萃取步 驟，以最大程度去除雜質；同時對孵育溫度和時間進行了調整，力求最大程度的提高提取效 率。另一個是擴增循環(huán)數(shù)的選擇。由于環(huán)境樣品中微生物的種類繁雜并且含量較低，因此對 于特定的微生物種類需要進行PCR擴增，然后再進行文庫構建、上機測序和數(shù)據(jù)分析等一系 列操作。PCR擴增循環(huán)數(shù)的選擇是非常關鍵的，如果擴增循環(huán)數(shù)太多，大多數(shù)微生物種類均 達到平臺期，則會破壞環(huán)境樣品中原有的微生物群落結構;如果擴增循環(huán)數(shù)太少，則會有很 多微生物種類不能被有效檢測到。本發(fā)明針對復雜和相對簡單的環(huán)境樣品，測試了不同擴 增循環(huán)數(shù)對最終微生物群落組成的影響。結果發(fā)現(xiàn)，對于復雜樣品，擴增循環(huán)數(shù)為25時，不 但微生物的數(shù)量和種類最多，并且微生物的群落組成也更接近原始狀態(tài);對于簡單樣品，如 果要關注優(yōu)勢菌的種類和比例，擴增循環(huán)數(shù)為25，能夠兼顧微生物種類和群落組成結構;如 果要關注其中的劣勢菌，則選擇擴增循環(huán)數(shù)為30會更有利。
[0025]目前，天根生化科技（北京）有限公司生產的土壤基因組DNA提取試劑盒是使用較 為普遍的強力提取試劑盒，其提取效果與本發(fā)明相比，濃度雖然較高，但D