一種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑，屬于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中微生物污染控制領(lǐng)域。本發(fā)明中，一種序列為SEQ ID NO:1的多肽可用于預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染，本發(fā)明試劑由序列為SEQ ID NO:1的多肽和氨基酸組成，不含任何抗生素成分。本發(fā)明的產(chǎn)品按照預(yù)防和清除污染所需濃度配制，可有效預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的微生物污染，克服了現(xiàn)有產(chǎn)品中抗生素成分的使用限制以及處理細(xì)胞周期較長的缺陷，且該產(chǎn)品穩(wěn)定性好，易于保存。
【專利說明】
-種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中微生物污染控制領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床實(shí)驗(yàn)研究、血液制品、抗體、疫苗等生物 制品的研發(fā)和生產(chǎn)等領(lǐng)域中，細(xì)胞的質(zhì)量直接影響科學(xué)研究結(jié)果及生物制品的安全和質(zhì) 量。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，微生物污染的威脅無處不在，潛在污染主要來自于:細(xì)胞自身攜帶 潛在污染源、原輔材料污染、細(xì)胞間的交叉污染、操作污染。
[0003] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)菌污染特征明顯，培養(yǎng)液可在短時(shí)間內(nèi)變黃，并出現(xiàn)明顯 渾濁現(xiàn)象，倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮。而支原體污染具有隱蔽 性，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，但支原體可引起細(xì)胞變形，影響DNA、RNA合成 及蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞生長，顯微鏡下可見細(xì)胞間出現(xiàn)大量黑點(diǎn)，細(xì)胞空泡化，呈調(diào)亡、壞死 狀態(tài)。
[0004] 常用于預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的方法有:細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的控制、無菌操作、 細(xì)胞培養(yǎng)基和器材的無菌處理、細(xì)胞交叉污染的控制、抗微生物試劑的添加。前幾項(xiàng)控制工 作中，難免百密一疏，抗微生物試劑的添加因其便捷性而為廣泛使用，市售主要抗微生物試 劑見表1: 表1市售主要抗微生物試劑
[0005] 由上表可知，市售主要抗微生物試劑大多為抗生素制劑，抗生素用于預(yù)防和清除 細(xì)胞污染雖然方便，但也存在諸多缺點(diǎn)：1.抗生素的使用對(duì)細(xì)胞會(huì)有不同程度的損傷(SP Langdon，Cell culture contamination: an overview[J]. Methods Mol Med, 2004,88: 309el7.)，且具有依賴性(王鴻等，細(xì)胞培養(yǎng)中珍貴貼壁細(xì)胞污染挽救方法的評(píng)價(jià)，首都醫(yī) 科大學(xué)學(xué)報(bào)2011，3(1):129-135.):2.賴藥性問題，傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)理大多通過阻 礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、抑制蛋白質(zhì)的合成、影響核酸、葉酸的代謝等來進(jìn)行抗微生物，微生 物很容易通過基因突變來改變代謝途徑，進(jìn)而對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性。3.支原體無細(xì)胞壁， 通常作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酷胺類、萬古霉素等對(duì)其完全不敏感;4.《藥 典》2015年版對(duì)生物制品中抗生素的使用有明確限制:除另有規(guī)定外，不得使用青霉素或其 他e-內(nèi)酷胺類抗生素;生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡可能避免使用抗生素，必須時(shí)，使用種類不得超過1 種；成品檢定中應(yīng)檢測并規(guī)定殘留量限值；5.抗生素處理污染細(xì)胞時(shí)間較長，一般為1-2 周，處理后的細(xì)胞生理性能或有變化，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果或最終的生物制品質(zhì)量。
[0006]抗菌膚是一類堿性多膚，一般由12~50個(gè)左右氨基酸組成，具有廣譜抗菌性，對(duì)細(xì) 菌、真菌、病毒、寄生蟲和腫瘤細(xì)胞有抑制或殺滅作用，可促進(jìn)傷口愈合過程，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫 系統(tǒng)的功能，中和細(xì)菌內(nèi)毒素 LPS，降低炎性細(xì)胞因子的釋放，減緩炎癥反應(yīng)引起的組織損 傷。相對(duì)于抗生素，抗菌膚在耐藥性方面具有不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，抗菌膚可通過與微生物細(xì)胞 膜作用，形成孔桐，影響細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，進(jìn)而使細(xì)胞死亡。細(xì)菌只有改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)才能 產(chǎn)生耐藥性，因此，運(yùn)種物理抗菌機(jī)理不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。
[0007]目前，抗菌膚數(shù)據(jù)庫（APD, http://aps.unmc.edu/AP/)收錄了來自6類生物共 2722種抗菌膚，其中，272種來自細(xì)菌，4種來自古生菌，8種來自原生生物，13種來自真菌， 335種來自植物，2043種來自動(dòng)物。雖然抗菌膚的種類眾多，但應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的不多，原 因如下：1.抗菌膚分子小，分離純化較困難，易被蛋白酶降解;2.大多數(shù)抗菌膚對(duì)微生物細(xì) 胞膜的攻擊特點(diǎn)令其對(duì)真核細(xì)胞(如人體細(xì)胞)有毒性;3.抗菌膚的性能各異，針對(duì)特定預(yù) 期用途須做大量基礎(chǔ)性研究工作，包括全面的藥理和毒理試驗(yàn)，證明有足夠的安全性和有 效性才能繼續(xù)下去;4.抗菌膚制劑中組分的相容性問題，抗菌膚為生物活性物質(zhì)，許多因素 會(huì)降低抗菌膚的活性，如高濃度的一價(jià)和二價(jià)陽離子、聚陰離子(polyanion)、血清、阿樸脂 蛋白A-I (apolipoprotein A-I )和蛋白酶等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明的第一個(gè)目的：提供一種不含抗生素的預(yù)防 和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑及其配制和使用方法。本發(fā)明提供的試劑主要組分為多膚 和氨基酸，多膚代謝后產(chǎn)物為氨基酸，對(duì)細(xì)胞安全無毒性。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的：拓展抗菌膚的應(yīng)用領(lǐng)域。已知抗菌膚可用于各個(gè)領(lǐng)域，包括 農(nóng)業(yè)、食品、衛(wèi)生用品、醫(yī)藥、化妝品、生物農(nóng)藥、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑、動(dòng)植物 抗病基因工程領(lǐng)域等，但尚無報(bào)道抗菌膚在細(xì)胞污染控制領(lǐng)域的應(yīng)用。
【申請(qǐng)人】發(fā)現(xiàn)本發(fā)明 中的多膚用于細(xì)胞污染控制領(lǐng)域具有預(yù)料不到的優(yōu)異技術(shù)效果。
[0010] 本發(fā)明的第=個(gè)目的：提供一種相容性好、抗微生物效果佳、協(xié)同增效的抗菌膚制 劑，用于預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染。
[0011] 本發(fā)明提供的預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑，含有序列為SEQ ID NO: 1的 多膚，多膚含量為1.5%-15%，優(yōu)選為2.5%-12.5%。試劑中還含有賴氨酸和甲硫氨酸，所述賴 氨酸含量為0.85%-2.73%，所述甲硫氨酸含量為0.09%-1.2%。
[0012] 本發(fā)明中所述多膚可通過化學(xué)合成，也可W通過基因工程技術(shù)表達(dá)、分離純化得 質(zhì)1(具體方法可參見Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，1989)〇
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑 的制備方法，如下： 先將溶劑經(jīng)121°C高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環(huán)境下冷藏備用；取多膚0.15g -1.5g， 賴氨酸0 . 〇85g -0.273g和甲硫氨酸0.009g-0.12g;將9ml溶劑加入溶解桶中，依次加入多 膚、賴氨酸和甲硫氨酸，攬拌溶解，溶劑補(bǔ)齊至10ml;在超凈臺(tái)內(nèi)將上述溶液經(jīng)0.22WI1-次 性濾器過濾除菌，分裝，在-20°C下保存。
[0014] 上述溶劑可為純水、PBS溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基、生理鹽水等。
[0015] 當(dāng)本發(fā)明的產(chǎn)品用于預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中微生物污染時(shí)，W相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng) 基，將產(chǎn)品按照1:1000的稀釋體積比例進(jìn)行稀釋，添加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，用于細(xì)胞培養(yǎng)即 可，其余培養(yǎng)操作照常。根據(jù)細(xì)胞的周期不同，每2-4天添加1次，長期添加，W預(yù)防微生物污 染。
[0016] 當(dāng)本發(fā)明的產(chǎn)品用于清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中微生物污染時(shí)，W相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng) 基，將產(chǎn)品按照1:1000的稀釋體積比例進(jìn)行稀釋，添加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，棄去舊的培養(yǎng)基， 用PBS將細(xì)胞清洗干凈，再加入新鮮的含有本發(fā)明產(chǎn)品的培養(yǎng)基，1天1次，連續(xù)處理3天。
[0017] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞污染控制類產(chǎn)品相比，具有W下技術(shù)效果： 1. 本發(fā)明在使用1-3天后有顯著微生物清除效果，而現(xiàn)有技術(shù)為7-14天； 2. 本發(fā)明不含有抗生素，多膚成分降解后終產(chǎn)物為氨基酸，符合藥典中要求； 3. 本發(fā)明產(chǎn)品在使用濃度下對(duì)細(xì)胞基本無毒性； 4. 本發(fā)明抗菌膚制劑中，各組分相容性好，且有協(xié)同增效作用。
[0018] 使用本發(fā)明提供的預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中微生物污染的試劑，可W清除 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中常見的細(xì)菌和支原體污染，在1-3天后有顯著清除效果，還可W用來預(yù) 防污染。經(jīng)過處理的污染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，治療周期完成后，細(xì)胞培養(yǎng)基澄清，細(xì)胞間無黑點(diǎn)， 細(xì)胞生長周期回復(fù)正常，細(xì)胞形態(tài)正常，無團(tuán)聚生長。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明提供的試劑使用后的抑菌結(jié)果。
[0020] 圖2是本發(fā)明提供的試劑使用前后的細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D。
[0021] A:處理前的CH0-S細(xì)胞;A' ：處理后的CH0-S細(xì)胞。
[0022] B:處理前的Vero細(xì)胞;B' ：處理后的Vero細(xì)胞。
[0023] C:處理前的NIH-3T3細(xì)胞;C' ：處理后的NIH-3T3細(xì)胞。
[0024] D:處理前的HEK293細(xì)胞;D' ：處理后的HEK293細(xì)胞。
[00巧]E:處理前的化pG2細(xì)胞;E' ：處理后的化pG2細(xì)胞。
[0026] 圖3是本發(fā)明提供的試劑使用前后的巢式PCR對(duì)照?qǐng)D。
[0027] 圖4是本發(fā)明提供的試劑的細(xì)胞毒性結(jié)果。
[0028] 圖5是實(shí)施例11的打孔測活對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例1 一種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑A及其制備方法 試劑A配方如下： 多膚:2.5% 賴氨酸:0.85〇/〇 甲硫氨酸:0. 〇9〇/〇 將純水經(jīng)12rc高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環(huán)境下冷藏備用；取0.25g多膚，0.085g賴 氨酸，0.009g甲硫氨酸;在超凈臺(tái)內(nèi)將9ml純水加入溶解桶中，依次加入多膚、賴氨酸和甲硫 氨酸，攬拌溶解，純水補(bǔ)齊至10ml;在超凈臺(tái)內(nèi)將上述溶液經(jīng)0.22um-次性濾器過濾除菌， 分裝，在-20°C下保存，即得本發(fā)明所述試劑A。
[0030]實(shí)施例2 -種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑B及其制備方法 試劑B配方如下： 多膚:3.8% 賴氨酸：1.56〇/〇 甲硫氨酸:0.36〇/〇 將PBS溶液經(jīng)121°C高溫103化a高壓滅菌，在4°C環(huán)境下冷藏備用;取0.3始多膚，0.156g 賴氨酸，0. 〇36g甲硫氨酸;在超凈臺(tái)內(nèi)將9mlPBS溶液加入溶解桶中，依次加入多膚，賴氨酸 和甲硫氨酸，攬拌溶解，PBS溶液補(bǔ)齊至10ml;在超凈臺(tái)內(nèi)將上述溶液經(jīng)0.22um-次性濾器 過濾除菌，分裝，在-20°C下保存，即得本發(fā)明所述試劑B。
[0031 ]實(shí)施例3 -種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑C及其制備方法 試劑C配方如下： 多膚:7.3% 賴氨酸：1.82〇/〇 甲硫氨酸:0.58〇/〇 將DMEM液體培養(yǎng)基經(jīng)121°C高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環(huán)境下冷藏備用；取0.73g多 膚，0.18?賴氨酸，0.05始甲硫氨酸;在超凈臺(tái)內(nèi)將9mlDMEM溶液加入溶解桶中，依次加入多 膚，賴氨酸和甲硫氨酸，攬拌溶解，DMEM補(bǔ)齊至10ml;在超凈臺(tái)內(nèi)將上述溶液經(jīng)0.22um-次 性濾器過濾除菌，分裝，在-20°C下保存，即得本發(fā)明所述試劑C。
[0032] 實(shí)施例4 一種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑D及其制備方法 試劑D配方如下： 多膚：10.6〇/〇 賴氨酸:2.45〇/〇 甲硫氨酸:0.9% 將生理鹽水經(jīng)12TC高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環(huán)境下冷藏備用；取1.06g多膚， 0.245g賴氨酸，0.09g甲硫氨酸;在超凈臺(tái)內(nèi)將9ml生理鹽水加入溶解桶中，依次加入多膚， 賴氨酸和甲硫氨酸，攬拌溶解，生理鹽水補(bǔ)齊至10ml;在超凈臺(tái)內(nèi)將上述溶液經(jīng)0.22um-次 性濾器過濾除菌，分裝，在-20°C下保存，即得本發(fā)明所述試劑D。
[0033] 實(shí)施例5 -種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑E及其制備方法 試劑E配方如下： 多膚:5% 賴氨酸：1.56〇/〇 甲硫氨酸:0.7% 將純水經(jīng)12rc高溫103化a高壓滅菌，在4°C環(huán)境下冷藏備用;取0.5g多膚，0.156g賴氨 酸，0.07g甲硫氨酸;在超凈臺(tái)內(nèi)將9ml純水加入溶解桶中，依次加入多膚，賴氨酸和甲硫氨 酸，攬拌溶解，純水補(bǔ)齊至10ml;在超凈臺(tái)內(nèi)將上述溶液經(jīng)0.22um-次性濾器過濾除菌，分 裝，在-20°C下保存，即得本發(fā)明所述試劑E。
[0034] 實(shí)施例6 -種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑F及其制備方法 試劑F配方如下： 多膚：12.5〇/〇 賴氨酸:2.73〇/〇 甲硫氨酸：1.2% 將純水經(jīng)121°C高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環(huán)境下冷藏備用；取1.25g多膚，0.27：3g賴 氨酸，0.12g甲硫氨酸;在超凈臺(tái)內(nèi)將9ml純水加入溶解桶中，依次加入多膚，賴氨酸和甲硫 氨酸，攬拌溶解，純水補(bǔ)齊至10ml;在超凈臺(tái)內(nèi)將上述溶液經(jīng)0.22um-次性濾器過濾除菌， 分裝，在-20°C下保存，即得本發(fā)明所述試劑F。
[0(X3日]實(shí)施例7抑菌試驗(yàn) 將C冊(cè)-S(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，密度為1.0 X 105 cell/well，將金 黃色葡萄球菌(ATCC6538)在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面連續(xù)傳代培養(yǎng)2次后，取新鮮培養(yǎng)物，用無 菌PBS洗脫下菌苔制成菌懸液，將菌懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)使其菌含量為（1~5) Xl〇6 C化/mL，用PBS稀釋菌液100倍，其菌含量為（1~5)X104 C化/mL，在上述培養(yǎng)細(xì)胞的孔中 加入菌液100化，使其最終菌濃度為(0.5~2.5) Xl〇4 C化/mL。將試劑A-F分別Wl:1000 的稀釋比例稀釋，加入試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)孔中，W不加試劑的加菌CHO-S細(xì)胞為對(duì)照，W未做 任何處理的細(xì)胞作為空白，每組同時(shí)做3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于35±2 °C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基的渾濁肉眼觀察非常清晰，采用直接法讀取結(jié)果。
[0036] 培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示，空白孔與試驗(yàn)孔4、8、(：、0、6少無菌生長，培養(yǎng)基澄清，未加試 劑的加菌CH0-S細(xì)胞孔(對(duì)照）培養(yǎng)基渾濁。結(jié)果表明，試劑A-F配制的實(shí)際使用濃度產(chǎn)品對(duì) 細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)菌有較佳的抑菌作用。
[0037] 實(shí)施例8支原體清除效果的巧光檢測 選用支原體污染的C冊(cè)-S細(xì)胞、Vero細(xì)胞、NIH-3T3細(xì)胞、肥K293細(xì)胞、HepG2細(xì)胞作為處 理對(duì)象，使用試劑B配制的產(chǎn)品，產(chǎn)品按照1:1000的稀釋體積比例，添加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，棄 去舊的培養(yǎng)基，用PBS將細(xì)胞清洗干凈，再加入新鮮的含有本發(fā)明產(chǎn)品的培養(yǎng)基，1天1次，連 續(xù)處理3天。
[0038] 應(yīng)用電子天平精確稱取化echst33342藍(lán)色染料Img，溶于10ml二甲基亞諷(DMS0) 中，使之配成lOOug/ml的儲(chǔ)備液。收集上述試劑處理3天前后的細(xì)胞，PBS洗涂后制成細(xì)胞懸 液，每個(gè)標(biāo)本取200ul移入化pendorf管中，加入藍(lán)色染料化echs口3342至終濃度lOug/ml， 37 °C下染色15min，取40ul細(xì)胞懸液迅速滴在載玻片上，加蓋玻片，在巧光顯微鏡（日本 Olympus，CKX41)下觀察結(jié)果。Hoechst33342染料能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA 中，使之發(fā)出明亮的藍(lán)色巧光。支原體內(nèi)含有DNA，亦能著色。
[0039] 用化echs 口 3342藍(lán)色染料染色，處理3天前后細(xì)胞的形態(tài)如圖2所示，可見支原體 污染的細(xì)胞中有顆粒狀小點(diǎn)，散在細(xì)胞周圍，或附于細(xì)胞膜表面;而本發(fā)明所述試劑B處理 后的細(xì)胞，可見細(xì)胞背景干凈，細(xì)胞周圍的顆粒狀物質(zhì)消失，結(jié)果顯示完全清除了支原體污 染。
[0040] 實(shí)施例9支原體清除效果的PCR檢測 W試劑C處理支原體污染的CH0-K1細(xì)胞、CH0-S細(xì)胞、H460細(xì)胞，處理方法同實(shí)施例8，W 經(jīng)12 rC高溫103Kpa高壓滅菌的純水為陰性對(duì)照。
[0041 ] 取處理3天前、后的細(xì)胞培養(yǎng)液及對(duì)照95°C水浴加熱5min，12000巧m離屯、Imin，取 上清做巢式PCR檢測。
[0042]巢式PCR第一輪體系和程序 3/
b)程序
由于PCR反應(yīng)中的引物來自支原體的保守16S-23S rRNA序列，因此，可根據(jù)1%瓊脂糖凝 膠電泳檢測PCR結(jié)果判定支原體是否被清除，檢測結(jié)果如圖3,其中，泳道1為陰性對(duì)照，泳 道2、3分別為W試劑C處理3天前、后的C冊(cè)-K1細(xì)胞培養(yǎng)液，泳道4、5分別為W試劑C處理3天 前、后的CHO-S細(xì)胞培養(yǎng)液，6、7泳道分別為W試劑C處理3天前、后的H460細(xì)胞培養(yǎng)液，M代表 Marker。圖帥，經(jīng)試劑C處理3天后的C冊(cè)-K1細(xì)胞、CHO-S細(xì)胞、H460細(xì)胞無支原體特異性條 帶，證明支原體已被清除。
[0043] 實(shí)施例10細(xì)胞毒性試驗(yàn) 用3-(4,5-二甲基-2-嚷挫)-2,5-二苯基漠化四挫即M1T法對(duì)肥K-293T細(xì)胞活力進(jìn)行計(jì) 量。將肥K-293T細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，密度為1.5 X 1〇5 cell/well，W未做任何處理的細(xì)胞 作為空白對(duì)照，將試劑A、B、C、DWl :1000的稀釋比例稀釋，分別加入試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)孔中， 每組做S個(gè)平行樣。樣品解育化，1化，1她，24h后，向各孔中各加的MTT溶液，解育4h 后，各加入15化1 DMS0充分溶解，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解，最后在570nm下測吸光度。
[0044] MTT試驗(yàn)結(jié)果見圖4,試劑A、B、C、D的實(shí)際使用濃度對(duì)HEK-293T細(xì)胞基本無毒性。
[0045] 實(shí)施例11比較試驗(yàn) 采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法比較試劑A中各組分及其組合對(duì)大腸桿菌E.coli K12D31的抑 菌活性。接種K12D31于液體LB培養(yǎng)基，37°C 20化pm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，按1%菌量加至融化 的LB瓊脂糖培養(yǎng)基中巧5-60°C)，混勻后按15ml/皿鋪于滅菌平皿。凝固后，在無菌條件下打 孔，按照20iU/孔的量加入待測的樣品。置于37°C培養(yǎng)箱8小時(shí)，觀察抑菌活性。結(jié)果見圖5， 其中，孔1為空白對(duì)照，加入的是無菌水，孔2為2.5%的多膚溶液，孔3為0.85%的賴氨酸溶液， 孔4為0.09%的甲硫氨酸溶液，孔5為混合溶液(含2.5%的多膚和0.85%的賴氨酸），孔6為混合 溶液(含2.5%的多膚和0.09%的甲硫氨酸），孔7為試劑A。圖5顯示，試劑A中巧中組分的混合液 抑菌效果最佳。
[0046] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種序列為SEQ ID NO: 1的多肽用于預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的用途。2. -種預(yù)防和清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染的試劑，其特征在于：所述試劑含有序列為SEQ ID NO: 1的多肽。3. 如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于:所述的多肽含量為1.5%-15%。4. 如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于:所述的多肽含量為2.5%-12.5%。5. 如權(quán)利要求2-4任一所述的試劑，還含有賴氨酸和甲硫氨酸。6. 如權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于:所述賴氨酸含量為0.85%-2.73%，所述甲硫氨 酸含量為〇·〇9%-1·2%。7. 如權(quán)利要求2-4、6所述的試劑用于清除和預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體生長的 用途。8. 如權(quán)利要求5所述的試劑用于清除和預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體生長的用 途。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK106047796SQ201610672152
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月15日 公開號(hào)201610672152.5, CN 106047796 A, CN 106047796A, CN 201610672152, CN-A-106047796, CN106047796 A, CN106047796A, CN201610672152, CN201610672152.5
【發(fā)明人】凌建群, 余海, 趙玲
【申請(qǐng)人】江蘇吉銳生物技術(shù)有限公司