異戊二烯合成酶基因及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種異戊二烯合成酶基因及其應(yīng)用，其解決了利用工程菌合成異戊二烯效率不高的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種異戊二烯合成酶基因、其表達(dá)的蛋白質(zhì)、含有異戊二烯合成酶基因的原核表達(dá)載體及工程菌以及產(chǎn)異戊二烯工程菌的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明可廣泛用于異戊二烯制備領(lǐng)域。
【專利說明】
異戊二烯合成酶基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種異戊二烯合成酶基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中，異戊二烯主要是由某些植物葉片排放至大氣中的，而工業(yè)生產(chǎn)中，目 前異戊二烯主要是由石油裂解物C5餾分萃取蒸餾而來。然而隨著石油資源日益枯竭及不 可再生，天然植物釋放的異戊二烯收集又事倍功半，通過微生物工程菌生產(chǎn)異戊二烯成為 一種可持續(xù)發(fā)展的必然趨勢。
[0003] 據(jù)報道，每年植物釋放到大氣中的異戊二烯達(dá)到5百萬噸，細(xì)菌自身又不具有異 戊二烯合成酶基因，因此植物是異戊二烯合成酶（ISPS)很好來源。利用基因工程技術(shù)開展 異戊二烯合成酶基因研究已取得了一些進(jìn)展，研究人員分離鑒定得到了少量的異戊二烯合 成酶基因，但國內(nèi)尚未有這方面的報道。
[0004] 2000年，Miller B首次在楊樹（白楊X顫楊）中獲得了全長IspS 基因，并且在大腸桿菌中得到了 7. 7nmol/mgDCW的異戊二烯（Miller B et al. Planta. 2001213(3) :483-7) ;2005 年，Sasaki 克隆得到了 白楊的 IspS 基因 （Sasaki K et al.FEBS Lett. 2005579(11) :2514-8) ;Thomas D. Sharkey 于 2005 年克隆得到蒙大 拿葛 IspS cDNA 全長（Sharkey TD et al. Plant Physiol. 2005137 (2) :700-12·)，隨后又 擴(kuò)充了數(shù)個楊柳科IspS基因，并且得到了刺槐的IspS cDNA全長序列（Sharkey TD et al，Evolution 201367 (4):1026-1040)。
[0005] 可見國內(nèi)外目前獲得的異戊二烯合成酶大多限于楊柳科和豆科植物，豆科植物關(guān) 于異戊二烯合成酶基因的研究主要集中在葛根、刺槐上，楊柳科的相關(guān)研究主要集中在楊 屬，而在殼斗科夏橡中并無研究報道，基因庫中也沒有夏橡異戊二烯合成酶基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明就是為了解決利用工程菌合成異戊二烯效率不高的技術(shù)問題，提供一種具 有較高合成效率的異戊二烯合成酶基因及應(yīng)用。
[0007] 為達(dá)到上述目的，一種異戊二烯合成酶基因，其是如下（a)或（b)的基因：（a)所 述基因 cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示；(b)所述基因是編碼如下蛋白質(zhì)的基 因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 異戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明同時提供一種異戊二烯合成酶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，其是如下（a)或（b)的 蛋白質(zhì)：(a)由序列表的序列2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在（a)中的氣基酸序 列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有異戊二烯合成酶活性的由（a)衍生的 蛋白質(zhì)；序列表的序列2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)是由序列表的序列1所不喊基序 列編碼。
[0009] 本發(fā)明還提供一種異戊二烯合成酶基因的原核表達(dá)載體。
[0010] 本發(fā)明還提供異戊二烯合成酶基因原核表達(dá)載體的產(chǎn)異戊二烯工程菌。
[0011] 本發(fā)明同時提供產(chǎn)異戊二烯工程菌在制備異戊二烯中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：根據(jù)植物在自然界異戊二烯的釋放速率，本發(fā)明選擇了釋放 量較高的夏橡異戊二烯合成酶基因進(jìn)行了分離鑒定和克隆，成功構(gòu)建異戊二烯生產(chǎn)菌株， 為生物法生產(chǎn)異戊二烯尋找到一個高效的異戊二烯合成酶。本發(fā)明利用基因工程手段，克 隆得到了夏橡基因 QrlspS，應(yīng)用到大腸桿菌中，使用氣相色譜進(jìn)行檢測，大腸桿菌具備生產(chǎn) 異戊二烯的能力，本發(fā)明對于使用微生物進(jìn)行異戊二烯大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了一個高效有 效的酶。
【附圖說明】
[0013] 圖1是夏橡總RNA的瓊脂糖電泳結(jié)果；
[0014] 圖2是夏橡QrlspS基因片段的瓊脂糖電泳結(jié)果；
[0015] 圖3是夏橡QrlspS基因3' -RACE的瓊脂糖電泳結(jié)果；
[0016] 圖4是夏橡QrlspS基因5' -RACE的瓊脂糖電泳結(jié)果；
[0017] 圖5是夏橡QRISPS氨基酸序列BlastP分析結(jié)果圖；
[0018] 圖6是RACE原理圖；
[0019] 圖7是夏橡QRISPS蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果；
[0020] 圖8是異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜結(jié)果；
[0021] 圖9是夏橡QrlspS基因在大腸桿菌中應(yīng)用的氣相檢測結(jié)果；
[0022] 圖10是夏橡QRISPS蛋白經(jīng)過取代突變之后在大腸桿菌中應(yīng)用的氣相檢測結(jié)果；
[0023] 圖11是夏橡QRISPS蛋白經(jīng)過添加突變之后在大腸桿菌中應(yīng)用的氣相檢測結(jié)果；
[0024] 圖12是夏橡QRISPS蛋白經(jīng)過缺失突變之后在大腸桿菌中應(yīng)用的氣相檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0026] 下述實施例中，大腸桿菌 BW25113 (Baba T et al. Mol Syst Biol. 2006 ; 2:2006. 0008.)是一株非病原菌，遺傳背景清楚，世代時間短、容易培養(yǎng)且培養(yǎng)基原料低廉。 大腸桿菌BW25113公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得，以上所述生物材料只為重復(fù)本 發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0027] 實施例1 :基因片段的獲得
[0028] 1.提取夏橡葉片總RNA
[0029] 采集夏橡葉片，使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen公司）提取楊樹葉片總RNA， 按照試劑盒說明方法進(jìn)行，進(jìn)行電泳（圖1)驗證RNA提取質(zhì)量，可見RNA完整性良好，可以 進(jìn)行后續(xù)實驗。
[0030] 2. RT-PCR
[0031] 以O(shè)ligo ((11〇2。做為反轉(zhuǎn)錄引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Superscript. III First-Strand Synthesis System for RT_PCR(Invitrogen 公司）說明將核酸反轉(zhuǎn)錄為 cDNA ；
[0032] 反應(yīng)體系如下：
[0033] RNA 1 μ g
[0034] 10mM dNTP 1 μ 1
[0035] 01igo(dT)20(0. 5yg/yl) 1 μ 1
[0036] 65°C 5min，置于冰上lmin，加入下面的10 μ 1的mix
[0037] 10XRT buffer 2μ 1 25mM MgCl·- 4μ 1 Ο, II DTT 2 μ 1 RNase0UT?(40U/u 1) 1μ 1 Superscript? III RT 1 μ 1
[0038] 5(TC 50min，85°C 15min 加入 1 μ 1 RNase H，37°C 20min
[0039] 反應(yīng)完畢，加入100 μ 1水稀釋cDNA，得到cDNA第一鏈。
[0040] 3.簡并引物設(shè)計
[0041] 根據(jù)楊柳科及豆科植物的已知氨基酸序列的保守區(qū)，并且參考所有已知IspS的 核酸序列及單萜合成酶的核酸序列設(shè)計的簡并引物QRF1及QRR1 :
[0042] QRF1:5'ATCATHGAYGAYATHTAYGAYGT 3'
[0043] QRR1 :5'YTGRTANGTGCARTGNGA 3'
[0044] 4.簡并PCR反應(yīng)
[0045] 反應(yīng)體系
[0046] lOXpyrobest buffer 1. 25 μ 1 dNTP (1 Oral) 0. 25 p 1 gDNA 0. 5 U 1 QRF1 (ImM) 0. 2 μ 1 QRR1 (ImM) 0. 2 u 1 Pyrobest (TAKARA 公司） 0. 06 μ 1 m to 12· 5 μ 1 12. 5ft 1
[0047] 反應(yīng)條件：
[0048]
[0049] 擴(kuò)增出672bp左右的片段（圖2)，擴(kuò)增產(chǎn)物于L 5%瓊脂糖凝膠上電泳，產(chǎn)物單一 明亮。
[0050] 備注：所示明亮單一條帶為QRF1和QRR1引物組擴(kuò)增產(chǎn)物，Marker為TAKARA 100bp DNA Ladder〇
[0051] 5.連接T載體，Sanger測序
[0052] 將單一明亮的條帶回收，連接PMD18-T (TAKARA公司）載體，轉(zhuǎn)化至 trans5a (TransGen公司）感受態(tài)細(xì)胞，第二天選擇白斑進(jìn)行驗證，選取陽性克隆，送至生 工Sanger測序。
[0053] 6.測序及序列分析，
[0054] 測序結(jié)果經(jīng)序列比對，顯示該基因為Isoprenoid_Biosyn_Clsuperfamily成員， 與川桑（Morus notabilis)的異戊二稀合成酶有68%同源性，與蘋果（Malus domestica) 的β羅勒稀合成酶有67%的同源性，與棉豆（Phaseolus lunatus])異戊二稀合成酶同源 性達(dá)到66% ;此片段命名為QrlspS基因片段，序列如SEQ ID No. 3所示。
[0055] 核酸序列進(jìn)行翻譯后氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0056] 實施例2 :QrIspS基因編碼區(qū)全長的獲得
[0057] 獲得 cDNA 全長的方法為 SMARTer-RACE，使用 SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech公司）進(jìn)行，以下使用的引物及試劑除GSP均為SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit內(nèi)提供，按照試劑盒說明方法進(jìn)行。
[0058] 1. RACE-Ready cDNA 的制備
[0059] RACE-Ready cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄體系如下：
[0060]
[0062] 2.基因特異性引物的設(shè)計：
[0063] 根據(jù)已經(jīng)獲得的QrlspS片段的序列設(shè)計基因特異性引物（GSP)，RACE-Ready cDNA做模版，GSP及通用引物（Universal Primer Mix，UPM)做引物進(jìn)行擴(kuò)增，可以得到 3'-RACE cDNA片段及5' -RACE cDNA片段。引物位置如圖6所示，中間黑色部分為簡并 PCR獲得序列，兩側(cè)黑色部分為通用引物序列，白色部分為需要得到的未知序列部分。
[0064] 共8個GSP序列，如下表：
[0065]
[0066] 3· 3' -RACE cDNA末端序列的獲得
[0067] 使用夏橡的3' -RACE-Ready cDNA為模版，UPM與GSP為引物進(jìn)行擴(kuò)增
[0068] 反應(yīng)體系：
[0069]
[0071] 反應(yīng)條件：
[0072]
[0073] 3' -RACE的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果如圖（圖3):
[0074] 得到一個單一明亮的夏橡DNA擴(kuò)增條帶，連接T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性 克隆Sanger測序，得到3'端cDNA序列。
[0075] 4. 5' -RACE cDNA末端序列的獲得
[0076] 使用夏橡的5' -RACE-Ready cDNA為模版，UPM與GSP為引物進(jìn)行擴(kuò)增.
[0077] 反應(yīng)體系：
[0078]
[0080] 反應(yīng)條件：
[0081]
[0082] 5' -RACE的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果如圖（圖4):
[0083] 由圖可見得到單一明亮的擴(kuò)增條帶，選擇其一連接T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選 陽性克隆Sanger測序，得到5'端cDNA序列。
[0084] 5.全長序列的獲得
[0085] 根據(jù)3' -RACE及5' -RACE測序結(jié)果，進(jìn)行序列比對，得到該基因 cDNA全長序列 (SEQ ID No. 1所示序列），對DNA、氨基酸序列進(jìn)行分析：該基因有1782bp，編碼575個氨基 酸，有ATG起始密碼子和TGA終止密碼子，說明該基因的完整性；其編碼的氨基酸含有一個 IspS高度保守標(biāo)簽序列DDXXD區(qū)域，同時也包含了 RRX8W保守區(qū)域。利用BLAST軟件在NCBI 中進(jìn)行同源比對，結(jié)果如圖5,顯示該基因為Isoprenoid_Biosyn_Clsuperfamily成員，與 川桑（Morus notabilis)的異戊二稀合成酶有62%同源性，與葡萄（Vitis vinifera)異戊 二稀合成酶同源性達(dá)到59% ;與蘋果（Malus domestica)的β羅勒稀合成酶有60%的同 源性，說明我們得到的是異戊二烯合成酶基因，簡寫為QrlspS基因，得到了編碼QRISPS蛋 白的氨基酸序列（SEQ ID No. 2所示序列）。
[0086] 實施例3 :大腸桿菌異戊二烯生產(chǎn)菌株的構(gòu)建
[0087] 全長引物QRFa及QRRa序列如下：
[0088] QRFa ：5'GTCATGCCAATGGCGAGCAAACAAGTGCTTTC 3'
[0089] QRRa :5'CGTCGACTGCAGCTAAAGGTGGATCTGGCTGTGG 3'
[0090] 1.大腸桿菌表達(dá)載體pBAD-QrlspS構(gòu)建
[0091] 將使用引物QRFa及QRRa獲得的QrlspS基因片段進(jìn)行Ncol和Kpnl (TAKARA公 司）雙酶切，并將pBAD-HisB表達(dá)載體（購自Invitrogen公司）進(jìn)行Ncol和ΚρηΙ雙酶 切，QrlspS基因連接至pBAD-HisB載體后轉(zhuǎn)化至trans5 α感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性克隆進(jìn)行 測序，pBAD-QrlspS的核苷酸序列是SEQ ID No. 5。
[0092] 2.異戊二烯生產(chǎn)菌株MV/pQrlspS的構(gòu)建
[0093] 將構(gòu)建好的pBAD-QrlspS與質(zhì)粒pi及p2共轉(zhuǎn)化至BW25113宿主得到異戊二烯生 產(chǎn)菌株 MV/pQrlspS。
[0094] 并且構(gòu)建對照菌株MV/pBAD，方法為將pBAD-HisB與質(zhì)粒pi及p2共轉(zhuǎn)至BW25113 宿主，得到無異戊二烯合成酶基因的對照菌株MV/pBAD。
[0095] 上述異戊二烯生產(chǎn)菌的構(gòu)建方法中，pi，p2包含異戊二烯合成途徑-甲羥戊酸 (MVA)途徑基因。其中pi由MvaE(乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶）基因、MvaS(HMG-乙酰輔酶A 合成酶）基因及MVK(甲羥戊酸激酶）基因組成，所述MVaE基因編碼由SEQIDN0.8所示的 氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；所述MvaS基因編碼由SEQ ID No. 9所示的氨基酸序列組成的蛋 白質(zhì)；所述MVK基因編碼由SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。p2由PMK (磷 酸甲羥戊酸激酶）基因、MVD(焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶）基因及idi (異戊二烯焦磷酸異構(gòu) 酶）基因組成，所述PMK基因編碼由SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；所述 MVD基因編碼由SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；所述idi基因編碼由SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0096] 其中，pi為鏈霉素抗性阿拉伯糖誘導(dǎo)型表達(dá)載體，pi的核苷酸序列是SEQ ID No. 6,包含MVA上游途徑基因表達(dá)盒，MVA上游途徑基因表達(dá)盒的核苷酸序列是SEQ ID No. 6的第1307-5821位，SEQ ID No. 6的第89-964位為阿拉伯糖啟動子，SEQ ID No. 6的 第5930-6087位為TrrnB終止子，SEQ ID No. 6的第1307-3729位是MvaE基因的編碼序列， SEQ ID No. 6的第3730-4904位是MvaS基因的編碼序列，SEQ ID No. 6的第4905-5821位 是MVK基因的編碼序列。
[0097] P2為氯霉素抗性阿拉伯糖誘導(dǎo)型表達(dá)載體，p2的核苷酸序列是SEQ ID No. 7,包 含MVA下游途徑基因表達(dá)盒，MVA下游途徑基因表達(dá)盒的核苷酸序列是SEQ ID No. 7的第 1309-4442 位，SEQ ID No. 6 的第 89-964 位為阿拉伯糖啟動子，SEQ ID No. 6 的第 4569-4726 位為TrrnB終止子，SEQ ID No. 6的第1309-2661位是PMK基因的編碼序列，SEQ ID No. 6 的第2677-3864位是MVD基因的編碼序列，SEQ ID No. 6的第3894-4442位是idi基因的 編碼序列。
[0098] 實施例4 :QrIspS基因在大腸桿菌中的應(yīng)用
[0099] 1、ISPS蛋白表達(dá)
[0100] 上述大腸桿菌工程菌MV/pQrlspS，使用L-arab誘導(dǎo)之后，蛋白表達(dá)結(jié)果SDS-PAGE 如圖所示（圖7)，可見不含異戊二烯合成酶的大腸桿菌宿主本身不表達(dá)異戊二烯合成酶 ISPS，QrlspS基因的轉(zhuǎn)入使宿主細(xì)胞表達(dá)ISPS蛋白。
[0101] 備注：圖為QRISPS蛋白在大腸桿菌工程菌中表達(dá)情況。
[0102] 2、大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的檢測
[0103] 將上述2個菌株進(jìn)行發(fā)酵，方法如下：將工程菌以百分之一的接種量轉(zhuǎn)接到 30mL(500mL三角瓶）含有鏈霉素、氯霉素及氨芐抗性的阿拉伯糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基（ZYM)中， 30°C，280rpm培養(yǎng)20h后。4°C，4000rpm離心收集菌液，用含有4%葡萄糖的M9培養(yǎng)基重懸 至600D菌體濃度，取lmL重懸菌液置于20mL頂空瓶內(nèi)，37°C，280rpm震蕩培養(yǎng)30h。
[0104] 含有鏈霉素、氯霉素及氨芐的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200 yL D+100yL E (以下均為質(zhì)量百分比濃度）；
[0105] A. ZY : 1 %胰蛋白胨，(λ 5 %酵母粉；
[0106] Β· 50ΧΜ :1. 25Μ Na2HP04,1. 25Μ ΚΗ2Ρ04,2· 5Μ NH4C1 和 0· 25Μ Na2S04 ;
[0107] C. 50X5052 :25 % 甘油，2· 5 % 葡萄糖，10 % 乳糖；
[0108] D. 1Μ MgS04 ；
[0109] Ε· 1000X 微量元素：50Mm FeC13,20mM CaC12,10mM MnC12,10mM ZnS04, CoC12、 NiC12、Na2Mo4、Na2Se03 和 H3B03 各 2mM ;
[0110] 鏈霉素：終濃度50mg/L、氯霉素終濃度34mg/L、氨芐終濃度100mg/L。
[0111] M9培養(yǎng)基配方如分子克隆實驗指南（科學(xué)出版社）第三版1595頁所示。
[0112] 反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行氣相色譜（GC)分析，使用的氣相色譜分析儀為Agilent 7890A GC Sysytem及Agilent7697A headspace Sampler頂空進(jìn)樣器，氣相分離柱為HP-5。頂空取 樣方法如下，Time :GC cycle time 20min, Vial equib time 6min ；Temperature (°C ) ：0ven 51, Loop/Valve 55, Transfer line 60。GC 方法如下：流速：2mL/min，Omin ~4min 50°C, 4min ~8. 5min 50 ~280°C，8. 5min ~10. 6min 280°C。
[0113] 此方法下異戊二稀標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）出峰時間為1. 75min (圖8)，大腸桿菌工 程菌MV/pQrlspS及陰性對照菌株MV/pBAD的GC色譜圖（圖9)，可見MV/pQrlspS在1. 75min 的保留峰，而對照沒有?？梢娢醇尤隥rlspS基因的菌株不具備異戊二烯生產(chǎn)能力，轉(zhuǎn)入 QrlspS基因后使得大腸桿菌具備了生產(chǎn)異戊二烯的能力，大腸桿菌中產(chǎn)量可達(dá)19. 64mg/ L〇
[0114] 實施例5 :經(jīng)過氨基酸突變的QRISPS蛋白在大腸桿菌中的應(yīng)用
[0115] 對QRISPS蛋白進(jìn)行取代、添加和缺失突變，使用實施例3構(gòu)建的pBAD-QrlspS為 模版，按照Fast Mutagenesis System(TransGen公司）試劑盒說明進(jìn)行突變。
[0116] 1、QRISPS蛋白的氨基酸突變
[0117] 氨基酸的取代突變：將39位氨基酸N突變?yōu)锳，即將核酸序列115-117位的AAT突 變?yōu)镚CT，使用突變引物為1F和1R;
[0118] 氨基酸的添加突變：39位氨基酸T后面添加一個氨基酸A，即將核酸序列117位之 后添加 GCG堿基，使用的突變引物為2F和2R ;
[0119] 氨基酸的缺失突變：將33位氨基酸T去掉，即將核酸序列115-117位堿基AAT去 掉，使用的突變引物為3F和3R。
[0120] 突變引物序列如下：
[0121]
[0122] 備注：有下劃線堿基為突變堿基
[0123] PCR 體系
[0124] Control Plasmid 1-5 ng Control Primers 1 μ 1 5 X TransStart FastPfu buffer 10 μ： 1 10 mM dNTPs 1 μ 1 TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μ 1 ddll20 to 50 ul
[0125] PCR 條件
[0126] 94。。 2-5 min 91°C 30 sec 55CC 30 sec 20-25 cycles 72V 15-30 sec/kb 72 °C 10 m i n
[0127] 電泳檢測
[0128] 取10 μ 1 PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0129] 觀察到目的條帶大小正確，可用DMT酶消化及轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
[0130] PCR產(chǎn)物的消化
[0131] 加1 μ 1 DMT酶于PCR產(chǎn)物中，混勻，37°C孵育lh。
[0132] 轉(zhuǎn)化
[0133] a.加入2-5 μ 1 DMT酶消化產(chǎn)物于50 μ 1 DMT感受態(tài)細(xì)胞中（在感受態(tài)細(xì)胞剛剛 解凍時加入產(chǎn)物），輕彈混勻，冰浴30分鐘。
[0134] b. 42°C準(zhǔn)確熱激45秒，立即置于冰上2min。
[0135] c.加250 μ 1平衡至室溫的S0C，225轉(zhuǎn)，37°C培養(yǎng)1小時。
[0136] d.取200 μ 1菌液鋪板，培養(yǎng)過夜（為得到較多的克隆，4000rpm離心lmin，棄掉部 分上清，保留100-150 μ 1，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養(yǎng)過夜）
[0137] 用對照質(zhì)粒模板（4. 5Kb)檢驗突變效率，在含氨芐的平板上涂8μ 1500πιΜ IPTG， 40μ1 40mg/ml X-gal，突變成功的菌落呈藍(lán)色。
[0138] 挑選藍(lán)色菌落進(jìn)行質(zhì)粒抽提（Plasmid Mini Kit 1，0MEGA公司），Sanger測序。得 到正確突變克隆，取代突變株命名為pBAD-QrlspScl，添加突變株命名為pBAD-QrIspSc2， 取代突變株命名為pBAD-QrIspSc3。
[0139] 2、異戊二烯生產(chǎn)菌株MV/pQrlspSc的構(gòu)建
[0140] 將構(gòu)建好的pBAD-QrlspScl與質(zhì)粒pi及p2共轉(zhuǎn)化至BW25113宿主得到異戊二烯 生產(chǎn)菌株 MV/pQrlspScl ;
[0141] 將構(gòu)建好的pBAD-QrIspSc2與質(zhì)粒pi及p2共轉(zhuǎn)化至BW25113宿主得到異戊二烯 生產(chǎn)菌株 MV/pQrIspSc2 ;
[0142] 將構(gòu)建好的pBAD-QrIspSc3與質(zhì)粒pi及p2共轉(zhuǎn)化至BW25113宿主得到異戊二烯 生產(chǎn)菌株 MV/pQrIspSc3。
[0143] 3、大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的檢測
[0144] 具體檢測方法同實施例4所述方法。MV/pQrlspScl得到的氣相檢測結(jié)果如圖10， MV/pQrIspSc2得到的氣相檢測結(jié)果如圖ll，MV/pQrIspSc3得到的氣相檢測結(jié)果如圖12所 示，可見MV/pQrlspScl、MV/pQrIspSc2及MV/pQrIspSc3菌株同樣具備生產(chǎn)異戊二稀的能 力，產(chǎn)量分別達(dá)到 17. 2mg/L，15. 2mg/L 及 13. 6mg/L。
【主權(quán)項】
1. 一種異戊二烯合成酶基因，其特征是如下（a)或（b)的基因： (a) 所述基因 cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示； (b) 所述基因是編碼如下蛋白質(zhì)的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取 代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有異戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨 基酸序列組成的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。2. 如權(quán)利要求1所述的異戊二烯合成酶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，其特征是如下（a)或（b) 的蛋白質(zhì)： (a) 由序列表的序列2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 在（a)中的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有異戊二 烯合成酶活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)； 所述序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)是由序列表的序列1所示堿基序 列編碼。3. -種含有如權(quán)利要求1所述異戊二烯合成酶基因的原核表達(dá)載體。4. 一種含有如權(quán)利要求3所述異戊二烯合成酶基因原核表達(dá)載體的產(chǎn)異戊二烯工程 菌。5. 如權(quán)利要求4所述的產(chǎn)異戊二烯工程菌在制備異戊二烯中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/88GK105985975SQ201510070061
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月10日
【發(fā)明人】李春, 賴小勤, 馮凡, 毋鴻江, 傅深展, 陶勇
【申請人】中國科學(xué)院微生物研究所, 中科鴻基生物科技有限公司