鐵皮石斛est-ssr引物組、開發(fā)方法及其在物種遺傳多樣性上的應用
【專利摘要】一種鐵皮石斛EST?SSR引物組，其特征在于：該引物組由9對引物組成，9對引物的序列表為如下所示：具有能降低條帶判讀的錯誤或偏差，同時也能夠反映出群體或個體的遺傳變異、并利于功能基因的研究優(yōu)點。
【專利說明】
鐵皮石斛EST-SSR引物組、開發(fā)方法及其在物種遺傳多樣性上 的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及鐵皮石斛技術領域，具體涉及一種鐵皮石斛EST-SSR引物組、開發(fā)方法 及其在物種遺傳多樣性上的應用。
【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛（學名：Dendrobium off icinale Kimura et Migo)，又名：黑節(jié)草、仙斛 蘭韻、紫縈仙株。屬微子目，蘭科多年生附生草本植物。莖直立，圓柱形，長9-35厘米，粗2-4 毫米，萼片和花瓣黃綠色，近相似，長圓狀披針形，長約1.8cm，寬4~5mm，花期3~6月。主要 分布于中國安徽、浙江、福建等地，其莖入藥，屬補益藥中的補陰藥。我國現有的76種石斛屬 植物中，具藥用的就有40多種.其藥理主要是強陰益精、補腎益力、明目和延年益壽。近年 來，國內對鐵皮石斛資源進行了大量研究，國外，Pyati AN等對5種石斛的離體培養(yǎng)也獲得 了一定程度的成功，但在石斛離體培養(yǎng)工作中，試驗設計粗糙，數據缺乏可比性，對石斛離 體條件下的遺傳穩(wěn)定性和生理穩(wěn)定性缺乏基礎性研究，未能獲得規(guī)范化石斛繁殖技術體系 和工藝流程，從而極大地阻礙了這一名貴中草藥走向場。
[0003] 分子標記鑒定是當今流行的比傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法更科學和靈敏的重要方法之一， 是構建高密度分子遺傳圖譜、分析物種分類與演化、染色體結構、遺傳多樣性、品種保護與 純度鑒定的有效工具;但是，普通基因組SSR(gSSR)引物擴增條帶穩(wěn)定性較弱，不能反映出 個體或群體的遺傳變異，且引物通用性較弱。EST-SSR標記不僅具有基因組SSR標記中技術 簡單、重復性好、多態(tài)性高和共顯性遺傳等特點，還具有引物開發(fā)廉價、通用性較好、條帶清 楚、容易統(tǒng)計等優(yōu)點。此外，由于EST-SSR是編碼基因的一部分，能夠直接獲得基因表達的相 關信息，這有可能直接鑒定決定重要表型性狀的等位基因。隨著NCBI中EST數據庫不斷地豐 富與完善，使用其序列開發(fā)SSR標記也已成為一種十分簡便而有效的方法，時至今日，EST-SSR標記已在眾多植物中得到廣泛的應用 [6]。目前，石斛屬植物的DNA分子鑒定方面主要采 用狀^)^?1^、1331?、31^?和331?等分子標記技術，如苑鶴等利用1^?0對人工栽培鐵皮石斛居 群的遺傳多樣性進行了相關研究，發(fā)現其親緣關系的遠近與其地理種源具有顯著的相關 性，而與栽培地點無關;王慧中等利用AFLP對13種石斛屬植物進行了遺傳多樣性的分析，其 結果與傳統(tǒng)分類學的結果基本一致;李明焱等 [9]利用ISSR進行了鐵皮石斛新品種的選育 工作;樊洪泓等[1()]利用SRAP對藥用石斛的遺傳多樣性及親緣關系進行了相關研究;邱道壽 等對石斛屬植物進行了SSR標記的開發(fā)及可轉移性分析。但至目前為止，有關鐵皮石斛的 EST-SSR標記卻極少見于報道。本文利用本課題組前期開發(fā)的鐵皮石斛EST-SSR引物用于鐵 皮石斛種質資源的遺傳多樣性分析、種質鑒定、親緣關系鑒定和指紋圖譜構建等方面。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明針對現有技術的上述不足，提供一種能降低條帶判讀的錯誤或偏差，同時 也能夠反映出群體或個體的遺傳變異、并利于功能基因的研究的鐵皮石斛EST-SSR引物。
[0005]為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為：一種鐵皮石斛EST-SSR引物 組，該引物組由9對引物組成，9對引物的序列表為如下所示(序列表SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 18的核苷酸序列）：
[0015] 本發(fā)明還提供一上述鐵皮石斛EST-SSR引物組的開發(fā)方法，包括：
[0016] (1)基因組DNA提取
[0017] DNA的提取采用植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒（上海萊楓生物科技有限公 司）提取鐵皮石斛基因組DNA，Eppendorf公司生產的Bio-Photometr核酸檢測儀檢測DNA濃 度和純度，根據計算所得的DNA濃度，將DNA樣品溶液用TE稀釋成50ng · uL-保存?zhèn)?用；
[0018] (2)序列來源獲得
[0019] 登錄到NCBI 中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在搜索欄中輸入Dendrobium nobile(金釵石斛），得到15383條EST序列（截至2015年9月18日），利用NCBI中金釵石斛的 EST序列進行后續(xù)的SSR位點查找及其引物設計；
[0020] (3)SSR位點查找
[0021] 在線搜索軟件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)對所有 EST序列進行SSR位點搜索(http: //www · gramene · org/db/searches/ssrtool)，搜索標準 為：二、三、四、五和六核苷酸的最小重復次數分別為10、6、5、4、3次，EST序列長度大于 100bp，SSR起始點位置距離5 '和3 '應不小于20bp。
[0022] (4)SSR引物設計
[0023]用Primer 5和Oligo 7軟件進行引物設計和評價，設計引物時設置的主要參數為： GC含量40%~70%，退火溫度50~62°C，引物長18~24bp，上下游引物Tm值之差應在1°C范 圍之內，預期擴增產物長度100~500bp，盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結構和錯配等情況的發(fā) 生，得分超過90分方為合格，才能被用于合成、使用;共設計出合格的SSR引物有106對，引物 命名為Dn加序號，即Dn-Ι~Dn-106;
[0024] (5)EST_SSR 引物篩選
[0025] 將106對通過評估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物最適 復性溫度的篩選于Eppendorf公司生產的Mastercyc 1 er普通梯度PCR儀上進行。2 X Taq PCR MasterMix購自天根生物公司（北京），PCR反應體系為20yL，其中包括：10yL的2XTaq PCR MasterMix(含有Taq酶、dNTP和優(yōu)化的反應緩沖液），0.4yL的模板DNA(50ng · yL-4，0.8yL的 引物對(5μπιο1 · yL-4 X2,8yL的ddH20。反應程序為94°C預變性5min，然后進行35個循環(huán)，每 個循環(huán)包括94°C變性30s，復性（48-64°C)30s，72°C延伸30s，最后72°C延伸10min，4°C保 存。隨機選擇6份鐵皮石斛種質資源用于引物以及最適退火溫度的篩選，各引物對的最適退 火溫度通過梯度PCR試驗確定。篩選出有目標條帶和最適退火溫度的引物。
[0026]本發(fā)明還涉及一種上述的EST-SSR引物組在物種遺傳多樣性上的應用，比如在鐵 皮石斛種質鑒定中的應用。
[0027]本發(fā)明的優(yōu)點和有意效果：
[0028] 1.本發(fā)明開發(fā)的EST-SSR引物擴增出的條帶為功能基因的一部分，序列相對保守， 其擴增條帶結果較gSSR更穩(wěn)定，這能降低條帶判讀的錯誤或偏差，同時也能夠反映出群體 或個體的遺傳變異，同時也利于功能基因的研究。
【附圖說明】
[0029] 圖1 9對引物在16份供試材料中的擴增。
[0030] 圖2基于SSR結果構建的16份材料的UPGMA聚類分析
【具體實施方式】：
[0031] 下面通過實施例進一步詳細描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例。 [0032] 實施例
[0033]本發(fā)明的引物組序列為：
[0043] 試驗材料
[0044]本試驗米集了 15份鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)種質資 源和一份串珠石斛(DO-5為串珠石斛，作為外來群，其余為鐵皮石斛），D0-1采自廣東饒平， D0-2采自云南思茅，D0-3采自安徽合肥，D0-4采自福建龍巖，D0-5采自浙江溫州，D0-6采自 福建武夷山，D0-7采自湖南新寧崑山，D0-8采自浙江瑞安，D0-9采自浙江蕭山，D0-10采自浙 江溫嶺雁蕩山，D0-11采自云南紅河，D0-12采自浙江麗水，D0-13采自云南文山，D0-14采自 浙江富陽，D0-15采自浙江臨安，D0-16采自浙江富陽.具體的步驟和鑒定鐵皮石斛的開發(fā)過 程為：
[0045] (1)基因組DNA提取:采用試劑盒法提取鐵皮石斛基因組DNA。具體步驟如下：1.稱 取蘭100mg新鮮植物。
[0046] 2.將樣品轉入研缽中，加液氮浸沒樣品，然后迅速研磨，反復2-3次，研磨至細粉末 狀，立即加入0.8ml Buffer PFG1和5ul RNase A1,快速研磨使Buffer PFHG1完全覆蓋在樣 品上，溫室放置，待樣品完全融化后倒入1.5ml離心管中，劇烈搖晃混合均勻。
[0047] 3.65 °C溫育1小時左右，溫育期間劇烈搖晃混合1-2次。
[0048] 4.冰浴2min，加入 125ul Buffer PFG2混合均勻。
[0049] 5.離心2min，仔細吸取蘭700ul上清，轉入干凈的1.5ml離心管中。
[0050] 6.加入 125ul Buffer PFG3混合均勾，離心2min。
[00511 7.實驗準備:將DNA吸附柱-C30置于收集管中并做好標記：
[0052] 在干凈的1.5ml離心管中加入150ul異丙醇。
[0053] 8.吸取步驟6中5650ul上相，轉入步驟7準備的已加入異丙醇的1.5ml離心管中， 緩慢吹打5次混合均勻，轉入DNA吸附柱-C30。
[0054] 9.離心lmin，棄收集管，將DNA吸附柱-C30放入另外一個干凈的收集管中。
[0055] 10.在DNA吸附柱-C30中加入500ul Buffer WAG，離心lmin，棄收集管，將DNA吸附 柱-C30放入另外一個干凈的收集管中。
[0056] 11.在DNA吸附柱-C30中加入500ul Buffer WB1，離心lmin，棄廢液，將DNA吸附柱-C30放回收集管中。
[0057] 12.重復步驟11。
[0058] 13.離心 2min。
[0059] 14.將DNA吸附柱-C30轉入試劑盒攜帶的1.5ml離心管中，向硅膠的中央加大約 lOOulTE，將1.5ml離心管的蓋子扣在DNA吸附柱上，做好標記，去除DNA吸附柱的蓋子，室溫 放置l-2min或者更長時間，12,000\8離心1111；[11。
[0060] 之后采用核酸檢測儀檢測DNA濃度和純度，然后將DNA樣品溶液用TE稀釋成50ng · uL-保存?zhèn)溆茫?br>[0061 ] (2)序列來源：登錄到NCBI中（http://www.ncbi .nlm.nih.gov/)，在搜索欄中輸入 Dendrobium officinale，僅得到800條EST序列（截至2015年9月18日），遠不能滿足試驗要 求，故在搜索欄中輸入其近緣種Dendrobium nobile(金釵石斛），得到15383條EST序列（截 至2015年9月18日），利用NCBI中金釵石斛的EST序列進行后續(xù)的SSR位點查找及其引物設 計。
[0062] (3)SSR位點查找：在線搜索軟件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)對所有 15383條EST序列進行 SSR 位點搜索（http: // www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，搜索標準為:二、三、四、五和六核苷酸的最小重 復次數分別為10、6、5、4、3次431'序列長度大于10(^?，338起始點位置距離5'和3'應不小于 20bp〇
[0063] (4)SSR引物設計：用Primer 5和Oligo 7軟件進行引物設計和評價。設計引物時設 置的主要參數為:GC含量40%~70%，退火溫度50~62°C，引物長18~24bp，上下游引物Tm 值之差應在1°C范圍之內，預期擴增產物長度100~500bp，盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結構 和錯配等情況的發(fā)生，得分超過90分方為合格，才能被用于合成、使用。共設計出合格的SSR 弓丨物有106對，引物命名為Dn加序號，即Dn-Ι~Dn-106。
[0064] (5)EST-SSR引物篩選:將106對通過評估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有 限公司合成。引物最適復性溫度的篩選于Eppendorf公司生產的Mastercyc 1 er普通梯度PCR 儀上進行。2XTaq PCR MasterMix購自天根生物公司（北京），PCR反應體系為20yL，其中包 括：l〇yL的2XTaq PCR MasterMix(含有Taq酶、dNTP和優(yōu)化的反應緩沖液），0.4yL的模板 DNA(50ng · yL-lO.SyL的引物對（5ymol · yL-qxSjyL的ddH20。反應程序為94°C預變性 5min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s，復性(48-64°C )30s，72°C延伸30s， 最后72°C延伸10min，4°C保存。隨機選擇6份鐵皮石斛種質資源用于引物以及最適退火溫度 的篩選，各引物對的最適退火溫度通過梯度PCR試驗確定。篩選出有目標條帶和最適退火溫 度的引物。
[0065] (6)聚丙烯酰氨凝膠電泳
[0066] 在最適退火溫度下，對有目標條帶的引物用于16份鐵皮石斛種質資源的PCR擴增， 產物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，銀染，等膠干燥后利用數碼相機進行拍照、保存。 具體步驟如下：
[0067] (1)
[0068]表1 6 %聚丙烯酰胺變性凝膠制備
[0069]
[0070] 注，40%丙烯酰胺:將19(^丙烯酰胺和1(^甲叉丙烯酰胺用水稀釋至50〇!^，4°(：貯 存?zhèn)溆谩?br>[0071] **TEMED和25%APS在灌膠前加入。
[0072 ] (2)灌膠:輕輕灌凝膠液，防止出現氣泡。聚合時間lh以上。
[0073] (3)預電泳:恒功率預電泳30min，溫度達到43 °C左右。
[0074] (4)樣品變性：10uL PCR樣品加入5uL 3XLoading Buffer[98% 甲酰胺，0.5M EDTA(pH8.0)，0.25%溴酚藍，0.25 %二甲苯青]，混勻后，在95°C變性5min，立即放至冰上 lOmin以上。
[0075] (5)加樣和電泳:吸打加樣槽，清除殘膠、尿素和氣泡，每一個加樣孔點入5uL樣品； 40_旦功率電泳約1. Oh~2.0;電泳結束后，小心分開兩塊玻璃板。
[0076] (6)銀染程序：固定:將凝膠板置于1L乙酸溶液（10% )中，輕輕搖蕩5-6min。漂洗： 用1.5L雙蒸水漂洗2-3min。染色:在1.5L新配的染色液中（1.5g硝酸銀，1.5mL37%甲醛），輕 輕搖蕩15min。漂洗：用1.5L雙蒸水漂洗，時間不超過10秒。顯影:在1.5L顯影液中（顯影液含 無水碳酸鈉45g，1 %硫代硫酸鈉300uL，37 %甲醛2.25mL。提前配制，置于4 °C冰箱中預冷)輕 輕搖蕩，直至出現帶紋。定影:在1.5L 10%乙酸溶液中定影2-3min。漂洗：用1.5L雙蒸水漂 洗2-3min。干膠:室溫下自然晾干。
[0077] (7)引物多態(tài)性指標分析
[0078]鐵皮石斛以富含多糖類物質而著名，其葉片多糖的含量也十分豐富，本試驗所使 用的試劑盒提取基因組DNA質量較高，無其它雜質干擾，之后經核酸檢測儀檢測顯示，OD260/ 0D 28Q值在1.68-1.95范圍內，獲得的DNA純度較高，達到了后續(xù)分析的要求。最后再依據檢測 出的DNA樣品溶液濃度，使用預熱的TE緩沖溶液稀釋成30-50ng · yL-1備用。
[0079] 通過優(yōu)化好的PCR反應體系對該106對EST-SSR引物進行篩選以及最佳退火溫度的 篩選。在最優(yōu)體系和最適退火溫度下進行PCR反應，以利于高質量的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 的獲得，這保證了后續(xù)條帶的統(tǒng)計和數據分析的準確性。
[0080] 選用16份差異較大的鐵皮石斛資源的核DNA為模板對篩選過后的引物進行擴增檢 測。圖1為9對引物在16份供試材料中的擴增。
[0081] 由表1可知，9對引物在16份材料（圖1)中共擴增出79條帶，其范圍為2~5條不等， 平均每條引物擴增出3.11條;其中多態(tài)性條帶有23條，平均每條引物擴增出2.56條多態(tài)性 條帶。平均多態(tài)性百分率為82.96%，其中DN5多態(tài)性百分率最低，為50% ;DN29、DN95和 DN106多態(tài)性百分率均為100%;其余引物多態(tài)性百分率介于50%~100%之間。
[0082] 此外，每對引物的Nei ' s基因多樣度范圍為0.1766~0.4297，均值為0.2855，小于 0.2的有DN23和DN60，介于0.2~0.3的有DN5、DN46和DN95，其余均大于0.3;香農信息指數范 圍為0 · 2931~0 · 6211，均值為0 · 4310，小于0 · 3的有DN23和DN60，介于0 · 3~0 · 4的有DN5、 DN23和DN46，其余均大于0.4。
[0083]表2 9對引物的擴增結果
[0086] 聚類分析
[0087] 依據9對EST-SSR引物擴增結果，再利用NTSYSpc2.10e軟件進行Jaccard相似性系 數分析，計算出它們之間的遺傳相似系數，其中，15份鐵皮石斛(去除D05)其范圍在0.582~ 0.949之間，串珠石斛(D05)與15份鐵皮石斛之間的范圍在0.456~0.709之間（表4)。
[0088]由遺傳相似系數進行UPGMA聚類分析，構建了 15份鐵皮石斛和1份串珠石斛的遺傳 關系圖（圖2)。其中在15份鐵皮石斛中D08和D016號遺傳相似系數最大，為0.949 ;D09和 D012、D013遺傳相似系數最小，為0.582。串珠石斛(005)與008遺傳相似系數最大(0.709)， 與D04遺傳相似系數最小(0.456)。由圖2可知，大約在遺傳相似系數0.58處，串珠石斛被從 鐵皮石斛中首先分1?出來;大約在遺傳相似系數0.68處，15份鐵皮石斛被分為3大類。
[0089] 第一類包括D09、D010、D014和D015;第二類僅包括D04;第三類包括D01、D011、D02、 D03、D07、D06、D013、D012、D08和D016。其中大約在0.77處第三類又可分為三小類，第一小類 包括D01、D011和D02;第二小類包括003、007、006、0013和0012;第三小類包括008和0016。
[0090] 結果表明，外類群-串珠石斛最先被分離出來，與15鐵皮石斛遺傳距離較遠。來自 浙江蕭山（D09)、浙江溫嶺雁蕩山（DO 10)、浙江富陽（DO 14)和浙江臨安(DO 15)親緣關系較近 而被聚類在一起，而來自浙江瑞安(D08)和浙江富陽（D016)彼此親緣關系最近而被聚類在 一起;來自廣東饒平(D01)、云南思茅(D02)和云南紅河(D011)親緣關系較近而被聚類在一 起。以上來自相同地區(qū)或區(qū)域的基本被聚類在一起。而來自浙江麗水（D012)、云南文山 (D013)與來自安徽合肥(D03)、湖南新寧崑山（D07)和福建武夷山（D06)的親緣關系較近而 被聚類在一起，由于目前鐵皮石斛產業(yè)高度商業(yè)化，可能是人為有意、無意攜帶流入這些地 區(qū)造成的，亦可能是由于這些種質遺傳背景比較復雜，彼此體內流著相同的"血液"，究其原 因有待后續(xù)進一步研究?？傮w而言，該20對引物聚類結果能夠比較準確地反應種內、種間彼 此親緣關系的遠近。
[0091] 表3 16份材料SSR分析的遺傳相似系數
[0093]所以，從上述應用實施例可以看出，本發(fā)明的引物可以實現對鐵皮石斛的甄選、鑒 別。
【主權項】
1. 一種鐵皮石解EST-SSR引物組，其特征在于：該引物組由9對引物組成，9對引物的序 列表為如下所示：2. 根據權利要求1所述的鐵皮石解EST-SSR引物組的開發(fā)方法，其特征在于:包括： (1) 基因組DNA提取 DNA的提取采用植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒提取鐵皮石解基因組DNA，檢測 DNA濃度和純度，根據計算所得的DNA濃度，將DNA樣品溶液用TE稀釋成50ng · uL-i，-20°C保 存?zhèn)溆茫? (2) 序列來源獲得 登錄到NCBI中，在捜索欄中輸入Demlrobium nobile，得到15383條EST序列，利用NCBI 中金較石解的EST序列進行后續(xù)的SSR位點查找及其引物設計； (3) SSR位點查找 在線捜索軟件SSRIT對所有EST序列進行SSR位點捜索，捜索標準為:二、Ξ、四、五和六 核巧酸的最小重復次數分別為10、6、5、4、3次，651'序列長度大于10化9,551?起始點位置距離 5'和3'應不小于206口。 (4) SSR引物設計 用Primer 5和Oligo 7軟件進行引物設計和評價，設計引物時設置的主要參數為:GC含 量40 %~70 %，退火溫度50~62°C，引物長18~24bp，上下游引物Tm值之差應在rC范圍之 內，預期擴增產物長度100~5(K)bp，盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結構和錯配等情況的發(fā)生， 得分超過90分方為合格，才能被用于合成、使用;共設計出合格的SSR引物有106對，引物命 名為Dn加序號，即Dn-1~Dn-106; 巧化ST-SSR引物篩選 將106對通過評估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成；引物最適復性 溫度的篩選于Eppendorf公司生產的Masteixycler普通梯度PCR儀上進行；2 X Taq PCR MasterMix購自天根生物公司，PCR反應體系為20化，其中包括：10化的2XTaq PCR MasterMix，0.4化的模板DNA，0.祉L的引物對(5μπιο 1 ·化-1) X 2，祉L的d地2〇;反應程序為94 。(:預變性5min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 °C變性30s，復性30s，72 °C延伸30s，最 后72°C延伸10min，4°C保存;隨機選擇6份鐵皮石解種質資源用于引物W及最適退火溫度的 篩選，各引物對的最適退火溫度通過梯度PC時式驗確定，篩選出有目標條帶和最適退火溫度 的引物。3. -種鐵皮石解EST-SSR引物組在物種遺傳多樣性中的應用。4. 一種鐵皮石解EST-SSR引物組在鐵皮石解種質鑒定中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK105969872SQ201610409877
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】付濤
【申請人】寧波城市職業(yè)技術學院