本發(fā)明屬于海洋生物病原檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時檢測對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、對蝦急性肝胰腺壞死癥(Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)、蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)的多重PCR檢測方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)和傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)一直是引起對蝦病毒病暴發(fā)流行的主要病毒。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將此兩種病劃為須向其申報的甲殼類重要疾病。對蝦急性肝胰腺壞死癥(Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)和蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是現(xiàn)階段養(yǎng)殖對蝦特別是南美白對蝦的最大威脅，是對蝦養(yǎng)殖過程中兩種新發(fā)疫病，前者導(dǎo)致蝦苗大量的死亡，后者導(dǎo)致對蝦生長緩慢，參差不齊，甚至生長停滯。

目前，對蝦病害種類較多，診斷手段主要包括病理學(xué)和生物學(xué)方法、免疫診斷法、分子雜交及PCR技術(shù)。已建立的常規(guī)PCR技術(shù)，常是一次只能檢測一種病原，比較費時間。而多重PCR技術(shù)是一種特殊的PCR方法，在一個反應(yīng)體系中加入多對病原特異性引物，能夠同時檢測多種病原體，從而縮短病原檢測的周期，提高檢測效率。但多重PCR檢測也受多種因素的影響，比如DNA聚合酶的活性、模板的質(zhì)量、所設(shè)計的病原引物的特異性、PCR反應(yīng)條件、不同病原樣本間對試劑的競爭等因素都會影響檢測結(jié)果的敏感性和準(zhǔn)確性。

基于當(dāng)前現(xiàn)狀，需建立一種準(zhǔn)確、快速、簡便的對蝦病原檢測方法，以利于對病原的早期診斷，便于及時采取有效的防治措施。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種方便快捷，檢測限低，且特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確率高、且能同時檢測對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的多重PCR檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種同時檢測對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的多重PCR引物，所述引物分別為WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和 IHHNV-R，序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ IDNO:3和4，SEQ ID NO:5和6，SEQ ID NO:7和8所示。

還提供一種同時檢測對蝦WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR檢測試劑盒，包括WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的專用檢測引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R、陽性對照品、陰性對照品、DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、Mg²⁺、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水；WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的專用檢測引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R，序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ IDNO:3和4，SEQ ID NO:5和6，SEQ ID NO:7和8所示，陽性對照品為SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列混合作為模板；陰性對照為：不含有對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒任一病原的任意DNA核酸序列。

同時，提供一種同時檢測對蝦WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：

(1)提取DNA：

取疑似對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒發(fā)病對蝦鰓和內(nèi)臟組織，提取病原核酸DNA備用；

采用上述多重PCR專用檢測引物；陽性對照為SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列混合作為模板，陰性對照為：不含有對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒任一病原的任意DNA核酸序列；

(2)多重PCR擴(kuò)增：

提取好待檢測的DNA模板，同時按照PCR檢測的PCR反應(yīng)體系設(shè)置陽性和陰性對照，加入陽性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品進(jìn)行擴(kuò)增；將各反應(yīng)管放入PCR儀的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)定多重PCR儀反應(yīng)程序，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)；

擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與分析：1.5％(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶并成像分析；

(3)結(jié)果判定：

當(dāng)檢測樣本和陽性對照的擴(kuò)增條帶大小接近，約為1189bp時，結(jié)果為對蝦白斑綜合征病毒陽性；如果沒有1189條帶，則為對蝦白斑綜合征病毒陰性；

當(dāng)檢測樣本和陽性對照的擴(kuò)增條帶大小接近，約為719bp時，結(jié)果為對蝦急性肝胰腺 壞死癥陽性；如果沒有719條帶，則為對蝦急性肝胰腺壞死癥陰性；

當(dāng)檢測樣本和陽性對照的擴(kuò)增條帶大小接近，約為512bp時，結(jié)果為蝦肝腸胞蟲陽性；如果沒有512bp條帶，則為蝦肝腸胞蟲陰性；

當(dāng)檢測樣本和陽性對照的擴(kuò)增條帶大小接近，約為244bp時，結(jié)果為傳染性皮下及造血組織壞死病毒陽性；如果沒有244bp條帶，則為傳染性皮下及造血組織壞死病毒陰性；

當(dāng)陰性對照出現(xiàn)條帶時，表明操作過程中有試劑污染，檢測結(jié)果無效；

當(dāng)陽性對照無條帶時，表明引物或者試劑盒中相關(guān)試劑降解，引物或試劑盒失效。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)提取病原核酸DNA的步驟為：取疑似對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒發(fā)病對蝦鰓和內(nèi)臟組織組織0.05-0.15g，加入400μL裂解液研磨均勻，加入蛋白酶K，終濃度為100μg/ml，震蕩混勻后于55℃溫育1-2h；

在反應(yīng)液中加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇混勻，去除殘余蛋白，10000r/min離心10min后取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇混勻，10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上層水相，加入1/10體積3mol/L乙酸鈉，再加入2倍體積無水乙醇，混勻，12000r/min離心5min，沉淀用75％冷乙醇洗滌2次，室溫晾干后加入50μL TE，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步的，所述裂解液組成為15mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,1％SDS。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)中PCR檢測的PCR反應(yīng)體系為：50μL反應(yīng)體系中包含有10倍濃度的含鎂離子的Taq DNA聚合酶緩沖液5μL，Taq DNA聚合酶1μL，各引物終濃度為0.4μM，提取好待檢測的DNA模板2μL。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)設(shè)定多重PCR反應(yīng)條件為：95℃4分鐘，1個循環(huán)；95℃1分鐘，58.5℃1分鐘，72℃1分鐘，35個循環(huán)；72℃10分鐘，1個循環(huán)；4℃保存。

本發(fā)明根據(jù)對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、對蝦急性肝胰腺壞死癥(Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)、蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)核酸序列，分別設(shè)計用于檢測對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的特異性引物。本發(fā)明通過對所設(shè)計的引物進(jìn)行實驗篩選，篩選出一組同時對對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒具有非常高的靈敏性和特異性的引物，引物序列如下：

對蝦白斑綜合征病毒

上游引物：WSSV-F：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCC SEQ ID NO:1

下游引物：WSSV-R：TACTTGCTTAGAGATGGCTTCG SEQ ID NO:2

對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)

上游引物：AHPND-F：GGAAGTCGGTCGTAGTGTAG SEQ ID NO:3

下游引物：AHPND-R：ATATCGCATAACCAAGCCATTC SEQ ID NO:4

蝦肝腸胞蟲

上游引物：EHP-F：GAGAGTAGCGGAACGGATAG SEQ ID NO:5

下游引物：EHP-R：GCATCACGGACCTGTTATTG SEQ ID NO:6

傳染性皮下及造血組織壞死病毒

上游引物：IHHNV-F：AAGAGCAGCGACAGTTCAG SEQ ID NO:7

下游引物：IHHNV-R：CGGCTTCCTTAGTTGATAGTTG SEQ ID NO:8

陽性質(zhì)控品

陽性質(zhì)控品：包括對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的核酸DNA。分別為人工合成含有上述引物擴(kuò)增目的片段的如下序列：

WSSV：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCAGATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTCCATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAATGCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGAACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAAAACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAATGGAGGAGTA GAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTATCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTA(SEQ ID NO:9)；

AHPND(pirVP)：

GGAAGTCGGTCGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTGGGGAGCTTACCATTCAATACCAATGGGGTGCGCCATTTATGGCTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATGTGGTACAACGTGATGAAACTTACCATTTACAACGCCCTGATAATGCATTCTATCATCAGCGTATTGTTGTAATTAACAATGGCGCTAGTCGTGGTTTCTGTACAATCTATTACCACTAAGAAGGTGCTCACATGACTAACGAATACGTTGTAACAATGTCATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAATGCTCGTAAAAGTTATTTATTTGATAACTATGAAGTTGATCCTAACTATGCTTTCAAAGCAATGGTTTCATTTGGTCTTTCAAATATTCCTTACGCGGGTGGTTTTTTATCAACGTTATGGAATATCTTTTGGCCAAATACGCCAAATGAGCCAGATATTGAAAACATTTGGGAACAATTACGTGACAGAATCCAAGATTTAGTAGATGAATCGATTATAGATGCCATCAATGGAATATTGGATAGCAAAATCAAAGAGACACGCGATAAAATTCAAGACATTAATGAGACTATCGAAAACTTCGGTTATGCTGCGGCAAAAGATGATTACATTGGTTTAGTTACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGCGAGCTAGACGGTGATGAATGGCTTGGTTATGCGATAT(SEQ ID NO:10)

EHP：

GAGAGTAGCGGAACGGATAGGGAGCATGGTATAGGTGGGCAAAGAATGAAATCTCAAGACCCCACCTGGACCAACGGAGGCGAAAGCGATGCTCTTAGACGTATCTGGGGATCAAGGACGAAGGCTAGAGTATCGAAAGTGATTAGACACCGCTGTAGTTCTAGCAGTAAACTATGCCGACAATGCTGGGTGTTGCGAGAGCGATGCTTGGTGTGGGAGAAATCTTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGCTCGCAAGGGTGAAACTTAAAGCGAAATTGACGGAAGGACACTACCAGGAGTGGATTGTGCTGCTTAATTTAACTCAACGCGGGAAAACTTACCAGGGTCAAGTCTATCGTAGATTGGAGACATGAGGTAGACAAGAGTGGTGCATGGCCGTTGGAAATTGATGGGGCGACTTTTAGCTTAAGTGCTGGAACCAGTGAGATCTTCTAGACAGGTGTTATTTAGGCACAGGAGGGAGAAGGCAATAACAGGTCCGTGATGC(SEQ ID NO:11)

IHHNV：

AAGAGCAGCGACAGTTCAGCAACAGAAACACAACGATATAAGATGGTAAAATCAATGATGAAGACCTACGGATGGAAAGTACATAAAGCAGGCGTAGTGATGCACTCGATGGTACCCCTTATGAAAGACTTAAAAGTATCAGGAGGCACATCATTTGAGACTCTCACATTTACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAAGCCG(SEQ ID NO:12)

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本發(fā)明提供了一種依賴于PCR的分子檢測試劑盒及檢測方法，為對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的同時檢測提供一種快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測方法及試劑盒。通過對引物的設(shè)計與篩選，使得檢測的靈敏度更高，特異性更好。檢測限低至10拷貝/μL，提高了檢測水平。所建立的多重PCR體系可重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)。該試劑盒為對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的檢測提供更有效的檢測方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。

(2)本發(fā)明所選的4種對蝦病原引物均是對應(yīng)4種病原的專用檢測引物，特異性強(qiáng)。是本發(fā)明的申請人經(jīng)大量的試驗驗證后，篩選出的4對具有非常高的特異性的引物，具有非常好的敏感性，檢測限低。高通量、低成本、高效率。

(3)本發(fā)明所涉及的4種病原包括世界各地的病原株，各自都有多種不同的病原株，一種病原的不同病原株的基因序列有的很保守，有的變異性比較大。并且不同病原之間還存在交叉反應(yīng)，在綜合比對這些病原株的序列后，申請人選擇了一種病原不同病原株之間保守性好的序列，從而能夠確保檢測出這種病原的不同病原株。因此本發(fā)明在設(shè)計引物時，考慮到一種病原與其他病原的基因之間的序列差別，使得在檢測時，假陽性率低。避免與其他病原發(fā)生交叉，申請人設(shè)計了很多對引物，再進(jìn)行大量的試驗驗證，從而篩選出用于本發(fā)明的這4對引物。這4對病原引物彼此間無交叉，且不與其它病原產(chǎn)生交叉，假陽性率低，能夠特異性的檢測出分布于世界各地不同地區(qū)的4種病原的病原株，具有非常好的特異性，廣泛適用性和實用性。

(4)本發(fā)明對檢測的病原基因片段無需再進(jìn)行克隆、測序和序列比對。一次實驗即可檢測出待測樣品中是否含有這4種病原中的一種、兩種、三種或四種?？朔艘酝鶈我粰z測的操作繁瑣、靈敏度低、適用性低等諸多限制。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技 術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為多重PCR體系中對蝦白斑綜合征病毒檢測的敏感性實驗結(jié)果圖；

圖2為多重PCR體系中對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)檢測的敏感性實驗結(jié)果圖；

圖3為多重PCR體系中蝦肝腸胞蟲檢測的敏感性實驗結(jié)果圖；

圖4為多重PCR體系中傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測的敏感性實驗結(jié)果圖；

圖5為多重PCR體系中4種對蝦病原混合檢測的敏感性實驗圖；

圖6為多重PCR體系中分別檢測1中，2種，3種，4種對蝦病原實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實施例1：

檢測對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒試驗

1)試劑

10×Taq Buffer：Tris-HCl 100mM，KCl 500mM，MgCl₂20mM，dNTPs 2mM，Taq酶1U/μL；

引物：WSSPV-F、WSSV-R、AHPND-F、AHPND-R、EHP-F、EHP-R、IHHNV-F、IHHNV-R各10μM，純水，陽性質(zhì)控品DNA10μg/ml；

本發(fā)明根據(jù)對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、對蝦急性肝胰腺壞死癥(Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)、蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)的核酸序列，分別設(shè)計用于檢測對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的特異性引物。本發(fā)明通過對所設(shè)計的引物進(jìn)行實驗篩選，篩選出一組同時對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒具有非常高的靈敏性和特異性的引物，引物序列如下：

對蝦白斑綜合征病毒

上游引物：WSSV-F：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCC SEQ ID NO:1

下游引物：WSSV-R：TACTTGCTTAGAGATGGCTTCG SEQ ID NO:2

對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)

上游引物：AHPND-F：GGAAGTCGGTCGTAGTGTAG SEQ ID NO:3

下游引物：AHPND-R：ATATCGCATAACCAAGCCATTC SEQ ID NO:4

蝦肝腸胞蟲

上游引物：EHP-F：GAGAGTAGCGGAACGGATAG SEQ ID NO:5

下游引物：EHP-R：GCATCACGGACCTGTTATTG SEQ ID NO:6

傳染性皮下及造血組織壞死病毒

上游引物：IHHNV-F：AAGAGCAGCGACAGTTCAG SEQ ID NO:7

下游引物：IHHNV-R：CGGCTTCCTTAGTTGATAGTTG SEQ ID NO:8

陽性質(zhì)控品：包括對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的核酸DNA。分別為人工合成(生工生物工程(上海)股份有限公司，以下均同此)含有上述引物擴(kuò)增目的片段的如下序列：

WSSV：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCAGATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTCCATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAATGCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGAACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAAAACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTC AAAGGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTATCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTA

AHPND：

GGAAGTCGGTCGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTGGGGAGCTTACCATTCAATACCAATGGGGTGCGCCATTTATGGCTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATGTGGTACAACGTGATGAAACTTACCATTTACAACGCCCTGATAATGCATTCTATCATCAGCGTATTGTTGTAATTAACAATGGCGCTAGTCGTGGTTTCTGTACAATCTATTACCACTAAGAAGGTGCTCACATGACTAACGAATACGTTGTAACAATGTCATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAATGCTCGTAAAAGTTATTTATTTGATAACTATGAAGTTGATCCTAACTATGCTTTCAAAGCAATGGTTTCATTTGGTCTTTCAAATATTCCTTACGCGGGTGGTTTTTTATCAACGTTATGGAATATCTTTTGGCCAAATACGCCAAATGAGCCAGATATTGAAAACATTTGGGAACAATTACGTGACAGAATCCAAGATTTAGTAGATGAATCGATTATAGATGCCATCAATGGAATATTGGATAGCAAAATCAAAGAGACACGCGATAAAATTCAAGACATTAATGAGACTATCGAAAACTTCGGTTATGCTGCGGCAAAAGATGATTACATTGGTTTAGTTACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGCGAGCTAGACGGTGATGAATGGCTTGGTTATGCGATAT

EHP：

GAGAGTAGCGGAACGGATAGGGAGCATGGTATAGGTGGGCAAAGAATGAAATCTCAAGACCCCACCTGGACCAACGGAGGCGAAAGCGATGCTCTTAGACGTATCTGGGGATCAAGGACGAAGGCTAGAGTATCGAAAGTGATTAGACACCGCTGTAGTTCTAGCAGTAAACTATGCCGACAATGCTGGGTGTTGCGAGAGCGATGCTTGGTGTGGGAGAAATCTTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGCTCGCAAGGGTGAAACTTAAAGCGAAATTGACGGAAGGACACTACCAGGAGTGGATTGTGCTGCTTAATTTAACTCAACGCGGGAAAACTTACCAGGGTCAAGTCTATCGTAGATTGGAGACATGAGGTAGACAAGAGTGGTGCATGGCCGTTGGAAATTGATGGGGCGACTTTTAGCTTAAGTGCTGGAACCAGTGAGATCTTCTAGACAGGTGTTATTTAGGCACAGGAGGGAGAAGGCAATAACAGGTCCGTGATGC

IHHNV：

AAGAGCAGCGACAGTTCAGCAACAGAAACACAACGATATAAGATGGTAAAATCAATGATGAAGACCTACGGATGGAAAGTACATAAAGCAGGCGTAGTGATGCACTCGATGGTACCCCTTATGAAAGACTTAAAAGTATCAGGAGGCACATCATTTGAGACTCTCACATTT ACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAAGCCG

陰性質(zhì)控品：不含WSSV、AHPND(PirVP)、EHP或IHHNV這四種病病原的任何DNA質(zhì)粒。

以上四種病原核酸片段分別轉(zhuǎn)入載體后，挑取陽性克隆菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒測其濃度后作為陽性質(zhì)控品。

一種同時檢測對蝦WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR檢測試劑盒，包括WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的專用檢測引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R、陽性對照品、陰性對照品、DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、Mg²⁺、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水；WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的專用檢測引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R；

陽性對照品為SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列混合作為模板；

陰性對照為：不含有對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒任一病原的任意DNA核酸序列。

檢測方法及步驟：

病原核酸DNA的提取：

取疑似對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒發(fā)病對蝦鰓和內(nèi)臟組織約0.1g，加入400μL裂解液(15mmol/L NaCl,10mmol/LTris-HCl,10mmol/L EDTA,1％SDS,pH8.0)研磨均勻，加入蛋白酶K，終濃度為100μg/ml，震蕩混勻后于55℃溫育1-2h。在反應(yīng)液中加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25:24:1)混勻，去除殘余蛋白，10000r/min離心10min后取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇(24:1)混勻，10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上層水相，加入1/10體積3mol/L乙酸鈉(pH 5.2)，再加入2倍體積無水乙醇，混勻，12000r/min離心5min，沉淀用75％冷乙醇洗滌2次，室溫晾干后加入50μL TE，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

多重PCR擴(kuò)增：

所述的多重PCR反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)體系中包含有10倍濃度的含鎂離子的Taq DNA聚合酶緩沖液5μL，Taq DNA聚合酶1μL，各引物終濃度為0.4μM，提取好待檢測的DNA模板2μL，純水補足至50μL，同時按上述體系設(shè)置陽性和陰性對照，加 入陽性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品1μL進(jìn)行擴(kuò)增。

將各反應(yīng)管放入PCR儀的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)定多重PCR儀反應(yīng)程序，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。以檢測所檢測的對蝦是否感染對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒。

設(shè)定多重PCR反應(yīng)條件為：95℃4分鐘，1個循環(huán)；95℃1分鐘，58.5℃1分鐘，72℃1分鐘，35個循環(huán)；72℃10分鐘，1個循環(huán)；4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與分析：1.5％(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶并成像分析。

結(jié)果判定：

當(dāng)檢測樣本和陽性對照的擴(kuò)增條帶大小接近，約為1189bp時，結(jié)果為對蝦白斑綜合征病毒陽性；如果沒有1189條帶，則為對蝦白斑綜合征病毒陰性；

當(dāng)檢測樣本和陽性對照的擴(kuò)增條帶大小接近，約為719bp時，結(jié)果為對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)陽性；如果沒有719條帶，則為對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)陰性；

當(dāng)檢測樣本和陽性對照的擴(kuò)增條帶大小接近，約為512bp時，結(jié)果為蝦肝腸胞蟲陽性；如果沒有512bp條帶，則為蝦肝腸胞蟲陰性；

當(dāng)檢測樣本和陽性對照的擴(kuò)增條帶大小接近，約為244bp時，結(jié)果為傳染性皮下及造血組織壞死病毒陽性；如果沒有244bp條帶，則為傳染性皮下及造血組織壞死病毒陰性；

當(dāng)陰性對照出現(xiàn)條帶時，表明操作過程中有試劑污染，檢測結(jié)果無效；

當(dāng)陽性對照無條帶時，表明引物或者試劑盒中相關(guān)試劑降解，引物或試劑盒失效。

同時檢測對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的多重PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法作進(jìn)一步的效果檢測。

一、敏感性實驗

將上述人工合成的陽性質(zhì)控品進(jìn)行稀釋，依次稀釋為1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷貝/μL，分別作為多重PCR模板進(jìn)行敏感性實驗。結(jié)果見圖1-5。

圖1為多重PCR體系中對蝦肝胰腺細(xì)小病毒檢測的敏感性實驗結(jié)果圖。其中M為Takara DL2000 DNA Marker，1-8為陽性標(biāo)準(zhǔn)品(從1到8依次為1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷貝/μL)，9為陰性對照。從圖中可以看出，泳道1-8均有約1189bp清晰的PCR擴(kuò)增條帶，對蝦白斑綜合征病毒檢測靈敏度達(dá)1×10¹拷貝/μL。

圖2為多重PCR體系中對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)檢測的敏感性實驗結(jié)果圖。其中M為Takara DL2000 DNA Marker，1-8為陽性標(biāo)準(zhǔn)品(從1到8依次為1×10⁸、1×10⁷、1 ×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷貝/μL)，9為陰性對照。從圖中可以看出，泳道1-8均有約719bp清晰的PCR擴(kuò)增條帶，對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)檢測靈敏度達(dá)1×10¹拷貝/μL。

圖3為多重PCR體系中蝦肝腸胞蟲檢測的敏感性實驗結(jié)果圖。其中M為Takara DL2000 DNA Marker，1-8為陽性標(biāo)準(zhǔn)品(從1到8依次為1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷貝/μL)，9為陰性對照。從圖中可以看出，泳道1-8均有約512bp清晰的PCR擴(kuò)增條帶，蝦肝腸胞蟲檢測靈敏度達(dá)1×10¹拷貝/μL。

圖4為多重PCR體系中傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測的敏感性實驗結(jié)果圖。其中M為Takara DL2000 DNA Marker，1-8為陽性標(biāo)準(zhǔn)品(從1到8依次為1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷貝/μL)，9為陰性對照。從圖中可以看出，泳道1-8均有約244bp清晰的PCR擴(kuò)增條帶，傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測靈敏度達(dá)1×10¹拷貝/μL。

圖5為多重PCR體系中4種對蝦病原混合檢測的敏感性實驗結(jié)果圖。其中M為Takara DL2000 DNA Marker，1-5為陽性標(biāo)準(zhǔn)品(從1到5依次為1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷貝/μL)，6為陰性對照。從圖中可以看出，泳道1-5均有約1189bp、719bp、512bp、244bp清晰的PCR擴(kuò)增條帶，再次證明對蝦白斑綜合征病毒、對蝦急性肝胰腺壞死癥(pirVP)、蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測靈敏度達(dá)1×10¹拷貝/μL。綜上所述，可以得出采用本發(fā)明的引物及試劑盒，對蝦白斑綜合征病毒檢測靈敏度達(dá)1×10¹拷貝/μL；對蝦急性肝胰腺壞死癥(pir^VP)檢測靈敏度達(dá)1×10¹拷貝/μL；蝦肝腸胞蟲檢測靈敏度達(dá)1×10¹拷貝/μL；傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測靈敏度達(dá)1×10¹拷貝/μL。由結(jié)果表明該多重PCR檢測方法的靈敏度要高于普通PCR方法。

二、特異性實驗

根據(jù)上述的多重PCR檢測方法，分別采用對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、對蝦急性肝胰腺壞死癥(AHPND)(pirVP)、蝦肝腸胞蟲(EHP)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)的其中1種、2種、3種或4種作模板以及陰性對照進(jìn)行實驗驗證，實驗結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒及檢測方法特異性好，未出現(xiàn)假陽性或假陰性，實驗結(jié)果見圖6。

圖6為多重PCR體系中分別檢測1種，2種，3種，4種對蝦病原實驗結(jié)果圖。其中M為Takara DL2000 DNA Marker，1-4為1種病原模板(從1到4依次為WSSV、AHPND(pir^VP)、EHP、IHHNV)，5-10為2種病原模板(從5到10依次為WSSV和AHPND(pir^VP)、WSSV和EHP、WSSV和IHHNV、AHPND(pir^VP)和EHP、AHPND(pir^VP)和IHHNV、EHP和IHHNV)，11-14為3種病原模板(從11到14依次為WSSV和AHPND(pir^VP) 和EHP、WSSV和EHP和IHHNV、AHPND(pir^VP)和EHP和IHHNV)，15為4種病原模板(WSSV和AHPND(pir^VP)和EHP和IHHNV)，16為陰性對照。

綜上所述，可以得出采樣本發(fā)明的檢測方法及試劑盒具有良好的特異性。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省海洋生物研究院

<120> 同時檢測對蝦WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR檢測方法和試劑盒

<130> 12

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttctcacctc atgctttctt cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacttgctta gagatggctt cg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaagtcggt cgtagtgtag 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atatcgcata accaagccat tc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagagtagcg gaacggatag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcatcacgga cctgttattg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagagcagcg acagttcag 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggcttcctt agttgatagt tg 22

<210> 9

<211> 1189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttctcacctc atgctttctt ccatggattc ccatacaaag tcatctttca tggacaacat 60

caaattgcac atgactgata ctcaatgctt cttcaagaac attgaacgat ttgagaaatt 120

cttgggaaga tatggggacg aatacgccat gtcccacaag caaaattgta actgcccctt 180

ccatctccac cacactttta ctccctcaga taacgagcat ctggtatcct ctttcgcatt 240

cgcccgccca gaagtctcca tggaagaaat tagagccaca ccctatcagg ccaacaagct 300

tattagtgac aaacattacg tgatgaacat gtccaagatc gattctagag taacaggatc 360

ttccctcctt aagaaggtta gcgaatggac tgaaatgaga atgaactcca actttaatgg 420

aacatttgaa ccatcaagac tcgccctctc caactctggc atgacaacgg caggagtcaa 480

cctcgacgtt attgtcaaac caaataatgc aagaagtgta ctaggaatat tggaatgtca 540

tcgccagcac gtgtgcaccg ccgacgccaa gggaactgtc gcttcagcca tgccagccgt 600

cttccaggca accgatggaa acggtaacga atctgaactg atccagaatg ctctgccaag 660

gaacagatac atccaaaaga gcacaatgaa cgctcaaact gtcgtgtttg ctaatgtttt 720

ggaacaactt atcgccgatc ttggaaaggt tatcgtgaac gaactggccg gcaccatcgc 780

tgaatctgta ccagaaagcg tatatgaaaa caccaaggaa atgattgata gactaggctc 840

tgacgacctc ttcaaatcta ataataatgg aggagtagaa tcaatggatt atgaagatag 900

cgaaacaaca tccaacaatg gtcccgtcct catctcagaa gccatgaaga atgccgtcta 960

tcacacacta atttccggca aggcagctcg cccggaaaat gtaccattcg cctcatgcgc 1020

cagcggccct ctcgcctttg atttccttct gtcaaaggga gatacattcg aagaaaagaa 1080

cgccgaacaa ggtgcagcag ctgccgtatc ctctacctat tcttcctctt ctaacactac 1140

tcttcgtaag catttggctc gagttttcga agccatctct aagcaagta 1189

<210> 10

<211> 719

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggaagtcggt cgtagtgtag acattgagaa tacgggacgt ggggagctta ccattcaata 60

ccaatggggt gcgccattta tggctggcgg ctggaaagtg gctaaatcac atgtggtaca 120

acgtgatgaa acttaccatt tacaacgccc tgataatgca ttctatcatc agcgtattgt 180

tgtaattaac aatggcgcta gtcgtggttt ctgtacaatc tattaccact aagaaggtgc 240

tcacatgact aacgaatacg ttgtaacaat gtcatctttg acggaattta accctaacaa 300

tgctcgtaaa agttatttat ttgataacta tgaagttgat cctaactatg ctttcaaagc 360

aatggtttca tttggtcttt caaatattcc ttacgcgggt ggttttttat caacgttatg 420

gaatatcttt tggccaaata cgccaaatga gccagatatt gaaaacattt gggaacaatt 480

acgtgacaga atccaagatt tagtagatga atcgattata gatgccatca atggaatatt 540

ggatagcaaa atcaaagaga cacgcgataa aattcaagac attaatgaga ctatcgaaaa 600

cttcggttat gctgcggcaa aagatgatta cattggttta gttactcatt acttgattgg 660

acttgaagag aactttaagc gcgagctaga cggtgatgaa tggcttggtt atgcgatat 719

<210> 11

<211> 512

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gagagtagcg gaacggatag ggagcatggt ataggtgggc aaagaatgaa atctcaagac 60

cccacctgga ccaacggagg cgaaagcgat gctcttagac gtatctgggg atcaaggacg 120

aaggctagag tatcgaaagt gattagacac cgctgtagtt ctagcagtaa actatgccga 180

caatgctggg tgttgcgaga gcgatgcttg gtgtgggaga aatcttagtt ttcgggctct 240

ggggatagta cgctcgcaag ggtgaaactt aaagcgaaat tgacggaagg acactaccag 300

gagtggattg tgctgcttaa tttaactcaa cgcgggaaaa cttaccaggg tcaagtctat 360

cgtagattgg agacatgagg tagacaagag tggtgcatgg ccgttggaaa ttgatggggc 420

gacttttagc ttaagtgctg gaaccagtga gatcttctag acaggtgtta tttaggcaca 480

ggagggagaa ggcaataaca ggtccgtgat gc 512

<210> 12

<211> 244

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aagagcagcg acagttcagc aacagaaaca caacgatata agatggtaaa atcaatgatg 60

aagacctacg gatggaaagt acataaagca ggcgtagtga tgcactcgat ggtacccctt 120

atgaaagact taaaagtatc aggaggcaca tcatttgaga ctctcacatt tacagacacc 180

ccatatttag aaatatttaa ggatactact ggactacata atcaactatc aactaaggaa 240

gccg 244