一種香蕉果實(shí)顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵響應(yīng)元件及其篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種香蕉果實(shí)顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵響應(yīng)元件及其篩選方法，該關(guān)鍵響應(yīng)元件是以巴西蕉基因組DNA為模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物，通過PCR方法擴(kuò)增獲得的DNA片段。本發(fā)明設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的香蕉MaGBSSI?3基因啟動(dòng)子缺失片段，篩選得到MaGBSSI?3基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵相應(yīng)元件，這為如何有效調(diào)控香蕉直鏈淀粉的合成，以滿足食品、醫(yī)療、工業(yè)等行業(yè)對(duì)不同含量直鏈淀粉的需求提供了研究方向，同時(shí)為其他植物GBSS基因的研究提供了借鑒。
【專利說明】
一種香蕉果實(shí)顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵響應(yīng)元 件及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種香蕉果實(shí)顆粒結(jié)合淀粉合 成酶基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵響應(yīng)元件及其篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 香蕉是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，是僅次于柑橘的世界第二大水果。淀粉 作為香蕉果實(shí)中的主要組成成分，又促使其被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FA0)認(rèn)定為僅次于水稻、小 麥、玉米之后的第四大糧食作物，是超過4億人的口糧(Englberger et al.，2006)。然而，隨 著香蕉產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和人們生活水平的迅速提高，對(duì)香蕉果實(shí)品質(zhì)的要求也越來越高。 將現(xiàn)代生物技術(shù)運(yùn)用于香蕉品質(zhì)改良中，可以解決一些用常規(guī)方法難以解決的問題。近年 來，香蕉生物技術(shù)取得了很大的發(fā)展，一些控制重要農(nóng)藝性狀基因的相繼分離并在香蕉中 遺傳轉(zhuǎn)化成功（Sreedharan et al.，2013;Rustagi et al.，2015;Tripathi et al. ,2015; Elitzur et al.，2016)為用基因工程技術(shù)來改良香蕉果實(shí)品質(zhì)奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0003] 目前，我國(guó)香蕉優(yōu)質(zhì)果率不足30%，大多數(shù)香蕉果實(shí)后熟過程中出現(xiàn)硬心、糯性 差、糖分含量偏低、抗性淀粉含量不穩(wěn)定等品質(zhì)問題。直鏈淀粉是香蕉果實(shí)的主要成分之 一，它的含量直接決定著果實(shí)糯性、甜味及抗性淀粉含量等品質(zhì)。直鏈淀粉合成酶基因 (GBSS)編碼結(jié)合在淀粉顆粒上的淀粉合成酶，又稱為顆粒結(jié)合型淀粉合成酶，是影響直鏈 淀粉合成的一個(gè)關(guān)鍵酶基因。前期研究發(fā)現(xiàn)GBSSI-3基因只在香蕉果實(shí)中高效表達(dá)，因此它 是專一性表達(dá)的基因 （Miao et al·，2014)。
[0004] 植物基因工程中常用組成型啟動(dòng)子（如35S)來調(diào)控外源基因的表達(dá)，但存在一些 缺點(diǎn)，如:35S啟動(dòng)子能促使外源基因在雙子葉植物中獲得較高的表達(dá)，但在單子葉植物中 驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)能力不強(qiáng);35S驅(qū)動(dòng)的表達(dá)無明顯的組織和器官專一性，產(chǎn)生大量異源表達(dá)產(chǎn) 物甚至有毒物質(zhì)，導(dǎo)致植物代謝失衡影響其正常生長(zhǎng)發(fā)育甚至死亡。應(yīng)用組織特異性啟動(dòng) 子則可以避免這種影響。
[0005]因此，希望從香蕉直鏈淀粉合成酶基因中分離出能在香蕉果實(shí)中專一表達(dá)的啟動(dòng) 子和表達(dá)調(diào)控元件，從而能在單子葉植物、特別是包括香蕉在內(nèi)的淀粉轉(zhuǎn)化型作物中驅(qū)動(dòng) 外源基因表達(dá)，從而提高作物產(chǎn)量，改善淀粉品質(zhì)。但是MaGBSSI-3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制目前還 不完全清楚，可能受多個(gè)水平、多種因子的協(xié)同調(diào)控，需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，從基因啟動(dòng)子的響應(yīng)元件角度進(jìn)行研 究，發(fā)現(xiàn)了香蕉果實(shí)顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因 MaGBSSI-3啟動(dòng)子的關(guān)鍵響應(yīng)元件。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種香蕉果實(shí)顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的關(guān) 鍵響應(yīng)元件，其是以巴西蕉基因組DNA為模板，采用核苷酸序列如SEQ ID N0.7和SEQ ID NO. 8所示的引物，通過PCR方法擴(kuò)增獲得的DNA片段。
[0008] 其中，所述關(guān)鍵響應(yīng)元件為113bp。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種重組載體，其為含有本發(fā)明第一個(gè)方面所述的關(guān) 鍵響應(yīng)元件的載體。
[0010] 其中，所述載體為載體或病毒載體。
[0011] 優(yōu)選地，所述重組載體為利用Sac I和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)將本發(fā)明第一個(gè) 方面所述的關(guān)鍵響應(yīng)元件替換到pVKH-35S-GUS-pA表達(dá)載體的CaMV35S啟動(dòng)子處得到的表 達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種香蕉果實(shí)顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的關(guān) 鍵響應(yīng)元件的篩選方法，包括以下步驟：
[0013] (1)以巴西蕉基因組DNA為模板，采用如下7組引物對(duì)，獲得堿基序列為1075bp、 1051匕口、933匕口、645匕口、453匕口、293匕口和113匕口的香蕉1&168551-3基因啟動(dòng)子缺失片段，其中，7 組引物對(duì)的3'端引物序列相同為SEQ ID N0.8所示，5'端引物序列分別為：SEQ ID N0.1、 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示；
[0014] (2)利用Sac I和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)將步驟（1)得到的不同的香蕉 MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子缺失片段替換到pVKH-35S-GUS-pA表達(dá)載體的CaMV35S啟動(dòng)子處得到 的表達(dá)載體；
[0015] (3)利用步驟(2)得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化香蕉果實(shí)薄片，分化培養(yǎng)，觀察基因 GUS染色 情況，推測(cè)最小缺失片段113bp為關(guān)鍵響應(yīng)元件。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種DNA，其是以巴西蕉基因組DNA為模板，采用3'端 引物序列為SEQIDN0.8所示，5 /端引物序列為SEQIDN0.1、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、 SEQIDN0.4、SEQIDN0.5、SEQIDN0.6或者SEQIDN0.7所示的引物對(duì)，通過PCR方法擴(kuò) 增獲得的DNA片段。
[0017] 本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種引物組，所述引物組含有核苷酸序列為SEQ ID N0·1和SEQIDN0·8、SEQIDN0·2和SEQIDN0·8、SEQIDN0·3和SEQIDN0·8、SEQID N0·4和SEQIDN0·8、SEQIDN0·5和SEQIDN0·8、SEQIDN0·6和SEQIDN0·8、SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物對(duì)中的一種或多種。
[0018] 本發(fā)明設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的香蕉MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子缺失片段，篩選得到MaGBSSI-3 基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵相應(yīng)元件，這為如何有效調(diào)控香蕉直鏈淀粉的合成，以滿足食品、醫(yī)療、 工業(yè)等行業(yè)對(duì)不同含量直鏈淀粉的需求提供了研究方向，同時(shí)為其他植物GBSS基因的研究 提供了借鑒。
【附圖說明】
[0019] 圖1為MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子缺失片段電泳圖：M為DL 2000marker，A-G為MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子缺失片段；
[0020] 圖2為MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子缺失片段表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；
[0021] 圖3為重組表達(dá)載體雙酶切驗(yàn)證，其中，Ml為DL 2000Marker，M2為DL lOOOOMarker，A-P為雙酶切及對(duì)照目的條帶；
[0022]圖4為不同MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子缺失片段轉(zhuǎn)化香蕉果實(shí)后的⑶S染色。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，以更好地理解本發(fā) 明。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按 照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn) 品。
[0024] l.MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子5'端缺失
[0025] 為了對(duì)已獲得的MaGBSSI-3的啟動(dòng)子響應(yīng)元件進(jìn)一步研究，通過對(duì)啟動(dòng)子序列的 生物信息學(xué)分析，將該啟動(dòng)子片段進(jìn)行不同長(zhǎng)度的5'端缺失及瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建。以已 克隆得到的啟動(dòng)子全長(zhǎng)為模板，設(shè)計(jì)5'端缺失引物序列（3'端引物序列相同），克隆對(duì)應(yīng)的 啟動(dòng)子缺失片段，其引物序列如下：
[0027] 克隆結(jié)果如圖1所示，MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子5'端缺失克隆得到長(zhǎng)度為1075、1051、 933、645、453、293和113&?七個(gè)不同大小的片段，經(jīng)?0財(cái)廣增產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)，其克隆片段大小 是正確的。
[0028] 2.不同缺失長(zhǎng)度的MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0029]將上述已經(jīng)克隆得到的七個(gè)MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子缺失片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回 收。將PCR克隆得到的不同缺失長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段和PVKH-35S-⑶S-pA表達(dá)空載體質(zhì)粒DNA 使用BamH I和Sac I兩種限制性內(nèi)切酶于37°C進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)及切 膠回收，然后于200yL PCR管中對(duì)酶切回收的目的產(chǎn)物和pPVKH空載體大片段進(jìn)行T4DNA連 接酶16 °C連接過夜，轉(zhuǎn)化、PCR篩選、雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：酶切產(chǎn) 物與MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子各缺失片段大小相一致，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證獲得的片段序列是正確的， 說明各缺失片段已替換表達(dá)載體PPVKH上的35S:啟動(dòng)子，即各瞬時(shí)表達(dá)載體pPVKH-P、 pPVKH-1051、pPVKH-933、pPVKH-645、pPVKH-453、pPVKH-293和 pPVKH-113均已構(gòu)建成功。 [0030] 3.不同缺失長(zhǎng)度的MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子重組表達(dá)載體的瞬時(shí)表達(dá)
[0031].不同缺失長(zhǎng)度的MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子重組表達(dá)載體基因槍轉(zhuǎn)化及瞬時(shí)表達(dá)方 法
[0032] 利用基因槍將不同缺失長(zhǎng)度啟動(dòng)子所構(gòu)建的重組載體(pPVKH(陽(yáng)性對(duì)照）、？?￥腿_ ?3、口？￥101-10514?￥101-9334?￥腿-6454?￥腿-4534?￥101-2934?￥101-113)質(zhì)粒0嫩直接導(dǎo) 入巴西蕉果實(shí)薄片(厚度為0.3mm，直徑為0.8cm，呈三角形)受體細(xì)胞，24~72h后觀察該重 組載體中GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)情況，其具體實(shí)驗(yàn)方法步驟如下：
[0033]受體材料預(yù)處理:在基因槍轟擊前先將香蕉果實(shí)薄片轉(zhuǎn)入含滲透劑(0.2mol/L甘 露醇和0.2mo 1/L山梨醇）的MS培養(yǎng)基中預(yù)處理4~6h。
[0034]微彈載體制備:稱取6〇11^110鎢粉置1.51^離心管中；加入111^70%的酒精，充分 禍旋，然后靜置15min，1500rpm離心5min ;小心去除上清液，加入lmL無菌水，充分禍旋， 1500rpm離心5min，去上清液，用無菌水重復(fù)沖洗三次;將鎢粉顆粒轉(zhuǎn)入lmL無菌水的50 %甘 油中；取50yL上述制備好并已渦旋的鎢粉顆粒轉(zhuǎn)入一無菌的1.5mL離心管中，按順序加入5μ L DNA(lygAxL)、50yL 2.5mol/L CaC12和20yL 0.1mol/L亞精胺(現(xiàn)配現(xiàn)用）；將混合物渦旋 lOmin，然后用15000rpm離心5s，去除上清液;用140yL 70 %乙醇沖洗上述沉淀物一次，再用 100%乙醇沖洗一次，最后用48yL 100%乙醇重新懸浮顆粒，并將離心管浸入超聲波清洗器 中3s，以分散鎢粉顆粒。
[0035]裝彈:將基因槍放置于一個(gè)較大型的超凈工作臺(tái)上，以利于無菌操作。用70%乙醇 擦凈真空室，用浸泡消毒法將可裂圓片、微粒子彈載體、阻擋網(wǎng)于70%酒精中消毒15min，然 后用無菌濾紙吸干或吹干殘余酒精;打開電源開關(guān)、真空栗及氦氣瓶閥；將可裂圓片裝入固 定蓋，旋緊;取6yL包被DNA的鎢粉顆粒無水乙醇懸浮液(約含0.6yg質(zhì)粒DNA和0.37mg的鎢粉 顆粒)點(diǎn)于微粒子彈載體中心，立即在干燥器中干燥，或于工作臺(tái)上吹干;將載有微粒子彈 的微粒子彈載體及阻擋網(wǎng)裝入微粒子彈發(fā)射裝置中；將欲轉(zhuǎn)化的靶組織平鋪在一個(gè)含有固 體MS培養(yǎng)基的9cm培養(yǎng)皿中心。
[0036] 轟擊:按VAC鍵，當(dāng)真空度達(dá)到所需要值(600~760mmHg，lmmHg=133.332Pa)時(shí)，將 VAC鍵轉(zhuǎn)到HOLD位置;按FIRE鍵使氦氣壓力達(dá)到適當(dāng)位置，約12s打一槍，再按VENT鍵，取出 樣品。
[0037]外植體材料培養(yǎng):將轟擊后的外植體轉(zhuǎn)入MS+AS分化培養(yǎng)基中于28°C、黑暗或弱光 條件下培養(yǎng)。該培養(yǎng)基中不添加卡那霉素等選擇壓力，以利于受轟擊細(xì)胞的恢復(fù)及充分表 達(dá)外源基因。
[0038] 重組載體瞬時(shí)表達(dá):將上述材料黑暗放置48h后，將其浸泡在染色液(50mmol/L磷 酸鈉緩沖液（口17.0)中含有：0.1111〇1/11(3[卩6(0~)6]，0.1111〇1/11(4[卩6(0幻6]，10111111〇1/1 Na2EDTA，0.001%(v/v)Triton X-100,20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc)中，于25~37°C保溫lh 至過夜;然后將外植體材料轉(zhuǎn)入70 %乙醇中脫色2~3次，至陰性對(duì)照材料呈白色;于顯微鏡 下觀察靶啟動(dòng)子所調(diào)控的GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)情況。
[0039] 結(jié)果如圖4所示:不同缺失長(zhǎng)度啟動(dòng)子及35S表達(dá)載體在香蕉果實(shí)中的瞬時(shí)表達(dá)， 其GUS顯色基本一致，說明MaGBSSI-3基因啟動(dòng)子不同缺失片段具有相同且與35S啟動(dòng)子一 致的調(diào)控強(qiáng)度，因此也推測(cè)最小缺失片段-113bp (只包括光響應(yīng)元件）的啟動(dòng)子是MaGBSSI -3基因正常表達(dá)的所必需的關(guān)鍵響應(yīng)元件。
[0040] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種香蕉果實(shí)顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵響應(yīng)元件，其特征在于，其是 以巴西蕉基因組DNA為模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物，通 過PCR方法擴(kuò)增獲得的DNA片段。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于，所述關(guān)鍵響應(yīng)元件為113bp。3. -種重組載體，其特征在于，其為含有權(quán)利要求1所述的關(guān)鍵響應(yīng)元件的載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，所述載體為載體或病毒載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，其為利用Sac I和BamHI兩個(gè)限制性酶 切位點(diǎn)將權(quán)利要求1所述的關(guān)鍵響應(yīng)元件替換到pVKH-35 S-GUS-pA表達(dá)載體的CaMV35 S啟動(dòng) 子處得到的表達(dá)載體。6. -種香蕉果實(shí)顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵響應(yīng)元件的篩選方法，其特征 在于，包括以下步驟： (1) 以巴西蕉基因組DNA為模板，采用如下7組引物對(duì)，獲得堿基序列為1075bp、1051bp、 933匕？、645匕？、453匕？、293匕？和113匕？的香蕉1&168331-3基因啟動(dòng)子缺失片段，其中，7組引物 對(duì)的3'端引物序列相同為SEQ ID NO.8所示，5'端引物序列分別為：SEQ ID NO.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示； (2) 利用Sac I和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)將步驟（I)得到的不同的香蕉MaGBSSI-3基 因啟動(dòng)子缺失片段替換到pVKH-35S-GUS-pA表達(dá)載體的CaMV35S啟動(dòng)子處得到的表達(dá)載體； (3) 利用步驟(2)得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化香蕉果實(shí)薄片，分化培養(yǎng)，觀察基因 GUS染色情 況，推測(cè)最小缺失片段113bp為關(guān)鍵響應(yīng)元件。7. -種DNA，其特征在于，其是以巴西蕉基因組DNA為模板，采用3'端引物序列為SEQ ID N0·8所示，5/端引物序列為SEQIDN0·1、SEQIDN0·2、SEQIDN0·3、SEQIDN0·4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示的引物對(duì)，通過PCR方法擴(kuò)增獲得的DNA片段。8. -種引物組，其特征在于，所述引物組含有核苷酸序列為SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0·8、SEQIDN0·2和SEQIDN0·8、SEQIDN0·3和SEQIDN0·8、SEQIDN0·4和SEQID N0·8、SEQIDN0·5和SEQIDN0·8、SEQIDN0·6和SEQIDN0·8、SEQIDN0·7和SEQID NO. 8所示的引物對(duì)中的一種或多種。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK105950627SQ201610476935
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】苗紅霞, 孫佩光, 金志強(qiáng), 徐碧玉, 劉菊華, 張建斌, 賈彩紅, 王卓, 王靜毅
【申請(qǐng)人】中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所