腦包蟲病標(biāo)志物nad5基因以及多頭帶絳蟲的檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物疾病診斷領(lǐng)域，具體涉及一種腦包蟲病標(biāo)志物nad5基因以及多頭帶絳蟲的檢測方法和試劑盒。對實驗室收集多頭帶絳蟲成蟲標(biāo)本和犬糞便提取DNA，以線粒體nad5基因部分序列作為多頭帶絳蟲的靶DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示感染多頭帶絳蟲犬糞便擴(kuò)增的目的片段與預(yù)期片段長度一致，為433bp。經(jīng)測序鑒定，與多頭帶絳蟲已知株nad5基因部分序列同源性均為99.5％。且特異性和靈敏度高。因此nad5基因可作為腦包蟲病標(biāo)志物。本發(fā)明所述多頭帶絳蟲的檢測方法能夠快速有效的檢測犬糞便中的多頭帶絳蟲蟲卵，同時具有較高的特異性和靈敏性，可以用于多頭帶絳蟲流行病學(xué)調(diào)查。
【專利說明】
腦包蟲病標(biāo)志物nad5基因從及多頭帶練蟲的檢測方法和試 劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于動物疾病診斷領(lǐng)域，具體設(shè)及腦包蟲病標(biāo)志物nad5基因W及多頭帶緣 蟲的檢測方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 多頭帶緣蟲(Taenia multiceps)是犬小腸內(nèi)的常見緣蟲，其孕節(jié)和蟲卵常隨犬糞 便排出外界，被羊、牛等草食動物吞食后進(jìn)入其體內(nèi)發(fā)育為腦多頭蝴，引起腦包蟲病。腦包 蟲病不僅引起羊、牛等家畜死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還威脅人類的健康。 感染多頭帶緣蟲的犬是腦包蟲病的重要傳染源，因此及時、準(zhǔn)確地掌握流行區(qū)犬多頭帶緣 蟲的感染情況并控制犬的感染，切斷傳播途徑，達(dá)到從傳染源控制的目的，從而對控制腦包 蟲病的流行、綜合防制等具有重要意義。
[0003] 在腦包蟲病流行區(qū)犬除感染多頭帶緣蟲外，往往還混合感染泡狀帶緣蟲、豆?fàn)顜?緣蟲等其他緣蟲。目前犬感染多頭帶緣蟲的檢測手段主要包括病原學(xué)檢查和血清學(xué)檢查。 糞便內(nèi)孕節(jié)節(jié)片和蟲卵檢查是犬科動物緣蟲感染常用的病原學(xué)檢測方法。對動物進(jìn)行糞檢 雖然還是目前進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的主要方法，但由于帶科緣蟲蟲卵在顯微鏡下形態(tài)極其相 似，很難形態(tài)觀察進(jìn)行種類鑒別，且此方法的敏感性不高，易漏檢。但還沒有用于犬多頭帶 緣蟲感染監(jiān)測中能推廣應(yīng)用且較簡便的方法，因此，探索一種簡便、快速、有效的犬多頭帶 緣蟲感染的檢測方法對從源頭上切斷腦包蟲病的流行具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，提供一種腦包蟲病的標(biāo)志物 nad5基因W及多頭帶緣蟲的檢測方法和試劑盒。
[0005]
【申請人】對實驗室收集多頭帶緣蟲成蟲標(biāo)本和犬糞便提取DNA，W線粒體nad5基因 部分序列作為多頭帶緣蟲的祀DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示感染多頭帶緣蟲犬糞便擴(kuò)增 的目的片段與預(yù)期片段長度一致，為433bp。經(jīng)測序鑒定，與多頭帶緣蟲已知株nad5基因部 分序列同源性均為99.5%。且特異性和靈敏度高。
[0006] 因此本發(fā)明提供了 nad5基因在制備腦包蟲病標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明還提供了 nad5基因在制備腦包蟲病檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[000引本發(fā)明還提供了一種多頭帶緣蟲的檢測方法，W待測樣品的DNA為模板，用nad5基 因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0009] 在一些實施方案中，所述nad5基因的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物 如沈Q ID No.2所示。
[0010] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述多頭帶緣蟲的檢測方法中所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體 系如下JXhq PCR MasterMix 12.扣L，nad5基因的上游引物和下游引物各化L，待測樣品 的DNA 1.化L，dd也0 8.2化，0.4%-0.6%BSA 0.祉L。
[001U 優(yōu)選的，所述nad5基因的上游引物和下游引物的濃度化Opmo 1/化。
[0012] 本發(fā)明所述多頭帶緣蟲的檢測方法中所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件優(yōu)選為95°C5min; 95°C30s，46°C40s，72°C45s，共 30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸 6min。
[0013] 本發(fā)明所述的檢測方法中所述待測樣品可W采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何一 種樣品，包括但不限于糞便、血液。優(yōu)選的所述待測樣品為糞便。如犬糞便。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種多頭帶緣蟲的檢測試劑盒，包括nad5基因的引物。
[001引優(yōu)選的，所述nad5基因的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物如SEQ ID No. 2所示。
[0016] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述試劑盒還包括0.4%-0.6%BSA。
[0017] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑。如Taq PCR MasterMix 等。
[0018] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述試劑盒還包括對照品和標(biāo)準(zhǔn)品。
[0019] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種腦包蟲病的標(biāo)志物nad5基因W及多頭帶 緣蟲的檢測方法和試劑盒。對實驗室收集多頭帶緣蟲成蟲標(biāo)本和犬糞便提取DNA，W線粒體 nad5基因部分序列作為多頭帶緣蟲的祀DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示感染多頭帶緣蟲犬 糞便擴(kuò)增的目的片段與預(yù)期片段長度一致，為433bp。經(jīng)測序鑒定，與多頭帶緣蟲已知株 nad5基因部分序列同源性均為99.5%。且特異性和靈敏度高。因此nad5基因可作為腦包蟲 病標(biāo)志物。本發(fā)明所述多頭帶緣蟲的檢測方法能夠快速有效的檢測犬糞便中的多頭帶緣蟲 蟲卵，同時具有較高的特異性和靈敏性，可W用于多頭帶緣蟲流行病學(xué)調(diào)查。本發(fā)明所述多 頭帶緣蟲的檢測試劑盒組成簡單，適用于多頭帶緣蟲的檢測。
【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0021] 圖1示人工感染犬糞便的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道M為化2000DNA Marker,泳道1為 多頭帶緣蟲成蟲，泳道2為多頭帶緣蟲蟲卵；
[0022] 圖2示多頭帶緣蟲分離株nad5基因片段序列比對，F(xiàn)J495086和GQ228818均為 GenBank多頭帶緣蟲序列；KC794850為測定的多頭帶緣蟲；:與FJ495086位置的堿基相 同；
[0023] 圖3示PCR特異性試驗結(jié)果，其中泳道1為空白對照;泳道2為多頭帶緣蟲成蟲;泳道 3為多頭帶緣蟲蟲卵；泳道4為豆?fàn)顜Ь壪x;泳道5為泡狀帶緣蟲;泳道6為細(xì)粒棘球緣蟲;泳 道7為犬復(fù)孔緣蟲;泳道8為孟氏迭宮緣蟲;泳道M為化2000DNA Marker;
[0024] 圖4示PCR靈敏性試驗結(jié)果，泳道1為1000個蟲卵;泳道2為100個蟲卵;泳道3為10個 蟲卵；泳道4為1個蟲卵；泳道M為DL2000DNA Marker;
[0025] 圖5示部分流浪犬糞便的PCR擴(kuò)增結(jié)果泳道1-6為檢測到帶科緣蟲蟲卵的犬糞;泳 道M:DL2000DNA Marker。
【具體實施方式】
[0026] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0027]為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。其中，主要 試劑:DNA Marker購自化KaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，PCR引物合成和測序由上海英 俊生物工程有限公司完成;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。主要材料:多頭帶緣蟲成蟲、泡狀帶 緣蟲成蟲、豆?fàn)顜Ь壪x成蟲、細(xì)粒棘球緣蟲成蟲、犬復(fù)孔緣蟲成蟲和孟氏迭宮緣蟲成蟲均由 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中屯、提供。20份流浪狗的糞便采自攀枝花流行病地區(qū)流浪 狗。
[00%]實施例1糞便中蟲卵形態(tài)學(xué)鑒定和收集
[0029] 稱取每只犬糞樣0.5g，用飽和食鹽水將其攬拌均勻后倒入干凈試管中，并補加飽 和食鹽水至滿，使液面凸出管口后放上蓋玻片，靜置0.化后，取下蓋玻片在顯微鏡下檢查， 對蟲卵進(jìn)行形態(tài)鑒定并將蓋玻片上的帶科緣蟲蟲卵用雙蒸水沖洗到干凈的EP管中，編號后 放到-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 實施例2引物設(shè)計
[0031] 根據(jù)GenBank上已收錄多頭帶緣蟲線粒體全基因組（序列號：GQ228818)的nad5基 因序列設(shè)計1對引物。
[0032] 上游引物Pi:5'-GTGTAGTTGATTTAGTGGGTT-3'（SEQ ID No.l)，
[0033] 下游引物P2:5'-GGCATTGCATGTAATCATAAC-3'（SEQ ID No.2)。
[0034] 擴(kuò)增片段為433bp。引物序列由上海英驗生物技術(shù)有限公司合成。
[0(X3日]實施例3 DNA的提取
[0036] (1)多頭帶緣蟲成蟲蟲體DNA的提取
[0037] 將成蟲孕卵節(jié)片用剪刀剪成碎片后用沸水、液氮反復(fù)處理數(shù)次后，按照試劑盒方 法提取DNA。
[0038] (2)糞便蟲卵DNA的提取
[0039] 將從犬糞便收集到的多頭帶緣蟲蟲卵分別用沸水、液氮反復(fù)處理數(shù)次，至大部分 蟲卵卵殼破裂后，按照試劑盒方法提取DNA。
[0040] 實施例4 PCR擴(kuò)增
[0041 ] (1)多頭帶緣蟲成蟲蟲體DNA PCR擴(kuò)增
[0042] 擴(kuò)增體系為25化 JXhq PCR MasterMix 12.化L，引物Pi、P2(10pmolAiL)各化L， 模板DNA 1.化L，dd此0 9.扣L，輕輕混勻后瞬時離屯、15s。同時，Wdd出0代替模板DNA作空白 對照。擴(kuò)增條件：951：5111111;951：3〇3,461：4〇3,721：453，共30個循環(huán)；最后72°(：延伸6111111。反 應(yīng)結(jié)束后取IOiiL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果見圖1。
[0043] (2)犬糞便DNA PCR擴(kuò)增
[0044] 擴(kuò)增體系為25化 JXhq PCR MasterMix 12.化L，引物Pi、P2(10pmolAiL)各化L， 模板DNA 1.扣L，dd此0 8.化L，0.4%BSA 0.祉L，輕輕混勻后瞬時離屯、15s。同時，Wdd出0代 替模板DNA作空白對照。擴(kuò)增條件同成蟲DNA PCR擴(kuò)增的條件。結(jié)果見圖1。
[0045] 結(jié)果顯示，用合成的引物P1、P2,從多頭帶緣蟲成蟲蟲體和犬糞便蟲卵DNA中擴(kuò)增 出了4(K)bp左右的目的片段，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符合，且條帶清晰。
[0046] 實施例5陽性PCR產(chǎn)物測序鑒定
[0047] 隨機(jī)抽取成蟲孕節(jié)和犬糞便DNA為模板擴(kuò)增的PCR陽性產(chǎn)物各1份，經(jīng)膠回收試劑 盒純化，將純化后的產(chǎn)物直接送上海英驗生物技術(shù)有限公司測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行分析。 WGenBank中的多頭帶緣蟲(序列號:GQ228818和FJ495086)的nad5基因序列作為參照，應(yīng)用 DNAman軟件對測序序列和參照序列進(jìn)行多重比較和相似性分析。結(jié)果見圖2。
[004引圖2結(jié)果顯示兩條測序去掉引物序列后，均得到39化P的片段(GenBank登陸號： 雌794850)，且相似性為100%。經(jīng)序列比對，與69228818和。1495086的相似性均為99.5%。 進(jìn)一步驗證蟲體和蟲卵均為多頭帶緣蟲。
[0049] 實施例6特異性檢測
[0050] 犬小腸內(nèi)寄生的緣蟲除多頭帶緣蟲外，最常見的還有泡狀帶緣蟲、豆?fàn)顜Ь壪x、犬 復(fù)孔緣蟲、孟氏迭宮緣蟲等其他緣蟲。用相同方法提取泡狀帶緣蟲、豆?fàn)顜Ь壪x、細(xì)粒棘球 緣蟲、犬復(fù)孔緣蟲和孟氏迭宮緣蟲的DNA，按照實施例4犬糞便DNA PCR擴(kuò)增的條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。結(jié)果見圖3。
[0051] 多頭帶緣蟲成蟲DNA PCR擴(kuò)增反應(yīng)均產(chǎn)生單一的目的條帶，但泡狀帶緣蟲、豆?fàn)顜?緣蟲DNA樣本及陰性對照均無此擴(kuò)增條帶。表明所述方法具有種特異性，不會發(fā)生交叉反 應(yīng)。
[0052] 實施例7靈敏度測定
[0053] 顯微鏡下計數(shù)多頭帶緣蟲蟲卵個數(shù)，按比例稀釋（1000、100、10、1個蟲卵/200化） 后提取DNA，按照實施例4犬糞便DNA PCR擴(kuò)增的條件進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果見圖4。
[0化4] 結(jié)果顯示除1個蟲卵的PCR產(chǎn)物無目的條帶外，10、100、1000個蟲卵/200化的PCR產(chǎn) 物均可見清晰的目的條帶。表明所述方法敏感度能達(dá)到10個蟲卵的鑒定。
[0055] 實施例8臨床糞樣應(yīng)用檢測
[0056] 隨機(jī)撿取20只流浪狗的糞便，進(jìn)行飽和食鹽水漂浮檢查，并提取多頭帶緣蟲陽性 糞樣的DNA作為擴(kuò)增模板按照實施例4犬糞便DNA PCR擴(kuò)增的條件進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)結(jié) 束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。若在4(K)bp位置出現(xiàn)條帶，則對應(yīng)的標(biāo)本記為陽性。
[0057] 對20份糞樣進(jìn)行常規(guī)蟲卵檢測，其中6份檢測到多頭帶緣蟲蟲卵。對其進(jìn)行PCR檢 測，有5份為陽性，而其他糞樣均無目的條帶出現(xiàn)，均為陰性(圖5)。說明該PCR方法具有較好 的應(yīng)用價值。
【主權(quán)項】
1. nad5基因在制備腦包蟲病標(biāo)志物中的應(yīng)用。 2. nad5基因在制備腦包蟲病檢測試劑盒中的應(yīng)用。3. -種多頭帶絳蟲的檢測方法，其特征在于，以待測樣品的DNA為模板，用nad5基因的 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述nad5基因的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系:2 X Taq PCR MasterMiX 12.5yL，nad5基因的上游引物和下游引物各IyL，待測樣品的DNA 1.5yL，ddH20 8.2yL,0.4%BSA 0.8yL〇6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件為95 °C 5min; 95°C30s，46°C40s，72°C45s，共 30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸 6min。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，待測樣品為糞便。8. -種多頭帶絳蟲的檢測試劑盒，其特征在于，包括nad5基因的引物。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，nad5基因的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。10. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，還包括0.4 %-0.6 %BSA。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925724SQ201610555138
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月14日
【發(fā)明人】楊光友, 王宇
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)