一種快速檢測(cè)食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種快速檢測(cè)食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性方法。該方法針對(duì)食品添加劑新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的化合結(jié)構(gòu)及其對(duì)細(xì)胞毒性作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選表征新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合細(xì)胞毒性的特異性指標(biāo)：細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH，通過(guò)高內(nèi)涵分析系統(tǒng)對(duì)六個(gè)指標(biāo)檢測(cè)分析，根據(jù)特異性指標(biāo)的分析結(jié)果鑒定其聯(lián)合毒性。本發(fā)明方法對(duì)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，具有快速、可靠、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以為食品添加劑新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的正確使用提供理論依據(jù)，對(duì)保證食品添加劑的正確使用和食品安全具有重要意義。
【專利說(shuō)明】
一種快速檢測(cè)食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域，涉及一種快速檢測(cè)食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性的方法，具體涉及一種一次性快速檢測(cè)兩種食品添加劑:新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉同時(shí)添加產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。
【背景技術(shù)】
[0002]食品添加劑是所有加工食品配料中的重要組成部分之一，可以使加工食品增加營(yíng)養(yǎng);提高色、香、味、形等感官質(zhì)量和內(nèi)在質(zhì)量;防止食品腐敗變質(zhì);改善食品的加工條件等。目前所使用的添加劑的使用標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)單一物質(zhì)的毒性而制定的，而食品行業(yè)中食品添加劑都是聯(lián)合使用的，實(shí)際生活中人類每天攝取多種食品，一種食品添加劑在允許使用范圍內(nèi)是安全的，而幾種同時(shí)使用時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生相加、協(xié)同、拮抗等形式的聯(lián)合作用，存在著使單一物質(zhì)的毒性作用增強(qiáng)的危險(xiǎn)性。目前尚未有標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)測(cè)兩種及以上的食品添加劑毒性的方法，因此亟需建立一種操作簡(jiǎn)便、可以快速準(zhǔn)確地評(píng)測(cè)食品添加劑聯(lián)合毒性的現(xiàn)代化檢測(cè)方法。
[0003]高內(nèi)涵分析(high content analysis，HCA)是一種基于細(xì)胞表型分析的高效新藥篩選技術(shù)，能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的前提下，同時(shí)檢測(cè)被篩樣品對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、周期、迀移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)傳導(dǎo)等方面的影響，實(shí)現(xiàn)化合物多種生物活性和毒性的早期、快速、高通量檢測(cè)。具有操作簡(jiǎn)單、快速高效、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、高靈敏性、短時(shí)間獲得豐富數(shù)據(jù)信息等優(yōu)點(diǎn)。目前該技術(shù)主要用于單一化合物(新藥物)篩選等方面，而對(duì)食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性的快速檢測(cè)方法未有報(bào)道和公開(kāi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種鑒別食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性方法，特別是一種一次性快速檢測(cè)新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合毒性的方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下:
[0006]該方法包括以下步驟:
[0007]步驟(I).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以5X 14個(gè)/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0008]步驟(2).取出步驟(I)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160yL/孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5\待測(cè)樣品，培養(yǎng)時(shí)間為7211;同時(shí)設(shè)立加入4(^17孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照(即設(shè)立步驟(I)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板棄掉培養(yǎng)液后加入160yL/孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時(shí)間為72h，作陰性對(duì)照)；
[0009]所述的待測(cè)樣品為新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液，最終濃度依照食品包裝袋上的劑量添加；
[0010]步驟(3).取出步驟(2)培養(yǎng)后的96孔板，加50μ?ν孔的活細(xì)胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0011 ]所述的活細(xì)胞染料溶液為Hoechst 34580，Mitotracker orange，IysoTrackerDeep Red三種染料的混合液，三者的最終濃度比值為1:2:1;
[0012]步驟(4).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%的多聚甲醛；
[0013]步驟(5).在步驟(4)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0014]所述的透膜緩沖液為含質(zhì)量百分比0.1%TritonX-100的PBS緩沖液；
[0015]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih;
[0016]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)lysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù);選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析；
[0017]步驟(8).采用MetaXpress分析軟件對(duì)步驟(7)檢測(cè)到的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的聯(lián)合毒性。
[0018]判定該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合使用有細(xì)胞毒性的標(biāo)準(zhǔn):溶酶體PH與陰性對(duì)照組(加入細(xì)胞培養(yǎng)液組)差異顯著(P<0.05)，以及其它五個(gè)指標(biāo)中的任一指標(biāo)或多個(gè)指標(biāo)與陰性對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，即可判定該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合使用有細(xì)胞毒性。注:如果細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位五個(gè)指標(biāo)中的任一指標(biāo)或多個(gè)指標(biāo)與陰性對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，而溶酶體PH與陰性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，該次檢測(cè)無(wú)效，需要重新對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)；如果細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)指標(biāo)都與陰性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，則表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合使用無(wú)細(xì)胞毒性;如果溶酶體PH單一指標(biāo)與陰性對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，則表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合使用具有潛在的細(xì)胞毒性，需要進(jìn)一步進(jìn)行分析鑒定。
[0019]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明針對(duì)食品添加劑新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的化合結(jié)構(gòu)篩選了表征新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的聯(lián)合細(xì)胞毒性的六個(gè)特異性指標(biāo)，具有較好的特異性;本發(fā)明進(jìn)行了重復(fù)性驗(yàn)證，利用棋盤法做了 100個(gè)濃度組合，每個(gè)組合重復(fù)3次，證明了該方法具有較好的重復(fù)性;本發(fā)明根據(jù)細(xì)胞染料的特性進(jìn)行了混合比例優(yōu)化，從而使普通方法需要進(jìn)行四次操作才能完成的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)而現(xiàn)在只需要操作一次，使試劑使用量、檢測(cè)時(shí)間等方面都大為減少，一定程度上也減少了出錯(cuò)的概率;本發(fā)明建立了快速檢測(cè)食品添加劑新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的聯(lián)合細(xì)胞毒性方法，可以為食品添加劑新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的正確使用提供理論依據(jù)，對(duì)保證食品添加劑的正確使用和食品安全具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的分析。
[0021]實(shí)施例1
[0022]步驟(I).到超市采集XXX牌果味飲料，記錄添加新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的劑量，分別為 0.05g/kg、0.16g/kg。
[0023]步驟(2).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以5X 14個(gè)/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0024]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測(cè)樣品(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液)，新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的添加量分別為0.05g/kg、0.16g/kg，培養(yǎng)時(shí)間為72h;同時(shí)設(shè)立加入40μ!7孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照；
[0025]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細(xì)胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0026]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0027]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0028]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0029]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)lysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析；
[0030]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示，添加0.05g/kg新紅、0.16g/kg對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉后，細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合添加是無(wú)細(xì)胞毒性的。
[0031]實(shí)施例2
[0032]步驟(I).到超市采集XXX牌飲料，記錄其添加新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的劑量，分別為0.05g/kg、0.18g/kg。
[0033]步驟(2).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以5X 14個(gè)/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0034]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測(cè)樣品(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液)，新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的添加量分別為0.05g/kg、0.18g/kg，培養(yǎng)時(shí)間為72h;同時(shí)設(shè)立加入40μ!7孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照；
[0035]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細(xì)胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0036]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0037]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0038]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0039]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)lysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析；
[0040]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示，添加0.05g/kg新紅、0.18g/kg對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉后，細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合添加是無(wú)細(xì)胞毒性的。
[0041 ] 實(shí)施例3
[0042]步驟(I).到超市采集XXX牌飲料，記錄其添加新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的劑量，分別為0.05g/kg、0.20g/kg。
[0043]步驟(2).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以5X 14個(gè)/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0044]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測(cè)樣品(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液)，新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的添加量分別為0.05g/kg、0.20g/kg，培養(yǎng)時(shí)間為72h;同時(shí)設(shè)立加入40μ!7孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照；
[0045]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細(xì)胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0046]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0047]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0048]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0049]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)lysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析；
[0050]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示，添加0.05g/kg新紅、0.20g/kg對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉后，細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合添加是無(wú)細(xì)胞毒性的。
[0051 ] 實(shí)施例4
[0052]步驟(I).到超市采集XXX牌糖果及飲料，將兩者混合后記錄新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的劑量，分別為0.05g/kg、0.21 g/kg。
[0053]步驟(2).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以5X 14個(gè)/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0054]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測(cè)樣品(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液)，新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的添加量分別為0.05g/kg、0.21 g/kg，培養(yǎng)時(shí)間為72h;同時(shí)設(shè)立加入40μ!7孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照；
[0055]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細(xì)胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0056]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0057]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0058]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0059]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)lysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析；
[0060]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示，添加0.05g/kg新紅、0.21g/kg對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉后，細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合添加是無(wú)細(xì)胞毒性的。
[0061 ] 實(shí)施例5
[0062]步驟(I).實(shí)驗(yàn)室配制出的飲料，測(cè)得最后新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的劑量，分別
^1.2g/L,0.8g/Lo
[0063]步驟(2).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以5X 14個(gè)/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0064]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測(cè)樣品(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液)，新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的終濃度分別為1.2g/L、0.8g/L，培養(yǎng)時(shí)間為72h;同時(shí)設(shè)立加入40μ!7孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照；
[0065]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細(xì)胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0066]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0067]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0068]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0069]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)lysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析；
[0070]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示，添加1.2g/L新紅、0.8g/L對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉后，細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞微管蛋白、細(xì)胞核狀態(tài)、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，活細(xì)胞總數(shù)與陰性對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。由于溶酶體PH指標(biāo)與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，按照判斷標(biāo)準(zhǔn)，該次檢測(cè)無(wú)效，需要重新對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè);重新檢測(cè)結(jié)果顯示，添加1.2g/L新紅、0.8g/L對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉后，細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、線粒體膜電位與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，細(xì)胞微管蛋白、溶酶體PH與陰性對(duì)照差異顯著(P<0.05)，表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合添加是有細(xì)胞毒性的。
[0071 ] 實(shí)施例6
[0072]步驟(I).實(shí)驗(yàn)室配制出的飲料，測(cè)得最后新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的劑量，分別為0.62g/kg、0.67g/kg。
[0073]步驟(2).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以5X 14個(gè)/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0074]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測(cè)樣品(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液)，新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的添加量分別為0.62g/kg、0.67g/kg，培養(yǎng)時(shí)間為72h;同時(shí)設(shè)立加入40μ!7孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照；
[0075]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細(xì)胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0076]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0077]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0078]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0079]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)lysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析；
[0080]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示，添加0.62g/kg新紅、0.67g/kg對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉后，細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管狀態(tài)、線粒體膜電位與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而溶酶體PH與陰性對(duì)照差異顯著(P<0.05)，表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合添加是有潛在細(xì)胞毒性的，需要進(jìn)一步分析驗(yàn)證。
[0081 ] 實(shí)施例7
[0082]步驟(I).實(shí)驗(yàn)室配制出的飲料，測(cè)得最后新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的劑量，分別為1.lg/kg、l.2g/kg。
[0083]步驟(2).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以5X 14個(gè)/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0084]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測(cè)樣品(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液)，新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的添加量分別為1.仏/1^、1.28/1^，培養(yǎng)時(shí)間為7211;同時(shí)設(shè)立加入40μ!7孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照；
[0085]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細(xì)胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0086]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0087]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0088]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0089]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)lysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析；
[0090]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示，添加1.lg/kg新紅、1.2g/kg對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉后，細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、線粒體膜電位與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>
0.05)，而細(xì)胞微管狀態(tài)、溶酶體PH與陰性對(duì)照差異顯著(P < 0.0 5 )，表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合添加是有細(xì)胞毒性的。
[0091 ] 實(shí)施例8
[0092]步驟(I).實(shí)驗(yàn)室配制出的飲料，測(cè)得最后新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的劑量，分別為2.lg/kg、l.2g/kg。
[0093]步驟(2).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)以5X 14個(gè)/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細(xì)胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0094]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測(cè)樣品(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液)，新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的添加量分別為2.1 g/kg a.2g/kg，培養(yǎng)時(shí)間為72h;同時(shí)設(shè)立加入40μ!7孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照；
[0095]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細(xì)胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0096]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0097]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0098]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0099]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)lysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析；
[0100]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對(duì)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示，添加2.lg/kg新紅、1.2g/kg對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉后，細(xì)胞總數(shù)與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、線粒體膜電位、細(xì)胞微管狀態(tài)、溶酶體PH與陰性對(duì)照差異顯著(P < 0.0 5 )，表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合添加是有細(xì)胞毒性的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢測(cè)食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 步驟(I).在預(yù)鋪細(xì)胞粘附劑的96孔板上，SMMC-7721細(xì)胞以5 X 14個(gè)/孔/I OOyL種板，37°C,5% CO2培養(yǎng)12h; 步驟(2).取出步驟(I)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160yL/孔R(shí)PM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測(cè)樣品，培養(yǎng)時(shí)間為72h;同時(shí)設(shè)立加入40yL/孔的細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照； 所述的待測(cè)樣品為新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉混合液，最終濃度依照食品包裝袋上的劑量添加； 步驟(3).取出步驟(2)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細(xì)胞染料溶液，37 °C孵育30min； 所述的活細(xì)胞染料溶液為Hoechst 34580 ? Mi to tracker orange ? IysoTracker DeepRed三種染料的混合液，三者的最終濃度比值為1:2:1; 步驟(4).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預(yù)溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min; 步驟(5).在步驟(4)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進(jìn)行洗滌I次，再加入100μL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min; 步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入10yL/孔的PBS進(jìn)行洗滌2次后，加入1000倍體積FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih; 步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入10yL/孔的I3BS進(jìn)行洗滌2次后，加入200μL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測(cè)Hoechst 34580標(biāo)記的細(xì)胞核，第二通道選擇“FITC”檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測(cè)Mitotracker orange標(biāo)記的線粒體膜電位(活細(xì)胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測(cè)IysoSensor Blue標(biāo)記的溶酶體PH值;普通光源下檢測(cè)細(xì)胞總數(shù);選擇20倍物鏡，每孔采集10個(gè)視野的圖像，存儲(chǔ)信息用于圖像分析； 步驟(8).采用MetaXpress分析軟件對(duì)步驟(7)檢測(cè)到的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進(jìn)行定位和定量分析，并以細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)參數(shù)判定食品添加劑新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉的聯(lián)合毒性。2.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性方法，其特征在于步驟(4)其中固定液為質(zhì)量百分比4%的多聚甲醛。3.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性方法，其特征在于步驟(5)所述的透膜緩沖液為含質(zhì)量百分比0.1 %Triton X-100的PBS緩沖液。4.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)食品添加劑(新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉)聯(lián)合毒性方法，其特征在于步驟(8)判定某劑量下新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合使用有細(xì)胞毒性的標(biāo)準(zhǔn)如下: ①若溶酶體PH與陰性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，但是細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位五個(gè)指標(biāo)中的任一指標(biāo)或多個(gè)指標(biāo)與陰性對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，則該次檢測(cè)無(wú)效，需要重新對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)； ②若溶酶體PH與陰性對(duì)照組差異顯著(P<0.05),且細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位五個(gè)指標(biāo)中的任一指標(biāo)或多個(gè)指標(biāo)與陰性對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，則判定該劑量下新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合使用有細(xì)胞毒性； ③若細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核狀態(tài)、細(xì)胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個(gè)指標(biāo)都與陰性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，則表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合使用無(wú)細(xì)胞毒性； ④若溶酶體PH單一指標(biāo)與陰性對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，則表明該劑量的新紅、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉聯(lián)合使用具有潛在的細(xì)胞毒性，需要進(jìn)一步進(jìn)行分析鑒定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK105925658SQ201610244076
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月11日
【發(fā)明人】曲道峰, 韓劍眾, 谷炎培
【申請(qǐng)人】浙江工商大學(xué)