用于慢性疼痛的多蛋白酶治療劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明包括含有至少兩個(gè)輕鏈內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域的梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物，以及編碼所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的核酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于通過使用所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物治療炎性病癥(如關(guān)節(jié)炎)；慢性疼痛如神經(jīng)性疼痛和炎性疼痛的方法和組合物，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包括源自具有連接至LC/A內(nèi)肽酶的LC/E來源的內(nèi)肽酶的完整BoNT/A的那些。
【專利說明】用于慢性疼痛的多蛋白酶治療劑
[0001]本發(fā)明涉及方法和組合物，所述方法和組合物涉及具有增強(qiáng)的破壞來自疼痛感受 器或炎癥誘導(dǎo)物的疼痛和/或炎癥介質(zhì)的胞外分泌能力的梭菌屬神經(jīng)毒素。
[0002] 背景
[0003] 通過肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)血清型A-G由于通過蛋白水解裂解 SNARE( "可溶性NSF附著蛋白受體"）蛋白質(zhì)來特異性地阻斷乙酰膽堿從外周神經(jīng)的釋放而 是已知的最強(qiáng)效毒物，所述蛋白質(zhì)介導(dǎo)突觸囊泡與細(xì)胞膜的融合，且因此是Ca 2+刺激的神經(jīng) 遞質(zhì)、疼痛肽和細(xì)胞因子從神經(jīng)元的胞外分泌來說必需的。
[0004] 梭菌屬毒素例如像肉毒桿菌神經(jīng)毒素（BoNT)(包括BoNT血清型BoNT/A、BoNT/B、 BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F以及BoNT/G，以及破傷風(fēng)毒素 TeTx)抑制神經(jīng)元傳遞的能 力已在多種治療性應(yīng)用和美容應(yīng)用中得到應(yīng)用，參見例如War d AB和Barne s MP，CL INICAL USERS OF BOTULINUM T0XINS(Cambridge University Press Cambridge 2007)。作為實(shí) 例，BoNT/A來源的藥劑BOTOX?已在一個(gè)或多個(gè)國(guó)家用于以下適應(yīng)癥:遲緩不能、成人痙 攣狀態(tài)、肛裂、背痛、眼瞼痙攣、磨牙癥、頸肌張力障礙、特發(fā)性震顫、眉間紋或過動(dòng)性面部皺 紋、頭痛、半面痙攣、膀胱過動(dòng)癥、多汗癥、青少年大腦性癱瘓、多發(fā)性硬化癥、肌陣攣性病 癥、鼻唇紋、痙攣性發(fā)音障礙、斜視以及VII神經(jīng)病癥。
[0005] 存在除了肉毒梭菌和破傷風(fēng)梭菌來源的毒素以外的梭菌屬毒素;這些包括但不限 于產(chǎn)氣莢膜梭菌、敗毒梭菌、艱難梭菌、螺狀梭菌、丁酸梭菌以及巴氏梭菌。然而，應(yīng)理解在 本說明書中，除非另外具體地或上下文指示，提及"梭菌屬毒素"或類似提及涉及肉毒梭菌 亞型和破傷風(fēng)梭菌亞型。
[0006] 此外，梭菌屬毒素療法用于或已被提出用于治療包括但不限于以下的病狀，
[0007] a)神經(jīng)肌肉病癥，參見例如，Kei Roger Aoki等人，Method for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions with Botulinum Toxin Types A and B,美 國(guó)專利號(hào) 6,872,397(2005年 3 月29 日）；Rhett M.Schiffman, Methods for Treating Uterine Disorders,美國(guó)專利公布號(hào)2004/0175399(2004年9月9日）；Richard L.Barron, Methods for Treating Ulcers and Gastroesophageal Reflux Disease,美國(guó)專利公布 號(hào)2004/0086531(2004年5月7 日）；以及Kei Roger Aoki等人，Method for Treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G,美國(guó)專利號(hào)6,319,505(2001 年 11 月20 日）；
[0008] b)眼病癥，參見例如，Eric R.First,Methods and Compositions for Treating Eye Disorders,美國(guó)專利公布號(hào)2004/0234532(2004年 11 月25 日）；Kei Roger Aoki等人， Botulinum Toxin Treatment for Blepharospasm,美國(guó)專利公布號(hào)2004/0151740(2004年 8月5 日）；以及 Kei Roger Aoki 等人，Botulinum Toxin Treatment for Strabismus，美國(guó) 專利公布號(hào)2004/0126396(2004年7月1日）；
[0009] c)疼痛，參見例如，Kei Roger Aoki等人，Pain Treatment by Peripheral Administration of a Neurotoxin,美國(guó)專利號(hào)6,869,610(2005年3月22 日）；Stephen Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods to Treat Pain,美國(guó)專利號(hào)6， 641,820(2003 年11 月4 日）；Kei Roger Aoki 等人，Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin，美國(guó)專利號(hào)6,464,986(2002年 10月15 日）；Kei Roger Aoki和Minglei Cui，Methods for Treating Pain，美國(guó)專利號(hào)6，113,915 (2000年9月5日）；Martin A.Voet，Methods for Treating Fibromyalgia，美國(guó)專利6,623， 742(2003年9月23日）；Martin A.Voet，Botulinum Toxin Therapy for Fibromyalgia，美 國(guó)專利公布號(hào)2004/0062776(2004年4月1 日）；以及Kei Roger Aoki等人，Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain，美國(guó)專利公布號(hào)2004/0037852(2004年2月26日）；
[0010] d)肌肉損傷，參見例如，Gregory F.Brooks，Methods for Treating Muscle Injuries，美國(guó)專利號(hào)6，423,319(2002年7月23日）；
[0011] e)頭痛，參見例如，Martin Voet，Methods for Treating Sinus Headache，美國(guó) 專利號(hào)6,838,434(2005年 1 月4日）；Kei Roger Aoki等人，Methods for Treating Tension Headache，美國(guó)專利號(hào)6,776,992(2004年8月 17日）；以及Kei Roger Aoki等人，Method for Treating Headache，美國(guó)專利號(hào)6，458，365(2002年10月 1 日）；William J. Binder，Method for Reduction of Migraine Headache Pain，美國(guó)專利5,714,469(1998年2月3日）；
[0012] f)心血管疾病，參見例如，Gregory F.Brooks和Stephen Donovan，Methods for Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxin，美國(guó)專利號(hào)6，767，544 (2004年7月27 日）；
[0013] e)神經(jīng)病癥，參見例如，Stephen Donovan，Parkinson's Disease Treatment，美 國(guó)專利號(hào)6,620,415(2003 年9 月 16日）；以及Stephen Donovan，Met hod for Treating Parkinson's Disease with a Botulinum Toxin，美國(guó)專利號(hào)6,306,403(2001 年 10月23 曰
[0014] g)神經(jīng)精神病癥，參見例如，Stephen Donovan，Botulinum Toxin Therapy for Neuropsychiatric Disorders，美國(guó)專利公布號(hào)2004/0180061(2004年9月 16 日）；以及 Steven Donovan,Therapeutic Treatments for Neuropsychiatric Disorders，美國(guó)專利 公布號(hào)2003/0211121 (2003年11 月 13 日）；
[0015] f)內(nèi)分泌病癥，參見例如，Stephen Donovan，Method for Treating Endocrine Disorders，美國(guó)專利號(hào)6,827,931 (2004年 12 月 7日）；Stephen Donovan，Met hod for Treating Thyroid Disorders with a Botulinum Toxin，美國(guó)專利號(hào)6740321(2004年5月 25 日）；Kei Roger Aoki等人，Method for Treating a Cholinergic Influenced Sweat Gland，美國(guó)專利號(hào)6，683，049(2004年1 月27 日）；Stephen Donovan，Neurotoxin Therapy for Diabetes，美國(guó)專利號(hào)6,416,765(2002年7 月9 日）；Stephen Donovan，Methods for Treating Diabetes，美國(guó)專利號(hào)6,337,075(2002年1 月8 日）；Stephen Donovan，Method for Treating a Pancreatic Disorder with a Neurotoxin，美國(guó)專利號(hào)6,261,572(2001 年7月17 日）；Stephen Donovan，Methods for Treating Pancreatic Disorders，美國(guó)專利 號(hào)6，143，306(2000年11月 7 日）；
[0016] g)癌癥，參見例如，Stephen Donovan，Methods for Treating Bone Tumors，美國(guó) 專利號(hào)6,565,870(2003年5月20 日）；Stephen Donovan，Method for Treating Cancer with a Neurotoxin to Improve Patient Function，美國(guó)專利號(hào)6,368,605(2002年4月9 日）；Stephen Donovan，Method for Treating Cancer with a Neurotoxin，美國(guó)專利號(hào)6， 139，845(2000年10月31 日）；以及Mi tchel 1 F · Brin和Stephen Donovan，Methods for Treating Diverse Cancers，美國(guó)專利公布號(hào)2005/0031648(2005年2月10日）；
[0017] h)耳病癥，參見例如，Stephen Donovan，Neurotoxin Therapy for Inner Ear Disorders，美國(guó)專利號(hào)6358926(2002年3月 19 日）；以及Stephen Donovan，Method for Treating Otic Disorders，美國(guó)專利號(hào)6265379(2001 年7月24日）；
[0018] i)自主神經(jīng)病癥，參見例如，Pankai J · Pasricha和Anthony Ν· Kal loo，Method for Treating Gastrointestinal Muscle Disorders and Other Smooth Muscle Dysfunction，美國(guó)專利 5,437,291(1995年8月1日）；
[0019] j)以及其他病癥，參見例如，William J.Binder，Method for Treatment of Skin Lesions Associated with Cutaneous Cell-proliferative Disorders，美國(guó)專利5,670， 484(1997年9月23日）；Eric R.First，Application of Botulinum Toxin to the Management of Neurogenic Inflammatory Disorders，美國(guó)專利6,063,768(2000年5月16 日）；Marvin Schwartz和Brian J.Freund，Method to Reduce Hair Loss and Stimulate !1&;^61'〇￥七11，美國(guó)專利6,299,893(2001年10月9日）；>&11〇.六.〇&1'1'1^116『8和六1&8七&;^ Carruthers，Cosmetic Use of Botulinum Toxin for Treatment of Downturned Mouth, 美國(guó)專利6,358,917(2002年3月 19 日）；Stephen Donovan，Use of a Clostridial Toxin to Reduce Appetite，美國(guó)專利公布號(hào) 2004/40253274(2004 年 12 月16 日）；以及 Howard I.Katz和Andrew M.Blumenfeld，Botulinum Toxin Dental Therapies and Procedures, 美國(guó)專利公布號(hào)2004/0115139(2004年6月17 日）；Kei Roger Aoki等人，Treatment of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum, 美國(guó)專利公布 號(hào)2002/0010138(2002年 1 月24日）；以及Kei Roger Aoki等人，Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain,美國(guó)專利公 布號(hào)2004/0013692(2004年 1 月22 日）。
[0020]以下表2提供各種當(dāng)前已知的肉毒桿菌相關(guān)的(BoNT和TeTX)梭菌屬毒素的同種型 的氨基酸序列。這些毒素彼此具有最少約35%氨基酸同一性且共享相同的功能性結(jié)構(gòu)域組 織和總體結(jié)構(gòu)架構(gòu)。天然存在的梭菌屬毒素各自被翻譯為約150kDa的單鏈多肽，所述單鏈 多肽的二硫環(huán)隨后被天然存在的蛋白酶(例如像內(nèi)源性梭菌屬毒素蛋白酶或環(huán)境中產(chǎn)生的 天然存在的蛋白酶)通過蛋白水解切割作用而裂解。這種翻譯后加工產(chǎn)生成熟雙鏈分子，所 述分子包含約50kDa輕鏈(LC)和約100kDa重鏈(HC)，二者通過單個(gè)鏈間二硫鍵和非共價(jià)相 互作用結(jié)合在一起。
[0021] 各成熟雙鏈梭菌屬毒素分子包含三個(gè)功能上不同的結(jié)構(gòu)域:1)位于LC中的酶結(jié)構(gòu) 域，其包含含有特異性地靶向介導(dǎo)突觸囊泡與細(xì)胞膜的融合的一種或多種SNARE蛋白的鋅 依賴性內(nèi)肽酶活性的金屬蛋白酶區(qū)；2)含于Η鏈的氨基端半部(稱為"Hn"）內(nèi)的易位結(jié)構(gòu)域， 其促進(jìn)毒素的至少LC鏈從內(nèi)體釋放至靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；以及3)存在于Η鏈的羧基端半部 (He)中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其決定毒素的結(jié)合活性和結(jié)合特異性。
[0022] He包含和Ηα亞結(jié)構(gòu)域(分別扯的1'|-末端部分和C末端部分）?，F(xiàn)在存在大量證據(jù) 表明大多數(shù)或所有ΒοΝΤ/Χ毒素使用"雙重受體"結(jié)合靶細(xì)胞，其中毒素的包含Hcn和Hcc亞結(jié) 構(gòu)域兩者的He部分結(jié)合某些細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂和蛋白質(zhì)受體(可能糖基化的）；所述蛋白 質(zhì)受體的結(jié)合有助于細(xì)胞內(nèi)的毒素的內(nèi)化。"X"意指肉毒桿菌毒素的任一血清型。雖然術(shù)語 "ΒοΝΤ/Χ"通常用于指示肉毒桿菌毒素的血清型，但所述術(shù)語還可包括其TeTX區(qū)。結(jié)合在 靶細(xì)胞的表面處復(fù)雜定位的受體。
[0023]應(yīng)理解存在這些毒素的每種血清型的菌株或亞型；這些可在其氨基酸序列中、特 別是(但非排他性地)在所指示毒素或毒素結(jié)構(gòu)域的同一性或活性特征中無顯著變化的非 關(guān)鍵區(qū)(所謂的"可變"區(qū)）中在某種程度上不同。
[0024] 在一些表1中，提供標(biāo)準(zhǔn)單字母和三字母氨基酸代碼：
[0028] ^2
[0030] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，梭菌屬亞型毒素變體可存在于自然中，具有以上 所示的氨基酸序列(或編碼這些氨基酸序列的核苷酸序列）的變化。如本文所用，術(shù)語"天然 存在的梭菌屬結(jié)構(gòu)域變體"意指由天然存在的過程產(chǎn)生的任何梭菌屬結(jié)構(gòu)域（內(nèi)肽酶、易位 和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域），包括但不限于由選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的梭菌屬結(jié)構(gòu)域同工型、由 自發(fā)突變產(chǎn)生的梭菌屬結(jié)構(gòu)域同工型和梭菌屬結(jié)構(gòu)域亞型。如本文所用，天然存在的梭菌 屬結(jié)構(gòu)域變體可與所述天然存在的梭菌屬結(jié)構(gòu)域變體所基于的參考梭菌屬結(jié)構(gòu)域?qū)嵸|(zhì)上 相同的方式起作用，且在本發(fā)明的任何方面中可取代參考梭菌屬結(jié)構(gòu)域。
[0031] 天然存在的梭菌屬結(jié)構(gòu)域變體可取代來自所述天然存在的梭菌屬結(jié)構(gòu)域變體所 基于的參考梭菌屬結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸、兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸、三個(gè)或更多個(gè)氨基 酸、四個(gè)或更多個(gè)氨基酸、五個(gè)或更多個(gè)氨基酸、十個(gè)或更多個(gè)氨基酸、20個(gè)或更多個(gè)氨基 酸、30個(gè)或更多個(gè)氨基酸、40個(gè)或更多個(gè)氨基酸、50個(gè)或更多個(gè)氨基酸或100個(gè)或更多個(gè)氨 基酸。天然存在的梭菌屬結(jié)構(gòu)域變體還可取代來自所述天然存在的梭菌屬結(jié)構(gòu)域變體所基 于的參考梭菌屬結(jié)構(gòu)域的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸、至少15個(gè)連續(xù)氨基酸、至少20個(gè)連續(xù)氨基 酸或至少25個(gè)連續(xù)氨基酸，所述天然存在的梭菌屬結(jié)構(gòu)域變體與所述天然存在的梭菌屬結(jié) 構(gòu)域變體所基于的參考梭菌屬結(jié)構(gòu)域具有至少50%氨基酸同一性、65 %氨基酸同一性、 75%氨基酸同一性、85%氨基酸同一性或95%氨基酸同一性，只要所述天然存在的梭菌屬 結(jié)構(gòu)域的生物或生物化學(xué)活性被基本上保留。還應(yīng)了解，還可進(jìn)行保守性氨基酸插入和缺 失，只要所述結(jié)構(gòu)域的特征性功能和同一性未基本上改變。
[0032] 由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這些氨基酸序列可由一 組有限的具有不同但限定的核苷酸序列的不同DNA分子編碼。例如，編碼給定肽或蛋白質(zhì)的 簡(jiǎn)并核苷酸序列可具有適于或被選擇用于有利于在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)的不同密碼子。使 用這一信息，能夠構(gòu)建可表達(dá)的開放核酸閱讀框以用于組裝包含這些氨基酸結(jié)構(gòu)域編碼區(qū) 的任何組合的核酸分子，單獨(dú)地或與另外的核酸序列組合，插入至適合的表達(dá)載體中且隨 后在所選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如，國(guó)際專利公布W001/14570公開制備單鏈可裂解的重 組修飾或未修飾的梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的方法以及使用這類方法制備其嵌合和雜合形 式。公開制備可表達(dá)的重組神經(jīng)毒素及其衍生物的方法的另外公布包括美國(guó)專利5,989， 545;6,203，794;6,395,513;美國(guó)公布號(hào)U.S. 2003/0166238 ;U.S. 2002/169942;U.S. 2004/ 176299;U.S. 2004/126397;U.S. 2005/035730;U.S. 2005/068494;U.S. 2006/011966;國(guó)際專 利公布W095/32738;WO 99/55359;W096/33273;W098/07864;W099/17806 ;W098/07864; 冊(cè)02/44199;1002/40506以及2012年10月4日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)13/644,386。在本 專利申請(qǐng)中引用的這些和所有其他專利、專利公布以及非專利公布(無論是否如此具體地 指示)據(jù)此以引用的方式作為本說明書的一部分單獨(dú)地并入。
[0033]使用重組DNA技術(shù)允許從天然存在的毒素亞型及其菌株構(gòu)建具有不同或修飾的功 能特性的修飾的梭菌屬神經(jīng)毒素。
[0034] 例如，改變天然神經(jīng)毒素輕鏈的天然存在的氨基酸序列和/或添加不同的治療性 部分允許構(gòu)建被設(shè)計(jì)用于在神經(jīng)元內(nèi)攜帶治療劑的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。參見美國(guó)專利號(hào)6,203，794 (據(jù)此以引用的方式并入本文）。
[0035] 改變靶向（細(xì)胞結(jié)合)結(jié)構(gòu)域允許毒素在胰腺細(xì)胞如腺泡細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而防止由 這類細(xì)胞分泌活化的消化酶，參見美國(guó)專利號(hào)6,843,998(據(jù)此以引用的方式并入本文）；或 在感覺傳入神經(jīng)元內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而防止神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子和特通肽釋放且因此提供疼痛緩 解;參見美國(guó)專利號(hào)6,395,513(據(jù)此以引用的方式并入本文）。
[0036]此外，美國(guó)專利號(hào)7,422,877(據(jù)此以引用的方式并入本文）公開了嵌合神經(jīng)毒素 衍生物的產(chǎn)生，所述嵌合神經(jīng)毒素衍生物包含例如一種神經(jīng)毒素亞型（例如BoNT/A)的結(jié)合 結(jié)構(gòu)域和易位結(jié)構(gòu)域(或其修飾型式）以及另一種神經(jīng)毒素亞型(例如BoNT/E)的輕鏈區(qū)。由 此可見鑒于神經(jīng)毒素亞型之間的總體結(jié)構(gòu)同源性，三種基本梭菌屬神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)域的任何 組合可在單一氨基酸鏈中（或在裂解的雙鏈分子中）進(jìn)行。因此例如，來自神經(jīng)毒素亞型A、 8、(：1、04小、6或了6了乂中的任一種的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可獨(dú)立地與來自神經(jīng)毒素亞型4、8、(：1、03、 F、G或TeTX的易位結(jié)構(gòu)域組合，且進(jìn)一步獨(dú)立地與來自神經(jīng)毒素亞型A、B、C1、D、E、F、G或 TeTX中的任一種的內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域組合。這可例如通過重組構(gòu)建且表達(dá)隨后裂解以產(chǎn)生雙鏈 毒素的單一嵌合鏈或通過單獨(dú)表達(dá)單一 Η鏈和L鏈來進(jìn)行，所述單一 Η鏈和L鏈然后通過例如 產(chǎn)生鏈間二硫鍵且隨后純化進(jìn)行組合。此外，使用這類技術(shù)，可改變不同結(jié)構(gòu)域的活性(例 如，可在LC結(jié)構(gòu)域中引入突變以破壞LC的蛋白酶活性），或可用其他部分置換天然存在的結(jié) 構(gòu)域，如本文其他地方所描述，其中例如BoNT/A的HC結(jié)構(gòu)域(或其一部分)突變或缺失且附 加靶向配體(TL)。
[0037]當(dāng)討論每種梭菌屬神經(jīng)毒素亞型的三種一般神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)域(結(jié)合、易位和內(nèi)肽 酶)時(shí)，應(yīng)了解梭菌屬神經(jīng)毒素研究是發(fā)展良好的領(lǐng)域，并且矯正包含具有其功能的這些結(jié) 構(gòu)域中的每種的氨基酸序列是熟知的。提及這些術(shù)語中的每種（"易位結(jié)構(gòu)域"、"結(jié)合結(jié)構(gòu) ±或"、以及"蛋白酶"、"內(nèi)肽酶"、"LC"或"輕鏈"結(jié)構(gòu)域)應(yīng)被理解為包括包含于如表2中列舉 的SEQ ID Ν0:7-14中列舉的梭菌屬神經(jīng)毒素亞型的氨基酸序列中的任一個(gè)中的相應(yīng)結(jié)構(gòu) 域以及這些序列或這些序列內(nèi)的結(jié)構(gòu)域的保守性修飾和優(yōu)化的變體。
[0038]另外，這些一般結(jié)構(gòu)域細(xì)分成亞結(jié)構(gòu)域也是已知的。例如，結(jié)合結(jié)構(gòu)域He細(xì)分成亞 結(jié)構(gòu)域H?(所述結(jié)構(gòu)域的氨基末端部分，大致對(duì)應(yīng)于BoNT/A的氨基酸871-1091)和HCC(HC結(jié) 構(gòu)域的羧基末端部分，大致對(duì)應(yīng)于BoNT/A的氨基酸1092-1296)也是熟知的。參見例如，Lacy DB和Stevens RC,Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, 1999, J.Mol .Biol .291:1091-1104。亞結(jié)構(gòu)域Hcn在肉毒桿菌毒素亞型之中是 高度保守的，然而，關(guān)于其功能所知甚少。Ηα亞結(jié)構(gòu)域是不太保守的。
[0039] 另外，這些結(jié)構(gòu)域和亞結(jié)構(gòu)域各自的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且已在 本說明書中公開，且因此使用本公開與遺傳密碼的知識(shí)的組合，可制備編碼待表達(dá)的蛋白 質(zhì)的核苷酸序列。當(dāng)然，鑒于本說明書對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說立即設(shè)想編碼所指 示多肽的其他核苷酸序列將是常規(guī)問題。此外，由于遺傳密碼的冗余，對(duì)于每種多肽來說有 限數(shù)目的核苷酸序列是可能的。此外，清楚的是可合成在同源性區(qū)中包含這些核苷酸序列 (或它們的獨(dú)特部分)的含有與參考序列的不超過10%、8%或5%堿基對(duì)差異的保守性修飾 的變體。
[0040] 此外，應(yīng)了解在表2和本說明書中其他地方或相關(guān)序列表中提出的氨基酸序列提 供編碼這些氨基酸序列及其指示區(qū)域的任何和所有核苷酸序列的完整公開。編碼給定神經(jīng) 毒素亞型的內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域或結(jié)合結(jié)構(gòu)域(包括任何亞結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列分 別可與表2或其他地方中列舉的這類參考氨基酸序列區(qū)域中的任一者具有60 %或更大、或 65%或更大、或70%或更大、或75%或更大、或80%或更大、或85%或更大、或90%或更大、 或95%或更大或100%同一性。
[0041] 肉毒桿菌神經(jīng)毒素由梭菌屬細(xì)胞表達(dá)，所述細(xì)胞還產(chǎn)生與神經(jīng)毒素非共價(jià)締合以 形成血凝素復(fù)合物(還被稱為祖細(xì)胞復(fù)合物）的一種或多種非毒素"神經(jīng)毒素相關(guān)蛋白"或 NAP。這些NAP幫助神經(jīng)毒素在其于污染的食物中消化時(shí)抵抗腸中的蛋白酶降解。
[0042] NAP蛋白包括三種血凝素（HA)蛋白（HA1、HA2和HA3)以及非毒性非血凝素蛋白 (NTNHhBoNT A2型、E型和F型不具有HA基因，并且僅產(chǎn)生包含BoNT和NTNH的12S(約300kDa) 復(fù)合物。"S"代表斯維德伯格單位（離心沉降率的單位型、C型和D型產(chǎn)生12S和16S(約 500kDa)復(fù)合物；16S復(fù)合物包括8〇階、階順、擬1、骱2和骱3<^1型具有123和163復(fù)合物加約 900kDA的19S復(fù)合物，其可表示16S復(fù)合物的二聚體。
[0043] 當(dāng)前，BoNT/Al-和/B-血凝素復(fù)合物已被批準(zhǔn)用于這類臨床用途。BoNT/Al復(fù)合物 的治療益處比BoNT/B的治療益處更持久，這是由于其在神經(jīng)元中具有較長(zhǎng)壽命的蛋白酶。
[0044] 如以上所指示，BoNT由輕鏈相關(guān)蛋白酶結(jié)構(gòu)域(LC)組成，所述結(jié)構(gòu)域通過單個(gè)共 價(jià)二硫鍵和另外非非共價(jià)鍵連接至重鏈(HCKHC的羧基末端(C末端)部分(?)結(jié)合在各種 神經(jīng)類型(包括運(yùn)動(dòng)、自主和感覺神經(jīng)元)上表達(dá)的其特異性受體。當(dāng)結(jié)合祀細(xì)胞時(shí)，BoNT分 子通過內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡中；HC的氨基末端(N末端)半部(Hn)形成允許LC從'內(nèi)體樣'膜 囊泡易位至細(xì)胞溶質(zhì)中的通道。此后，LC裂解特異性SNARE蛋白質(zhì)底物，從而破壞SNARE介導(dǎo) 囊泡-膜融合且因此神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子和疼痛肽從細(xì)胞釋放的能力。
[0045] 不同BoNT血清型的LC是類似的，但不是相同的，并且兩個(gè)不同的LC可裂解不同的 SNARE蛋白，或不同地裂解同一SNARE蛋白。例如，LC/A、LC/C和LC/E裂解SNAP-25; LC/B、LC/ D、LC/F和LC/G裂解小突觸泡蛋白-2(VAMP-2);此外，LC/C裂解突觸融合蛋白，其是據(jù)報(bào)道為 細(xì)胞分裂所需的另一種SNARE蛋白。TeTx的LC裂解VAMP-2。每種血清型的LC在分子中的獨(dú)特 位置處裂解其底物。
[0046] 例如，BoNT/A(LC/A)的輕鏈從SNAP-25的C末端去除9個(gè)氨基酸，而LC/E缺失另外17 個(gè)C末端殘基，并且因此通過通過對(duì)穩(wěn)定的SNARE復(fù)合物去穩(wěn)定而得到神經(jīng)-胞外分泌的更 具破壞性的阻斷(Meng等人，2009;Wang等人，2011)。例如，通過LC/A抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放通常 可通過升高Ca 2+流入逆轉(zhuǎn)，但在LC/E的情況下不能，這可能是由于SNAP-25底物的更大破壞。 然而，盡管通過LC/E更大的活性"穩(wěn)健性"，因?yàn)長(zhǎng)C/E誘導(dǎo)僅較短的瞬時(shí)神經(jīng)肌肉麻痹，所以 其臨床應(yīng)用受到限制。
[0047] 高度希望產(chǎn)生具有新特性的治療劑。例如，其中兩種或更多種源自多于一種血清 型的輕鏈內(nèi)肽酶可組合在BoNT或TeTx衍生物中（其中每個(gè)輕鏈?zhǔn)腔钚缘那易R(shí)別其底物 SNARE蛋白中的不同氨基酸序列）的治療劑可被設(shè)計(jì)成靶向如慢性疼痛、慢性炎性病狀(包 括關(guān)節(jié)炎)的病狀和/或涉及細(xì)胞因子釋放的病狀。
[0048] 在一個(gè)實(shí)例中，設(shè)計(jì)將LC/E的強(qiáng)效蛋白酶與LC/A的長(zhǎng)效作用組合的治療劑。對(duì)于 提高用于治療慢性疼痛(包括緊張性頭痛/偏頭痛和慢性炎性疾病如關(guān)節(jié)炎)的BoNT/A的功 效來說這是特別重要的，因?yàn)锽oNT/A復(fù)合物本身據(jù)發(fā)現(xiàn)在一些但并非所有這類患者中是有 效的。參見例如，Naumann M.等人（2008)ASSESSMENT:B0TULINUM NEUROTOXIN IN THE TREATMENT OF AUTONOMIC DISORDERS AND PAIN(AN EVIDENCE-BASED REVIEW):REPORT OF THE THERAPEUTICS AND TECHNOLOGY ASSESSMENT SUB⑶MMITTEE OF THE AMERICAN ACADEMY OF NEUROLOGY 70:1707-1714(據(jù)此以引用的方式并入本文）。阻斷疼痛相關(guān)因子 如疼痛蛋白和細(xì)胞因子的胞外分泌可證明適用于治療慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛和炎性病狀。
[0049] 當(dāng)通過活化TRPV1(瞬時(shí)受體電位香草酸1)(參與大多形式的疼痛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的陽 離子通道）引發(fā)時(shí)，BoNT/A不能阻斷疼痛刺激肽[例如降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和底物P]從 感覺神經(jīng)元的胞外分泌(Meng等人，2007;Meng等人,2009)。
[0050] BoNT/E也未能抑制來自感覺神經(jīng)元的辣椒素刺激的、TRPV1介導(dǎo)的CGRP和物質(zhì)P釋 放，這是由于其細(xì)胞表面受體(糖基化的突觸囊泡蛋白2A( SVP2A)和糖基化的SVP2B)稀疏或 從感覺神經(jīng)元缺失。然而，其中(受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)被來自BoNT/A的其對(duì)應(yīng)物置 換的嵌合蛋白能夠阻斷這些疼痛介導(dǎo)的肽的釋放，從而表明BoNT/A細(xì)胞表面受體有助于 LC/E內(nèi)吞和遞送至傷害性C纖維中。
[0051 ] 一旦在神經(jīng)元內(nèi)部，LC/E蛋白酶就去除26個(gè)SNAP-25氨基酸殘基，由此防止為神 經(jīng)-胞外分泌所需的穩(wěn)定SNARE復(fù)合物的形成(Meng等人，2009)。雖然LC/A也裂解SNAP-25， 但它僅裂解9個(gè)氨基酸殘基，并且胞外分泌活性的阻斷不太完全和穩(wěn)定。
[0052] 為了使臨床上使用LC/E蛋白酶的這種有利特征變得實(shí)際，希望極大地延伸其作用 持續(xù)時(shí)間。
[0053] 附圖簡(jiǎn)述
[0054]圖1是用于通過產(chǎn)生編碼經(jīng)由接頭連接至BoNT/A的N末端LC/A部分的活性LC/E的 基因構(gòu)建體以產(chǎn)生含有兩種活性蛋白酶的復(fù)合神經(jīng)毒素 LC/E-BoNT/A而產(chǎn)生復(fù)合神經(jīng)毒素 的示意圖。
[0055] 圖2A是不出使用TaX〇:li?Superf low樹脂（由Clonetech Laboratories，Inc ·制造） (一種對(duì)His6標(biāo)簽(SEQ ID勵(lì):15)具有高度靈敏度的0)2+帶電荷的瓊脂糖樹脂)通過固定金 屬親和色譜法（MAC)純化His6標(biāo)記的（"His6"公開為SEQ ID NO: 15)LC/E-BoNT/A構(gòu)建體的 SDS-PAGE電泳的照片。
[0056] 圖2B示出隨后經(jīng)受陽離子交換色譜法的匯集的含LC/E-BoNT/A MAC級(jí)分的洗脫 曲線中吸光度和傳導(dǎo)率對(duì)時(shí)間。
[0057]圖3是示出用生物素化的凝血酶處理純化的LC/E-BoNT/A以產(chǎn)生雙鏈毒素且除去 His6(SEQ ID N0:15)標(biāo)簽的SDS-PAGE電泳的照片。符號(hào)+和-分別指示用或不用試劑二硫蘇 糖醇(DTT)處理以減少連接LC/E-LC/A和HC/A鏈的二硫鍵。
[0058]圖4是蛋白質(zhì)印跡的照片，其中將BoNT/A(上部凝膠)和LC/E-BoNT/A(下部凝膠）的 連續(xù)稀釋液針對(duì)其裂解培養(yǎng)的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元(CGN)中的SNARE蛋白SNAP-25的能力進(jìn) 行測(cè)定。
[0059] 圖5示出注射LC/E-BoNT/A、BoNT/E或BoNT/A的腓腸肌中肌肉麻痹的持續(xù)時(shí)間，其 中將最大耐受劑量(TDmax)對(duì)比天數(shù)的時(shí)間長(zhǎng)度進(jìn)行繪圖。
[0060]圖6A是蛋白質(zhì)印跡的照片，其中將LC/E-BoNT/A的連續(xù)稀釋液與大鼠TGN(三叉神 經(jīng)節(jié)神經(jīng)元)孵育過夜，然后使用抗SNAP-25和抗突觸融合蛋白抗體針對(duì)LC/E-BoNT/A裂解 SNAP-25(主要產(chǎn)生由LC/E產(chǎn)生的26個(gè)殘基截短的SNAP-25裂解產(chǎn)生）而不裂解突觸融合蛋 白的能力測(cè)定溶解產(chǎn)物。
[0061 ] 圖6B是LC/E-BoNT/A的劑量反應(yīng)曲線，其示出通過60mM KC1引發(fā)的a)SNAP-25的裂 解和b)CGRP釋放的抑制或c)大鼠TGN中的辣椒素，以及BoNT/A未能顯著降低與BoNT/A-起 孵育的TGN中由辣椒素引發(fā)的CGRP釋放。
[0062] 圖7A是從術(shù)前4天至術(shù)后約21天進(jìn)行的用鹽水、BoNT/A或LC/E-BoNT/A處理動(dòng)物、 接著將爪置于冷(4°C)板中且測(cè)量大鼠從所述板縮回其爪所需的時(shí)間的大鼠模型保留神經(jīng) 損傷(SNI)測(cè)試中抗傷害性活動(dòng)持續(xù)時(shí)間的曲線圖。
[0063] 圖7B是從術(shù)前4天至術(shù)后約21天進(jìn)行的用鹽水、BoNT/A或LC/E-BoNT/A處理動(dòng)物、 接著通過對(duì)施加校準(zhǔn)的von Frey毛發(fā)到后爪的趾面上的敏感性測(cè)量誘導(dǎo)的異常性疼痛的 大鼠模型保留神經(jīng)損傷(SNI)測(cè)試中抗傷害性活動(dòng)持續(xù)時(shí)間的曲線圖。
[0064]圖8A是本發(fā)明的雙蛋白酶多肽的示意圖。這種多肽使兩種不同的SNARE蛋白失活： 通過LC/B使VAMP失活且通過LC/A使SNAP-25失活。將合成LC/B基因經(jīng)由接頭序列(編碼"DI" 殘基)融合至BoNT/A的5端以產(chǎn)生復(fù)合神經(jīng)毒素LC/B-BoNT/A。后者還包含兩個(gè)凝血酶識(shí)別 序列。
[0065]圖8B說明使用TalonQ? Superflow樹脂（由Clonetech Laboratories，Inc ·制造）通 過IMAC純化His6標(biāo)記的LC/B-BoNT/A的通過考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠。
[0066]圖8C在用生物素化的凝血酶處理以產(chǎn)生雙鏈（DC)毒素之后IMAC純化的LC/B-BoNT/A的SDS-PAGE。符號(hào)+和-分別指示用或不用還原劑二硫蘇糖醇(DTT)處理。
[0067]圖8D示出SDS-PAGE凝膠的蛋白質(zhì)印跡，其中將LC/B-BoNT/A的連續(xù)稀釋液與大鼠 CGN在37°C下孵育24小時(shí)。然后使用抗SNAP-25抗體和抗VAMP 2抗體測(cè)定溶解產(chǎn)物以監(jiān)測(cè)毒 素對(duì)兩種SNARE蛋白SNAP-25和VAMP 2的裂解。通過其特異性抗體探測(cè)且通過LC/B或LC/A未 識(shí)別的突觸融合蛋白1充當(dāng)內(nèi)部負(fù)載對(duì)照。
[0068] 圖8E示出LC/B-BoNT/A的劑量/反應(yīng)曲線，其示出在較高濃度的LC/B-BoNT/A構(gòu)建 體下SNAP-25 (矩形)和VAMP 2 (倒三角形）的裂解。
[0069] 圖9是本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，其中多SNARE裂解治療性候選物具有是所有三種主 要類型的SNARE蛋白質(zhì)失活的能力：通過LC/C1使SNAP-25和突觸融合蛋白1-3失活且通過 LC/D使VAMP 1-3失活。DI是LC/D與LC/C1之間的接頭。
[0070] 圖10A是從術(shù)前4天至術(shù)后約21天進(jìn)行的用鹽水、PK(GMP符合的LC/E-BoNT/A)或普 瑞巴林處理動(dòng)物、接著用Von Frey細(xì)絲刺激爪且測(cè)量大鼠縮回其爪的機(jī)械閾值的大鼠模型 保留神經(jīng)損傷(SNI)測(cè)試中抗傷害性活動(dòng)持續(xù)時(shí)間的曲線圖。
[0071] 圖10B是從術(shù)前4天至術(shù)后約21天進(jìn)行的用鹽水、PK(使用適于GMP符合生產(chǎn)的方法 制造的LC/E-BoNT/A)或普瑞巴林處理動(dòng)物、接著將爪置于冷(4°C)板中且測(cè)量大鼠從所述 板縮回其爪所需的時(shí)間的大鼠模型保留神經(jīng)損傷(SNI)測(cè)試中抗傷害性活動(dòng)持續(xù)時(shí)間的曲 線圖。
[0072]圖11是從術(shù)前4天至術(shù)后約36天進(jìn)行的用鹽水或PK(使用適于GMP符合生產(chǎn)的方法 制造的LC/E-BoNT/A)處理動(dòng)物、接著用Von Frey細(xì)絲刺激爪且測(cè)量大鼠縮回其爪的機(jī)械閾 值的大鼠模型保留神經(jīng)損傷(SNI)測(cè)試中抗傷害性活動(dòng)持續(xù)時(shí)間的曲線圖。在術(shù)后第10天 對(duì)一組動(dòng)物進(jìn)行第二PK注射。
[0073]發(fā)明詳述
[0074] 本發(fā)明涉及與源自肉毒桿菌神經(jīng)毒素的治療性多肽分子相關(guān)的方法和組合物。具 體地說，所述分子包含至少兩個(gè)源自不同BoNT血清型的輕鏈的活性內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。非常優(yōu) 選地，所述內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域識(shí)別且裂解其底物中的不同氨基酸序列。尤其優(yōu)選地，所述內(nèi)肽酶 結(jié)構(gòu)域源自兩種或更多種BoNT血清型，或BoNT血清型和TeTx IX。
[0075] 組合來自選定BoNT的重鏈與至少兩個(gè)不同的活性梭菌屬輕鏈內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域的能 力提供具有增強(qiáng)的和耐受特性的工程化的治療分子。這類治療劑首先通過設(shè)計(jì)和產(chǎn)生編碼 兩種不同BoNT血清型的復(fù)合物的基因構(gòu)建體以及展示多重和協(xié)同生物活性與治療應(yīng)用的 重組蛋白的原核表達(dá)/純化來舉例說明。
[0076] 通過這類多內(nèi)肽酶治療劑阻斷胞外分泌可具有累加活性，如阻斷痛覺受體運(yùn)輸至 感覺神經(jīng)元的表面。因此，這類治療劑不僅抑制可溶性突觸因子的胞外分泌，而且可抑制為 神經(jīng)膜內(nèi)部的蛋白質(zhì)的運(yùn)輸。
[0077] 在未在實(shí)施例部分中說明的某些治療劑中，天然存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被改變以使 得治療劑重新靶向不同或另外的細(xì)胞類型。例如，在Aoki等人，美國(guó)專利6，776，990中，BoNT 的結(jié)合區(qū)被人縮膽囊素或其類似物置換，從而使毒素(具有僅單一內(nèi)肽酶)靶向胰腺腺泡細(xì) 胞。類似地，在2012年10月4日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)13/644,386中，在某些實(shí)例中靶 向配體置換天然存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在這樣一個(gè)實(shí)例中，編碼人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑 (IL-1RA)的基因用于置換天然存在的H C區(qū)或其部分，從而靶向分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。
[0078]例證本發(fā)明的當(dāng)前優(yōu)選的分子是基于使用分子生物學(xué)方法用于產(chǎn)生表達(dá)包含融 合至活性重組BoNT/A的LC/A部分的BoNT/E的LC的蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體的新穎概念。這種獨(dú) 特分子包含LC/E-BoNT/A(在圖1中示出），其結(jié)合BoNT/A受體(例如，突觸囊泡蛋白2和/或神 經(jīng)節(jié)苷酯），經(jīng)歷受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用且易位至細(xì)胞溶質(zhì)，其中SNARE蛋白SNAP-25有效的裂 解，從而產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子和疼痛肽釋放的抑制。"有效裂解"意指其中大多數(shù)SNAP-25 分子具有足夠數(shù) 目的氨基酸裂解以通過提高 Ca2+流量防止胞外分泌阻斷的逆轉(zhuǎn); 例如像 由通過LC/E裂解SNAP-25引起。
[0079] 上述構(gòu)建體優(yōu)選地被設(shè)計(jì)成包含位于/A的HC與LC之間的編碼特異性氨基酸殘基 的短序列，所述氨基酸殘基由凝血酶蛋白酶選擇性地識(shí)別和裂解，因此所獲得的單鏈(SC) 重組蛋白可通過暴露于凝血酶體外轉(zhuǎn)化成雙鏈(DC)形式。
[0080] 非常優(yōu)選地，本發(fā)明由經(jīng)由雙氨基酸接頭（例如，天冬氨酸-異亮氨酸;DI)連接至 BoNT/A的LC/A部分的LC/E例證，從而產(chǎn)生新穎的復(fù)合毒素。在涉及使感覺神經(jīng)元暴露于此 構(gòu)建體的實(shí)驗(yàn)中，蛋白酶顯示被遞送在培養(yǎng)的神經(jīng)元內(nèi)，并且連接的LC/E被穩(wěn)定化，其進(jìn)而 產(chǎn)生長(zhǎng)效神經(jīng)性麻痹像LC/A。
[0081] 重要地，與LC/A不同，這種長(zhǎng)效分子主要產(chǎn)生具有LC/E特征的蛋白水解產(chǎn)物并且 阻斷由來自大鼠培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元的辣椒素引發(fā)的疼痛介體的釋放，這是由于/E裂解的 SNAP-25不能介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子和疼痛肽釋放。此外，這種復(fù)合蛋白質(zhì)證明在減弱神 經(jīng)性疼痛(保留神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的）的大鼠模型中的疼痛行為方面比單獨(dú)LC/A更有效。
[0082] 示例性嵌合分子因此提供作為用于治療慢性疼痛的治療劑的主要優(yōu)點(diǎn)：（a)憑借 存在于連接的LC/A中的神經(jīng)末端保留/穩(wěn)定化基序，正常瞬時(shí)作用/E蛋白酶的高度合乎需 要和極大延長(zhǎng)的壽命；（b)通過/E蛋白酶顯著裂解SNAP-25使SNARE復(fù)合物不穩(wěn)定，以及(c) 抑制來自感覺神經(jīng)元的疼痛肽的TRPV1介導(dǎo)的胞外分泌。這些新發(fā)現(xiàn)突出了展示協(xié)同復(fù)合 作用的這種專有工程化蛋白的抗傷害性潛力。其相對(duì)于第一代天然BoNT的優(yōu)點(diǎn)已決定性地 證明且因此應(yīng)帶來更多改進(jìn)的治療劑。
[0083]因?yàn)樘烊籅oNT僅具有一個(gè)蛋白酶結(jié)構(gòu)域，遞送額外LC的創(chuàng)新概念一其裂解在不同 位置處的相同底物(或另一種底物)一不僅顯著增強(qiáng)其抑制特性，而且原始LC/A的額外穩(wěn)定 化影響產(chǎn)生出人意料的協(xié)同作用，即相較于BoNT/E大大延長(zhǎng)的治療益處持續(xù)時(shí)間。
[0084] 在其他實(shí)例中，不同的多內(nèi)肽酶治療劑通過使用用于構(gòu)建LC/E-BoNT/A核酸的技 術(shù)構(gòu)建LC/B-BoNT/A核酸構(gòu)建體來舉例說明。在表達(dá)由LC/E-BoNT/A開放閱讀框編碼的多肽 且產(chǎn)生凝血酶位點(diǎn)的缺口之后，所得蛋白質(zhì)裂解SNAP-25和VAMP-2兩者。裂解參與突觸融合 三元復(fù)合物的兩種SNARE蛋白可導(dǎo)致更有效。
[0085] 根據(jù)本發(fā)明的一般概念，提供一種包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的組合物，所述梭 菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu) 域以及第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域，其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域各自具有 針對(duì)SNARE蛋白的選擇性蛋白水解活性且識(shí)別SNARE蛋白中的不同裂解位點(diǎn)。
[0086] 還考慮使用這種一般概念組合物的核酸和治療方法。此外，還考慮一種用于治療 慢性疼痛的包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的治療性組合物，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含 多肽，所述多肽包含:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域， 其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域各自具有針對(duì)SNARE蛋白的選擇性蛋 白水解活性且識(shí)別SNARE蛋白中的不同裂解位點(diǎn)。此外，還考慮包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物 的治療性組合物用于制造用以治療慢性疼痛的藥劑的用途，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包 含多肽，所述多肽包含:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu) 域，其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域各自具有針對(duì)SNARE蛋白的選擇 性蛋白水解活性且識(shí)別SNARE蛋白中的不同裂解位點(diǎn)。
[0087] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，提供一種包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的組合物，所 述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含：
[0088] a)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，
[0089] b)易位結(jié)構(gòu)域，以及
[0090] c)源自梭菌屬神經(jīng)毒素BoNT/A亞型的第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域，以及 [0091] d)源自梭菌屬神經(jīng)毒素BoNT/E亞型的第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。
[0092]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，提供一種編碼包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的 多肽的核酸，所述核酸包含從羧基端至氨基端依次編碼以下各項(xiàng)的單個(gè)開放閱讀框:結(jié)合 結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、源自梭菌屬神經(jīng)毒素BoNT/A亞型的第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及源自梭菌 屬神經(jīng)毒素BoNT/E亞型的第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。
[0093]根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，提供一種用于治療慢性疼痛的包含梭菌屬神經(jīng) 毒素衍生物的治療性組合物，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含:結(jié)合結(jié) 構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、源自梭菌屬神經(jīng)毒素BoNT/A亞型的第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及源自梭菌屬 神經(jīng)毒素BoNT/E亞型的第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。
[0094]根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，提供包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的治療性組合 物用于制造用以治療慢性疼痛的藥劑的用途，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含多肽，所述 多肽包含:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、源自梭菌屬神經(jīng)毒素BoNT/A亞型的第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域 以及源自梭菌屬神經(jīng)毒素BoNT/E亞型的第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。 實(shí)施例
[0095] 實(shí)施例1
[0096] 將具有針對(duì)在大腸桿菌中的增強(qiáng)表達(dá)優(yōu)化的其密碼子和編碼Lys殘基的三個(gè)額外 核苷酸(AAA)的合成BoNT/A基因克隆至真核表達(dá)載體pET29a( + )的Nde I和Sal I位點(diǎn)中以 產(chǎn)生 pET-29a-BoNT/A。
[0097] 然后將pET-29a_B〇NT/A進(jìn)一步修飾以便提供受控的特異性缺口和同時(shí)除去由 pET-29a克隆載體編碼的六組氨酸(His6(SEQIDN0 :15))標(biāo)簽的能力。將編碼凝血酶裂解 位點(diǎn)的核苷酸序列工程化至編碼毒素的HC/LC環(huán)的核酸區(qū)中。這在以下以核酸和氨基酸形 式分別作為SEQIDN0:1和SEQIDN0:2示出。
[0098] 修飾的BoNT/A環(huán)核苷酸序列（SEQ ID N0:1)及其編碼氨基酸序列（SEQ ID N0:2)
[0099]
[0100] 此外，另外的凝血酶位點(diǎn)被插入編碼所表達(dá)蛋白質(zhì)的HC/A與His6(SEQ ID N0:15) 區(qū)之間的區(qū)域。這在以下以核酸和氨基酸形式分別作為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4示出。
[0101] 融合至BoNT/A基因的3'端的核苷酸序列（SEQ ID N0:3)及其編碼氨基酸序列（SEQ ID NO:4)
[0102]
[0103] 以上提供的核苷酸序列從左至右分別包含以下區(qū)：
[0104] a)核苷酸1-3:編碼額外Lys的插入的AAA密碼子以提供任選的胰蛋白酶裂解位點(diǎn)， 以便除去C末端His6(SEQ ID N0:15);
[0105] b)單下劃線:Sal I限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)；
[0106] c)雙下劃線:Hind III限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)
[0107] d)粗體:凝血酶識(shí)別序列；
[0108] e)單下劃線:Pst I限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)；
[0109] f)雙下劃線:Xho I限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)；
[0110] g)核苷酸49-66:編碼His6(SEQ ID N0:15)標(biāo)簽的核苷酸區(qū)。對(duì)比氨基酸序列在相 應(yīng)核苷酸上方展示。箭頭指示凝血酶裂解位點(diǎn)，并且星號(hào)表示翻譯"終止"密碼子。
[0111] 包含上述BoNT/A開放閱讀框且包含SEQIDN0:l和SEQIDN0 :3的此核酸構(gòu)建體 被稱為 pET29a-BoNT/A-2T。
[0112] PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)是從編碼LC/E蛋白酶(殘基1-411)的合成核酸擴(kuò)增的，并且兩個(gè) 限制位點(diǎn)(Nde I和Eco RV)在擴(kuò)增期間分別并入在所述核酸擴(kuò)增子的5'端和3'端。然后將 此PCR擴(kuò)增子通過Nde I和Eco RV消化且克隆至也用Nde I和Eco RV消化的pET29a( + )載體 中。所得中間載體構(gòu)建體被稱為pET29a-LC/E。
[0113] 將BoNT/A-2T的上述完整"單鏈"開放閱讀框BoNT基因區(qū)使用pET29a-BoNT/A-2T作 為模板用一對(duì)引物(噬菌體T7末端反向引物和含有B 〇NT/A5'編碼序列上游的EcoRV限制序 列的正向引物)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將所得PCR擴(kuò)增子通過EcoRV和Xho I酶消化，純化且插入 Eco RV-和Xho I-裂解的pET29a-LC/E質(zhì)粒中。此最終構(gòu)建體被稱為pET29a-LC/E-BoNT/A， 并且開放核酸閱讀框被公開為SEQ ID NO: 5,而相應(yīng)氨基酸序列在本文公開為SEQ ID NO: 6〇
[0114] 實(shí)施例2
[0115] 為了表達(dá)LC/E-BoNT/A，將序列驗(yàn)證的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中， 并且使用Studier的自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)革E蛋白質(zhì)的表達(dá)（Studier，F(xiàn).W.，41Protein Expr.Purif. 207(2005))。用固定金屬(Co2+)親和色譜法（MAC)使用Talon超流樹脂實(shí)現(xiàn)細(xì) 菌溶解產(chǎn)物中的His6(SEQ ID N0:15)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的部分純化(約60%)。通過大于或等于 50mM咪唑洗脫Mr約200kDa的主要蛋白質(zhì)；這在圖2A中示出，其示出SDS-PAGE和凝膠的考馬 斯藍(lán)染色。凝膠泳道是如下:泳道1:在施加至MAC柱之前的澄清溶解產(chǎn)物;泳道2: IMAC柱流 過級(jí)分;泳道3: IMAC柱洗滌級(jí)分;泳道4-9，來自IMAC柱的使用咪唑洗脫的級(jí)分。
[0116] 將匯集的頂AC洗脫級(jí)分緩沖交換至0.02M磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中，且然后通過負(fù) 載至UN0-S1陽離子交換柱上進(jìn)一步純化，接著用達(dá)150mM NaCl洗滌，且然后用NaCl梯度洗 脫;將毒素用等于或大于220mM的NaCl濃度進(jìn)行洗脫。圖2B示出LC/E-BoNT/A單鏈多肽隨時(shí) 間變化的洗脫曲線(在280nm下的吸光度），其中NaCl梯度的傳導(dǎo)率增加疊加。箭頭示出含有 LC/E-BoNT/A的吸光度峰的位置。
[0117] 實(shí)施例3
[0118] 在將洗脫的完整毒素緩沖交換至25mMHEPES/145mMNaCl(pH7.4)中之后，將純 化的單鏈（"SC"）蛋白質(zhì)儲(chǔ)存在-80°c下，且取得等分試樣以用于SDS-PAGE分析。圖3示出純 化的多肽的還原(+ )和非還原(-)SDS-PAGE以及蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果，從而證實(shí)這種純化 的蛋白質(zhì)確實(shí)以SC形式表達(dá)，如通過以約200kDa的表觀分子量迀移的單一條帶所揭示。此 條帶在不存在或存在還原劑的情況下觀察到。參見例如圖3的考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠照片 的泳道SC(-)和SC( + )。
[0119] 通過與生物素化的凝血酶（1單位/mg蛋白質(zhì))在22°C下孵育3小時(shí)來嘗試這種SC多 肽的缺口；然后通過用鏈霉親和素瓊脂糖處理樣品來除去凝血酶蛋白酶。具有約l〇〇KDa表 觀分子量的條帶在還原條件下在SDS-PAGE凝膠上運(yùn)行的樣品中的蛋白質(zhì)的凝血酶處理之 后出現(xiàn);約200KDa條帶在這些條件下未觀察到，但存在于在非還原條件下運(yùn)行的凝膠中，而 約lOOKDa條帶在這些后者樣品中不存在。參見例如圖3的考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠照片的泳 道DC(-)和DC(+)。
[0120] 約lOOKDa條帶據(jù)信表示LC/E-LC/A和HC/A鏈，其具有類似大小。此條帶中的多肽的 身份通過使用針對(duì)假定單鏈多肽LC/E和BoNT/A中的每種特異性的抗體在缺口的和未缺口 的LC/E-BoNT/A上運(yùn)行的SDS-PAGE凝膠的蛋白質(zhì)印跡得以證實(shí)。
[0121] 如圖3中所示，在還原劑不存在下缺口的樣品基序以約200kDa迀移，從而指示LC/ E-LC/A與HC/A之間的鏈間二硫鍵形成，且在所有樣品中存留，如使用抗-LC/E或抗-BoNT/A 抗體在蛋白質(zhì)印跡標(biāo)記的（-)和顯影的泳道中所示。因此，在還原和非還原條件下的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡突出在無復(fù)合毒素的降解的情況下發(fā)生的環(huán)區(qū)域處的特異性缺口。未缺 口的和缺口的蛋白質(zhì)的迀移率的略微差異是由于凝血酶處理的樣品中His6(SEQ ID N0: 15)標(biāo)簽的除去;這使用針對(duì)此標(biāo)簽的特異性抗體得以證實(shí)。參見圖3的使用抗-His6(SEQ ID NO: 15)抗體的蛋白質(zhì)印跡，其中His6(SEQ ID NO: 15)標(biāo)簽不可檢測(cè)。此實(shí)驗(yàn)因此還證明 凝血酶蛋白酶可同時(shí)使HC與第一 LC之間的二硫鍵的連接的半胱氨酸殘基之間的毒素缺口， 且除去His6(SEQ ID N0:15)。
[0122] 實(shí)施例4
[0123] 將重組產(chǎn)生的LC/E-BoNT/A和BoNT/A各自以O(shè).OlpM至1000pM毒素的10倍連續(xù)稀釋 濃度與培養(yǎng)的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元(CGN)孵育過夜。將這些細(xì)胞從7-8天齡大鼠的小腦解離 并且以約1 X l〇6/ml懸浮于3份的基礎(chǔ)伊格爾培養(yǎng)基和1份的40mM HEPES-Na0H(pH7.3)、 78.4mM KCl、37.6mM D-葡萄糖、2.8mM CaCl2、1.6mM MgS〇4以及l(fā).OmM NaH2P〇4以及l(fā)x N2補(bǔ) 充物、ImM L-谷氨酰胺、60單位/ml青霉素、60μg/ml鏈霉素以及2 % (v/v)馬透析血清中。將 此細(xì)胞懸浮液的等分部分(lml)添加至16-mm-直徑聚-D-賴氨酸涂覆的孔(即24-格式）中的 每個(gè)，并且在5% (v/v)C〇2中培養(yǎng)20-24小時(shí)之后添加胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷水解酶 (40μΜ);通過每10天用相同新鮮制備的培養(yǎng)基置換來維持神經(jīng)元。在規(guī)定的情況下，將所述 神經(jīng)元暴露于培養(yǎng)基中的BoNT/A或LC/E-B 〇NT/A(滅菌的0.2-μπι過濾器)持續(xù)24小時(shí)。
[0124] 在與BoNT/A或LC/E-BoNT/A蛋白質(zhì)孵育24小時(shí)之后，然后收獲細(xì)胞且使用識(shí)別完 整SNAP-25的抗-SNAP-25抗體以及LC/A-裂解的SNAP-25和LC/E-裂解的SNAP-25使其經(jīng)受 SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。SNARE蛋白質(zhì)突觸融合蛋白1用作陽性內(nèi)部負(fù)載對(duì)照。
[0125] 使用抗-SNAP-25抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。如可在圖4中觀察到，在裂解完整SNAP-25 方面LC/E-BoNT/A幾乎與BoNT/A活性一樣，其中在每種情況下顯著裂解在高于ΙρΜ的毒素濃 度下發(fā)生。值得注意的，如可觀察到，當(dāng)使用低于約ΙρΜ的毒素時(shí)，用LC/E-BoNT/A處理CGN還 得到LC/A裂解產(chǎn)物。當(dāng)LC/E-BoNT/A毒素的濃度升高至約0 . OlnM以上時(shí)，此裂解產(chǎn)物 ("SNAP-25a"）似乎通過共同遞送LC/E蛋白酶基本上進(jìn)一步裂解成LC/E的裂解產(chǎn)物（"SNAP-25ε"）（圖4)。這些結(jié)果表明BoNT/A重鏈易位結(jié)構(gòu)域能夠?qū)⒐矁r(jià)連接的LC/A和LC/E蛋白酶遞 送至CGN的細(xì)胞溶質(zhì)，其中所述蛋白酶保持活性以裂解SNAP-25，從而使SNARE蛋白全部或部 分失活。
[0126] 實(shí)施例5
[0127] LC/E-BoNT/A的特異性神經(jīng)毒性通過以據(jù)此以引用的方式并入的Maisey，E.A.，等 人，177EUR.J.BI0CHEM. 683-691(1988)中描述的方式腹膜內(nèi)注射至小鼠中來測(cè)定。在4天內(nèi) 殺死50%小鼠的毒素的最低量被定義為一個(gè)最小致死劑量(mLD50)。毒素的特異性活性可 表示為mLD50單位的數(shù)目/mg毒素。
[0128] LC/E-BoNT/A制劑的mLD50據(jù)觀察為0.7xl08。這種特異性活性介于針對(duì)重組BoNT/ E所觀察到的特異性活性(0.4x10 s)與針對(duì)BoNT/A所觀察到的特異性活性(2xl08)之間。使用 例如據(jù)此以引用的方式并入的Aoki，K.R.，39T0XIC0N 1815-1820(2001)中描述的小鼠趾外 展評(píng)分(DAS)測(cè)定來評(píng)定體外神經(jīng)性麻痹作用的持續(xù)時(shí)間。
[0129] 將重組LC/E-BoNT/A以0.5mLD5Q單位的劑量注射至小鼠腓腸肌中，其是可施用至實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物而不產(chǎn)生全身癥狀的最大耐受劑量。此劑量的LC/E-B0NT/A引起持續(xù)約27天的麻痹； 類似于由6單位的天然BoNT/A誘導(dǎo)的作用；參見圖5。相較于BoNT/E，LC/E-BONT/A的長(zhǎng)效作 用似乎是由于融合蛋白中的LC/A部分穩(wěn)定化連接的LC/E部分的能力;單獨(dú)BoNT/E得到比其 他毒素更短的麻痹;參見圖5中BoNT/E對(duì)LC/E-BoNT/A的比較。
[0130] 實(shí)施例6
[0131] 使用三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(TGN)檢查L(zhǎng)C/E-BONT/A蛋白的抗傷害性潛力。這些細(xì) 胞是用于此實(shí)驗(yàn)的良好模型，這是由于由于其參與疼痛傳播和培養(yǎng)中的這些細(xì)胞提供用于 研究通過不同刺激物觸發(fā)的疼痛肽(CGRP，SP)的釋放的良好模型；參見例如，Bacccaglini 和Hogan,80PR0C NATL ACAD SCI U.S.A.594-598(1983)。從紅辣椒分離的辣椒素活化 TRPV1，其主要在感覺神經(jīng)元的C-纖維上表達(dá)。因此，復(fù)合毒素阻斷由其激動(dòng)劑辣椒素引發(fā) 的CGRP的釋放的能力應(yīng)是其抑制活性的良好指示。
[0132] BoNT/A僅從SNARE蛋白SNAP-25的C末端除去9個(gè)氨基酸殘基（7A-截短的" SNAP-25 裂解產(chǎn)物），并且不會(huì)影響由TGN中的辣椒素引發(fā)的CGRP胞外分泌。相比之下，通過LC/E蛋白 酶除去17個(gè)另外殘基(產(chǎn)生7E-截短的" SNAP-25裂解產(chǎn)物）阻斷這種辣椒素刺激的CGRP釋 放;參見例如據(jù)此以引用的方式并入的Meng等人，29J NEUR0SCI 4981-4992(2009)。
[0133] 因?yàn)殚L(zhǎng)效毒素LC/E-BoNT/A的主要SNAP-25裂解產(chǎn)物是"/E-截短的" SNAP-25裂解 產(chǎn)物，而不是CGN中的7A-截短的" SNAP-25裂解產(chǎn)物(殘基圖4)，所以預(yù)期LC/E-BoNT/A將阻 斷CGRP疼痛肽的釋放。
[0134] 簡(jiǎn)言之，在用腹膜內(nèi)注射D〇lethal(50mg/kg體重)深度麻醉之后從出生后第5天的 Wi s tar大鼠解剖TGN。將所述組織置于冰冷的L15培養(yǎng)基中，且然后在冰冷的無菌CMF-HBSS 中洗滌兩次，之后在170g下離心1分鐘。在將所述組織切成小片且通過預(yù)先涂覆有L15培養(yǎng) 基的10-ml Falcon移液管之后，將所述組織在振蕩下在37°C下在含有2.4U/ml分散酶II和 lmg/ml膠原酶I的不含鈣和鎂的Hanks平衡鹽溶液(CMF-HBSS)的1:1混合物中孵育30分鐘。 然后將懸浮液溫和研磨通過預(yù)先涂覆L15培養(yǎng)基的10-ml Falcon移液管直到渾濁，之后添 加lmg/ml DNA酶I持續(xù)15分鐘。
[0135] 在170g下離心5分鐘之后，將細(xì)胞沉淀懸浮且在培養(yǎng)基[含有10% (v/v)熱滅活的 胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素和 100μg/ml鏈霉素的Ham's F12溶液（Sigma-Aldrich， St .Louis，M0)]中洗滌三次。將細(xì)胞接種到補(bǔ)充有神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF) (50ng/ml)的F12培養(yǎng) 基中的預(yù)先涂覆有聚-L-賴氨酸(0. lmg/ml)和層粘連蛋白（20μg/ml)的24孔板上并且在37 °(：下維持在C02孵育箱中。在24小時(shí)之后(且其后的每天），用含有抗有絲分裂劑胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(10μΜ)的新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)上清液。
[0136] 在37°C下在用LC/E-BoNT/A的連續(xù)稀釋液過夜孵育大鼠 TGN之后，通過SDS-PAGE、 接著使用能夠結(jié)合完整以及A-截短的和E-截短的產(chǎn)物的抗-SNAP-25抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡 來監(jiān)測(cè)裂解程度。
[0137] 如圖6A中所示，LC/E-BoNT/A得到SNAP-25的劑量依賴性裂解，具有主要7E-截短 的" SNAP-25裂解產(chǎn)物。
[0138] 此外，如所預(yù)期，復(fù)合毒素以劑量依賴性方式通過由60mM KC1或辣椒素引發(fā)的TGN 阻斷CGRP的釋放（圖6B)。通過用HBS(用NaCl等滲平衡）中的60mM KC1處理刺激Ca2+-依賴性 CGRP釋放。為了用辣椒素刺激，分別在乙醇或二甲亞砜中制備儲(chǔ)備液（ImM)并且在BR-HBS中 稀釋至所需濃度。在所有情況下，將媒介物的最終濃度保持在〇. 1 % ;當(dāng)測(cè)量基礎(chǔ)流出時(shí)這 也包括于BR-HBS中。
[0139] 將細(xì)胞用K+或辣椒素刺激并且監(jiān)測(cè)CGRP的釋放持續(xù)30分鐘。為了測(cè)定所釋放的 CGRP的量，將0. lml的樣品添加至涂覆有針對(duì)CGRP的單克隆抗體的96孔板，并且按照試劑盒 的說明書進(jìn)行酶免疫測(cè)定。
[0140] 所述結(jié)果表明LC/E-BoNT/A多肽抑制從大致密核心囊泡釋放疼痛肽的能力，而用 BoNT/A類似處理細(xì)胞在活化TRPV1陽離子通道時(shí)未能抑制CGRP的釋放。參見圖6B。
[0141] 實(shí)施例7
[0142] 在持久性外周神經(jīng)性疼痛，即保留神經(jīng)損傷（SNI)測(cè)定的大鼠模型中評(píng)價(jià)LC/E-BoNT/A的抗傷害性活性。此模型是基于以下觀察結(jié)果:實(shí)質(zhì)上所有神經(jīng)性疼痛(除了由通過 截肢的完全損害引起的幻肢痛的特殊情況）由部分神經(jīng)損傷造成。這些神經(jīng)性疼痛包括糖 尿病性神經(jīng)病變、治療后神經(jīng)痛、中毒性神經(jīng)病、壓迫性神經(jīng)病和創(chuàng)傷，并且特征在于自發(fā) 刺痛、灼痛和休克樣疼痛以及痛覺過敏，包括觸覺異常痛敏、針刺痛覺過敏和痛覺過敏。
[0143] SNI手術(shù)在麻醉的成年大鼠（如Spague-Dawley大鼠）上進(jìn)行，并且涉及坐骨神經(jīng)的 末端遠(yuǎn)端分支中的兩個(gè)(脛骨和常見腓神經(jīng))的連接和橫斷，其流而下第三分支(腓腸神經(jīng)） 完整；參見以引用的方式并入本文的Decosterd，I ·&Woolf，C· J ·，87PAIN 580-587(2000)。 此模型具有技術(shù)上易于進(jìn)行且經(jīng)受所產(chǎn)生的損失程度的最小變化的優(yōu)點(diǎn)。
[0144] 將所述毒素注射至末端后肢的趾（掌）側(cè)。LC/E-BoNT/A和B〇NT/A(不影響運(yùn)動(dòng)功 能）的最大趾內(nèi)劑量據(jù)發(fā)現(xiàn)分別是75和15小鼠LD50單位/kg。相較于假對(duì)照小鼠（其經(jīng)受坐 骨神經(jīng)的暴露而無任何損傷），具有SNI的大鼠顯示長(zhǎng)效神經(jīng)性疼痛樣行為。
[0145] 神經(jīng)性疼痛的兩個(gè)模型是冷異常性疼痛和機(jī)械異常性疼痛。在第一測(cè)試中，冷超 敏性的那些，將手術(shù)的爪與在4°C下的冷板相接觸，并且在不同時(shí)間點(diǎn)記錄爪縮回持續(xù)時(shí) 間，如圖7A中所示。作為冷超敏性調(diào)節(jié)的測(cè)量，處理后值被表示為處理前值的百分比。
[0146] 如圖7A所示，在處理之后冷超敏性通過LC/E-BoNT/A有效降低持續(xù)2周（相較于鹽 水處理的P〈〇. 001)，特別是持續(xù)前10天。LC/E-BoNT/A的抗傷害性作用顯著大于由BoNT/A誘 導(dǎo)的抗傷害性作用(在注射后第5天和第7天P〈0.05)。無論給予毒素還是鹽水，在假對(duì)照中 未觀察到冷誘導(dǎo)的異常性疼痛。
[0147] 在第二測(cè)試中，通過將動(dòng)物置于升高的絲柵上且用一組von Frey毛發(fā)刺激處理的 爪的趾表面以測(cè)定在檢測(cè)到疼痛（由爪的敏銳縮回指示)之前能夠耐受的感覺刺激的量來 測(cè)量機(jī)械異常性疼痛。將Von Frey毛發(fā)(或單絲)校準(zhǔn)以提供大約實(shí)際力的對(duì)數(shù)尺度，以及 感知強(qiáng)度的線性尺度。機(jī)械閾值表示為引起爪縮回所需的平均最小克的力的50%。
[0148] 如在圖7B中所示，機(jī)械閾值通過神經(jīng)損傷顯著降低(將假對(duì)照與僅給予鹽水的SNI 大鼠相比較）。令人鼓舞地，LC/E-BoNT/A開始在注射之后2天內(nèi)逆轉(zhuǎn)這種機(jī)械超敏性，并且 在處理后7天觀察到鎮(zhèn)痛作用的最大值。在注射之后3至10天記錄比鹽水處理的大鼠顯著更 高的機(jī)械閾值(對(duì)比鹽水P〈〇. 〇〇 1)。此外，即使用BoNT/A處理誘導(dǎo)損傷后機(jī)械閾值的適度增 加，但LC/E-BoNT/A據(jù)發(fā)現(xiàn)顯著更有效(P〈0.05)。
[0149] 當(dāng)施用至假動(dòng)物時(shí)，毒素和鹽水均不影響通過冷和機(jī)械刺激觸發(fā)的疼痛行為（圖 7A、B) IC/E-BoNT/A證明在降低冷縮回持續(xù)時(shí)間方面比BoNT/A更有效（圖7A)并且尤其增加 機(jī)械縮回閾值（圖7B)。重要地，將LC/E-BoNT/A注射至對(duì)冷和機(jī)械刺激具有SNI標(biāo)準(zhǔn)化靈敏 度的大鼠中在第3天和第7天至類似于所有假對(duì)照的那些的值?？傊?，LC/E-BoNT/A誘導(dǎo)在慢 性神經(jīng)性疼痛的大鼠模型中誘導(dǎo)強(qiáng)效抗傷害性作用。
[0150] 實(shí)施例8
[0151] 以下提供的復(fù)合合成神經(jīng)毒素開放閱讀框LC/E-BoNT/A基因序列及其編碼氨基酸 (分別SEQ ID N0:5和6)分布包含以下區(qū)（相對(duì)于核苷酸氨基鑒定的）：殘基1-1233，LC/E;殘 基1240-5130，B〇NT/A。包含核苷酸（1234-1239)的DNA序列作為接頭引入且確保正確閱讀 框。對(duì)比氨基酸序列在相應(yīng)核苷酸上方展示。將凝血酶蛋白酶識(shí)別序列插入LC/A與HN/A之 間的環(huán)中；類似地，將另一個(gè)凝血酶位點(diǎn)工程化為具有BoNT/A基因的羧基位點(diǎn)的裂解序列； 這些允許同時(shí)缺口和C-末端His6(SEQIDN0 :15)的去除。
[0152] 復(fù)合神經(jīng)毒素基因（LC/E-BoNT/A)序列及其編碼氨基酸(SEQ ID N0:5和6)
[0153]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158] 本發(fā)明的此實(shí)施例解決了現(xiàn)有技術(shù)提出的至少兩個(gè)主要問題。首先，它提供長(zhǎng)效 BoNT嵌合體，其具有擴(kuò)大的抗傷害性治療潛力。第二，它提供對(duì)于慢性疼痛治療具有獨(dú)特潛 力的長(zhǎng)效BoNT來源的治療劑。
[0159]管理慢性疼痛對(duì)現(xiàn)代醫(yī)療保健提出主要挑戰(zhàn)，因?yàn)榛颊叽沓^20%的成人群 體。相當(dāng)大部分的群體對(duì)通常使用的止痛藥無反應(yīng)。另外，與處方鴉片制劑的揮霍相關(guān)的藥 物依賴和濫用的增加和在大多數(shù)情況下針對(duì)疼痛原始開處方的許多麻醉劑的短半衰期使 類鴉片制劑和非類固醇抗炎藥物的使用成為無吸引力的選擇。
[0160] BoNT/A復(fù)合物的治療性用途證明有益于一些而不是所有偏頭痛患者，這是由于假 定疼痛途徑的假定干擾。BoNT/A未能減弱由由疼痛肽或原位C-纖維的TRPV1活化引發(fā)的神 經(jīng)元方便并且不能阻斷來自培養(yǎng)的神經(jīng)元的CGRP釋放突出有必要開發(fā)長(zhǎng)效且更廣泛有效 的形式。
[0161] BoNT/A和BoNT/E的BoNT-衍生物嵌合體成功進(jìn)入TGN，并且得到/E-樣SNAP-25裂解 產(chǎn)物，其進(jìn)而抑制疼痛介體的釋放;然而，其短作用持續(xù)時(shí)間限制臨床應(yīng)用。
[0162] 本發(fā)明將不同血清型的至少兩種BoNT的結(jié)構(gòu)域組合在一起以產(chǎn)生新穎治療劑。這 種創(chuàng)新策略可用于產(chǎn)生其他嵌合多鏈治療劑，包括包含來自不同BoNT血清型的多個(gè)LC以產(chǎn) 生具有所需特性的治療劑的構(gòu)建體;例如多-SNARE-裂解毒素(裂解不同的SNARE蛋白質(zhì))治 療劑，其可例如通過將LC/C1連接至BoNT/A而不是LC/E來構(gòu)建。
[0163] 實(shí)施例9
[0164] 在另一個(gè)實(shí)施例中，以基本上類似于上述的方式通過用合成LC/B基因取代LC/E-BoNT/A核酸中的LC/E基因以產(chǎn)生編碼作為單一開放閱讀框的LC/B-BoNT/A的最終質(zhì)粒來產(chǎn) 生多內(nèi)肽酶構(gòu)建體。
[0165] 為了表達(dá)LC/B-BoNT/A，將序列驗(yàn)證的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中， 并且如先前針對(duì)LC/E-BoNT/A所描述表達(dá)所得蛋白質(zhì)。部分純化來自澄清的細(xì)菌溶解產(chǎn)物 的His 6-標(biāo)記的毒素使用頂AC親和分離步驟使用Talon超流樹脂實(shí)現(xiàn)。通過2 150mM咪唑洗 脫Mr約200k的主要蛋白質(zhì)；這在圖8B中示出，其示出在還原條件下的SDS-PAGE和凝膠的考 馬斯藍(lán)染色。凝膠泳道是如下:泳道1:在施加至IMAC柱之前的澄清溶解產(chǎn)物;2:頂AC柱流過 級(jí)分;3: IMAC柱洗滌級(jí)分;4-8，使用咪唑洗脫的級(jí)分。
[0166] 將匯集的IMAC洗脫液緩沖交換至25mM HEPES/145mM NaCl(pH7.4)中并且通過 SDS-PAGE分析等分部分。圖8C示出純化的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE，其中等分部分在還原(+ )和非 還原(_)下電泳。電泳證實(shí)蛋白質(zhì)確實(shí)以單鏈（"SC"）形式表達(dá)，如由異約200kDa的表觀分子 量迀移的主要條帶揭示。此條帶在不存在或存在還原劑的情況下觀察到。參見例如圖8C中 的考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠的泳道SC(-)和SC( + )。
[0167] 通過與生物素化的凝血酶（1單位/mg毒素)在22°C下孵育3小時(shí)來實(shí)現(xiàn)這種單鏈蛋 白質(zhì)的缺口（和His6標(biāo)簽的除去）；然后通過用固定在瓊脂糖上的鏈霉親和素處理樣品來除 去凝血酶蛋白酶。具有約100K表觀分子量的兩個(gè)條帶(未通過SDS-PAGE良好解析，這是由于 兩個(gè)蛋白質(zhì)鏈的迀移率的相似性)在于還原條件下在SDS-PAGE凝膠上運(yùn)行的樣品中蛋白質(zhì) 的凝血酶處理之后出現(xiàn)；約200K條帶未在這些條件下觀察到，但存在于在非還原條件下運(yùn) 行的凝膠中，而約lOOKDa條帶在這些后者樣品中不存在。參見例如圖8C中的考馬斯亮藍(lán)染 色的凝膠的泳道DC(-)和DC( + )。約100K條帶據(jù)信表示LC/B-LC/A和HC/A鏈，其具有大小的較 小差異。
[0168] 將大鼠培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元（CGN)與凝血酶處理的LC/B-BoNT/A以0.32pM至 5000pM的5倍連續(xù)稀釋濃度孵育。在37°C下在與LC/B-BoNT/A孵育24小時(shí)之后，然后守活細(xì) 胞且使其經(jīng)受SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡，使用a)識(shí)別完整SNAP-25用LC/A處理的大裂解產(chǎn)物 的抗-SNAP-25抗體和b)拾取完整型式的抗-VAMP2抗體?？雇挥|融合蛋白1抗體用于檢測(cè) SNARE蛋白突觸融合蛋白1，其用作陽性內(nèi)部負(fù)載對(duì)照。來自多個(gè)印跡的代表性蛋白質(zhì)印跡 (圖8D)和定量數(shù)據(jù)（圖8E)表明LC/B-BoNT/A裂解SNAP-25以及VAMP2;然而，VAMP2在較高濃 度的LC/B-BoNT/A下有效裂解。雖然不希望受理論約束，但這一結(jié)果可能起因于將降低VAMP 裂解的BoNT/A的LC[Fern;indez-Salas等人，Proc.Natt.Acad.Sci.USA.2004,101 (9) :3208-3213]。
[0169] 實(shí)施例10
[0170] 如由來自LC/E-BoNT/A(識(shí)別同一底物的兩個(gè)不同序列的兩種活性蛋白酶)和LC/ B-BoNT/A(裂解兩種不同底物的兩種蛋白酶)的陽性功能結(jié)果所說明，且鑒于本專利申請(qǐng)的 公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到本發(fā)明的另外實(shí)施例可涉及用于通過組合用于抑制 來自不同神經(jīng)類型（例如感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元）的疼痛肽、細(xì)胞因子和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放 的不同梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型來產(chǎn)生各種其他多內(nèi)肽酶治療劑的組合物 和方法。此外，多蛋白酶毒素的作用活性將間接阻斷細(xì)胞因子釋放細(xì)胞的這類介體的活性。
[0171] 例如，使所有三種SNARE蛋白質(zhì)失活的單一治療劑通過將BoNT/D的輕鏈(LC/D)經(jīng) 由接頭重組融合至BoNT/Cl的N末端來產(chǎn)生（殘基圖9)。簡(jiǎn)言之，將編碼LC/D內(nèi)肽酶的核酸 "框內(nèi)"插入LC/E-BoNT/A中以置換LC/E。編碼LC/D的合成基因被設(shè)計(jì)為具有針對(duì)在大腸桿 菌中最佳表達(dá)優(yōu)化的密碼子。所得質(zhì)粒編碼包含LC/D-BoNT/A的中間體蛋白質(zhì)。
[0172] 隨后，編碼BoNT/Cl的合成基因（像BoNT/A構(gòu)建體，在其環(huán)區(qū)域中具有凝血酶裂解 位點(diǎn)）用于置換LC/D-BoNT/A中的BoNT/A基因以產(chǎn)生包含LC/D-BoNT/Cl開放閱讀框的最終 核酸構(gòu)建體。所表達(dá)的純化的和缺口的LC/D-BoNT/Cl治療劑將具有通過用LC/D裂解使VAMP 1-3失活的能力；LC/C1蛋白酶將裂解突觸融合蛋白1-3和SNAP-25。這種構(gòu)建體將適合用于 治療慢性炎性和神經(jīng)性疼痛。
[0173] 實(shí)施例11
[0174] 60歲男性在左髖中具有嚴(yán)重慢性關(guān)節(jié)疼痛，并且行走困難。在檢查之后，患者被診 斷為患有髖白股(髖)關(guān)節(jié)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0175] 通過直接注射至股骨神經(jīng)節(jié)和坐骨神經(jīng)節(jié)中來向所述患者施用有效量的梭菌屬 神經(jīng)毒素衍生物L(fēng)C/E/BoNT/A。如上所述制備基因構(gòu)建體且在其表達(dá)之后使用His 6標(biāo)簽 (SEQ ID N0:15)親和純化梭菌屬毒素衍生物，接著凝血酶缺口且在使用之前離子交換色譜 法。
[0176] 在48小時(shí)內(nèi)，存在疼痛程度和劇烈的顯著改善，并且在一周內(nèi)患者能夠不費(fèi)力的 行走。
[0177] 實(shí)施例12
[0178] 用于人使用的足夠量的梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物L(fēng)C/E/BoNT/A的計(jì)劃最終需求使用 于表達(dá)和純化與在良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP符合的）設(shè)備中生產(chǎn)相容的LC/E-BoNT/A蛋白質(zhì)的生 產(chǎn)/純化平臺(tái)成為必要。LC/E-BoNT/A蛋白質(zhì)的按比例擴(kuò)大的生產(chǎn)和純化實(shí)質(zhì)上如上針對(duì)工 作臺(tái)規(guī)模實(shí)驗(yàn)所述進(jìn)行。此過程產(chǎn)生在SDS-PAGE中具有預(yù)期表觀分子量(約200kDa)的純活 化產(chǎn)物。在還原鏈間二硫鍵之后，HC鏈和LC/E-LC/A鏈在還原SDS PAGE凝膠上共迀移，各自 具有約lOOkDa的表觀分子量；用考馬斯亮藍(lán)染色揭示與圖3中所示的迀移圖案基本上相同 的迀移圖案。使用適于GMP符合生產(chǎn)的方法制造的LC/E-BoNT/A被稱為"PK"。
[0179] 用于裂解SNAP-25的GMP PK蛋白的活性及其在小鼠中的特異性神經(jīng)毒性匹配在工 作臺(tái)規(guī)模下產(chǎn)生的相同蛋白質(zhì)的活性和特異性神經(jīng)毒性。類似地，PK的抗傷害性潛力通過 其結(jié)合且進(jìn)入感覺神經(jīng)元的能力得以證明，從而主要產(chǎn)生LC/E-截短的SNAP-25且抑制去極 化或辣椒素刺激的CGRP釋放，如通過用PK材料重復(fù)實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)并且獲得與圖6A和6B中 所示的那些基本上相同的結(jié)果所示。
[0180] 最重要地，這種有前景的PK蛋白向在工作臺(tái)規(guī)模下產(chǎn)生的LC/E-BoNT/A蛋白還證 明體內(nèi)同等穩(wěn)健抗傷害。在慢性疼痛的保留神經(jīng)損傷(SNI)模型（參見例如實(shí)施例7和圖7A 和7B)將PK單次注射至大鼠的一個(gè)后爪中不會(huì)影響運(yùn)動(dòng)活性(如在旋轉(zhuǎn)棒上所定量)或誘導(dǎo) 任何可檢測(cè)的副作用，但在14天的延長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)減輕對(duì)假組的對(duì)照水平的機(jī)械超敏性。此 外，在SNI模型中升高水平的冷異常性疼痛也類似地減弱，如通過縮回持續(xù)時(shí)間的顯著減少 所示。將鹽水媒介物注射至假手術(shù)動(dòng)物不會(huì)改變?cè)诶鐖D7A和7B中測(cè)量的兩個(gè)傷害性參數(shù) 的基線水平。PK蛋白令人信服地減輕升高水平的疼痛。
[0181] 這些發(fā)現(xiàn)證明是從多組廣泛動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可再現(xiàn)的并且突出PK用于逆轉(zhuǎn)由于嚴(yán)重神 經(jīng)損傷所致的劇烈疼痛的體內(nèi)治療功效，并且揭示單獨(dú)BoNT/A用于治療疼痛、特別是慢性 疼痛的不適當(dāng)。
[0182] 實(shí)施例13
[0183] 這種新穎GMP-樣抗傷害性的高效率進(jìn)一步通過在涉及每日全身（I.P.)施用10mg/ Kg普瑞巴林的單次注射(75U/Kg)PK的SNI模型中評(píng)定來證明，普瑞巴林是在臨床上用作神 經(jīng)性疼痛的一線治療、還已知施加顯著不良反應(yīng)且在一定比例的患者中具有有限鎮(zhèn)痛作用 的鎮(zhèn)痛藥物。
[0184] 再次使用大鼠中慢性疼痛的保留神經(jīng)損傷(SNI)和冷異常性疼痛模型以及如在先 前段落中相同劑量的活性劑，單次足底注射PK產(chǎn)生比每日普瑞巴林的益處持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)得多 的益處持續(xù)時(shí)間，與PK相比，普瑞巴林不能顯著實(shí)現(xiàn)機(jī)械超敏性的逆轉(zhuǎn)（圖10A)并且誘導(dǎo)對(duì) 冷的升高反應(yīng)性的更適度減弱（圖10B) 1K的第二注射延長(zhǎng)其在機(jī)械敏感性（圖11)和冷異 常性疼痛(未圖示)方面的強(qiáng)效鎮(zhèn)痛作用，從而產(chǎn)生在初始治療之后持續(xù)超過25天的顯著高 于對(duì)照基線的疼痛緩解。
[0185] 本發(fā)明不限于本文所述的實(shí)施方案，而是可在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下修正 或修改。
[0186] 現(xiàn)將通過下文以權(quán)利要求格式提出的以下組的實(shí)施方案描述本發(fā)明。
[0187] 1)-種組合物，其包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含 多肽，所述多肽包含:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域， 其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域各自具有針對(duì)SNARE蛋白的選擇性蛋 白水解活性且識(shí)別SNARE蛋白中的不同裂解位點(diǎn)。
[0188] 2)如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域、所述第一 內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域包含在單一多肽鏈中。
[0189] 3)如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述多肽還包含選擇性內(nèi)肽酶裂解位點(diǎn)，所述 選擇性內(nèi)肽酶裂解位點(diǎn)位于包含所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述易位結(jié)構(gòu)域的第一區(qū)域與包含所 述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域的第二區(qū)域之間。
[0190] 4)如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域、所述第一 內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域包含在多于一個(gè)多肽鏈中。
[0191] 5)如權(quán)利要求4所述的組合物，其中至少兩個(gè)所述多肽鏈通過二硫鍵連接。
[0192] 6)如權(quán)利要求1所述的組合物，其包含第一多肽鏈，所述第一多肽鏈包含所述結(jié)合 結(jié)構(gòu)域和所述易位結(jié)構(gòu)域；以及第二多肽鏈，所述第二多肽鏈包含所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域 和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。
[0193] 7)如權(quán)利要求5所述的組合物，其包含第一多肽鏈，所述第一多肽鏈包含所述結(jié)合 結(jié)構(gòu)域和所述易位結(jié)構(gòu)域；以及第二多肽鏈，所述第二多肽鏈包含所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域 和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。
[0194] 8)如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述易位結(jié)構(gòu)域源自第一 梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型，并且其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽 酶結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)源自第二梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型。
[0195] 9)如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域以及所述第 一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)源自第一梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌 屬神經(jīng)毒素亞型。
[0196] 10)如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域和所述第 一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域源自第一梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型，并且所述第二內(nèi)肽酶結(jié) 構(gòu)域源自第二梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型。
[0197] 11)如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述第一梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒 素亞型是BoNT/A，并且所述第二梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型是BoNT/E。
[0198] 12)如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述第一梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒 素亞型是BoNT/A，并且所述第二梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型是BoNT/Cl。
[0199] 13)如權(quán)利要求11所述的組合物，其包含第一多肽鏈，所述第一多肽鏈包含所述結(jié) 合結(jié)構(gòu)域和所述易位結(jié)構(gòu)域；以及第二多肽鏈，所述第二多肽鏈包含所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu) 域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。
[0200] 14)如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈通過二 硫鍵連接。
[0201] 15)如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域、所述第 一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及所述第二多肽鏈全部包含在單一多肽鏈中。
[0202] 16)如權(quán)利要求11所述的組合物，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列包 含位于所述易位結(jié)構(gòu)域與所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域之間的第一蛋白酶裂解位點(diǎn)。
[0203] 17)如權(quán)利要求11所述的組合物，其還包含：
[0204] a)聚組氨酸氨基酸序列，其位于所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域的羧基端側(cè)上或所述第二內(nèi)肽酶 結(jié)構(gòu)域的氨基端處；
[0205] b)第一氨基酸序列，其包含位于所述易位結(jié)構(gòu)域與所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域之間的 第一蛋白酶裂解位點(diǎn)；以及
[0206] c)第二氨基酸序列，其包含位于所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域與所述聚組氨酸氨基酸序 列之間或所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述聚組氨酸氨基酸序列之間的第二蛋白酶裂解位點(diǎn)。
[0207] 18) -種編碼包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的多肽的核酸，所述核酸包含從羧基端 至氨基端依次編碼以下各項(xiàng)的單個(gè)開放閱讀框:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu) 域以及第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域，其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域各自具有 針對(duì)SNARE蛋白的選擇性蛋白水解活性且識(shí)別SNARE蛋白中的不同裂解位點(diǎn)。
[0208] 19)如權(quán)利要求18所述的核酸，其中編碼所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域、所述 第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域中的每個(gè)的密碼子針對(duì)在選自由以下各項(xiàng) 組成的組的細(xì)胞類型中表達(dá)而進(jìn)行優(yōu)化：細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞以及昆蟲細(xì) 胞。
[0209] 20)如權(quán)利要求19所述的核酸，其中所述密碼子針對(duì)在大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá) 而進(jìn)行優(yōu)化。
[0210] 21)如權(quán)利要求18所述的核酸，其中至少兩個(gè)選自由所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié) 構(gòu)域、所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域組成的組的結(jié)構(gòu)域由源自選自由 以下組成的組的不同梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型的核酸序列編碼:BoNT/A、 BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G 以及 TeTX。
[0211] 22)如權(quán)利要求21所述的核酸，其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié) 構(gòu)域由源自選自由以下組成的組的不同梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型的核酸序 列編碼：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G 以及 TeTX。
[0212] 23)如權(quán)利要求22所述的核酸，其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域由源自BoNT/A的核酸 序列編碼，并且所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域由源自BoNT/Cl的核酸序列編碼。
[0213] 24)如權(quán)利要求22所述的核酸，其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域由源自BoNT/A的核酸 序列編碼，并且所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域由源自BoNT/E的核酸序列編碼。
[0214] 25)如權(quán)利要求24所述的核酸，其中所述開放閱讀框編碼核苷酸序列(所述核苷酸 序列編碼內(nèi)肽酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域)與終止密碼子之間的至少六個(gè)組氨酸殘基。
[0215] 26)-種治療慢性疼痛的方法，所述方法包括施用包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的 治療性組合物，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié) 構(gòu)域、第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域，其中所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二 內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域各自具有針對(duì)SNARE蛋白的選擇性蛋白水解活性且識(shí)別SNARE蛋白中的不同 裂解位點(diǎn)。
[0216] 27)如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述慢性疼痛選自由以下組成的組:炎性傷害 性疼痛和神經(jīng)性疼痛。
[0217] 28)如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述慢性疼痛是神經(jīng)性疼痛。
[0218] 29)如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛選自由以下組成的組:癌癥疼 痛、術(shù)后疼痛、神經(jīng)性疼痛、異常性疼痛、皰疹后神經(jīng)痛、腸易激綜合癥以及其他內(nèi)臟痛、骨 痛、周圍神經(jīng)病變、循環(huán)系統(tǒng)附屬疼痛以及頭痛疼痛。
[0219] 30)如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述慢性疼痛是炎性傷害性疼痛。
[0220] 31)如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述慢性疼痛是關(guān)節(jié)炎疼痛。
[0221] 32)如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述治療性組合物的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述 易位結(jié)構(gòu)域源自第一梭菌屬神經(jīng)毒素或梭菌屬神經(jīng)毒素亞型，并且其中所述組合物的所述 第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)源自第二梭菌屬神經(jīng)毒素或梭 菌屬神經(jīng)毒素亞型。
[0222] 盡管已參考所公開的實(shí)施方案描述了本發(fā)明的各個(gè)方面，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將 顯而易見，所公開的特定實(shí)施例僅說明所述方面且決不限制本發(fā)明?？稍诓幻撾x本發(fā)明的 精神的情況下進(jìn)行各種修改。本文描述的每個(gè)和各個(gè)特征以及這類特征的每個(gè)和各個(gè)組合 包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，條件是包括在所述組合中的特征不是互相對(duì)立的。此外，本發(fā)明的 任何組合物或裝置應(yīng)理解為包括權(quán)利要求的一個(gè)或多個(gè)要素、基本上由權(quán)利要求的一個(gè)或 多個(gè)要素組成或由權(quán)利要求的一個(gè)或多個(gè)要素組成，并且此外未明確包括作為權(quán)利要求的 要素的每個(gè)和各個(gè)要素應(yīng)視為在本文具有明確排除對(duì)所述權(quán)利要求的負(fù)面限制的基礎(chǔ)。
[0223] 在本說明書中引用的任何和所有專利、公布、專利申請(qǐng)以及通過登錄號(hào)提及的核 苷酸和/或氨基酸序列據(jù)此以引用的方式作為本說明書的一部分整體并入。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的組合物，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含多肽， 所述多肽包含： a) 結(jié)合結(jié)構(gòu)域， b) 易位結(jié)構(gòu)域，以及 c) 源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/A亞型的第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域，以及 d) 源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/E亞型的第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域、所述第一內(nèi)肽 酶結(jié)構(gòu)域以及所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域包含在單一多肽鏈中。3. 如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述多肽還包含選擇性內(nèi)肽酶裂解位點(diǎn)，所述 選擇性內(nèi)肽酶裂解位點(diǎn)位于包含所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述易位結(jié)構(gòu)域的第一區(qū)域與包含所 述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域的第二區(qū)域之間。4. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域、所述第一內(nèi)肽 酶結(jié)構(gòu)域以及所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域包含在多于一個(gè)多肽鏈中。5. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其中至少兩個(gè)所述多肽鏈通過二硫鍵連接。6. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其包含第一多肽鏈，所述第一多肽鏈包含所述結(jié)合結(jié)構(gòu) 域和所述易位結(jié)構(gòu)域；以及第二多肽鏈，所述第二多肽鏈包含所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所 述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。7. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其包含第一多肽鏈，所述第一多肽鏈包含所述結(jié)合結(jié)構(gòu) 域和所述易位結(jié)構(gòu)域；以及第二多肽鏈，所述第二多肽鏈包含所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域和所 述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。8. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述易位結(jié)構(gòu)域源 自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/A。9. 如權(quán)利要求8所述的組合物，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列包含位于 所述易位結(jié)構(gòu)域與所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域之間的第一蛋白酶裂解位點(diǎn)。10. 如權(quán)利要求8所述的組合物，其還包含： a) 聚組氨酸氨基酸序列，其位于所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域的羧基端側(cè)上或所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu) 域的氨基端處； b) 第一氨基酸序列，其包含位于所述易位結(jié)構(gòu)域與所述第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域之間的第一 蛋白酶裂解位點(diǎn)；以及 c) 第二氨基酸序列，其包含位于所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域與所述聚組氨酸氨基酸序列之 間或所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述聚組氨酸氨基酸序列之間的第二蛋白酶裂解位點(diǎn)。11. 一種編碼包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的多肽的核酸，所述核酸包含從羧基端至氨 基端依次編碼以下各項(xiàng)的單個(gè)開放閱讀框:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/A亞型的第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/E亞型的第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu) 域。12. 如權(quán)利要求11所述的核酸，其中編碼所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域、所述第一 內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及所述第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域中的每個(gè)的密碼子針對(duì)在選自由以下各項(xiàng)組成 的組的細(xì)胞類型中表達(dá)而進(jìn)行優(yōu)化:細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞以及昆蟲細(xì)胞。13. 如權(quán)利要求12所述的核酸，其中所述密碼子針對(duì)在大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞中增強(qiáng)的表 達(dá)進(jìn)行選擇。14. 如權(quán)利要求11、12或13所述的核酸，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述易位結(jié)構(gòu)域由源自 梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/A亞型的核酸序列編碼。15. 如權(quán)利要求14所述的核酸，其中所述開放閱讀框編碼核苷酸序列(所述核苷酸序列 編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域)與終止密碼子之間的至少六個(gè)組氨酸殘基。16. -種治療慢性疼痛的方法，所述方法包括施用包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的治療 性組合物，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、 源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/A亞型的第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/E亞 型的第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述慢性疼痛選自由以下組成的組:炎性傷害性疼 痛和神經(jīng)性疼痛。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述慢性疼痛是神經(jīng)性疼痛。19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛選自由以下組成的組:癌癥疼痛、 術(shù)后疼痛、神經(jīng)性疼痛、異常性疼痛、皰疹后神經(jīng)痛、腸易激綜合癥以及其他內(nèi)臟痛、骨痛、 周圍神經(jīng)病變、循環(huán)系統(tǒng)附屬疼痛以及頭痛疼痛。20. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述慢性疼痛是炎性傷害性疼痛。21. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述慢性疼痛是關(guān)節(jié)炎疼痛。22. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述治療性組合物的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述易位 結(jié)構(gòu)域源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/A亞型。23. -種治療性組合物，其包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包 含多肽，所述多肽包含:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/A亞型的第一 內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/E亞型的第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域，所述治療性組合 物供治療慢性疼痛使用。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的供使用的治療性組合物，其中所述慢性疼痛選自由以下組 成的組:炎性傷害性疼痛和神經(jīng)性疼痛。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的供使用的治療性組合物，其中所述慢性疼痛是神經(jīng)性疼痛。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的供使用的治療性組合物，其中所述神經(jīng)性疼痛選自由以下 組成的組:癌癥疼痛、術(shù)后疼痛、神經(jīng)性疼痛、異常性疼痛、皰疹后神經(jīng)痛、腸易激綜合癥以 及其他內(nèi)臟痛、骨痛、周圍神經(jīng)病變、循環(huán)系統(tǒng)附屬疼痛以及頭痛疼痛。27. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的供使用的治療性組合物，其中所述慢性疼痛是炎性傷害性 疼痛。28. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的供使用的治療性組合物，其中所述慢性疼痛是關(guān)節(jié)炎疼痛。29. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的供治療的用途，其中所述治療性組合物的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域 和所述易位結(jié)構(gòu)域源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/A亞型。30. 包含梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物的治療性組合物在制造用于治療慢性疼痛的藥劑中的 用途，所述梭菌屬神經(jīng)毒素衍生物包含多肽，所述多肽包含:結(jié)合結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域、源自 梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/A亞型的第一內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域以及源自梭菌屬神經(jīng)毒素 BoNT/E亞型的 第二內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域。
【文檔編號(hào)】C07K14/33GK105916875SQ201480073447
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2014年12月19日
【發(fā)明人】J·O·多利, 王佳夫, 孟江慧
【申請(qǐng)人】都柏林城市大學(xué)