作為子宮頸癌和存活期的生物標(biāo)記物的角蛋白的制作方法
【專利摘要】本公開提供檢測(cè)和分析獲自試驗(yàn)受試者的樣品中的KRT4和KRT17表達(dá)的方法。本公開涉及鑒定患有子宮頸癌或子宮頸非癌性病變的哺乳動(dòng)物受試者的方法與試劑盒。本公開進(jìn)一步提供了通過測(cè)定樣品中的KRT17表達(dá)水平來確定患有子宮頸癌的受試者的存活期可能性或治療效果的方法與試劑盒。
【專利說明】
作為子宮頸癌和存活期的生物標(biāo)記物的角蛋白
[00011 本申請(qǐng)要求2013年8月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/863,671和2013年8月14日提 交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1 /865，750的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容經(jīng)此引用并入本文。
[0002] 關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明 本公開在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的基金號(hào)碼AI091175和CA140084的政府支持下進(jìn) 行。政府在本公開中具有某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及診斷子宮頸異常的方法，所述子宮頸異常表明在受試者中存在子宮頸 癌或存在癌前期病變。本公開進(jìn)一步提供了分析受試者體內(nèi)的角蛋白4和角蛋白17的蛋白 表達(dá)水平以確定在受試者體內(nèi)存在子宮頸癌或存在癌前期病變的方法。本公開進(jìn)一步涉及 分析受試者體內(nèi)的角蛋白17以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后和存活期的方法。
[0004] 發(fā)明背景 子宮頸癌是全球婦女死亡的第二主要原因，但是在大多數(shù)工業(yè)化國(guó)家是癌癥死亡率的 不太常見的原因，主要是因?yàn)樽訉m頸癌篩查細(xì)胞學(xué)（即"巴氏試驗(yàn)"）的成功。在美國(guó)，在2012 年報(bào)道了12,200例新診斷病例和4,200例癌癥死亡。參見Siegel R等人，CA:A Cancer Journal for Clinicians.2012;62:10-29。此外，三百萬宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本具有異常的細(xì)胞 學(xué)發(fā)現(xiàn)，需要通過陰道鏡進(jìn)一步評(píng)估。參見Schiffman Μ等人，JNCI. 2011; 103:368-83。盡管 高危型人乳頭瘤病毒(HPV)檢測(cè)廣泛用于提高子宮頸癌篩查的準(zhǔn)確性，陽性檢測(cè)結(jié)果對(duì)進(jìn) 行未明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)或低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)的細(xì)胞學(xué)診斷的 患者體內(nèi)潛在的高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)或鱗狀細(xì)胞癌具有不佳的特異性，因?yàn)榇蠖鄶?shù) HPV感染是短暫的，不太可能導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。參見Wright TCJ.J Fam Pract.2009;58:S3-7。 由于各種技術(shù)問題(例如染色的特異性)或?qū)е录訇幮曰蚣訇栃栽\斷的診斷挑戰(zhàn)(例如缺少 獨(dú)特的生物標(biāo)記物），HSIL的組織學(xué)分類也可能會(huì)有問題。雖然pl6 INK4a/Ki-67雙染色法和其 它生物標(biāo)記物可能提供客觀依據(jù)來支持HSIL和鱗狀細(xì)胞癌的組織學(xué)診斷，但大多數(shù)在高比 例的LSIL中表達(dá)。參見例如Samarawardana P等人,ΑρρΙ · Immunohistochem.Mol .Morphol. 2 011;19:514_8 ;Yamazaki T等人，Pathobio logy .2006;73:176-82;和 Masoudi Η 等人， Histopathology·2006;49:542-5。
[0005] 因此，仍然存在對(duì)以下的重要的臨床需要：（i)鑒定新的子宮頸癌生物標(biāo)記物，其 能夠在組織活檢中改善HSIL/鱗狀細(xì)胞癌相對(duì)正常/LSIL的檢測(cè)的特異性；（ii)集中資源治 療最有可能從陰道鏡和后續(xù)的治療干預(yù)中獲益的患者；（iii)以及避免過度治療可能僅具 有短暫HPV感染的患者。參見Narayan K· Int · J ·Gyneco 1 · Cancer · 2005; 15:573-82。此外，鱗 狀細(xì)胞癌患者中預(yù)后指標(biāo)的驗(yàn)證可以改善他們的臨床管理和治療效果。例如，在臨床實(shí)踐 中，大多數(shù)鱗狀細(xì)胞癌患者接受根治性子宮切除術(shù)，并且根據(jù)腫瘤分期還可能接受術(shù)后化 療和放療。但是，這些患者的治療效果明顯不同。參見例如Schwarz JK等人，JAMA.2007; 298:2289-95;和 Eifel PJ 等人，J · Cl in · Oncol · 2004; 22:872-80。
[0006] 鑒于上述缺點(diǎn)，本公開鑒定和驗(yàn)證了用于HSIL與鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)記物，其包 括，例如角蛋白4(KRT4)和角蛋白17(KRT17)，并進(jìn)一步表征KRT17為宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的 預(yù)后生物標(biāo)記物。
[0007] 發(fā)明概述 本公開表明，角蛋白4(KRT4)和角蛋白17(KRT17)是指示受試者體內(nèi)存在子宮頸癌或存 在癌前病變的用于診斷子宮頸癌和診斷子宮頸異常的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物。
[0008] 在本公開的一個(gè)方面，KRT4被驗(yàn)證為用于診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌和高度鱗狀上皮內(nèi) 病變(HSIL)的臨床生物標(biāo)記物。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與正常對(duì)照樣品、參比樣品和/或低 度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)相比時(shí)，在患有宮頸鱗狀細(xì)胞癌和HSIL的受試者體內(nèi)KRT4的表達(dá) 降低。
[0009] 在本公開的另一方面，KRT17被鑒定為用于診斷患有或可能患有宮頸鱗狀細(xì)胞癌 的受試者的臨床生物標(biāo)記物。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與正常對(duì)照樣品或參比樣品和/或低度 鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)相比時(shí)，在患有宮頸鱗狀細(xì)胞癌和HSIL的受試者體內(nèi)KRT17表達(dá)水 平顯著提高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在正常鱗狀粘膜或表征為具有LSIL的受試者中，KRT17 表達(dá)不存在或以可忽略水平測(cè)得，這表明在此類受試者體內(nèi)不存在宮頸鱗狀細(xì)胞癌或其癌 前病變。
[0010]綜上所述，本公開表明，KRT4表達(dá)的喪失或降低和/或KRT17表達(dá)的提高是子宮頸 癌進(jìn)展中的一個(gè)關(guān)鍵事件。在本發(fā)明的方法中結(jié)合這一發(fā)現(xiàn)以鑒定患有子宮頸癌或其癌前 病變的受試者。
[0011]在本公開的一個(gè)方面，相對(duì)于非癌性對(duì)照樣品或LSIL樣品，在鱗狀細(xì)胞癌樣品中 已經(jīng)觀察到KRT17表達(dá)水平的顯著提高，這已經(jīng)與存活期的降低的幾率和/或負(fù)面治療效果 相關(guān)聯(lián)。因此，在本公開的某些實(shí)施方案中，當(dāng)在獲自受試者的樣品中檢測(cè)到提高水平的 KRT17表達(dá)時(shí)，與不具有相對(duì)于正常鱗狀粘膜或?qū)φ諛悠稫RT17表達(dá)提高的診斷患有子宮頸 癌的受試者相比，該受試者可能具有存活期的降低的可能性和/或負(fù)面的治療效果。
[0012]附圖概述 圖1:基于質(zhì)譜法的生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)與基于免疫組織化學(xué)的生物標(biāo)記物驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)設(shè) 計(jì)。A.設(shè)計(jì)用于各診斷類別的組織微陣列。具體而言，正常:非癌性外宮頸鱗狀粘膜，LSIL: 低度鱗狀上皮內(nèi)病變，HSIL:高度鱗狀上皮內(nèi)病變，SCC:鱗狀細(xì)胞癌。B.基于基因本體分類 的由福爾馬林固定石蠟包埋的存檔宮頸組織鑒定的蛋白的亞細(xì)胞定位。顯示了各亞細(xì)胞類 別的蛋白百分比。
[0013] 圖2:鱗狀細(xì)胞癌中的角蛋白4表達(dá)檢測(cè)。A.在代表性病例中的角蛋白4 (KRT4)免疫 組織化學(xué)染色。正常：非癌性外宮頸鱗狀粘膜，LSIL:低度鱗狀上皮內(nèi)病變，HSIL:高度鱗狀 上皮內(nèi)病變，SCC:鱗狀細(xì)胞癌。比例尺條表示50微米。B.基于PathSQ免疫組織化學(xué)評(píng)分的各 診斷類別中的KRT4表達(dá)數(shù)據(jù)，所述評(píng)分基于具有強(qiáng)染色的陽性細(xì)胞的百分比(n =每個(gè)診斷 類另U25-27個(gè)病例）。平均值(粗虛線）和中值（實(shí)線）。*?>0.001，根據(jù)1(^181?11-如1118和 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。
[0014] 圖3:高度鱗狀上皮內(nèi)病變與鱗狀細(xì)胞癌中的角蛋白17檢測(cè)。正常:非癌性外宮頸 鱗狀粘膜，LSIL:低度鱗狀上皮內(nèi)病變，HSIL:高度鱗狀上皮內(nèi)病變，SCC:鱗狀細(xì)胞癌。A.在 來自各診斷類別的代表性病例中的角蛋白17 (KRT17)免疫組織化學(xué)染色。比例尺條表示50 微米。B.基于PathSQ免疫組織化學(xué)評(píng)分的各診斷類別中的KRT17表達(dá)數(shù)據(jù)，通過表現(xiàn)出強(qiáng)染 色的陽性細(xì)胞百分比測(cè)定（n =每個(gè)診斷類別25-27個(gè)病例）。平均值(粗虛線）和中值(實(shí) 線）。噸>0 · 05，根據(jù)Kruskal-Wallis和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。
[0015] 圖4:角蛋白17表達(dá)與非癌性病理的關(guān)聯(lián)。A.在獲自患有以下疾病的受試者的樣品 中未觀察到KRT17表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化:不成熟鱗狀上皮化生、成熟鱗狀上皮化生、炎癥 (宮頸炎）、傷口愈合（活檢部位改變）或單純皰疹病毒感染。平均值（粗虛線）和中值（實(shí) 線）。*?>0.001，根據(jù)Kruskal-Wal 1 is 3.在不成熟鱗狀上皮化生(左側(cè)）、成熟鱗狀上皮化生 (右偵U)和宮頸內(nèi)儲(chǔ)備細(xì)胞(底部）中檢測(cè)KRT17表達(dá)。十七例宮頸內(nèi)粘膜儲(chǔ)備細(xì)胞樣品中的 十二例對(duì)KRT17染色呈陽性。比例尺條表示20微米。C.角蛋白17表達(dá)與鱗狀細(xì)胞癌（SCC)中 高危型HPV類型之間的關(guān)聯(lián)。（左側(cè))鱗狀細(xì)胞癌病例(η = 25)中高危型HPV類型的百分比。樣 品的54%和28%分別對(duì)HPV16型或18型為陽性。四個(gè)樣品表現(xiàn)出雙重HPV感染，包括HPV16和 其它高危型HPV。一個(gè)病例具有單獨(dú)的HPV39。通過多重PCR和毛細(xì)管電泳進(jìn)行高危型HPV分 型。（右側(cè))鱗狀細(xì)胞癌(η = 25)中KRT17 PathSQ免疫組織化學(xué)定量的箱型圖。平均值(粗虛 線)和中值(實(shí)線）。根據(jù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)未檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p>0.05)。
[0016] 圖5 :具有高或低KRT17 (K17 )表達(dá)的診斷患有鱗狀細(xì)胞癌的患者總體存活的 Kaplan-Meier曲線。A.顯示了具有高KRT17vs低KRT17 ImageJ得分的65例鱗狀細(xì)胞癌病例 的結(jié)果，表明了當(dāng)患者表現(xiàn)出低KRT17表達(dá)時(shí)患者存活期超出5年（60個(gè)月）和10年（120個(gè) 月）的更高可能性。B.顯示了具有高KRT17VS低KRT17 PathSQ得分的65例鱗狀細(xì)胞癌病例的 結(jié)果，，披露了當(dāng)患者表現(xiàn)出低KRT17表達(dá)時(shí)患者存活期超出5年(60個(gè)月）和10年（120個(gè)月） 的更高可能性。C.在具有低(左側(cè))或高(右側(cè))KRT17表達(dá)的代表性鱗狀細(xì)胞癌病例中KRT17 的免疫組織化學(xué)染色。在20X放大倍數(shù)下攝取圖像。比例尺條表示100微米。
[0017] 圖6:角蛋白17表達(dá)與癌癥分期、分級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)和原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性組織部位的 相關(guān)性。鱗狀細(xì)胞癌(η = 65)中KRT17 PathSQ免疫組織化學(xué)定量的箱型圖。A.評(píng)估不同分期 的癌癥中的KRT17表達(dá)。T1:局限于子宮的宮頸癌，T2:腫瘤侵犯超出子宮，但尚未到達(dá)骨盆 壁或到達(dá)陰道的下三分之一(n = 4)，T3:腫瘤擴(kuò)展至骨盆壁和/或涉及陰道的下三分之一 和/或造成腎盂積水或無功能腎(nilShAJCC分期（16)』.評(píng)估不同組織學(xué)分級(jí)的癌癥中 的KRT17表達(dá)。G1:高分化(低分級(jí)）；G2:中度分化;G3:低分化。C.評(píng)估具有不同淋巴結(jié)狀態(tài) 的癌癥中的KRT17表達(dá)。N0:淋巴結(jié)陰性;N1:區(qū)域(骨盆)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。九個(gè)病例未進(jìn)行評(píng)估。 D.評(píng)估來自相同受試者的匹配的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中的KRT17表達(dá)。平均值(粗虛線）和 中值(實(shí)線）。根據(jù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)未檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p>0.05)。
[0018] 圖7:KRT17作為子宮頸癌中患者結(jié)果的預(yù)后指標(biāo)驗(yàn)證，與腫瘤分期無關(guān)。A.具有低 和高K17表達(dá)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中角蛋白17(K17)的代表性蘇木精與伊紅(H&E)和免疫組織 化學(xué)（IHC)染色。兩種代表性樣品為相同分期和腫瘤分級(jí)。比例尺條，100微米。Β-Ε.通過 PathSQ法對(duì)高和低Κ17樣品（Β)的IHC評(píng)分，來自切割的福爾馬林固定石蠟包埋鱗狀細(xì)胞癌 的角蛋白17(KRT 17)mRNA水平的相對(duì)表達(dá)(C)，根據(jù)腫瘤分期，通過PathSQ法的IHC得分(D); T1+T2:癌癥被限制在子宮頸，而T3+T4表示擴(kuò)展超出子宮頸的癌癥。E.根據(jù)腫瘤分級(jí)，通過 PathSQ法的IHC得分(D)。等級(jí)G1是高分化腫瘤;G2:中度分化;并且G3表示低分化腫瘤。箱型 圖中的水平虛線表示平均值，而實(shí)線表示中值。框符代表四分位數(shù)間距，須形線代表第2.5 和第97.5百分位數(shù)。黑色圓圈代表來自Mann-Whitney U檢驗(yàn)的離群樣品。#*p〈0.001。F-H. 描述通過原發(fā)性腫瘤中K17 IHC狀態(tài)分層的子宮頸癌患者(鱗狀細(xì)胞癌)總體存活可能性的 Kaplan-Meier曲線，低（彡50 PathSQ得分）或高（彡50 PathSQ得分)K17。所有病例(F)并在 分期T1+T2中：癌癥被限制在子宮頸(G)，而T3+T4表示擴(kuò)展超出子宮頸的癌癥(H)。采用時(shí)序 檢驗(yàn)計(jì)算P值。I.使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型通過K17狀態(tài)分層的子宮頸癌患者失敗的風(fēng)險(xiǎn)。J.子 宮頸癌細(xì)胞系（例如8丨他、0&81^、(：-334、!11'-3、]\^-180和他1^)中1(17的相對(duì)內(nèi)源性表達(dá)。
[0019] 圖8:角蛋白17下調(diào)（knockdown)誘發(fā)細(xì)胞周期停滯和降低的細(xì)胞尺寸。A.在通過 比色法與分析技術(shù)測(cè)定用陰形對(duì)照物siRNA或抗KRT17的siRNA轉(zhuǎn)染后SiHa和CaSki細(xì)胞的 細(xì)胞增殖。與使用陰性對(duì)照物siRNA或shRNA的KRT17表達(dá)相比，在具有通過siRNA(B)或 shRNA(E)下調(diào)的KRT17的SiHa和CaSki細(xì)胞中的G1期細(xì)胞群。C-D.與陰性對(duì)照物siRNA相比， 在具有通過抗KRT17的siRNA下調(diào)的KRT17的SiHa和CaSki細(xì)胞中的有絲分裂后G1A細(xì)胞群 (C)和KRT17 RNA定量(D)。F.與陰性對(duì)照物shRNA相比，在具有通過shRNA下調(diào)的KRT17的 SiHa與CaSki細(xì)胞中通過流式細(xì)胞儀分析經(jīng)前向散射(FSC)測(cè)定的細(xì)胞尺寸測(cè)量結(jié)果。G.與 陰性對(duì)照物shRNA相比，在具有通過shRNA下調(diào)的KRT17的SiHa和CaSki細(xì)胞中與衰老相關(guān)的 半乳糖苷酶的定量。H.在用人KRT17轉(zhuǎn)染后在C-33A細(xì)胞（即缺乏內(nèi)源性KRT17的細(xì)胞）中 的G1期細(xì)胞群。
[0020] 圖9:角蛋白17下調(diào)與細(xì)胞核ρ27ΚΙΡ1積累相關(guān)。A-C.用陰性對(duì)照物siRNA或抗KRT17 的siRNA轉(zhuǎn)染的SiHa和CaSki細(xì)胞中的p27 KIP1、phosph〇-pRb、pl30和細(xì)胞周期蛋白A(cyclin A)的代表性蛋白印跡(A)和相對(duì)表達(dá)定量（B-C)。D.在用陰性對(duì)照物siRNA或抗KRT 17的 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中在免疫熒光染色后細(xì)胞核p27KIP1陽性細(xì)胞的定量。E-F.在獲自用陰性 對(duì)照物shRNA或抗KRT17的shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SiHa與CaSki細(xì)胞的胞質(zhì)（頂部）和細(xì)胞核（底 部)細(xì)胞組分中p27 KIP1的代表性蛋白印跡(E)和相對(duì)表達(dá)定量(FhG.在用陰性對(duì)照物shRNA 或抗1(1?1'17的8111?祖轉(zhuǎn)染的8；[]^和0&31<:;[細(xì)胞中使用口1108口110-]^81:〇116!13(361'10)抗體(卩-p27 KIP1SerlO)的phosph〇-p27KIP1和CDK2的代表性蛋白印跡檢測(cè)。H.在用陰性對(duì)照物shRNA或 抗KRT 17的shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中p27KIP1 (CDKN1B)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。I.用陰性對(duì)照物 shRNA或抗KRT17的shRNA轉(zhuǎn)染的SiHa和CaSki細(xì)胞通過RT-定量PCR(RT-qPCR)獲得的細(xì)胞周 期蛋白依賴性激酶抑制劑的相對(duì)基因表達(dá)。J.在用陰性對(duì)照物shRNA或抗KRT17的shRNA轉(zhuǎn) 染的CaSki細(xì)胞中的p21 eipl/WAF1和p53表達(dá)的代表性蛋白印跡檢測(cè)。定量數(shù)據(jù)表示為平均值 土標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過T檢驗(yàn)法或Mann-Whitney U進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*p〈0·05，**p〈0·01和***p〈 0.001ο
[0021] 表1:病例的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)與臨床特征。a低度鱗狀上皮內(nèi)病變，b高度鱗狀上皮內(nèi)病 變，c鱗狀細(xì)胞癌，和d按照AJCC癌癥分期手冊(cè)和Annals of surgical oncology 17(6)， 1471-1474的腫瘤臨床分期。
[0022] 表2:角蛋白4和17受試者工作曲線分析和根據(jù)PathSQ評(píng)分的不同診斷類別之間的 錯(cuò)誤分類比率結(jié)果。a曲線下面積，b置信區(qū)間，c陽性預(yù)測(cè)值，d陰性預(yù)測(cè)值，e鱗狀細(xì)胞癌，f 高度鱗狀上皮內(nèi)病變，g低度鱗狀上皮內(nèi)病變。
[0023] 發(fā)明詳述 迄今為止，宮頸高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)的診斷標(biāo)記物(例如免 疫組織化學(xué)標(biāo)記物)略微提高了診斷準(zhǔn)確性，并且沒有預(yù)后價(jià)值。相反，本公開鑒定、表征和 驗(yàn)證了兩種新型生物標(biāo)記物，即KRT4和KRT17，其提高了對(duì)宮頸HSIL和鱗狀細(xì)胞癌的診斷和 預(yù)后準(zhǔn)確性。
[0024]診斷方法 本公開的一個(gè)方面描述了使用角蛋白4(KRT4)和/或角蛋白17(KRT17或K17)作為宮頸 高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)的生物標(biāo)記物的方法。在本文中，由獲自各 診斷類別（即非癌性外宮頸鱗狀粘膜、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、HSIL和SCC)的福爾馬林 固定石蠟包埋樣品的顯微切割組織切片鑒定KRT4和KRT17,并通過基于質(zhì)譜的鳥槍法蛋白 質(zhì)組學(xué)進(jìn)行評(píng)估。所述數(shù)據(jù)顯示，KRT4和KRT17表現(xiàn)出跨越SCC診斷類別的在表達(dá)方面的至 少兩倍的差異，并具有指示疾病進(jìn)展的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。因此，本公開表明，可以測(cè)量KRT4和/ 或KRT17表達(dá)作為非癌性鱗狀粘膜向SCC的進(jìn)展的指標(biāo)。例如，KRT17表達(dá)由正常組織向 LSIL、LSIL向HSIL和HSIL向鱗狀細(xì)胞癌逐漸提高。在另一實(shí)例中，在由正常組織向鱗狀細(xì)胞 癌的進(jìn)程中，KRT4表達(dá)降低。
[0025]鑒于上述情況，選擇KRT4和KRT17以便通過組織微陣列的免疫組織化學(xué)分析供進(jìn) 一步驗(yàn)證作為診斷性生物標(biāo)記物。這些免疫組織化學(xué)研究清楚地表明，與正常外宮頸鱗狀 粘膜和LSIL相比，KRT17表達(dá)在HSIL和鱗狀細(xì)胞癌中顯著提高。類似地，本文中提供的免疫 組織化學(xué)研究證實(shí)，與其它診斷類別（即非癌性外宮頸鱗狀粘膜、低度鱗狀上皮內(nèi)病變 (LSIL)、HSIL)相比，KRT4表達(dá)在鱗狀細(xì)胞癌中顯著降低。
[0026]本公開的一個(gè)實(shí)施方案提供了診斷患有鱗狀細(xì)胞癌的受試者的方法，其包括獲得 來自受試者的樣品，并檢測(cè)樣品中KRT17表達(dá)的水平。由此在該樣品中提高的KRT17表達(dá)水 平鑒定該受試者為患有宮頸鱗狀細(xì)胞癌。
[0027]在本公開的又一實(shí)施方案中，測(cè)量KRT4表達(dá)作為非癌性鱗狀粘膜向SCC進(jìn)展的指 標(biāo)。因此，本公開的一個(gè)實(shí)施方案提供用于診斷患有鱗狀細(xì)胞癌的受試者的方法，其包括獲 得來自受試者的樣品，并檢測(cè)樣品中KRT4表達(dá)的水平。由此在該樣品中降低的KRT17表達(dá)水 平鑒定該受試者為患有宮頸鱗狀細(xì)胞癌。
[0028]在某些實(shí)施方案中，生物樣品獲自相關(guān)受試者。按照本方法可以使用的生物樣品 可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種手段來收集。用于本方法的樣品收集技術(shù)的非限 制性實(shí)例包括:細(xì)針抽吸、手術(shù)切除、內(nèi)窺鏡活檢、切除活檢、切開式活檢、細(xì)針活檢、打孔活 檢、刮取活檢和皮膚活檢。此外，可以由癌癥或腫瘤組織或由其它體液樣品如全血(或其血 漿或血清組分)或淋巴組織來檢測(cè)KRT4和/或KRT17表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，獲自受試 者的樣品直接使用，而不進(jìn)行任何初步處理或加工，如福爾馬林固定、閃凍、或石蠟包埋。在 一個(gè)特定實(shí)施方案中，生物樣品可以獲自受試者并通過福爾馬林處理并將福爾馬林固定的 樣品包埋在石蠟中來進(jìn)行處理。在某些實(shí)施方案中，樣品在使用前可以儲(chǔ)存。
[0029]在獲得合適的生物樣品后，樣品中KRT4和/或KRT 17表達(dá)的水平可以使用本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員已知的各種技術(shù)來測(cè)定。在本公開的某些實(shí)施方案中，KRT17表達(dá)水平可以通過 選自以下的方法來測(cè)量:免疫組織化學(xué)法（IHC)、q-RT-PCR、Northern印跡法、蛋白印跡法、 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、微陣列分析或RT-PCR。
[0030] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，對(duì)福爾馬林固定、石蠟包埋樣品進(jìn)行KRT4和/或KRT17的 免疫組織化學(xué)分析。這里，來自蘇木精和伊紅染色的組織切片的正常宮頸粘膜、LSIUHSIL 和鱗狀細(xì)胞癌通過激光捕獲顯微鏡切割，收集來自各診斷類別（即非癌性外宮頸鱗狀粘膜、 LSIL、HSIL和SCC)的細(xì)胞。福爾馬林固定、石蠟包埋的組織隨后在含有蛋白酶混合物 (protease cocktails)的50mM碳酸氫銨中孵育以促進(jìn)蛋白交聯(lián)的逆向過程。該樣品隨后可 以通過在脲中的均質(zhì)化來進(jìn)一步處理。該蛋白濃度隨后可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知 的任何合適的方法來測(cè)定。
[0031] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，經(jīng)由組織微陣列進(jìn)行KRT4和/或KRT17蛋白檢測(cè)。例如，含 有正常宮頸粘膜、LSIL、HSIL或鱗狀細(xì)胞癌的組織可以獲自石蠟塊并置入組織微陣列塊。在 某些實(shí)施方案中，組織樣品的其它來源可以用作對(duì)照樣品，包括但不限于商業(yè)組織微陣列 樣品，如獲自HISTO-Array?的那些。用于本方法的組織微陣列切片隨后可以處理，即在二甲 苯中脫石蠟和用醇再水化。
[0032] 在某些實(shí)施方案中，樣品通過以下方法進(jìn)一步處理:用檸檬酸鹽緩沖液孵育，施加 過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，或通過用血清處理該樣品以阻斷非特異性結(jié)合(例如 牛、人、驢或馬血清）。該樣品用抗KRT4和/或KRT17的初級(jí)抗體進(jìn)一步孵育?？梢允褂每筀RT4 或KRT17抗原的任何抗體，包括但不限于小鼠單克隆-[E3 ]抗人KRT17抗體、小鼠單克隆-[6B10]抗人KRT4抗體、抗人KRT4或KRT17的多克隆抗體，抗哺乳動(dòng)物KRT4或KRT17蛋白結(jié)構(gòu) 域或其表位的單克隆抗體或多克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，在用初級(jí)抗體孵育后，通過使 用生物素化次級(jí)抗體通過間接抗生物素蛋白-生物素基免疫過氧化物酶法處理該樣品，顯 影，并用蘇木精復(fù)染。切片可以隨后用于分析KRT4和/或KRT17表達(dá)。
[0033]在某些實(shí)施方案中，通過PathSQ法（一種人工半定量評(píng)分系統(tǒng)）定量角蛋白表達(dá)， 該方法定量不知曉相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)的強(qiáng)染色細(xì)胞的百分比。在又一實(shí)施方案中，切片可以通 過使用DAB-蘇木精（DAB-H)顏色去卷積插件的National Institutes of Health ImageJ 1.46--基于Java的圖像處理軟件（參見Schneider CA等人，Nat methods · (2012)9:671- 5)和/或通過人工半定量評(píng)分系統(tǒng)（其定量不知曉相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)的強(qiáng)陽性染色細(xì)胞的百分 比（PathSQ))來評(píng)分。
[0034] 在又一實(shí)施方案中，可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)或定量RT-PCR來測(cè)定KRT4和/ 或KRT17表達(dá)。更具體而言，可以通過使用Trizol試劑從樣品中提取全部RNA。隨后可以使用 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR。例如，可以使用1微克RNA作為cDNA合 成的模板，隨后cDNA模板可以與KRT 17或KRT4的基因特異性引物（即正向5 ' -3 '引物序列和 反向3 ' -5 '序列）混合。還可以加入用于檢測(cè)的探針序列（例如Taqman或SYBR Green)。隨后 可以對(duì)各樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，獲得的數(shù)據(jù)可以歸一化至對(duì)照物或正常樣品中所示KRT4 或KRT17表達(dá)水平的對(duì)照水平。參見例如Schmittgen和Livak，Nature protocols(2008)3: 1101-1108〇
[0035]在本公開的一個(gè)實(shí)施方案中，將樣品中KRT4和/或KRT17的量與正常細(xì)胞或非癌性 細(xì)胞中存在的KRT4和/或KRT17的標(biāo)準(zhǔn)量相比，或與對(duì)照樣品中KRT4和/或KRT17的量相比。 可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行該比較。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，指示患有 SCC的受試者的KRT17表達(dá)量包括但不限于與對(duì)照樣品相比提高5-10%、10-20%，或與對(duì)照 樣品相比提高至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200% 或更高，或 相對(duì)于對(duì)照樣品表現(xiàn)出的KRT 17表達(dá)量提高至少0.25倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5 倍、10倍、11倍或更高。在某些特定實(shí)施方案中，符合鱗狀細(xì)胞癌的角蛋白17表達(dá)值通過樣 品中的8%，或5%至10%的細(xì)胞中的KRT17染色例示。
[0036]在又一實(shí)施方案中，指示患有SCC的受試者的KRT4表達(dá)量包括但不限于與對(duì)照樣 品相比表達(dá)降低5-10 %、10-20 %，或與對(duì)照樣品相比時(shí)KRT4表達(dá)降低至少20 %、30 %、 40 %、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更多，或相對(duì)于對(duì)照樣品表現(xiàn)出的KRT4 表達(dá)量降低至少〇. 25倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、11倍或更多。在某些實(shí) 施方案中，指示鱗狀細(xì)胞癌的角蛋白4表達(dá)水平通過樣品中存在的<6%或1%至7%的細(xì)胞 中存在KRT4染色例示。
[0037]預(yù)后方法 鑒于角蛋白17作為鱗狀細(xì)胞癌和/或SCC疾病進(jìn)展的生物標(biāo)記物的效用，進(jìn)一步表征了 KRT17的作用。本公開顯示，在幾種人子宮頸癌細(xì)胞系（即SiHa、CaSki、C-33A、HT-3、ME-180 和HeLa)中的細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)與KRT17表達(dá)極為相關(guān)。參見圖8。更具體而言，本公開的圖8A 提供了人子宮頸癌細(xì)胞系(例如SiHa、CaSki)中KRT17的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加，如與其中 通過RNA干擾抑制KRT17表達(dá)的細(xì)胞樣品相比在其中表達(dá)KRT17的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞數(shù)量 顯著增加所證明的那樣。此外，圖8B-E顯示，KRT17的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，而在人子宮頸 癌細(xì)胞系中KRT17的下調(diào)(knockdown)在G1期誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。
[0038]鑒于上述情況，在細(xì)胞表達(dá)KRT17方面分析細(xì)胞生長(zhǎng)，并與人子宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行 比較，由此通過針對(duì)KRT17的短發(fā)夾RNA來抑制KRT17表達(dá)。參見圖8F。細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)據(jù)清楚地 表明，表達(dá)KRT 17的細(xì)胞明顯比未表達(dá)KRT 17或表達(dá)正常水平的KRT 17的細(xì)胞更大。本文中提 供的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，角蛋白17表達(dá)與核p27Kipl (-種蛋白質(zhì)，當(dāng)在細(xì)胞核中存在時(shí)抑制 CDK2,這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯）的減少相關(guān)。參見圖9。綜上所述，本公開第一次顯示KRT17在 子宮頸癌進(jìn)展中的新的作用，由此使得本公開的發(fā)明人闡明KRT17在確定治療效果和患者 存活方面的作用。
[0039]本公開進(jìn)一步提供了 KRT17表達(dá)水平與患有鱗狀細(xì)胞癌的受試者的不良存活期相 關(guān)。更具體而言，本文中提供的數(shù)據(jù)表明，與未表現(xiàn)出KRT17表達(dá)提高的診斷患有子宮頸癌 的受試者相比，在診斷患有鱗狀細(xì)胞癌的受試者體內(nèi)提高的KRT17表達(dá)指示受試者將具有 存活期的降低的可能性和/或負(fù)面的治療效果。參見例如圖5-7。
[0040] 鑒于上述情況，本公開的一個(gè)方面提供了確定患有子宮頸癌的受試者存活期的可 能性的方法，其包括獲得來自受試者的樣品，并檢測(cè)樣品中KRT17表達(dá)的水平；以及任選地， 通過將KRT17表達(dá)水平與獲自其它受試者和/或?qū)φ諛悠返陌┬詷悠分械腒RT17表達(dá)水平進(jìn) 行比較來進(jìn)一步評(píng)估獲得的樣品中的KRT17表達(dá)水平。
[0041] 在某些實(shí)施方案中，生物樣品獲自相關(guān)受試者，即診斷為HSIL或SCC的受試者或患 者。按照本方法可以使用的生物樣品可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種手段來收 集。樣品收集技術(shù)的非限制性實(shí)例包括:細(xì)針抽吸、手術(shù)切除、內(nèi)窺鏡活檢、切除活檢、切開 式活檢、細(xì)針活檢、打孔活檢、刮取活檢和皮膚活檢。此外，可以由癌癥或腫瘤組織或由其它 體液樣品如全血(或其血漿或血清組分)或淋巴組織來檢測(cè)KRT17表達(dá)。在某些實(shí)施方案中， 獲自受試者的樣品直接使用，而不進(jìn)行任何初步處理或加工，如福爾馬林固定、閃凍、或石 蠟包埋。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，生物樣品可以獲自受試者并通過福爾馬林處理并將福爾 馬林固定的樣品包埋在石蠟中來進(jìn)行處理，并在通過本方法進(jìn)行評(píng)估之前儲(chǔ)存。
[0042]在某些實(shí)施方案中，在獲得合適的生物樣品后，樣品中KRT 17的表達(dá)水平可以使用 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種技術(shù)來測(cè)定。在本公開的特定實(shí)施方案中，KRT17表達(dá)水平 可以通過選自以下的方法來測(cè)量:免疫組織化學(xué)法(IHC)、顯微鏡法、q-RT-PCR、Northern印 跡法、蛋白印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、微陣列分析或RT-PCR。
[0043]在一個(gè)特定實(shí)施方案中，對(duì)福爾馬林固定、石蠟包埋樣品進(jìn)行KRT17的免疫組織化 學(xué)分析。這里，來自蘇木精和伊紅染色的組織切片的HSIL和/或鱗狀細(xì)胞癌樣品可以過激光 捕獲顯微鏡切割。福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品隨后在含有蛋白酶混合物(protease cocktails)的50mM碳酸氫銨中孵育以促進(jìn)蛋白交聯(lián)的逆向過程。該樣品隨后可以通過在脲 中均質(zhì)化來進(jìn)一步處理。KRT17的蛋白濃度隨后可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何 合適的方法來測(cè)定。
[0044]在一個(gè)特定實(shí)施方案中，經(jīng)由組織微陣列進(jìn)行KRT17蛋白檢測(cè)。例如，含有HSIL或 鱗狀細(xì)胞癌的組織可以獲自石蠟塊并置入組織微陣列塊。在某些實(shí)施方案中，組織樣品的 其它來源可以用作對(duì)照樣品，包括但不限于商業(yè)組織微陣列樣品，如獲自HISTO-Array?的 那些，具有已知KRT17表達(dá)水平的非癌性粘膜組織或SCC組織樣品。用于本方法的組織微陣 列切片可以隨后處理，即在二甲苯中脫石蠟和用醇再水化。
[0045]在某些實(shí)施方案中，樣品隨后可以通過以下方法進(jìn)一步處理：用檸檬酸鹽緩沖液 孵育，施加過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，或通過用血清處理該樣品以封閉非特異性 結(jié)合(例如牛、人、驢或馬血清）。該樣品可以隨后用抗KRT17的初級(jí)抗體進(jìn)一步孵育?？梢允?用抗KRT17抗原的任何抗體，包括但不限于小鼠單克隆-[E3 ]抗人KRT17抗體、抗人KRT17的 多克隆抗體、抗哺乳動(dòng)物KRT17蛋白結(jié)構(gòu)域或其表位的單克隆抗體或多克隆抗體。在某些實(shí) 施方案中，在用初級(jí)抗體孵育后，通過使用生物素化次級(jí)抗體的間接抗生物素蛋白-生物素 基免疫過氧化物酶法處理該樣品，顯影，并用蘇木精復(fù)染。切片可以隨后使用顯微鏡法分析 KRT17表達(dá)(例如熒光顯微鏡法或光學(xué)顯微鏡法）。
[0046]在某些實(shí)施方案中，通過PathSQ法（一種人工半定量評(píng)分系統(tǒng)）定量角蛋白表達(dá)， 該方法定量不知曉相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)的強(qiáng)染色細(xì)胞的百分比。在又一實(shí)施方案中，切片可以通 過使用DAB-蘇木精（DAB-H)顏色去卷積插件的National Institutes of Health ImageJ 1.46--基于Java的圖像處理軟件（參見Schneider CA等人，Nat methods · (2012)9:671- 5)來評(píng)分。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)來測(cè)定KRT17表達(dá)。例 如，將KRT17特異性單克隆抗體添加到微量滴定條或板的孔中。將獲自相關(guān)受試者的測(cè)試樣 品、含有正常KRT17蛋白表達(dá)水平的對(duì)照物SSC樣品、沒有表現(xiàn)出KRT17表達(dá)的非癌性對(duì)照樣 品提供至孔中。隨后孵育該樣品以使KRT17蛋白抗原結(jié)合固定的（捕獲)KRT17抗體。隨后用 緩沖溶液對(duì)樣品施以洗滌，并隨后通過結(jié)合第一次孵育過程中捕獲的KRT17蛋白用能夠結(jié) 合的檢測(cè)抗體進(jìn)行處理。在某些實(shí)施方案中，在除去過量檢測(cè)抗體后，加入標(biāo)記抗體(例如 抗兔IgG-HRP)，其結(jié)合該檢測(cè)抗體以完成復(fù)合物形成。在第三次孵育和洗滌以除去所有過 量的標(biāo)記抗體后，加入底物溶液，其通過結(jié)合的酶起作用以產(chǎn)生顏色。該著色產(chǎn)物的強(qiáng)度與 原始樣品中存在的總KRT 17蛋白濃度直接成比例。樣品中存在的KRT 17蛋白的量隨后可以通 過以下方法測(cè)定:讀取樣品的吸光度并與對(duì)照孔進(jìn)行比較，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知 的軟件相對(duì)于對(duì)照KRT17表達(dá)水平對(duì)吸光度進(jìn)行繪圖。
[0048] 在又一實(shí)施方案中，可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)或定量RT-PCR來測(cè)定KRT17表 達(dá)。更具體而言，可以通過使用Trizol試劑從樣品中提取全部RNA。隨后可以使用本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR。例如，RNA可以用作cDNA合成的模板，cDNA模板 可以隨后與KRT17的基因特異性引物（即正向5'-3'引物序列和反向3'-5'序列）混合。還可 以加入用于檢測(cè)的探針序列(例如Taqman或SYBR Green)。隨后可以對(duì)各樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR，獲得的數(shù)據(jù)可以歸一化至對(duì)照物或正常樣品中所示KRT17的對(duì)照水平。參見例如 Schmittgen和Livak，Nature protocols(2008)3:1101-1108。
[0049]在一個(gè)特定實(shí)施方案中，可以通過使用DAB-蘇木精（DAB-H)顏色去卷積插件的 National Institutes of Health ImageJ 1.46(參見Schneider CA等人，Nat methods. (2012)9:671-5)基于Java的圖像處理軟件（參見Ruifrok AC，Johnston DA.Anal Quant Cytol Histol. (2001 )23:291-9)和/或通過人工半定量評(píng)分系統(tǒng)（其定量不知曉相應(yīng)臨床 數(shù)據(jù)的強(qiáng)陽性染色細(xì)胞的百分比（PathSQ))對(duì)封裝在切片上并用KRT17抗體染色的樣品進(jìn) 行分析和評(píng)分。
[0050] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過測(cè)定患者子集的ImageJ得分和/或PathSQ得分并參照Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型根據(jù)最低赤池信息量準(zhǔn)則選擇適當(dāng)?shù)腒RT17表達(dá)水平來測(cè)定樣品中的 KRT17表達(dá)水平。在其它實(shí)施方案中，低KRT17表達(dá)水平通過少于樣品中存在的細(xì)胞的50% 中存在KRT17染色例示。在又一實(shí)施方案中，通過少于存在于樣品中的細(xì)胞的52%或少于樣 品中存在的細(xì)胞的52.5%中存在KRT染色來指示低KRT17表達(dá)水平。相反，通過在樣品中至 少50%的細(xì)胞中存在KRT17染色來指示受試者體內(nèi)的高KRT17表達(dá)水平（其符合低的超出5 年的存活幾率）。在某些實(shí)施方案中，受試者體內(nèi)的高KRT17表達(dá)水平構(gòu)成了樣品中大于 52%或大于52.5%的細(xì)胞對(duì)KRT17蛋白染色陽性的樣品。
[0051 ]綜上所述，本公開提供了通過分析樣品中的KRT17表達(dá)水平并確定KRT17水平在測(cè) 試樣品中是否高度過表達(dá)來測(cè)定已經(jīng)診斷患有SCC和/或HSIL的受試者的存活期可能性的 方法。由此，鱗狀細(xì)胞癌中的高KRT17表達(dá)水平將受試者鑒定為具有導(dǎo)致子宮頸癌死亡率的 最大風(fēng)險(xiǎn)。
[0052] 術(shù)語 本公開中所用的術(shù)語"肽"或"蛋白"是指通過α-氨基與相鄰氨基酸殘基的羧基之間的 肽鍵彼此連接的一線性系列氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白是角蛋白17(KRT17)。 在又一實(shí)施方案中，該蛋白是角蛋白4(KRT4)。
[0053] 本文中所用的術(shù)語"核酸"是指一種或多種任意類型的核苷酸堿基，包括單鏈或雙 鏈形式。在本公開的一個(gè)方面，核酸是DNA，在另一方面，核酸是RNA。在實(shí)施本公開的方法 時(shí)，通過本發(fā)明的方法分析的核酸(例如KRT4或KRT17 RNA)源于一種或多種樣品。
[0054] 本文中所用的術(shù)語"角蛋白17"、"K17"或"KRT17"是指人角蛋白，角蛋白，位于17號(hào) 染色體上的II型細(xì)胞骨架4基因，如登錄號(hào)NG_008625所示，或其產(chǎn)物，其編碼I型中間絲鏈 角蛋白17。包含在KRT17的所指含義中的是如登錄號(hào)NM_000422中所示的角蛋白17cDNA序列 的mRNA轉(zhuǎn)錄體，以及由此翻譯的蛋白，包括例如登錄號(hào)NP_000413中所示的角蛋白，1型細(xì)胞 骨架蛋白，17,或其同系物。
[0055] 本文中所用的術(shù)語"角蛋白4"、"K4"或"KRT4"是指人角蛋白，位于12號(hào)染色體上的 Π 型細(xì)胞骨架4基因，如登錄號(hào)NG_007380.1中所示，或其產(chǎn)物，其編碼在粘膜上皮細(xì)胞的分 化層中表達(dá)的II型中間絲鏈。包括在KRT4的所指含義中的是如登錄號(hào)NM_0002272中所示的 角蛋白4cDNA序列的mRNA轉(zhuǎn)錄體，以及由此翻譯的蛋白，例如，如登錄號(hào)NP_002263中所示的 角蛋白，II型細(xì)胞骨架蛋白，4,或其同系物。
[0056] 本文中所用的短語"受試者"、"試驗(yàn)對(duì)象"或"患者"是指任何哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí) 施方案中，該受試者是癌癥診斷(例如鱗狀細(xì)胞癌）的候選人或患有子宮頸癌或存在癌前病 變?nèi)鏗SIL或LSIL的個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，該受試者已經(jīng)被診斷患有SCC，并且該受試者 是治療其的候選人。本公開的方法可以對(duì)存在發(fā)展為癌癥或已經(jīng)診斷患有癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的任 何哺乳動(dòng)物受試者實(shí)施。特別地，本文中描述的方法在對(duì)人類實(shí)施時(shí)最有用。
[0057]本公開中使用的"生物樣品"、"測(cè)試樣品"或"樣品"可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 任何方式獲得。樣品可以衍生自受試者的任何部分，包括全血、組織、淋巴結(jié)或其組合。在某 些實(shí)施方案中，該樣品是從受試者提取的組織活檢、新鮮組織或活組織。在其它實(shí)施方案 中，該樣品在用于公開的方法之前經(jīng)過處理。例如，從受試者分離的福爾馬林固定、石蠟包 埋的組織樣品可用于本公開的方法，因?yàn)楦栺R林固定和石蠟包埋對(duì)組織學(xué)保存和臨床組 織樣本的診斷有益，并且福爾馬林固定石蠟包埋的組織與新鮮或冷凍組織相比更易于大量 獲得。
[0058]本文中所用的"對(duì)照樣品"、"非癌性樣品"或"正常樣品"是并未表現(xiàn)出提高的 KRT17和/或降低的KRT4水平的樣品。在某些實(shí)施方案中，對(duì)照樣品不含有癌細(xì)胞(例如良性 組織成分，包括但不限于正常鱗狀粘膜、外宮頸鱗狀粘膜基質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其它良性粘 膜組織成分）。在另一實(shí)施方案中，對(duì)照物或正常樣品是來自良性或癌組織的樣品，其沒有 表現(xiàn)出提高的KRT17表達(dá)水平。用于本公開的對(duì)照樣品的非限制性實(shí)例包括非癌性組織提 取物、由受試者提取的手術(shù)切緣、已知具有正?；蚪档偷腒RT17水平的分離的細(xì)胞、或獲自 其它健康個(gè)體的樣品。在一個(gè)方面，本公開的對(duì)照樣品是獲自相關(guān)受試者的良性組織。
[0059] 術(shù)語"增加"或"更大"或"提高"指的是至少超過在對(duì)照樣品中鑒定（如KRT4或 KRT17表達(dá)）、測(cè)量或分析的實(shí)體的相對(duì)量。非限制性實(shí)例包括但不限于超出對(duì)照樣品5-10%、10-20%的提高，或超出對(duì)照樣品至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100%、200%或更大的提高，或相對(duì)于對(duì)照樣品中分析的實(shí)體提高至少0.25倍、0.5倍、1倍、 1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、11倍或更大。
[0060] 術(shù)語"減少"或"降低"指的是至少小于在對(duì)照樣品中鑒定、測(cè)量或分析的實(shí)體的相 對(duì)量。非限制性實(shí)例包括但不限于與對(duì)照樣品相比降低5-10%、10-20%，或與對(duì)照樣品相 比時(shí)降低至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更多，或相對(duì) 于對(duì)照樣品中分析的實(shí)體降低至少0.25倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、11 倍或更多。
[0061]本公開中所用的"KRT4表達(dá)水平降低"應(yīng)當(dāng)是指存在于細(xì)胞、有機(jī)體或樣品中的 KRT4蛋白或其肽片段、或RNA的量與KRT4表達(dá)的對(duì)照或正常水平相比降低。在某些特定實(shí)施 方案中，指示鱗狀細(xì)胞癌的角蛋白4表達(dá)水平降低通過樣品中存在的細(xì)胞的<6%或1 %至 7%中存在KRT4表達(dá)例示。
[0062]本公開中所用的"KRT17表達(dá)水平提高"應(yīng)當(dāng)是指存在于細(xì)胞、有機(jī)體或樣品中的 KRT17蛋白或其肽片段、或RNA的量與KRT17表達(dá)的對(duì)照或正常水平相比提高。在某些特定實(shí) 施方案中，符合鱗狀細(xì)胞癌的角蛋白17表達(dá)水平提高通過樣品中存在的細(xì)胞的多8%或5% 至10 %中存在KRT17表達(dá)例示。在又一實(shí)施方案中，指示較少患者存活期的KRT17表達(dá)水平 提高通過樣品中至少50%的細(xì)胞中、或在KRT17染色陽性的樣品中大于52%或大于52.5% 的細(xì)胞中存在KRT17染色來指示。 實(shí)施例
[0063] 實(shí)施例1.材料與方法 受試者（患者)樣品.進(jìn)行的研究包括分析124個(gè)福爾馬林固定石蠟包埋的手術(shù)組織塊 (表1)。所有手術(shù)組織塊獲自自1989至2011接收護(hù)理的受試者（患者）。選擇標(biāo)準(zhǔn)為（i)具有 正常外宮頸鱗狀上皮或不顯著的正常外宮頸鱗狀粘膜（正常外宮頸鱗狀粘膜）、LSIL (CINl)、HSIL(CIN2/3)、原發(fā)性宮頸鱗狀細(xì)胞癌的病理診斷的病例，（ii)受試者在診斷時(shí)的 年齡多18歲。診斷患有其它解剖部位（即在子宮頸外部）的癌癥的受試者被排除在該研究 外。在所有病例中，通過檢查蘇木精和伊紅(H&E)染色的切片以確認(rèn)診斷組織（如最初報(bào)道 的那樣)顯示在剩余組織塊中來進(jìn)行組織學(xué)檢查。初始分類為CIN1的病例重新分類為L(zhǎng)SIL， 并且報(bào)道為CIN2或CIN3的病例被分類為HSIL。所有其它病例如最初報(bào)道的那樣分類，不修 正初始診斷。殘留組織不足的病例被排除在研究之外。鱗狀細(xì)胞癌通過以下分類：（i)按照 Edge SB和Compton CC.Annals of surgical oncology. (2010)17:1471-4的臨床分期， (ii)腫瘤分級(jí)和（iii)淋巴結(jié)狀態(tài)（表1)。每個(gè)受試者的存活數(shù)據(jù)獲自Stony Brook University Cancer Registry。
[0064] 細(xì)胞培養(yǎng)·人子宮頸癌細(xì)胞系3丨此、0&31^、(：-334、!11'-3、1^-180和如1^獲自 American Type Culture Collection(ATCC,Manassas，VA,USA)并如推薦那樣用含有10% 胎牛血清（Sigma-Aldrich , St Louis ,M0 ,USA)的RPMI 1640、DMEM或McCoy ' s 5A培養(yǎng)基 (Gibco-Life 16(：1111〇1〇8168)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞在37°〇下在含有5%(1)2的加濕氣氛中生長(zhǎng)。每 48小時(shí)更換培養(yǎng)基。
[0065] 樣品制備.來自所有診斷類別的總計(jì)22個(gè)福爾馬林固定石蠟包埋組織樣品用于蛋 白質(zhì)組學(xué)分析?；蛴蒛Mass Memorial Medical Center提供獨(dú)立的74個(gè)福爾馬林固定石錯(cuò) 包埋手術(shù)組織塊。來自蘇木精與伊紅染色的組織切片的正常宮頸粘膜、LSIL、HSIL和鱗狀細(xì) 胞癌通過激光捕獲顯微鏡(Zeiss P. A. L.Μ.)切割，由每個(gè)診斷類別收集540，000至650，000 個(gè)細(xì)胞。切割的組織由各個(gè)診斷類別匯集以便均質(zhì)化（圖1)。福爾馬林固定、石蠟包埋的組 織首先在含有蛋白酶混合物(Roche，Branford，CT，USA)的50mM碳酸氫銨中在65 °C下孵育3 小時(shí)以促進(jìn)蛋白交聯(lián)的逆向過程。隨后，組織在含有Invitrosol?(Invitrogen, Carlsbad, CA,USA)和RapiGest?(Waters Corporation,Milford,ΜΑ)(17)的在50mM碳酸氫銨（pH 7)中 的4M脲中均質(zhì)化。該蛋白濃度使用EZQ蛋白測(cè)定（Inv i trogen, Car 1 sbad, CA, USA)來確定。
[0066] 胰蛋白酶消化.10微克組織裂解物在50mM碳酸氫銨中稀釋用于胰蛋白酶消化。測(cè) 序級(jí)改性胰蛋白酶(Promega ,Fitchburg, WI)以1:30酶/蛋白的比例與2毫摩爾CaCl2-起添 加到各樣品中并在37°C下孵育16小時(shí)。在消化后，所有反應(yīng)用90%的甲酸(2%最終)酸化以 停止蛋白酶解。隨后，樣品在14，OOOrpm下離心30分鐘以除去不溶性材料。收集可溶性肽混 合物用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。
[0067] 多維色譜和串聯(lián)質(zhì)譜法.將肽混合物加壓裝載到首先用3厘米的5微米強(qiáng)陽離子交 換材料(Partisphere SCX,Whatman)并隨后用3厘米的10微米C18反相（RP)粒子(Aqua， Phenomenex，CA，USA)填充的250微米內(nèi)徑（i . d.)恪融石英毛細(xì)管上。裝載并洗滌過的微毛 細(xì)管經(jīng)由2微米過濾的聯(lián)合(filtered uni on)(UpChurch Scientific)連接至100微米內(nèi)徑 的柱，其已經(jīng)用P-2000C02激光拉出器（Sutter Instrument，Novato，CA,USA)拉至5微米內(nèi) 徑，隨后用13厘米的3微米C18RP粒子(Aqua，Phenomenex，CA，USA)填充并在5%乙腈、0.1% 甲酸（緩沖液A)中平衡。該分體柱（spli t-column)隨后與納米液相色譜法Eskigent高性能 液相色譜栗配接安裝。通道2的流速對(duì)有機(jī)梯度設(shè)定在300nl/min。通道1的流速對(duì)鹽脈沖設(shè) 定在0.5微升/分鐘。進(jìn)行全自動(dòng)化13步色譜運(yùn)行。使用三種不同的洗脫緩沖液:5%乙腈， 0.1%甲酸(緩沖液A);98%乙腈，0.1%甲酸(緩沖液B);和0.5 Μ乙酸銨，5%乙腈，0.1%甲 酸(緩沖液C)。以此類色譜事件順序，通過增加鹽的步驟(提高緩沖液C中的濃度)和隨后的 有機(jī)梯度(提高緩沖液Β中的濃度)將肽序貫地從SCX樹脂洗脫到RP樹脂中。最后的色譜法步 驟由使用100%緩沖液C的高鹽洗滌和隨后的乙腈梯度組成。施加2.5千伏遠(yuǎn)端電壓將洗脫 的肽直接電噴霧到裝有納米液相色譜法電噴霧電離源(Thermo Finnigan，San Jose，CA, USA)的LTQ-Orbi trap XL質(zhì)譜儀中。通過Orbi trap并隨后進(jìn)行由LTQ以數(shù)據(jù)依賴方式對(duì)選自 全質(zhì)譜光譜(在35%碰撞能量下）的第一、第二、第三和第四強(qiáng)離子依次生成的五個(gè)串聯(lián)質(zhì) 譜事件，在400至2000m/z范圍內(nèi)對(duì)肽記錄完整的質(zhì)譜光譜。質(zhì)譜儀掃描功能和高性能液相 色譜法溶劑梯度通過Xcalibur數(shù)據(jù)系統(tǒng)(Thermo Finnigan，San Jose，CA，USA)來控制。
[0068] 串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)庫檢索和解釋.來自三次相同試驗(yàn)的光譜從用于數(shù)據(jù)分析 的各個(gè)類別進(jìn)行合并。串聯(lián)質(zhì)譜從原始文件中提取，對(duì)手動(dòng)驗(yàn)證的數(shù)據(jù)集預(yù)先訓(xùn)練的二元 分類器用于去除低品質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜。剩余的光譜對(duì)含有69,711個(gè)以FASTA格式序列形式從 UniProtKB(參見UniProtConsortium. Reorganizing the protein space at the Universal Protein Resource(UniProt) .Nucleic Acids Res.2012;40:D71_5)下載的蛋 白質(zhì)序列和124種共同的污染物蛋白（總計(jì)69,835序列條目）的人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。 為了計(jì)算置信水平和假陽性率，使用追加至目標(biāo)數(shù)據(jù)庫的含有69,835個(gè)蛋白質(zhì)的反向序列 的的誘餌數(shù)據(jù)庫（參見Elias JE和Gygi SP.Nat.Methods. 2007;4:207-14)和SEQUEST算法 (參見Eng JK等人，Analytical Chemistry. 1995;67:1426-36;和Ashburner Μ等人，Nature Genet. 2000; 25:25-9)以便從合并數(shù)據(jù)庫中尋找最佳匹配序列。在Linux操作系統(tǒng)下運(yùn)行的 Intel Xeon X5450X/3.0 PR0C處理器集群上使用Integrated Proteomics Pipeline(IP2， Integrated Proteomics Applications，San Diego,CA,USA)進(jìn)行SEQUEST檢索。肽質(zhì)量檢 索容許量設(shè)定為50ppm?？紤]了無差異的修改。對(duì)數(shù)據(jù)庫檢索沒有施加酶裂解條件，因此無 論其胰蛋白酶狀態(tài)如何，檢索空間包括其理論質(zhì)量落在50ppm質(zhì)量容許量窗口內(nèi)的所有候 選酶。
[0069] 在Scaffold軟件（參見Lundgren DH等人，Curr Protoc Bioinformatics· (2009) 第13章：第13 3單元）中使用SEQUEST定義的參數(shù)、互相關(guān)分?jǐn)?shù)(XCorr)和互相關(guān)分?jǐn)?shù)的歸一 化差值(DeltaCN)來評(píng)估肽/光譜匹配的有效性。檢索結(jié)果通過電荷狀態(tài)(+1、+2和+3)和胰 蛋白酶狀態(tài)(完全_、半-和非胰蛋白酶)來分組，得到9個(gè)不同的子組。在每個(gè)子組中，獲得對(duì) (a)直接和(b)誘餌數(shù)據(jù)庫命中的XCorr和DeltaCN值的分布，并且這兩個(gè)子集通過二次判別 分析來分離。兩種分布中的離群點(diǎn)（例如具有極低Xcorr但是極高DeltaCN的匹配)被丟棄。 直接和誘餌子集的充分分離通常是不可能的；因此，設(shè)定判別分?jǐn)?shù)以使得根據(jù)接受的誘餌 數(shù)據(jù)庫肽的數(shù)量確定1%的假陽性率。對(duì)各個(gè)數(shù)據(jù)子集獨(dú)立地進(jìn)行該程序，獲得與胰蛋白酶 狀態(tài)或電荷狀態(tài)無關(guān)的假陽性率。此外，要求七個(gè)氨基酸殘基的最小序列長(zhǎng)度，并且除非指 定，最終名單上的各蛋白得到至少兩種獨(dú)立的肽鑒定的支持。這些附加要求，尤其是后者， 導(dǎo)致消除了大部分誘餌數(shù)據(jù)庫和假陽性命中，因?yàn)檫@些傾向于壓倒性地呈現(xiàn)為被單一肽匹 配鑒定的蛋白。在最后的過濾步驟后，誤鑒定率降低至低于1 %。通過Scaffold軟件 (Pro teome Software，Inc .Portland，OR)進(jìn)行全局歸一化。Gene Onto logy (參見 Ashburner M等人，Nature Genet. (2000)25:25-9)用于確定鑒定的蛋白的亞細(xì)胞定位。
[0070] 通過免疫組織化學(xué)分析的診斷驗(yàn)證.為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)組譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建每種診斷類 另IJ25-27個(gè)病例的組織微陣列（圖1)。各病例含有最多三個(gè)核心復(fù)制，除了 12個(gè)LSIL病例之 外，其由于病灶尺寸小而僅含有一個(gè)核心。檢查切片并在玻璃切片上標(biāo)記含有正常宮頸粘 膜、LSIL、HSIL和鱗狀細(xì)胞癌的區(qū)域。組織的三毫米穿孔用作樣品，其隨后從石蠟塊的相應(yīng) 區(qū)域取出并置入組織微陣列塊。此外，購(gòu)買來自HISTO-Array?組織陣列（IMGENEX，San Diego，CA，USA)的含有40個(gè)另外的鱗狀細(xì)胞癌病例的商業(yè)組織微陣列。在60°C下孵育1小時(shí) 后，組織微陣列切片在二甲苯中脫蠟并用梯度醇再水化。在Decloaking隔室中在檸檬酸鹽 緩沖液(20毫摩爾，pH 6.0)中在120 °C下進(jìn)行抗原復(fù)原10分鐘。通過施加3 %過氧化氫5分鐘 來阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。切片隨后在5%馬血清中封閉。所用初級(jí)抗體是：小鼠單克隆-[E3]抗人 KRT17 抗體(ab75123, Abeam Cambridge，MA, USA; 4°C 過夜）和小鼠單克隆-[6B10] 抗人KRT4抗體（vp_c399, Vector Laboratories ,Burlingame ,CA; 1:150 1小時(shí)，室溫）。在用 初級(jí)抗體孵育后，通過間接抗生物素蛋白-生物素-基免疫過氧化物酶法使用生物素化馬次 級(jí)抗體（R.T.U.Vectastain Universal Elite ABC kit； Vector Laboratories, Bur 1 ingame，CA，USA)處理該切片，在3，3 二氨基聯(lián)苯胺（DAB) (K3468，Dako，Carpentaria， CA，USA)中顯影，并用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。對(duì)所有病例使用針對(duì)不相關(guān)的抗原生成的相同濃度 的子類匹配小鼠免疫球蛋白代替初級(jí)抗體進(jìn)行陰性對(duì)照。切片通過一種手工半定量評(píng)分系 統(tǒng)PathSQ評(píng)分，該方法定量不知曉相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)的強(qiáng)染色細(xì)胞的百分比。
[0071] 角蛋白蛋白質(zhì)表達(dá)的評(píng)分.通過使用DAB-蘇木精(DAB-H)顏色去卷積插件（參見 Ruifrok AC,Johnston DA.Anal Quant Cytol Histol. (2001)23:291-9,其內(nèi)容經(jīng)此引用 并入本文）的National Institutes of Health ImageJ 1.46(參見Schneider CA等人，Nat methods. (2012)9:671-5，其內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文)基于Java的圖像處理軟件和通過人工 半定量評(píng)分系統(tǒng)(其定量不知曉相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)的強(qiáng)陽性染色細(xì)胞的百分比(PathSQ))對(duì)切 片進(jìn)行評(píng)分。
[0072] RT-PCR和qRT-PCR.按照制造商的方法使用Trizol試劑（Invitrogen)提取全部 RNA。用Reverse Transcription System(Promega，Madison，WI)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶PCR。在所有 情況下，使用1微克RNA作為cDNA合成的模板，cDNA模板與KRT17、CDKN2A(p 16INK4a)、CDKN2B (pl5INK4b)、CDKN2C(pl8INK4c)、CDKN2D(pl9INK4d)、CDKNlA(p21 CIP1/WAF1)、CDKNlB(p27KIP1)、 C0PS5(JAB 1)、GAPDH、β-肌動(dòng)蛋白和18S的基因特異性引物混合。根據(jù)檢測(cè)系統(tǒng)使用Taqman 2Xuniversal PCR Master Mix或SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)。 Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR機(jī)器用于qRT-PCR并編程為:95°C，10分鐘；95°C，15秒； 6CTC，1分鐘并重復(fù) 40個(gè)周期。如 Schmitt gen和 Livak，Nature protocols (2008)3 :1101-1108中所述，通過各個(gè)別樣品中的表達(dá)水平將數(shù)據(jù)歸一化，其內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。 [0073] 通過ImageJ和PathSQ評(píng)分子宮頸癌中高/低K17表達(dá)的分類.為了顯示總體存活期 的Kaplan-Meier曲線，根據(jù)通過ImageJ和PathSQ測(cè)得的KRT17(K17)的表達(dá)水平，將SCC病例 進(jìn)一步分為兩組，高K17水平vs.低K17水平。根據(jù)來自Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的最低赤池信 息量準(zhǔn)則(AIC)選擇兩種評(píng)分方法的最佳分界點(diǎn)。在ImageJ評(píng)分中的163(病例總數(shù)的第74 百分位)和PathSQ評(píng)分的52.5%(病例總數(shù)的第64百分位)的數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)分界點(diǎn)用于將患者分 類為兩組。高K17水平（高K17)，ImageJ評(píng)分彡163或PathSQ評(píng)分彡52.5%，和低1(17水平(低 1(17)〈163或〈53%，分別為111^6]"和?31:113( >)評(píng)分。事實(shí)上，111^6]"評(píng)分的161-165區(qū)間（分別 為第72-第75百分位)或52-53區(qū)間（分別為第63和第65百分位）中的任何分界點(diǎn)對(duì)Cox比例 風(fēng)險(xiǎn)模型而言導(dǎo)致相同的AIC值。該Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的中點(diǎn)，163和52.5% (報(bào)道為>50% ) 用于SCC患者中的總存活期的Kaplan-Meier曲線。時(shí)序檢驗(yàn)用于比較具有高K17水平和低 K17水平的SCC患者之間的總體存活期。通過Kap lan-Me i er評(píng)估和時(shí)序檢驗(yàn)來研究總體存活 期與其它SCC因素(年齡、分期、分級(jí)和淋巴結(jié)狀態(tài))之間的關(guān)聯(lián)?；贑ox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型 計(jì)算危險(xiǎn)比(HR)和95%CI。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定在0.05,使用SAS 9.3(SAS Institute，Inc.， Cary，NC)和SigmaPlot 11 (Systat Software，San Jose,CA)進(jìn)行分析。
[0074] 在某些實(shí)施方案中，免疫組織化學(xué)分析的測(cè)量單位是每個(gè)核心，并且所有核心的 平均PathSQ評(píng)分用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過Kruskal-Wallis或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)確定診斷類別 之間的評(píng)分差異。計(jì)算接受者操作曲線和曲線下面積以便根據(jù)邏輯回歸模型評(píng)估生物標(biāo)記 物辨別不同診斷類別的潛力。使用尤登指數(shù)確定來自接受者操作曲線的最佳分界值。參見 Youden WJ.Cancer. (1950)3:32-5，其內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。對(duì)于角蛋白4(KRT4)，所得接 受者操作曲線中的最佳分界值對(duì)應(yīng)于陽性細(xì)胞的多6 %，而對(duì)于角蛋白17 (KRT17 )，所得接 受者操作曲線中的最佳分界值對(duì)PathSQ評(píng)分對(duì)應(yīng)于陽性細(xì)胞的多8%。相應(yīng)于最佳分界值 計(jì)算敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和誤分類率。皮爾遜相關(guān)系數(shù)用于評(píng)價(jià)KRT17 表達(dá)和其它定量變量(如患者年齡和組織儲(chǔ)存時(shí)間）之間的相關(guān)性。由手術(shù)至死亡或末次隨 訪(如果還在世的話)的時(shí)間來定義總存活期。通過單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估KRT17表達(dá) 和總存活期之間的關(guān)聯(lián)。證實(shí)了 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的假設(shè)。
[0075] 小干擾RNA和短發(fā)夾RNA.對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，0N-TARGETplus Human KRT17(3872)小干 擾RNA (s iRNA) -4種s iRNA的 SMART池 （Thermo Sc i ent if i c，Wa 1 tham，ΜΑ，USA)用于下調(diào)KRT17 表達(dá)(siKRT17)。下列KRT17siRNA序列用于下調(diào)KRT17表達(dá)： (5'-3'）AGAAAGAACCGCTJGACCAC(SEQIDN0:l)， CGUCAGGUGCGUACCAUUG(SEQ ID N0:2)，GGUCCAGGAUGGCAAGGUC(SEQ ID N0:3)， GGAGAGGAUGCCCACCUGA(SEQ ID N0:4) AN-TARGETplus非靶向?qū)φ誷iRNA(Thermo Scient if ic，Wal tham，MA，USA)用作RNA干擾對(duì)照物（陰性siRNA)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法使用 Oligofectamine? 2000(Life Technologies，Grand Island,NY,USA)將siRNA轉(zhuǎn)染到癌細(xì) 胞中。為了穩(wěn)定下調(diào)KRT17，三種GIPZ慢病毒shRNA(GE Dharmacon Lafayette，CO，USA)用于 篩選最佳下調(diào)效率。下列KRT shRNA序列用于下調(diào)KRT17表達(dá)：（5'-3'）8111-TCTTGTACTGAGTCAGGTG(SEQ ID N0:5)、sh2-TCTTTCTTGTACTGAGTCA(SEQ ID N0:6)和sh3-CTGTCTCAAACTTGGTGCG(SEQ ID N0:7)。陰性GIPZ慢病毒shRNA對(duì)照物用作陰性shRNA。遵循 制造商方法進(jìn)行慢病毒生產(chǎn)。在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后，以10微克/毫升選擇細(xì)胞，并對(duì)各細(xì)胞系生 產(chǎn)穩(wěn)定克隆。
[0076] 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分析和衰老檢測(cè).瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，SiHa和CaSki細(xì)胞 以4000細(xì)胞/孔在96孔板中接種。通過在培養(yǎng)基中孵育10微升WST-1 (Roche Applied Science，Mannheim, Germany )2小時(shí)并讀取450和630納米處的吸光度在第1、3和5天來進(jìn)行 細(xì)胞增殖測(cè)定。由630納米處的吸光度減去450納米處的吸光度來計(jì)算細(xì)胞增殖速率。進(jìn)行 細(xì)胞數(shù)吸光度曲線以計(jì)算每孔的細(xì)胞。使用碘化丙啶和吖啶橙染色通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn) 行細(xì)胞周期分析。分別在瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后三天或兩周，收獲細(xì)胞并以0.5-1 X106細(xì)胞/毫 升重新懸浮在含有0.02毫克/毫升RNase H( Invi trogen)和0.05毫克/毫升碘化丙啶 (Sigma-Aldrich)的改性Krishan緩沖液中。用Modf it LT軟件第3版（Verity Software House，Top sham, ME，USA)計(jì)算結(jié)果。對(duì)于吖啶橙，如前所述進(jìn)行細(xì)胞周期染色和分析 (Darzynkiewicz等人，1980;E1-Naggar，2004) 〇在Stony Brook University在Research Flow Cytometry core在FACSCaliburTM(Becton Dickinson)中分析所有樣品。衰老β-半乳 糖苷酶染色試劑盒(Cell Signaling,Danvers,MA,USA#9860)用于按照制造商指南測(cè)定衰 老細(xì)胞的百分比。
[0077] 血清饑餓釋放、環(huán)己酰亞胺追蹤和細(xì)霉素 B治療.對(duì)于蛋白穩(wěn)定性分析，在50 %匯 合下將細(xì)胞接種到60毫米培養(yǎng)皿中，血清饑餓48小時(shí)。在血清饑餓后，細(xì)胞用含有20 %FBS 和40微克/毫升的環(huán)己酰亞胺(CHX，目錄號(hào)239764;Calbiochem)的DMEM重新刺激。在指定時(shí) 間點(diǎn)處，制備全細(xì)胞提取物并進(jìn)行蛋白印跡試驗(yàn)。
[0078]蛋白印跡法和核內(nèi)蛋白的提取.用RIPA(Sigma-Aldrich)緩沖液收集全細(xì)胞蛋白 樣品并隨后超聲處理。核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)蛋白通過NE-PER?蛋白提取試劑(Pierce)按照制造商 的指南提取。蛋白濃度通過BCA蛋白測(cè)定法(Pierce)測(cè)定。將等量的樣品裝載到十二烷基硫 酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。該膜用TBS/0.5%T Ween-20中的5% 脫脂乳（TBS-T)在室溫下封閉30分鐘，隨后用以下探測(cè)：小鼠抗角蛋白17抗體（0 &七#%_ 101461，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、小鼠抗人p27KIP1 抗體（Cat#610242, BD transduction Labs)、兔抗人pRB抗體（Cat#9313S,Cell Signaling,Danvers,MA,USA)、 兔抗-細(xì)胞周期蛋白 Dl(Cat#2978S, Cell Signaling, Danvers ,MA, USA)、兔抗-SKP2(Cat# 2652P，Ce 11 Signaling，Danvers，MA，USA)、兔抗-phospho p27KIP1Ser 10(Cat#sc-12939-R, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA)、小鼠抗-JAB1 (Cat#sc_13157，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz,CA)、小鼠抗-HPV16 E6/18E6(Cat#sc_460，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz, CA)、小鼠抗-HPV16 E7(Cat#sc_6981，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz, CA)、兔抗-細(xì)胞周期蛋白 A(Cat#sc_751Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz,CA)、小鼠抗-RNF123(KPCl)(Cat#sc_101122 Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、兔抗-UBE3A(Cat#AP2l54B ABGENT，San Diego，CA，USA)、 兔抗-pl30(Cat#sc_317,Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz,CA)、兔抗-phospho角蛋 白 17Ser44(Cat#3519S，Cell Signaling,Danvers，MA,USA)、兔抗-細(xì)胞角蛋白 17(Cat#ab 109725Abcam, Cambridge，MA, USA)、小鼠抗-p53 抗體（Cat#sc_126, Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)、小鼠抗人p21抗體（Cat#2946，Cel 1 Signaling， Danvers，MA,USA)、小鼠抗-GAPDH抗體（Cat#sc_365062，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)、小鼠抗人a-微管蛋白抗體（Cat#05-829，Mi 11 ipore，Temecula，CA，USA)、小 鼠抗-核纖層蛋白B1 (Cat#ab90576Abcam, Cambridge，MA，USA)，在4°C下過夜。山羊抗-兔和 抗-小鼠以及兔抗-山羊辣根過氧化物酶-綴合次級(jí)抗體(Jackson Immunoresearch,West Grove, PA, USA)以 1:5000 使用。用SuperSignal West Pico 化學(xué)發(fā)光底物（Thermo Scientific, Waltham, MA，USA)檢測(cè)辣根過氧化物酶活性并在UVP生物成像系統(tǒng)(Upland, CA,USA)中顯現(xiàn)。使用ImageJ軟件（National Institute of Health,Bethesda,ΜΑ,USA)定 量表達(dá)水平，并如圖9中所示歸一化至加載對(duì)照物。
[0079] 實(shí)施例2.生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)和候選選擇 通過激光捕獲顯微切割處理來自22個(gè)福爾馬林固定石蠟包埋組織（包括正常宮頸粘 膜、LSIL、HSIL和鱗狀細(xì)胞癌）的病灶性上皮細(xì)胞以進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。將收集自各類別 的多個(gè)患者的細(xì)胞匯集以鑒定蛋白質(zhì)豐度方面最穩(wěn)健和一致的差異。使用質(zhì)譜兼容性裂解 緩沖液從福爾馬林固定石蠟包埋組織中提取蛋白并用高分辨率質(zhì)譜儀LTQ-OrbitrapXL進(jìn) 行分析。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的2D液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法，我們以1%的誤發(fā) 現(xiàn)率鑒定了 1750種蛋白，并使用頻譜計(jì)數(shù)法導(dǎo)出了這些類別中這些蛋白的相對(duì)定量(數(shù)據(jù) 未顯示）。參見Liu Η等人，Anal Chem. (2004)76:4193-201。為了通過鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)分析 檢查福爾馬林固定石蠟包埋組織的全面采樣，我們通過基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology database)評(píng)估了鑒定的蛋白的細(xì)胞定位，并顯示了由支持分析福爾馬林固定石蠟包埋組 織的效用的多種范圍的亞細(xì)胞位置鑒定這些蛋白（圖lb)。為了選擇候選生物標(biāo)記物，我們 首先在診斷類別中基于頻譜計(jì)數(shù)選擇具有至少兩倍差異的蛋白，并進(jìn)一步通過選擇指示疾 病進(jìn)展的蛋白表達(dá)譜縮小這一名單的范圍。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，選擇兩種候選生物標(biāo)記物KRT17 和KRT4用于進(jìn)一步驗(yàn)證。這兩種蛋白在正常向鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展中顯示了相反的趨勢(shì)。 KRT17由正常向LSIL、HSIL和向鱗狀細(xì)胞癌中顯示提高的表達(dá)，而KRT4在正常向鱗狀細(xì)胞癌 的進(jìn)展中顯示降低的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0080] 實(shí)施例3.作為診斷標(biāo)記物的角蛋白4和角蛋白17 為了確定KRT4和KRT17在一種或多種診斷類別中的診斷價(jià)值，在來自四個(gè)診斷類別的 歸檔患者組織的組織微陣列上對(duì)KRT4和KRT17進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色:正常、LSIL、HSIL、鱗 狀細(xì)胞癌。免疫染色切片通過PathSQ評(píng)分，其定量強(qiáng)陽性染色細(xì)胞的百分比。對(duì)KRT4的免疫 組織化學(xué)分析顯示了在正常、LSIL和在一些HSIL中的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，但在鱗狀細(xì)胞癌中顯著 降低（圖2A-BKKRT4的損失具有68%的敏感性(95%CI:46-85%)和61%的特異性(95%(：1: 49-72%)以便區(qū)分鱗狀細(xì)胞癌與其它診斷類別（表2)。表2中包括陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值 和接受者操作曲線模型的曲線下面積以及誤分類率。按照PathSQ分界值（多6%的陽性細(xì) 胞），84%的正常病例、44%的LSIL、55%的HSIL和32%的鱗狀細(xì)胞癌病例對(duì)KRT4為陽性。 [0081 ]與KRT4中看到的相比，KRT17免疫組織化學(xué)染色證明了細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的相反模式;在 大多數(shù)HSIL和鱗狀細(xì)胞癌中檢測(cè)到KRT17,但在正常鱗狀粘膜(包括外宮頸鱗狀粘膜）和 LSIL中通常以可忽略的水平檢測(cè)到（圖Sa-bhKRTH具有94%的敏感性(95%CI:73-94%) 和86%的特異性(95%CI :73-94%)以便區(qū)分正常粘膜/LSI與HSIL/鱗狀細(xì)胞癌(表2)。表2 中包括陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、曲線下面積以及誤分類率?；赑athSQ分界值（多8%的陽 性細(xì)胞），所有正常病例是陰性的，27 %的LSIL病例是陽性的，并且96 %的HSIL病例和92 % 的鱗狀細(xì)胞癌病例是陽性的。因此，我們的研究結(jié)果表明，KRT17表達(dá)可以以高敏感性和特 異性區(qū)分具有惡性病變的患者(HSIL或鱗狀細(xì)胞癌）與具有非惡性瞬時(shí)感染(LSIL)的患者 或具有正常宮頸粘膜的健康個(gè)體。
[0082]接下來，檢查了與疾病無關(guān)的參數(shù)，包括患者年齡和組織的儲(chǔ)存時(shí)間，以確定是否 任何因素影響KRT17作為用于HSIL與鱗狀細(xì)胞癌病例的生物標(biāo)記物的可靠性。在KRT17表達(dá) 與患者年齡或組織儲(chǔ)存長(zhǎng)度之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性(分別地，r = 0.02和r = -0.40，p值 >0.05)。此外，在具有宮頸炎、成熟鱗狀上皮化生、活檢部位變化(傷口愈合)或單純皰疹病 毒感染的病例中沒有發(fā)現(xiàn)KRT17表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化（圖4A)。但是，在未成熟鱗狀上皮化 生中（圖4A-B)和在宮頸內(nèi)儲(chǔ)備細(xì)胞中檢測(cè)到KRT17。由具有宮頸內(nèi)粘膜的17個(gè)病例中，70% (12/17)在儲(chǔ)備細(xì)胞中具有陽性染色。最后，在KRT17表達(dá)與鱗狀細(xì)胞癌患者中不同的高危 型HPV類型之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著相關(guān)性（圖4C)。
[0083]實(shí)施例4.角蛋白17作為患者存活期的預(yù)后生物標(biāo)記物 鑒于KRT17區(qū)分高度病變與正常粘膜和LSIL的高敏感性和特異性，進(jìn)一步檢查了另外 的鱗狀細(xì)胞癌病例，以確定是否KRT17對(duì)患者存活期具有預(yù)后價(jià)值。基于Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型， KRT17表達(dá)與鱗狀細(xì)胞癌患者中降低的總體存活期顯著相關(guān)(p = 0.009)<X〇X比例風(fēng)險(xiǎn)模型 的中點(diǎn)，在彡50 %的腫瘤細(xì)胞中的強(qiáng)染色用作閾值以分離用于Kap 1 an-Me i er曲線中總體患 者存活期的鱗狀細(xì)胞癌病例（圖5)。
[0084] 具有低KRT17表達(dá)的鱗狀細(xì)胞癌患者的五年存活率估計(jì)為96.97 % (95 % CI: 80.37-99.57% )。相反，具有高KRT17表達(dá)的鱗狀細(xì)胞癌患者的五年存活率估計(jì)為64.31 % (95%CI :39.2-81.21 %)。在鱗狀細(xì)胞癌患者的十年存活率中觀察到類似趨勢(shì)。具有低 KRT17表達(dá)的鱗狀細(xì)胞癌患者的十年存活率估計(jì)為96.97% (95%CI: 80.37-99.57% )，但是 具有高KRT17表達(dá)的鱗狀細(xì)胞癌患者的十年存活率估計(jì)為52.61%(95%(：1:28.33-72.11 %)。盡管KRT17表達(dá)與總體患者存活期相關(guān)，KRT17表達(dá)與腫瘤分期、病理分級(jí)或淋巴 結(jié)狀態(tài)并不顯著相關(guān)（圖6-7)?？偠灾疚闹刑峁┑臄?shù)據(jù)表明，高KRT17表達(dá)與鱗狀細(xì)胞 癌患者的不良總體存活期相關(guān)(風(fēng)險(xiǎn)比=14.76,95%(：1 1.87-116.58，？ = 0.01，圖5)。 [0085]為了進(jìn)一步驗(yàn)證KRT17作為患者存活期和/或治療效果的預(yù)后生物標(biāo)記物的用途， 從UMass Memorial Medical Center的檔案收藏中回顧性地選擇另外的74個(gè)福爾馬林固定 石錯(cuò)包埋手術(shù)組織塊，符合Stony Brook Medicine的IRB批準(zhǔn)的規(guī)程。選擇標(biāo)準(zhǔn)是：（i)具有 原發(fā)性宮頸鱗狀細(xì)胞癌(SCC)的病理診斷的病例，和（ii)診斷時(shí)患者年齡大于18歲。在其它 解剖部位診斷患有癌癥的患者被排除在研究之外。通過臨床分期和腫瘤分級(jí)將SCC分類。存 活期數(shù)據(jù)獲自UMass Memorial Cancer Registry。
[0086] 使用頻率和百分比描述分類數(shù)據(jù)。使用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差或標(biāo)準(zhǔn)誤差來描述連續(xù) 數(shù)據(jù)。兩組的平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性用學(xué)生t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)來確定。多個(gè) 組的平均值的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較使用單向AN0VA或Kruskal-Wallis AN0VA通過秩來確定。進(jìn)行總 體存活期分析以驗(yàn)證角蛋白17的表達(dá)水平與臨床結(jié)果之間的關(guān)系。采用Kap lan-Me i er法生 成圖7中顯示的存活期曲線。使用時(shí)序檢驗(yàn)測(cè)試角蛋白17表達(dá)組的存活期函數(shù)的分布。如上 文定義的那樣檢測(cè)角蛋白17表達(dá)組，以檢查在低角蛋白17患者(PathSQ〈50)與高角蛋白17 (PathSQ多50)分界組之間在總體存活率方面的任何差異。通過使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行 多變量分析。該模型進(jìn)一步檢驗(yàn)了在調(diào)節(jié)被認(rèn)為是總體存活率的關(guān)鍵預(yù)后決定指標(biāo)的潛在 混雜因素(如癌癥的分期)時(shí)在總體存活期方面的任何差異。使用SAS 9.3(SAS Institute， 1]1(3.，〇&^，1^，1]3八）和3丨81]1&?1〇1:11(35^七&七3〇;1^?^代，3&11]〇86，〇八，1]3八）進(jìn)行所有分析。 對(duì)于統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，設(shè)定在Ρ〈〇·05(a)，p〇wer(l_0)在彡0.8。
[0087] 表1:病例的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征
表2.按照PathSQ評(píng)分在不同診斷類別之間的角蛋白4和17接受者操作曲線分析和錯(cuò)誤 分類比率結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鑒定患有子宮頸癌的哺乳動(dòng)物受試者的方法，包括獲得來自受試者的樣品，并檢測(cè) 獲自所述受試者的處理過的樣品中的KRT4和/或KRT17表達(dá)，其中處理過的樣品中降低的 KRT4表達(dá)水平或提高的KRTl 7表達(dá)水平將所述受試者鑒定為患有子宮頸癌。2. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括處理所述樣品。3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述處理樣品包括切割所述樣品以分離細(xì)胞，在包含脲的裂 解液中裂解所述分離的細(xì)胞，從裂解液中分離所述蛋白，在包含胰蛋白酶的消化溶液中消 化分離的蛋白，并使所得混合物離心為肽。4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品選自：全血、組織、淋巴結(jié)或其組合。5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述樣品是腫瘤活檢樣品或福爾馬林固定石蠟包埋組織樣 品。6. 權(quán)利要求1的方法，其中通過選自以下的方法測(cè)定樣品中KRT4和/或KRT17表達(dá)的水 平:采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光測(cè)定、蛋白印跡法或ELISA的個(gè)體腫瘤活檢樣本或組織微 陣列。7. 權(quán)利要求1的方法，其中基于檢測(cè)KRT4或KRT17 mRNA的水平來測(cè)量KRT4和/或KRT17 表達(dá)的水平。8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述子宮頸癌是鱗狀細(xì)胞癌。9. 權(quán)利要求1的方法，其中基于比較樣品中KRT4或KRT17表達(dá)水平與對(duì)照水平來確定所 述降低的KRT4表達(dá)水平和/或所述提高的KRTl 7表達(dá)水平。10. 權(quán)利要求9的方法，其中由受試者的健康組織、或由來自其它受試者的健康或癌性 組織建立所述對(duì)照水平。11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述健康組織是鱗狀粘膜。12. 權(quán)利要求1的方法，其中所述提高的KRT17表達(dá)水平通過在所述樣品中大于50%的細(xì) 胞中存在KRTl 7表達(dá)來指示。13. 權(quán)利要求1的方法，其中所述降低的KRT4表達(dá)水平通過在所述樣品中小于10%的細(xì) 胞中存在KRT4表達(dá)來指示。14. 用于鑒定患有子宮頸癌的哺乳動(dòng)物受試者的試劑盒，包括描述如權(quán)利要求1-13任 一項(xiàng)所述的使用方法的說明書。15. 確定患有子宮頸癌的受試者的存活期可能性的方法，包括檢測(cè)獲自受試者的樣品 中的KRT17表達(dá)水平，其中在樣品中提高的KRT17表達(dá)水平將所述受試者鑒定為具有降低的 存活期可能性。16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述提高的KRT17表達(dá)水平通過所述樣品的免疫組織化學(xué) 染色來測(cè)定。17. 權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括將所述樣品通過免疫組織化學(xué)染色測(cè)定的KRT17表 達(dá)水平與獲自具有已知子宮頸癌存活時(shí)間的其它受試者的癌性組織樣品的KRT17表達(dá)水平 進(jìn)行比較。18. 權(quán)利要求16的方法，其中通過在所述樣品中的大于50%的細(xì)胞中存在KRTl 7表達(dá)來 指示所述提高的KRTl 7表達(dá)水平。19. 權(quán)利要求18的方法，其中通過在所述樣品中的大于52%的細(xì)胞中存在KRTl 7表達(dá)來 指示所述提高的KRTl 7表達(dá)水平。20. 權(quán)利要求15的方法，其中在樣品中的所述提高的KRT17表達(dá)水平將所述受試者鑒定 為具有自癌癥陽性診斷之日起存活期超出50個(gè)月的降低的可能性。21. 權(quán)利要求15的方法，其中在樣品中的所述提高的KRT17表達(dá)水平將所述受試者鑒定 為具有自癌癥陽性診斷之日起存活期超出120個(gè)月的降低的可能性。22. 用于確定患有子宮頸癌的受試者的存活期可能性的試劑盒，包括描述如權(quán)利要求 15-21任一項(xiàng)所述的使用方法的說明書。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105899673SQ201480055603
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年8月8日
【發(fā)明人】K.R.什羅耶, L.F.埃斯科巴-霍尤斯, E.I.陳
【申請(qǐng)人】紐約州州立大學(xué)研究基金會(huì)