一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法，它由桑葉蛋白提取、構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)、生物膜分離、定向金屬離子緩釋、酶切洗脫、純化精制凍干燥六個(gè)步驟完成其制備方法；該桑葉金屬硫蛋白的蛋白來(lái)源是純植物中提取分離獲得，植物蛋白資源得到充分利用，與其它來(lái)源的MT原料相比，具有原料來(lái)源可靠、提取過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低、綠色安全等特點(diǎn)；濃縮液體蛋白與金屬離子誘導(dǎo)，選擇的是人體必須的金屬元素作為融合載體表達(dá)體，能夠可溶性地、高產(chǎn)率穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物；目的蛋白能與金屬離子定量緩釋有效進(jìn)行分類表達(dá)，得到純化后的不同結(jié)構(gòu)的MT蛋白分子；提取過(guò)程的周期短，處理量大，反應(yīng)所得目標(biāo)產(chǎn)物回收率高，損失小、純度高、無(wú)二次污染等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法
[0001 ]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法，特指桑葉蛋白，構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá) 及其定向緩釋金屬離子誘導(dǎo)合成的生產(chǎn)方法，屬生物技術(shù)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】： 金屬硫蛋白（MetalIoThionein)簡(jiǎn)稱MT，化學(xué)名為金屬硫組氨酸三甲基內(nèi)鹽，是一類廣 泛存在于生物中的低分子量(6000~7000道爾頓）、富含半胱氨酸(20%~30%)、是生物體內(nèi)發(fā) 現(xiàn)的一種最重要、最奇異、生理功能最多、巰基(-SH)的活性多肽物質(zhì)，不含組氨酸和芳香族 氨基酸；并能被金屬誘導(dǎo)的金屬結(jié)合蛋白；享有特殊生理功能的"應(yīng)激蛋白、驅(qū)動(dòng)蛋白"之 稱，在人體代謝與細(xì)胞基因中扮演的是名副其實(shí)的"生命管家"的角色，參與體內(nèi)微量元素 的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，拮抗電離輻射，清除自由基以及對(duì)重金屬的解毒作用，還與機(jī)體生長(zhǎng) 發(fā)育、衰老及某些疾病有關(guān)(如帕金森、癌癥、癲癇等）;MT研究已涉及農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、生物化學(xué)、 分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、衛(wèi)生毒理學(xué)、食品科學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、保健美容及生命科學(xué)等領(lǐng)域。除了 可以開發(fā)各種治療藥物、保健化妝品等以外，還可以利用MT作為生物進(jìn)行重金屬污染環(huán)境 的修復(fù)和環(huán)境監(jiān)測(cè)的標(biāo)記物。
[0003] 根據(jù)金屬硫蛋白命名委員會(huì)（The Committeeon the Nomenclature of Metallothionein)的建議，1988年，Kagi將具有以下特征的蛋白質(zhì)或多肽定義為MT: I.分子 量低，一般為6~7KD;半胱氨酸含量高，約占全部氨基酸殘基的1/3;不含組氨酸和芳香族氨 基酸殘基;無(wú)二硫鍵;2.金屬含量高，半胱氨酸殘基上的-SH可以和211工(1、取、(：11等近20種金 屬離子配位結(jié)合;3 .具有廣泛的存在性及高效的可誘導(dǎo)性，許多內(nèi)源和外源激素均可誘導(dǎo) 金屬硫蛋白合成;4.特征的氨基酸序列，Cys殘基在氨基酸序列中占據(jù)相當(dāng)保守的位置;所 有的氣基酸殘基均以還原態(tài)存在;并通過(guò)疏基以硫酯鍵結(jié)合金屬尚子。有文獻(xiàn)表明，科學(xué)家 們相繼在植物、微生物以及海洋生物中發(fā)現(xiàn)和證明了存在具有相似結(jié)構(gòu)和生理功能基本一 致的金屬硫蛋白（Classification of Metallothionein，P · -A.BinzKgi，1999);植 物金屬硫蛋白最早是由Caster line和Barnett于1977年從大豆根中發(fā)現(xiàn)的；1987年Lane等 從小麥胚胎中發(fā)現(xiàn)Ec蛋白，并證明其氨基酸序列與動(dòng)物MTs相一致，從而證明了植物體中含 有MTs;國(guó)內(nèi)專利一種植物金屬硫蛋白的制備方法(專利號(hào)：200410044118)中提到的植物 金屬硫蛋白是一種利用基因工程技術(shù)構(gòu)建植物金屬硫蛋白，在大腸桿菌中得到高效表達(dá)的 方法，而非純植物中蛋白質(zhì)直接獲得;另外有研究表明，國(guó)內(nèi)對(duì)植物體中類金屬硫蛋白（簡(jiǎn) 稱類MT)研究多有報(bào)道，如番茄、膀胱麥瓶草、多斑溝酸漿、菠菜、翦股穎根中分離到的植物 重金屬結(jié)合蛋白（肽)都屬類MT，而真正能從純植物中提取高含量的MT蛋白并運(yùn)用于工業(yè)生 產(chǎn)的企業(yè)尚未見報(bào)道，而以前報(bào)道的分子量約IOKD的都是屬于類MT，而類MT可能是提取過(guò) 程中的人為產(chǎn)物，或由于不純、小肽聚合而成等，因此用于產(chǎn)業(yè)化有一定的局限性。
[0004] 桑葉，藥食同源植物，適宜我國(guó)南北種植，1981年衛(wèi)生部公布的85版藥食同源第二 批(91)第45號(hào)文件中的桑葉可用于保健食品；2003年的非典、2009年甲型HlNl流感病，2013 年甲型H7N9流感，國(guó)家中醫(yī)藥局將對(duì)中醫(yī)藥診療方案微調(diào)再次將桑葉列入?yún)⒖继幏街祝?至今桑葉仍作為防控非典、禽流感、病毒型流感措施的重要藥材。
[0005] 本發(fā)明所指的桑葉金屬硫蛋白（MT)來(lái)源于植物桑葉中，我們前期研究發(fā)現(xiàn)桑葉具 有EIN2同源基因，該基因的DNA全長(zhǎng)5614 bp，mRNA編碼序列為3921 bp，含7個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子，該基因編碼1036個(gè)氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)桑葉蛋白DNA基因有Ma/MTs的存在，因此桑 葉蛋白可以經(jīng)金屬離子誘導(dǎo)大量產(chǎn)生金屬硫蛋白的條件，且原料的來(lái)源具有安全、綠色、營(yíng) 養(yǎng)藥食同源等特點(diǎn)。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的是為了在新鮮桑葉中直接提取桑葉蛋白，實(shí)現(xiàn)在金屬硫蛋白在制備中成 本低、提取率高，純度高、生物利用率高、安全無(wú)污染的特點(diǎn)及可用于規(guī)?；a(chǎn)，提供一種 桑葉金屬硫蛋白的制備方法。
[0007] 本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)其發(fā)明目的的：一種桑葉金屬硫蛋白，它由桑葉 蛋白提取1、構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)2、生物膜分離3、定向金屬離子緩釋4、酶切洗脫5、純化 精制凍干燥6六個(gè)步驟完成其制備方法； 桑葉蛋白提取1:經(jīng)桑葉原料預(yù)處理得到桑葉漿液采用Tir s - HCl緩沖液進(jìn)行勻漿，將 桑葉漿液均勻加熱至90°C靜置冷卻至65°C，再配制加入一定比例的2-羥基丙酸與乙醇混合 液，進(jìn)行桑葉蛋白加熱沉淀，靜置45分鐘后觀察，所得沉淀部分為桑葉粗蛋白； 構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)2:經(jīng)上述桑葉蛋白提取1步驟得到的桑葉粗蛋白設(shè)定目標(biāo)產(chǎn)物 模型裝置，將桑葉粗蛋白利用分子篩水熱轉(zhuǎn)化法原理，通過(guò)吸附，除去大分子有機(jī)物，分級(jí) 沉淀小分子蛋白得到目標(biāo)產(chǎn)物MT蛋白溶液混合體； 生物膜分離3:經(jīng)上述構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)2步驟得到的MT蛋白溶液混合體，經(jīng)生物 膜固液分離，其過(guò)程包括濃縮、去雜、殺菌、脫色一次性處理完成，保留蛋白分子為3KDa~ 7KDa目標(biāo)產(chǎn)物為所得MT蛋白濃縮液體； 定向金屬離子緩釋4:經(jīng)上述生物膜分離3步驟后的富集濃縮液體MT蛋白，采用25°C、PH =7條件下、0.2moI/1磷酸鈉緩沖液、配制還原劑二硫蘇糖醇（DTT，ImmoI/L)或B2巰基乙醇 (10mmol/L)作為疏基（一 SH)結(jié)構(gòu)活性穩(wěn)定劑，分類定向緩釋金屬離子與濃縮液體蛋白結(jié) 合誘導(dǎo)合成三種不同結(jié)構(gòu)類型的巰基蛋白(MTs-PS _ )等電點(diǎn)(pi)為4;在中性pH條件下，MT 帶負(fù)電荷，蛋白肽鏈通過(guò)Cys殘基的，SH以硫酯鍵的形式配位結(jié)合金屬離子;靜置30分鐘后， 形成新的融合蛋白，總巰基采用DTNB巰基法測(cè)得巰基含量，金屬離子采用原子吸收光譜測(cè) 定，所得產(chǎn)物為= MTs-PS _ -I、MTs-PS _ - Π 、MTs-PS _ -ΙΠ 三類巰基化合物，待進(jìn)行下一步處 理； 酶切洗脫5:經(jīng)上述定向金屬離子緩釋4步驟后分別得到的富集奶^-?3_-1、11^-?5_-Π 、MTs-PS _ -ΙΠ 加入GST酶切液和巰基乙醇的混合液，柱外酶切，酶切后的反應(yīng)混合液經(jīng)膜 過(guò)濾裝置濃縮后，收集洗脫峰;分別配制硅酸鹽和氯化鈉的混合溶液，進(jìn)行重復(fù)洗脫至中性 條件下形成多聚體蛋白，即為ΜΤ-Ι、ΜΤ-Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮液體； 純化精制凍干燥6:將酶切洗脫5步驟得到的富集MT-I、ΜΤ- Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮液，分 別收集洗脫峰的洗脫液，經(jīng)Sephadex G-25層析柱兩次脫鹽，收集洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空 凍干，得到純度95%以上金屬硫蛋白精品，感官呈雪白色凍干粉末即為高純度品質(zhì)的MT凍干 粉;貯存條件為_14°C~25°C最佳。
[0008] 由于采用上述技術(shù)方案，預(yù)先將新鮮桑葉經(jīng)打漿、榨汁等常規(guī)工藝加工得到桑葉 漿液，桑葉漿液中蛋白成分用2-羥基丙酸與乙醇混合液加熱沉淀，桑葉漿液要求的加熱溫 度控制在90°C，其目的在于殺菌去除部分有機(jī)物或雜質(zhì)，靜置45分鐘后反應(yīng)，沉淀部分為桑 葉蛋白；構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)，設(shè)定目標(biāo)產(chǎn)物模型裝置，再利用分子篩水熱轉(zhuǎn)化法原理， 通過(guò)吸附，除去大分子有機(jī)物，分級(jí)沉淀小分子蛋白，其目的在于得到目標(biāo)產(chǎn)物MT蛋白溶液 混合體；再經(jīng)生物膜固液分離其目的在于進(jìn)一步去雜、殺菌、脫色，其目標(biāo)產(chǎn)物為3KDa~ 7KDa小分子蛋白濃縮液體，其蛋白濃度大于80%. pro/L;金屬離子的定向緩釋其目的在于與 分離得到的小分子濃縮液體蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，采用25°C、PH=7條件下、0.2mol/l磷酸鈉緩沖 液、配制還原劑二硫蘇糖醇（DTT，ImmoI/L)或B2巰基乙醇（IOmmo 1/L)作為巰基（一 SH)結(jié) 構(gòu)活性穩(wěn)定劑，以L(升)為計(jì)量單位與金屬離子的比例為1000:1(蛋白濃度與金屬離子之 比），具體實(shí)施步驟為： 第一類(MTs-PS _ -I)金屬離子定向緩釋順序依次為： 鐵(Fe)-錳(Μη)-鈣（Ca)-鎂(Mg) -鈉(Na)-鉻（Cr)所得產(chǎn)物分子量為3~5kDa的 MTS-I巰基化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰220nm; 第二類(MTs-PS _ -Π )金屬離子定向緩釋順序依次為： 鋅(Zn)-銅(Cn)-鎘(Cd)-鉛(Pb)-汞(Hg)，所得產(chǎn)物分子量為6~7kDa的MTS-Π 巰基 化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰250nm; 第三類(MTs-PS _ -m)金屬離子定向緩釋順序依次為： 鎳(Ni)-鋁(A1)-鉬(Mo)-鈦(Ti)-鍶(Sr)，所得產(chǎn)物分子量為6~7kDa的MTS-ΙΠ 巰基 化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰275nm; 經(jīng)上述金屬離子定向緩釋其目的在于誘導(dǎo)合成得到MT巰基化 PS _ -Π 、MTs-PS _ -m不同的配位結(jié)構(gòu)；上樣后，采用多維核磁共振(匪R)法化學(xué)計(jì)量比分 析得出MTs-PS _ -I形成線形配位結(jié)構(gòu)，配位數(shù)為2;MTs-PS _ -Π 形成三角形配位結(jié)構(gòu)，配位 數(shù)為3;MTs-PS _ -ΙΠ 形成二面體配位結(jié)構(gòu)，配位數(shù)為4;PH在酸性環(huán)境下對(duì)三種不同類型MT 巰基化合物進(jìn)行脫金屬進(jìn)處理，得到脫金屬硫蛋白，波長(zhǎng)190nm處有明顯肽鍵吸收峰；加入 GST酶切液和巰基乙醇的混合液，柱外酶切，酶切后的反應(yīng)混合液經(jīng)膜過(guò)濾裝置濃縮后，收 集洗脫峰;分別配制硅酸鹽和氯化鈉的混合溶液，進(jìn)行重復(fù)洗脫至中性條件下形成多聚體 蛋白，即為ΜΤ-Ι、ΜΤ-Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮液;分別收集(MTs-PS _ -I)220nm處洗脫峰的洗脫 液、（MTs-PS _ -n)250nm處洗脫峰的洗脫液、（MTs-PS _ -m)275nm處洗脫峰的洗脫液，經(jīng) Sephadex G-25層析柱兩次脫鹽，收集洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空凍干，采用ELISA法測(cè)得硫 蛋白含量，用火焰原子吸收法測(cè)定金屬元素含量、用DTNB法測(cè)定巰基含量、金屬硫蛋白分子 量測(cè)定用電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定;分別得到MT-I純度(95%)，感官呈雪白色凍干粉末，MT-Π 純度 (95%)感官呈微黃或白色凍干粉末;ΜΤ-ΙΠ 純度(95%)感官呈白色結(jié)晶體凍干粉末，貯存條件 為-14°C~25°C最佳。
[0009]由于采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比該桑葉金屬硫蛋白的制備方法針對(duì)現(xiàn)有 金屬硫蛋白來(lái)源的局限性，將新鮮桑葉提取桑葉蛋白作為首要條件，構(gòu)建蛋白融合載體表 達(dá)模型，分子篩水熱轉(zhuǎn)化法原理，再將沉淀得到的桑葉蛋白進(jìn)行生物膜固液分離、定向金屬 離子緩釋、酶切洗脫、純化精制、冷凍干燥等工藝，在提取過(guò)程中MTS-PS _蛋白采用ELISA 法，純度80 %~93%之間，總巰基采用DTNB巰基法與MT蛋白的理論摩爾比值20:1接近的原理 為實(shí)驗(yàn)依據(jù)進(jìn)行桑葉MT蛋白提取與誘導(dǎo)合成；該桑葉金屬硫蛋白的制備方法具有以下優(yōu) 點(diǎn)：1、蛋白來(lái)源的選擇是純植物中提取分離獲得，植物蛋白資源得到充分利用，與其它來(lái)源 的MT原料(如菌種培養(yǎng)、基因、動(dòng)物肝臟等來(lái)源)相比，具有原料來(lái)源可靠、提取過(guò)程簡(jiǎn)單、成 本低、綠色安全等特點(diǎn)；2、濃縮液體蛋白的與金屬離子誘導(dǎo)，選擇的是人體必須的金屬元素 作為融合載體表達(dá)體，能夠可溶性地、高產(chǎn)率穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物;3、目的蛋白能與金屬離子 定量緩釋有效進(jìn)行分類表達(dá)，得到純化后的不同結(jié)構(gòu)的MT蛋白分子;4、提取過(guò)程的周期短， 處理量大，反應(yīng)所得目標(biāo)產(chǎn)物回收率高，損失小、純度高、無(wú)二次污染，具有工業(yè)化批量生產(chǎn) 等特點(diǎn)；利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的金屬硫蛋白制劑能參與調(diào)節(jié)人體微量元素(如鋅），并具有 拮抗重金屬（隔、汞和鋁），抗輻射(包括紫外線)和修復(fù)受損組織等功效，是一種極好的化 妝品添加劑和生化試劑（自由基清除劑、抗氧化劑和生物解毒劑）；也可作為一種安全的新 型食品添加劑和具有排鉛、解毒(重金屬）、補(bǔ)充人體必需元素的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的 營(yíng)養(yǎng)素。
[0010] 本發(fā)明研究了桑葉金屬硫蛋白，有以下幾點(diǎn)意義：1.證實(shí)了桑葉蛋白具有超強(qiáng)清 除羥自由基的能力、重金屬生物解毒提供一種分子機(jī)制，既通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬硫蛋白把有 害的金屬離子轉(zhuǎn)化為有益的金屬結(jié)合蛋白；2.本發(fā)明為桑葉純植物中提取金屬硫蛋白提供 了一種有效的生產(chǎn)方法，并能為桑葉深加工產(chǎn)業(yè)提供創(chuàng)新發(fā)展的高新技術(shù);3.為進(jìn)一步研 究各種植物源金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，特別是植物MT在分子進(jìn)化方面的深入研究提供了 新的途徑。
[0011]
【附圖說(shuō)明】： 附圖1是本發(fā)明工藝流程示意圖。
[0012] 附圖標(biāo)記說(shuō)明見說(shuō)明書最后一頁(yè)表格。
[0013]
【具體實(shí)施方式】： 下面結(jié)合附圖對(duì)
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步說(shuō)明： 實(shí)施例1: 由
【發(fā)明內(nèi)容】
可知，一種桑葉金屬硫蛋白，它由桑葉蛋白提取1、構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá) 2、生物膜分離3、定向金屬離子緩釋4、酶切洗脫5、純化精制凍干燥6六個(gè)步驟完成其制備方 法； 桑葉蛋白提取1:經(jīng)桑葉原料預(yù)處理得到桑葉漿液采用Tir s - HCl緩沖液進(jìn)行勻漿，將 桑葉漿液均勻加熱至90°C靜置冷卻至65°C，再配制加入一定比例的2-羥基丙酸與乙醇混合 液，進(jìn)行桑葉蛋白加熱沉淀，靜置45分鐘后觀察，所得沉淀部分為桑葉粗蛋白； 構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)2:經(jīng)上述桑葉蛋白提取1步驟得到的桑葉粗蛋白設(shè)定目標(biāo)產(chǎn)物 模型裝置，將桑葉粗蛋白利用分子篩水熱轉(zhuǎn)化法原理，通過(guò)吸附，除去大分子有機(jī)物，分級(jí) 沉淀小分子蛋白得到目標(biāo)產(chǎn)物MT蛋白溶液混合體； 生物膜分離3:經(jīng)上述構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)2步驟得到的MT蛋白溶液混合體，經(jīng)生物 膜固液分離，其過(guò)程包括濃縮、去雜、殺菌、脫色一次性處理完成，保留蛋白分子為3KDa~ 7KDa目標(biāo)產(chǎn)物為所得MT蛋白濃縮液體； 定向金屬離子緩釋4:經(jīng)上述生物膜分離3步驟后的富集濃縮液體MT蛋白，采用25°C、PH =7條件下、0.2moI/1磷酸鈉緩沖液、配制還原劑二硫蘇糖醇（DTT，ImmoI/L)或B2巰基乙醇 (10mmol/L)作為疏基（一 SH)結(jié)構(gòu)活性穩(wěn)定劑，分類定向緩釋金屬離子與濃縮液體蛋白結(jié) 合誘導(dǎo)合成三種不同結(jié)構(gòu)類型的巰基蛋白(MTs-PS _ )等電點(diǎn)(pi)為4;在中性pH條件下，MT 帶負(fù)電荷，蛋白肽鏈通過(guò)Cys殘基的，SH以硫酯鍵的形式配位結(jié)合金屬離子;靜置30分鐘后， 形成新的融合蛋白，總巰基采用DTNB巰基法測(cè)得巰基含量，金屬離子采用原子吸收光譜測(cè) 定，所得產(chǎn)物為= MTs-PS _ -I、MTs-PS _ - Π 、MTs-PS _ -ΙΠ 三類巰基化合物，待進(jìn)行下一步處 理； 酶切洗脫5:經(jīng)上述定向金屬離子緩釋4步驟后分別得到的富集奶^-?3_-1、11^-?5_-Π 、MTs-PS _ -ΙΠ 加入GST酶切液和巰基乙醇的混合液，柱外酶切，酶切后的反應(yīng)混合液經(jīng)膜 過(guò)濾裝置濃縮后，收集洗脫峰;分別配制硅酸鹽和氯化鈉的混合溶液，進(jìn)行重復(fù)洗脫至中性 條件下形成多聚體蛋白，即為ΜΤ-Ι、ΜΤ-Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮液體； 純化精制凍干燥6:將酶切洗脫5步驟得到的富集MT-I、ΜΤ- Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮液，分 別收集洗脫峰的洗脫液，經(jīng)Sephadex G-25層析柱兩次脫鹽，收集洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空 凍干，得到純度95%以上金屬硫蛋白精品，感官呈雪白色凍干粉末即為高純度品質(zhì)的MT凍干 粉;貯存條件為_14°C~25°C最佳。
[0014]由于采用上述技術(shù)方案，預(yù)先將新鮮桑葉經(jīng)打漿、榨汁等常規(guī)工藝加工得到桑葉 漿液，桑葉漿液中蛋白成分用2-羥基丙酸與乙醇混合液加熱沉淀，桑葉漿液要求的加熱溫 度控制在90°C，其目的在于殺菌去除部分有機(jī)物或雜質(zhì)，靜置45分鐘后反應(yīng)，沉淀部分為桑 葉蛋白；構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)，設(shè)定目標(biāo)產(chǎn)物模型裝置，再利用分子篩水熱轉(zhuǎn)化法原理， 通過(guò)吸附，除去大分子有機(jī)物，分級(jí)沉淀小分子蛋白，其目的在于得到目標(biāo)產(chǎn)物MT蛋白溶液 混合體；再經(jīng)生物膜固液分離其目的在于進(jìn)一步去雜、殺菌、脫色，其目標(biāo)產(chǎn)物為3KDa~ 7KDa小分子蛋白濃縮液體，其蛋白濃度在大于80%. pro/L;金屬離子的定向緩釋其目的在于 與分離得到的小分子濃縮液體蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，采用25°C、PH=7條件下、0.2mol/l磷酸鈉緩沖 液、配制還原劑二硫蘇糖醇（DTT，ImmoI/L)或B2巰基乙醇（IOmmo 1/L)作為巰基（一 SH)結(jié) 構(gòu)活性穩(wěn)定劑，以L(升)為計(jì)量單位與金屬離子的比例為1000:1(蛋白濃度與金屬離子之 比），具體實(shí)施步驟為： 第一類(MTs-PS _ -I)金屬離子定向緩釋順序依次為： 鐵(Fe)-錳(Μη)-鈣（Ca)-鎂(Mg) -鈉(Na)-鉻（Cr)所得產(chǎn)物分子量為3~5kDa的 MTS-I巰基化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰220nm; 第二類(MTs-PS _ -Π )金屬離子定向緩釋順序依次為： 鋅(Zn)-銅(Cn)-鎘(Cd)-鉛(Pb)-汞(Hg)，所得產(chǎn)物分子量為6~7kDa的MTS-Π 巰基 化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰250nm; 第三類(MTs-PS _ -m)金屬離子定向緩釋順序依次為： 鎳(Ni)-鋁(A1)-鉬(Mo)-鈦(Ti)-鍶(Sr)，所得產(chǎn)物分子量為6~7kDa的MTS-ΙΠ 巰基 化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰275nm; 經(jīng)上述金屬離子定向緩釋其目的在于誘導(dǎo)合成得到MT巰基化 PS _ -Π 、MTs-PS _ -m不同的配位結(jié)構(gòu)；上樣后，采用多維核磁共振(匪R)法化學(xué)計(jì)量比分 析得出MTs-PS _ -I形成線形配位結(jié)構(gòu)，配位數(shù)為2;MTs-PS _ -Π 形成三角形配位結(jié)構(gòu)，配位 數(shù)為3;MTs-PS _ -ΙΠ 形成二面體配位結(jié)構(gòu)，配位數(shù)為4;PH在酸性環(huán)境下對(duì)三種不同類型MT 巰基化合物進(jìn)行脫金屬進(jìn)處理，得到脫金屬硫蛋白，波長(zhǎng)190nm處有明顯肽鍵吸收峰；加入 GST酶切液和巰基乙醇的混合液，柱外酶切，酶切后的反應(yīng)混合液經(jīng)膜過(guò)濾裝置濃縮后，收 集洗脫峰;分別配制硅酸鹽和氯化鈉的混合溶液，進(jìn)行重復(fù)洗脫至中性條件下形成多聚體 蛋白，即為ΜΤ-Ι、ΜΤ-Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮液;分別收集(MTs-PS _ -I)220nm處洗脫峰的洗脫 液、（MTs-PS _ -n)250nm處洗脫峰的洗脫液、（MTs-PS _ -m)275nm處洗脫峰的洗脫液，經(jīng) Sephadex G-25層析柱兩次脫鹽，收集洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空凍干，采用ELISA法測(cè)得硫 蛋白含量，用火焰原子吸收法測(cè)定金屬元素含量、用DTNB法測(cè)定巰基含量、金屬硫蛋白分子 量測(cè)定用電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定;分別得到MT-I純度(95%)，感官呈雪白色凍干粉末，MT-Π 純度 (95%)感官呈微黃或白色凍干粉末;ΜΤ-ΙΠ 純度(95%)感官呈白色結(jié)晶體凍干粉末，貯存條件 為-14°C~25°C最佳。
[0015] 實(shí)施例2: 選用新鮮桑葉l〇〇kg，經(jīng)原料預(yù)處理打漿、壓汁等原料預(yù)處理工藝，得到桑葉漿液，采用 Tirs-HCl緩沖液與純凈水1:100進(jìn)行勻漿加熱90°C靜置冷卻至60°C，再配制加入一定比例 的2-羥基丙酸與乙醇混合液進(jìn)行沉淀，沉淀部分為桑葉粗蛋白；桑葉蛋白含量測(cè)定用 Bradford法測(cè)定;構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)，設(shè)定目標(biāo)產(chǎn)物模型裝置，再利用分子篩水熱轉(zhuǎn)化 法原理，通過(guò)吸附，除去大分子有機(jī)物，分級(jí)沉淀小分子蛋白，得到MT小分子蛋白溶液混合 體;經(jīng)生物膜固液分離、濃縮等工藝得到目標(biāo)產(chǎn)物MT蛋白濃縮液體，分子量為3KDa~7KDa; 采用25°C、PH=7條件下、0.2mol/l磷酸鈉緩沖液、配制還原劑二硫蘇糖醇（DTT，lmmol/L)或 B2巰基乙醇（lOmmol/L)作為巰基（一SH)結(jié)構(gòu)活性穩(wěn)定劑，以L(升)為計(jì)量單位與金屬離子 的比例為1000:1(蛋白濃度與金屬離子之比）；具體實(shí)施步驟為：（金屬離子含量以mg/kg或 g/kg計(jì)量） 第一類(MTs-PS _ -I)金屬離子含量和緩釋順序依次為： 鐵（Fe)333mg/kg-猛（Mn)569mg/kg-|丐（Ca)24 · Og/kg-鎂(Mg)6 · 09g/kg-鈉（Na) 1.68g/kg-鉻(Cr)1.67g/kg所得產(chǎn)物分子量為3~5kDa的MTS-I巰基化合物，其表現(xiàn)出特征 吸收峰220nm; 第二類(MTs-PS _ - Π )金屬離子含量和緩釋順序依次為： 鋅(Zn)8 · 48g/kg-銅（Cn)O · 32mg/kg-錦(Cd)O · lmg/kg-鉛(Pb)O · lmg/kg-萊(Hg) 0. lmg/kg，所得產(chǎn)物分子量為6~7kDa的MTS- Π 巰基化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰250nm; 第三類(MTs-PS _ -m)金屬離子含量和緩釋順序依次為： 鎳(Ni)O · 52mg/kg-錯(cuò)(Al)O · lmg/kg-鉬(Mo)O · llmg/kg-鈦(Ti)O · lmg/kg-鎖（Sr) 78.4mg/kg，所得產(chǎn)物分子量為6~7kDa的MTS-ΙΠ 巰基化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰275nm; 采用多維核磁共振(NMR)法化學(xué)計(jì)量比分析得出MTs-PS _ -I形成線形配位結(jié)構(gòu)，配位 數(shù)為2;MTs-PS _ -Π 形成三角形配位結(jié)構(gòu)，配位數(shù)為3;MTs-PS _ -ΙΠ 形成二面體配位結(jié)構(gòu)， 配位數(shù)為4; PH在酸性環(huán)境下對(duì)三種不同類型MT巰基化合物進(jìn)行脫金屬進(jìn)處理，得到脫金屬 硫蛋白，波長(zhǎng)190nm處有明顯肽鍵吸收峰；加入GST酶切液和巰基乙醇的混合液，柱外酶切， 酶切后的反應(yīng)混合液經(jīng)膜過(guò)濾裝置濃縮后，收集洗脫峰；分別配制硅酸鹽和氯化鈉的混合 溶液，進(jìn)行重復(fù)洗脫至中性條件下形成多聚體蛋白，即為ΜΤ-Ι、ΜΤ-Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮液； 采用ELISA法測(cè)得硫蛋白含量(MTs-PS _ -I)220nm處洗脫峰的洗脫液，MTs-PS _ -I濃度為 83.1 mg/L; (MTs-PS _ -n)250nm處洗脫峰的洗脫液MTs-PS _ -Π 濃度為87.7 mg/L，（MTs-PS _ -m)275nm處洗脫峰的洗脫液，MTs-PS _ -ΙΠ 濃度為93.3 mg/L，純化精制經(jīng)Sephadex G-25層析柱兩次脫鹽，收集洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空凍干，用火焰原子吸收法測(cè)定金屬元 素含量、用DTNB法測(cè)定巰基含量、金屬硫蛋白分子量測(cè)定用電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定；分別得到 MT-I純度(95%)，感官呈雪白色凍干粉末，MT- Π 純度(95%)感官呈微黃或白色凍干粉末。MT- m純度(95%)感官呈白色結(jié)晶體凍干粉末，貯存條件為-14 °C~25 °C最佳。
[0016]金屬硫蛋白疏基及其含量測(cè)定： 1、在試管中分別加入不同體積標(biāo)準(zhǔn)金屬硫蛋白溶液（質(zhì)量濃度為IygAiL )，加入IOyL 1.2mol/L鹽酸溶液和巰基試劑200yL0.1mol/L EDTA，置暗處反應(yīng)10min脫去金屬，加入 5mmol/L DTNB試劑混勻3min，使MT與DTNB形成黃色絡(luò)合物，用緩沖液稀釋至4mL，在412nm波 長(zhǎng)處測(cè)定紫外吸光度，定量巰基含量，以摩爾消光系數(shù)Σ =13 JOOmor1Cnr1. L推算金屬硫蛋 白總量。
[0017] 2、DTNB 穩(wěn)定性 取400yL 5mmol/LDTNB溶液，分別加入7.6mL pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的0.1111〇1/1磷 酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，pH7.5、8.0、8.5、9.0的0 . Imo 1/L Tris-HCl緩沖液，每隔2h于 412nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以考察DTNB在不同pH值條件下的穩(wěn)定性。 rnniRi
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法，其特征是它由桑葉蛋白提?。?)、構(gòu)建蛋白融合載 體表達(dá)(2 )、生物膜分離(3 )、定向金屬離子緩釋(4 )、酶切洗脫(5 )、純化精制凍干燥(6 )六個(gè) 步驟完成其制備方法； 桑葉蛋白提取（1):經(jīng)桑葉原料預(yù)處理得到桑葉漿液采用Tirs - HC1緩沖液進(jìn)行勻漿， 將桑葉漿液均勻加熱至90 °C靜置冷卻至65°C，再配制加入一定比例的2-羥基丙酸與乙醇混 合液，進(jìn)行桑葉蛋白加熱沉淀，靜置45分鐘后觀察，所得沉淀部分為桑葉粗蛋白； 構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)(2):經(jīng)上述桑葉蛋白提?。?)步驟得到的桑葉粗蛋白設(shè)定目標(biāo) 產(chǎn)物模型裝置，將桑葉粗蛋白利用分子篩水熱轉(zhuǎn)化法原理，通過(guò)吸附，除去大分子有機(jī)物， 分級(jí)沉淀小分子蛋白得到目標(biāo)產(chǎn)物MT蛋白溶液混合體； 生物膜分離（3):經(jīng)上述構(gòu)建蛋白融合載體表達(dá)（2)步驟得到的MT蛋白溶液混合體，經(jīng) 生物膜固液分離，其過(guò)程包括濃縮、去雜、殺菌、脫色一次性處理完成，保留蛋白分子為3KDa ~7KDa目標(biāo)產(chǎn)物為所得MT蛋白濃縮液體； 定向金屬離子緩釋(4):經(jīng)上述生物膜分離（3)步驟后的富集濃縮液體MT蛋白，采用25 °C、PH=7條件下、0.2mol/l磷酸鈉緩沖液、配制還原劑二硫蘇糖醇（DTT，lmmol/L)或B2巰基 乙醇（10mmol/L)作為疏基（一 SH)結(jié)構(gòu)活性穩(wěn)定劑，分類定向緩釋金屬離子與濃縮液體蛋 白結(jié)合誘導(dǎo)合成三種不同結(jié)構(gòu)類型的巰基蛋白（MTs-PS _ )等電點(diǎn)(pi)為4;在中性pH條件 下，MT帶負(fù)電荷，蛋白肽鏈通過(guò)Cys殘基的，SH以硫酯鍵的形式配位結(jié)合金屬離子;靜置30分 鐘后，形成新的融合蛋白，總巰基采用DTNB巰基法測(cè)得巰基含量，金屬離子采用原子吸收光 譜測(cè)定，所得產(chǎn)物為:MTs-PS _ -I、MTs-PS _ - Π 、MTs-PS _ -ΙΠ 三類巰基化合物，待進(jìn)行下一 步處理； 酶切洗脫(5):經(jīng)上述定向金屬離子緩釋(4)步驟后分別得到的富集價(jià)8-?3_-1、11^-PS _ -Π 、MTs-PS _ -ΙΠ 加入GST酶切液和巰基乙醇的混合液，柱外酶切，酶切后的反應(yīng)混合 液經(jīng)膜過(guò)濾裝置濃縮后，收集洗脫峰;分別配制硅酸鹽和氯化鈉的混合溶液，進(jìn)行重復(fù)洗脫 至中性條件下形成多聚體蛋白，即為ΜΤ-Ι、ΜΤ-Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮液體； 純化精制凍干燥(6):將酶切洗脫（5)步驟得到的富集ΜΤ-Ι、ΜΤ- Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮 液，分別收集洗脫峰的洗脫液，經(jīng)Sephadex G-25層析柱兩次脫鹽，收集洗脫峰的洗脫液進(jìn) 行真空凍干，得到純度95%以上金屬硫蛋白精品，感官呈雪白色凍干粉末即為高純度品質(zhì)的 MT凍干粉;貯存條件為-14 °C~25 °C最佳。2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法，預(yù)先將新鮮桑葉經(jīng)打漿、 榨汁等常規(guī)工藝加工得到桑葉漿液，桑葉漿液中蛋白成分用2-羥基丙酸與乙醇混合液加熱 沉淀，桑葉漿液要求的加熱溫度控制在90°C，其特征是在于殺菌去除部分有機(jī)物或雜質(zhì)，靜 置45分鐘后反應(yīng)，沉淀部分為桑葉蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法，經(jīng)生物膜固液分離其目 的在于進(jìn)一步去雜、殺菌、脫色，其目標(biāo)產(chǎn)物為3KDa~7KDa小分子蛋白濃縮液體，其特征在 于其蛋白濃度大于80%.pro/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法，其特征是金屬離子的定 向緩釋其目的在于與分離得到的小分子濃縮液體蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，采用25°C、PH=7條件下、 0.2mol/l磷酸鈉緩沖液、配制還原劑二硫蘇糖醇（DTT，lmmol/L)或B2疏基乙醇（lOmmol/ L)作為巰基（一 SH)結(jié)構(gòu)活性穩(wěn)定劑，以L(升)為計(jì)量單位與金屬離子的比例為1000:1(蛋白 濃度與金屬離子之比），具體實(shí)施步驟為： 第一類(MTs-PS _ -I)金屬離子定向緩釋順序依次為： 鐵(Fe)-錳(Μη) -鈣（Ca)-鎂(Mg)-鈉(Na)-鉻（Cr)所得產(chǎn)物分子量為3~5kDa的 MTS-Ι巰基化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰220nm; 第二類(MTs-PS _ -Π )金屬離子定向緩釋順序依次為： 鋅(Zn)-銅(Cn)-鎘(Cd)-鉛(Pb)-汞(Hg)，所得產(chǎn)物分子量為6~7kDa的MTS-Π 巰基 化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰250nm; 第三類(MTs-PS _ -m)金屬離子定向緩釋順序依次為： 鎳(Ni)-鋁(A1)-鉬(Mo)-鈦(Ti)-鍶（Sr)，所得產(chǎn)物分子量為6~7kDa的MTS-ΙΠ 巰基 化合物，其表現(xiàn)出特征吸收峰275nm; 經(jīng)上述金屬離子定向緩釋其目的在于誘導(dǎo)合成得到MT巰基化合物為階8卞5_-1、11^-PS _ -Π 、MTs-PS _ -m不同的配位結(jié)構(gòu)；上樣后，采用多維核磁共振(匪R)法化學(xué)計(jì)量比分 析得出MTs-PS _ -I形成線形配位結(jié)構(gòu)，配位數(shù)為2;MTs-PS _ -Π 形成三角形配位結(jié)構(gòu)，配位 數(shù)為3;MTs-PS _ -ΙΠ 形成二面體配位結(jié)構(gòu)，配位數(shù)為4;PH在酸性環(huán)境下對(duì)三種不同類型MT 巰基化合物進(jìn)行脫金屬進(jìn)處理，得到脫金屬硫蛋白，波長(zhǎng)190nm處有明顯肽鍵吸收峰。5. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法，其特征是加入GST酶切液 和巰基乙醇的混合液，柱外酶切，酶切后的反應(yīng)混合液經(jīng)膜過(guò)濾裝置濃縮后，收集洗脫峰； 分別配制硅酸鹽和氯化鈉的混合溶液，進(jìn)行重復(fù)洗脫至中性條件下形成多聚體蛋白，即為 ΜΤ-Ι、ΜΤ-Π 、ΜΤ-ΙΠ 的蛋白濃縮液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種桑葉金屬硫蛋白的制備方法，其特征是分別收集(MTs-PS _ -I)220nm處洗脫峰的洗脫液、（MTs-PS _ - Π )250nm處洗脫峰的洗脫液、（MTs-PS _ -ΙΠ ) 275nm處洗脫峰的洗脫液，經(jīng)Sephadex G-25層析柱兩次脫鹽，收集洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真 空凍干，采用ELISA法測(cè)得硫蛋白含量，用火焰原子吸收法測(cè)定金屬元素含量、用DTNB法測(cè) 定巰基含量、金屬硫蛋白分子量測(cè)定用電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定;分別得到MT-I純度(95%)，感官 呈雪白色凍干粉末，ΜΤ-Π 純度(95%)感官呈微黃或白色凍干粉末;ΜΤ-ΙΠ 純度(95%)感官呈 白色結(jié)晶體凍干粉末，貯存條件為-14°C~25°C最佳。
【文檔編號(hào)】C07K14/825GK105859875SQ201610358800
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】左有權(quán)
【申請(qǐng)人】湖南海熙生物科技有限公司