一種利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片的方法，通過采集露白期前的幼小花蕾，用8?羥基喹啉溶液處理并過夜后，將花蕾進(jìn)行剝離，保留花托，分解花托為子房組織，利用混合酶液浸沒，在35℃恒溫放置3.0～3.5h后，用蒸餾水浸泡，最后進(jìn)行正常涂片既得。本方法選取初花時期幼嫩的花托為材料，進(jìn)行染色體制片，材料選取容易，獲得的分裂相舒展、染色體形態(tài)良好，適于進(jìn)行核型分析及染色體原位雜交等分析過程。
【專利說明】
一種利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多年生果樹育種是園藝植物育種中的重點和難點。近年來興起利用染色體操作技術(shù)進(jìn)行果樹育種的方法，如:培育三倍體無籽果樹新品種。通過自然篩選和物理、化學(xué)誘導(dǎo)獲得果樹多倍體成為果樹育種的重要途徑之一。
[0003]枇杷是原產(chǎn)我國的特色水果，其獨特的冬花、春實、夏熟特征緩解了春夏鮮食水果缺乏的窘境，其獨特的風(fēng)味也使其成為廣大消費者青睞的對象。由于枇杷籽多肉少，給消費者食用帶來極大不便，無籽枇杷應(yīng)運而生，其中三倍體無籽枇杷的培育創(chuàng)造了水果育種的大篇章。在枇杷多倍體育種中，對植株染色體的鑒定不可或缺，特別是部分質(zhì)優(yōu)、高產(chǎn)的優(yōu)良單株以及一些優(yōu)良芽變新株系。在枇杷多倍體研究中，多倍體雜交后代染色體數(shù)目呈多樣性變化。對這些植株染色體數(shù)目的鑒定成為多倍體枇杷研究的重點之一。
[0004]枇杷染色體制片主要以種子萌發(fā)生根，取根尖為材料進(jìn)行染色體制片。植株根尖、幼嫩葉片和莖尖也可以作為制片材料。但是對于成年植株則難以取得根尖，高空壓條雖然可以獲得大量根系，但是這對植株有較大損害。幼嫩葉片和莖尖由于表面絨毛難以去除而較少成為制片材料。枇杷花序為圓錐狀花序，大量小花著生于花序之上，每個單花的發(fā)育均在較短時間內(nèi)完成。其中在露白前有一個快速膨大時期，取這一時期的花蕾進(jìn)行染色體制片將可以獲得優(yōu)良的分裂相。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)取材不方便和對植株損害大的缺點，目的是提供一種取材方便，可獲得良好分裂相的枇杷染色體制片方法，該方法利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片，一方面省去了高空壓條技術(shù)對植株的損害和由此帶來的勞動消耗，另一方面由于其材料來源豐富，對試驗的進(jìn)行極為有利。
[0006]本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]—種利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片的方法，具體包括以下步驟:
[0008]I)取材:選取新花枝，采集露白期前的幼小花蕾；
[0009]2)預(yù)處理:將采集的花蕾浸入8-羥基喹啉溶液中4h，吸出處理液，利用卡洛氏固定液固定過夜；
[0010]3)材料剝離:將花蕾進(jìn)行剝離，去除表皮，保留花托；
[0011]4)酶解:將花托分解為Imm3的子房組織，清洗后用蒸餾水浸泡20min后，浸沒于混合酶液中，震蕩使懸浮，于35°C恒溫放置3.0?3.5小時；
[0012]5)低滲處理:酶解子房組織置于蒸餾水中浸泡10?15min后，用卡洛氏固定液固定；
[0013]6)涂片:取出帶有固定液的子房組織在清潔、干燥的載玻片上快速涂抹，并用固定液覆蓋涂布好的材料，微烤至固定液呈液滴狀即可。
[0014]特別的，步驟(I)中采集的幼小花蕾以小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期前為佳。
[0015]特別的，步驟(3)材料剝離具體為將花蕾分解，去除花瓣、花萼、雌蕊、雄蕊以及表皮，留下含子房的花托。
[0016]特別的，步驟(4)中酶解前將花托分解為Imm3的組織塊后酶解。
[0017]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明方法選取枇杷成年植株幼嫩的花托為材料，進(jìn)行染色體制片，花蕾取材容易，且有大量材料可供備選。經(jīng)去除表皮及華的其它組織，留下花托經(jīng)酶解后涂片，可獲得較為分散的中期分裂相，染色體較為舒展，背景較淺，適于進(jìn)行核型分析及染色體原位雜交等后續(xù)分析過程。
【附圖說明】
:
[0018]圖1是本發(fā)明利用幼嫩子房為材料進(jìn)行染色體制片獲得的二倍體(2n= 2x = 37)植株染色體照片；
[0019]圖2是本發(fā)明利用幼嫩子房為材料進(jìn)行染色體制片獲得的三倍體(2n= 3x = 51)植株染色體照片；
[0020]圖3是本發(fā)明利用幼嫩子房為材料進(jìn)行染色體制片獲得的四倍體(2n= 4x = 58)植株染色體照片。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0022]實施例1對成年二倍體(2n= 2x = 34)植株進(jìn)行染色體制片
[0023]—種利用幼嫩花托進(jìn)行枇杷染色體制片的方法，具體通過以下步驟完成:
[0024]I)取材:于初花期或者在整個花期的任意時刻選擇新花枝對單個成年植株進(jìn)行取材，取材時間為晴朗早上8:00-9:00之間，取材對象為露白期前的幼小花蕾，以小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期前為佳，因不同材料花蕾大小存在差異；
[0025]2)預(yù)處理及固定:用眼科鑷將花蕾取下，去掉花柄后放入裝有0.002mol/L 8_羥基喹啉溶液的棕色小玻璃管中，輕輕振蕩使花蕾浸入溶液中。處后吸出預(yù)處理液，加入卡洛氏固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，固定過夜；
[0026]3)材料剝離:從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷小心剝?nèi)セㄍ斜砥?，除去花萼、花冠、雄蕊和柱頭，留下花托。
[0027]4)酶解:將去皮花托分解為1_3的組織塊，將組織塊放置于離心管中，加入蒸餾水清洗2次，后加入蒸餾水浸泡20分鐘，吸出蒸餾水，加入混合酶液(3 %纖維素酶+0.03 %果膠酶，酶和子房體積比為10:1，不同廠家、批次的酶制劑，可適當(dāng)調(diào)整濃度)浸沒材料，震蕩子房使其在酶液中懸浮一次，于35°C恒溫箱中放置，3.0-3.5小時(可根據(jù)材料調(diào)整酶解時間)后取出；
[0028]5)低滲處理:酶解后的材料從恒溫箱中取出后，尖嘴吸管吸出酶液，加入蒸餾水，放置10-15分鐘后吸出蒸饋水，加入卡洛氏固定液；
[0029]6)涂片:用鑷子夾取子房并于鑷尖滴加卡洛氏固定液，在清潔、干燥的載玻片上快速涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴固定液于載玻片上涂布好材料范圍的中央，將固定液沿四周輕輕吹散開，酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀即可。
[0030]7)鏡檢拍照，如圖1所示。
[0031]后經(jīng)過
【申請人】實驗，利用本發(fā)明方法還可對成年三倍體(2n= 3x = 51)以及四倍體(2n = 4x = 68)植株進(jìn)行染色體制片，如圖2和圖3所示，均可獲得較為分散的中期分裂相，染色體較為舒展，背景較淺，適于進(jìn)行核型分析及染色體原位雜交等后續(xù)分析過程。
【主權(quán)項】
1.一種利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片的方法，其特征在于具體包括以下步驟: 1)取材:選取新花枝，采集露白期前的幼小花蕾； 2)預(yù)處理:將采集的花蕾浸入8-羥基喹啉溶液中4h，吸出處理液，利用卡洛氏固定液固定過夜； 3)材料剝離:將花蕾進(jìn)行剝離，保留花托； 4)酶解:將花托分解為Imm3的子房組織，清洗后用蒸餾水浸泡20min后，浸沒于混合酶液中，震蕩使懸浮，于35°C恒溫放置3.0?3.5小時； 5)低滲處理:酶解子房組織置于蒸餾水中浸泡10?15min后，用卡洛氏固定液固定； 6)涂片:取出帶有固定液的子房組織在清潔、干燥的載玻片上快速涂抹，并用固定液覆蓋涂布好的材料，微烤至固定液呈液滴狀即可。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片的方法，其特征在于:步驟(I)中采集的幼小花蕾以小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期前為佳。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片的方法，其特征在于:步驟(3)材料剝離具體為將花蕾分解，去除花瓣、花萼、雌蕊、雄蕊以及表皮，留下含子房的花托。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用幼嫩花蕾進(jìn)行枇杷成年植株染色體制片的方法，其特征在于:步驟(4)中酶解前將花托分解為Imm3的組織塊。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838786SQ201610176922
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月24日
【發(fā)明人】梁國魯, 黨江波, 孫海燕, 郭啟高, 何橋, 向素瓊, 李曉林
【申請人】西南大學(xué)