具有催化活性的人豬嵌合尿酸氧化酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有催化活性的人豬嵌合尿酸氧化酶，編碼它們的DNA序列，含有該DNA序列的表達(dá)載體，含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及采用該宿主細(xì)胞制備人豬嵌合尿酸氧化酶的方法。該人豬嵌合尿酸氧化酶的序列是將SEQ ID NO：1所示序列進(jìn)行若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換所得的重組氨基酸殘基序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的人豬嵌合尿酸氧化酶有著更高的催化活性，具有制備低免疫原性甚至無免疫原性降尿酸藥物或藥物組合物的良好前景。
【專利說明】
具有催化活性的人豬嵌合尿酸氧化酶
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有催化活性的人豬嵌合尿酸氧化酶，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 痛風(fēng)和高尿酸血癥是目前危害人類健康的常見疾病;據(jù)統(tǒng)計(jì)，高尿酸血癥的發(fā)病 率已經(jīng)達(dá)到了人群的10%。痛風(fēng)是由于血尿酸水平過高而造成尿酸鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)中沉積而 導(dǎo)致的一種急性關(guān)節(jié)炎。目前控制痛風(fēng)的藥物主要是別嘌呤醇和丙磺舒類藥物。由于這兩 類藥物均需要長期服用，加之該類藥物都存在明顯的肝腎毒性以及過敏反應(yīng)，尤其是別嘌 呤醇，可以引起嚴(yán)重的剝脫性皮炎，甚至?xí)＜盎颊叩纳?。這些因素導(dǎo)致目前對(duì)這類疾病 的控制并不理想，進(jìn)而造成患者痛風(fēng)石的形成和腎功能的障礙。目前，高尿酸血癥已被列為 心血管疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，尋找有效的治療手段勢在必行。
[0003] 在動(dòng)物體內(nèi)，其尿酸的水平僅為人類的1/10。因此，痛風(fēng)和高尿酸血癥也被認(rèn)為是 人類獨(dú)有的疾病。動(dòng)物體內(nèi)尿酸水平低的原因是由于其體內(nèi)存在尿酸酶，能夠把尿酸進(jìn)一 步分解為極易溶解的尿囊素。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，人類的基因組中也存在尿酸酶基因，但是在人 類進(jìn)化的過程中，由于該基因的突變，造成其不能表達(dá)有功能的蛋白質(zhì)，從而成為假基因。 由此可見，尿酸酶是治療痛風(fēng)與高尿酸血癥的理想藥物。
[0004] 具有活性的尿酸酶是四聚體蛋白，由4個(gè)相同的亞基組成，每個(gè)亞基分子量在34kD 左右、且由301 - 304個(gè)氨基酸殘基組成。在溶液中，尿酸酶發(fā)揮酶活性的最適pH為8.0 (BayolA etaLBiophysChem. 1995 · 54:229 - 235 ·)。在目前所知的所有來源的尿酸酶中，比 活性最高的來源于黃曲霉，為27IU/mg;其次是來源于枯草芽胞桿菌，它的比活性保持在 13IU/mg(HuangS H，Wu T K.Eur J Biochem.2004.271:517 - 523·)。另外，來源于豆類植物 的尿酸酶，其活性只有2 -6IU/mg;來源于哺乳動(dòng)物的尿酸酶，經(jīng)過重組表達(dá)后，豬的尿酸酶 活性可以達(dá)到5 I U / m g，狒狒的尿酸酶酶活性只有1 I U / m g ( M i c h a e 1 Η，S u s a η J. K. 2006. US7056713B1)，而人源尿酸酶無活性。
[0005] 在藥物研究中，微生物尿酸酶的高活性和哺乳動(dòng)物尿酸酶的低免疫原性，使得這 兩大來源的尿酸酶成了目前開發(fā)應(yīng)用重組尿酸酶的研究熱點(diǎn)。但黃曲霉來源的尿酸酶與推 測出的人源尿酸酶的同源性不足40%(1^6(：(：，111父，6丨1^8 1?八，(：〇〇1^1?6，]\1似1^0 1， CaskeyC T.Science. 1988.239:1288 -1291.)，人體易產(chǎn)生抗黃曲霉來源尿酸酶抗體，黃曲 霉來源尿酸酶的功效迅速減弱，同時(shí)引發(fā)嚴(yán)重過敏性反應(yīng)，無法用于長期治療。20多年前， 黃曲霉尿酸酶(Uricozyme)在法國和意大利批準(zhǔn)。本世紀(jì)初，黃曲霉來源尿酸酶基因的酵母 基因工程菌表達(dá)的尿酸酶(Rasburicase)在美國和歐盟批準(zhǔn)。由于這兩種尿酸酶的基因均 來自于黃曲霉，有很強(qiáng)的免疫原性，Ur icozyme和Rasburicase出現(xiàn)嚴(yán)重過敏反應(yīng)的比例達(dá) 5%以上，并且還有近半數(shù)的患者出現(xiàn)發(fā)熱，惡心嘔吐等不良反應(yīng)。
[0006] 目前在美國用于臨床的尿酸酶(Pegloticase)是經(jīng)過PEG化修飾的豬和狒狒的重 組尿酸酶嵌合蛋白，商品名為KRYSTEXXA。雖然該尿酸酶來源于哺乳動(dòng)物(豬和狒狒），但由 于與人類的差異造成的過敏反應(yīng)，加之PEG化的影響，其免疫原性仍然較強(qiáng)。每兩周一次靜 脈注射KRYSTEXXA的患者中92 %產(chǎn)生了抗peglot icase的抗體，42 %的患者產(chǎn)生了抗PEG抗 體;輸液反應(yīng)的發(fā)生率達(dá)到26%。盡管如此，美國FDA于2010年批準(zhǔn)了該藥上市。由此可見該 類藥物有著巨大的市場需求。
[0007] 發(fā)明人曾于2014年2月11日申請(qǐng)了申請(qǐng)?zhí)枮?01410048071.9、申請(qǐng)公布號(hào)為 CN103834623A、名稱為《具有催化活性的人源尿酸氧化酶》的中國發(fā)明專利申請(qǐng)，其中對(duì)人 尿酸氧化酶進(jìn)行具體位點(diǎn)氨基酸殘基替換、或者進(jìn)行外顯子位點(diǎn)氨基酸殘基替換，并最終 獲得了具有催化活性的人源尿酸氧化酶。此后，發(fā)明人將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向獲得具有更高催化 活性的人源尿酸氧化酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種具有催化活 性的人豬嵌合尿酸氧化酶，與發(fā)明人之前的成果相比，具備更高的催化活性。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0010] 一種具有催化活性的人豬嵌合尿酸氧化酶，其特征是，該酶的序列是將SEQ ID NO: 1所示序列進(jìn)行若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換所得的重組氨基酸殘基序列;所述若干位點(diǎn)氨 基酸殘基替換由1 一 3個(gè)外顯子替換、以及0至2個(gè)定點(diǎn)替換組成；
[0011]所述外顯子替換選自：
[0012] 第84至122位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID N0:2的第84至122位氨基酸殘基序 列；
[0013] 第149至211位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID N0:2的第149至211位氨基酸殘基序 列；
[0014] 第212至252位氨基酸殘基序列替換為SEQ ID N0:2的第212至252位氨基酸殘基序 列；
[0015] 所述定點(diǎn)替換選自：
[0016] 第24位谷氨酸替換為天冬氨酸；
[0017]第83位谷氨酸替換為甘氨酸。
[0018]優(yōu)選地，所述若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換由3個(gè)外顯子替換和1 一 2個(gè)定點(diǎn)替換組成。
[0019] 優(yōu)選地，所述若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換由3個(gè)外顯子替換和2個(gè)定點(diǎn)替換組成。
[0020] 優(yōu)選地，所述重組氨基酸殘基序列為SEQ ID N0:3至SEQ ID N0:5之一。
[0021] 本發(fā)明還提供：
[0022] 上述人豬嵌合尿酸氧化酶用于制備降尿酸藥物或藥物組合物的用途。
[0023] 含有上述人豬嵌合尿酸氧化酶的藥物組合物。
[0024] 編碼上述人豬嵌合尿酸氧化酶的基因序列。
[0025]含有上述基因序列的表達(dá)載體。
[0026]含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0027] 制備前文所述人豬嵌合尿酸氧化酶的方法，包括:采用前文所述的宿主細(xì)胞表達(dá) 所述人豬嵌合尿酸氧化酶，然后經(jīng)分離、純化后獲得人豬嵌合尿酸氧化酶成品。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的人豬嵌合尿酸氧化酶有著更高的催化活性，具有制備 低免疫原性甚至無免疫原性降尿酸藥物或藥物組合物的良好前景。
【附圖說明】
[0029]圖1為豬尿酸酶中24位氨基酸的結(jié)構(gòu)分析示意圖。
[0030]圖2為豬尿酸酶中83位氨基酸的結(jié)構(gòu)分析示意圖。
[0031]圖3為人豬嵌合尿酸氧化酶分離純化電泳圖。泳道1:人豬嵌合尿酸氧化酶的菌液； 泳道2:人豬嵌合尿酸氧化酶菌液在超聲破碎后的上清;泳道3:人豬嵌合尿酸氧化酶在鹽析 后以緩沖溶液復(fù)溶的溶液;泳道4:人豬嵌合尿酸氧化酶在層析前的溶液;泳道5:人豬嵌合 尿酸氧化酶在層析后的溶液。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 1.本發(fā)明的主要技術(shù)成果
[0033] 發(fā)明人應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)14種不同生物來源(人、黑猩猩、猩猩、大猩猩、長 臂猿、狒狒、獼猴、食蟹猴、夜猴、家兔、小鼠、狗、牛、豬）的尿酸氧化酶氨基酸序列進(jìn)行了比 對(duì)，鑒別出錯(cuò)意突變位點(diǎn)主要分布在人尿酸酶基因的3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)外顯子區(qū)域內(nèi)。哺乳動(dòng)物 豬尿酸酶氨基酸與人源尿酸酶氨基酸同源性在88%以上，活性區(qū)域高度一致。利用外顯子 替換技術(shù)，在不具有尿酸酶活性的人尿酸酶氨基酸序列中，通過外顯子替換技術(shù)引入部分 影響酶催化活性的豬源尿酸酶氨基酸序列，最終獲得具有尿酸酶活性的人豬嵌合尿酸酶， 且提高了與推導(dǎo)出的無活性人源尿酸酶氨基酸序列的同源性，從而實(shí)現(xiàn)降低人體中免疫原 性的目的。
[0034]將人的尿酸酶基因3、5、6號(hào)外顯子與豬尿酸酶基因的相應(yīng)外顯子替換，得到有活 性的人豬嵌合尿酸酶，該嵌合蛋白氨基酸序列（SEQ ID N0:3)與人源尿酸酶氨基酸序列同 源性可以提高至90%以上。
[0035] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在研制重組蛋白質(zhì)藥物中需盡量克服蛋白的物理和化學(xué) 不穩(wěn)定性。尿酸酶蛋白的高疏水性等生物物理性質(zhì)決定了相對(duì)高濃度的蛋白質(zhì)溶液（> 5mg/ml)處于非生理?xiàng)l件下（如高溫或弱酸性pH值)時(shí)會(huì)加速其交聯(lián)和聚集（即較差的物理 穩(wěn)定性和不利于制備成生物制品的特性）。運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)重組的尿酸酶進(jìn)行了序 列比對(duì)、同源模建，分析關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)其結(jié)構(gòu)造成的影響，從而再對(duì)關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn) 行定點(diǎn)突變，進(jìn)而改善其活性和穩(wěn)定性。
[0036] 發(fā)明人經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明前述的重組人豬嵌合尿酸酶氨基酸序列的基 礎(chǔ)上，經(jīng)過2個(gè)氨基酸(24位和83位)的定點(diǎn)突變，不僅提高了原蛋白的酶活性，還增強(qiáng)或改 善了嵌合蛋白的理化性質(zhì)(減少了疏水介導(dǎo)的聚集，提高了與溶劑的相容性，增加了體外熱 穩(wěn)定性，延長了體內(nèi)代謝半衰期，等等）。該人豬嵌合尿酸氧化酶氨基酸序列為SEQ ID N0: 5,其中3、5、6號(hào)外顯子來源于豬尿酸酶氨基酸序列（SEQ ID N0:2)，其余外顯子來源于人尿 酸酶氨基酸序列（SEQ ID N0:1)，且24位和83位氨基酸定點(diǎn)突變。
[0037]需要說明的是，第1至10位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于1號(hào)外顯子，第11至83位氨基酸殘基 對(duì)應(yīng)于2號(hào)外顯子，第84至122位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于3號(hào)外顯子，第123至148位氨基酸殘基對(duì) 應(yīng)于4號(hào)外顯子，第149至211位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于5號(hào)外顯子，第212至252位氨基酸殘基對(duì) 應(yīng)于6號(hào)外顯子，第253至280位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于7號(hào)外顯子，第281至305位氨基酸殘基對(duì) 應(yīng)于8號(hào)外顯子。
[0038]由圖1中分析可知，在豬尿酸酶中的24位氨基酸，天冬氨酸（D)可與相鄰亞基的 K291、Y289形成氫鍵(或通過水分子），谷氨酸(E)則由于與V47形成氫鍵，遠(yuǎn)離相鄰亞基的 K29UY289,不利于二聚體穩(wěn)定位于β?折疊中的柔性部位，可能對(duì)β?延伸方向存在影響，因 此在此位點(diǎn)，天冬氨酸(D)能提高3 - 5 - 6人豬嵌合尿酸酶的酶活性和穩(wěn)定性。
[0039]由圖2分析可知，在豬尿酸酶中的83位氨基酸，（1)83位氨基酸位于α螺旋2、α螺旋3 兩個(gè)螺旋之間的回轉(zhuǎn)處，甘氨酸(G)有利于消除由附近氨基酸殘基造成的空間位阻，而谷氨 酸(Ε)能增加空間位阻，影響柔韌性。⑵谷氨酸(Ε)為酸性氨基酸，可能與附近的Κ85，Κ47等 存在作用力，影響螺旋定位。（3)活性位點(diǎn)Thr68和Asp69位于α螺旋2的另一側(cè)，而α螺旋2的 空間定位并不牢固，Ε83可能會(huì)不利于與兩者的空間定位，進(jìn)而影響酶活性。
[0040]用于編碼本發(fā)明前述人豬嵌合尿酸氧化酶的多核苷酸序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知的DNA重組、PCR等各種技術(shù)來獲得，但不局限于本發(fā)明較佳實(shí)施方案中采用的兩輪重 疊延伸PCR法以及Strantagene的quick change中描述的定點(diǎn)突變方法。
[0041]將上述多核苷酸與相應(yīng)表達(dá)載體進(jìn)行有效連接后，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中表 達(dá)。上述載體可以通過附加體或整合到宿主染色體的形式在宿主生物中進(jìn)行復(fù)制。在適當(dāng) 的啟動(dòng)子控制下，人豬嵌合尿酸氧化酶可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞 中表達(dá)。優(yōu)選大腸桿菌作為宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。其他適用的微生物宿主包括 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas) 和葡萄球菌屬(Staphylococcus)等。也可以在這些原核宿主中制備表達(dá)載體，也可具有眾 多公知啟動(dòng)子中的任一種，如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸啟動(dòng)子系統(tǒng)、β內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng) 或噬菌體λ或Τ7來源的啟動(dòng)子系統(tǒng)。通常這些啟動(dòng)子會(huì)控制表達(dá)，且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序 列等，以便起始和完成轉(zhuǎn)錄及翻譯。
[0042] 同時(shí)，酵母或真菌等其它微生物也可用于表達(dá)。優(yōu)選的酵母宿主為畢赤酵母 (Pichia pastoris)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)以及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia angusta)。真菌宿主包括黑 曲霉（Aspergillus niger)、里氏木霉（Trichoderma reesei)及裂裙菌（Schizophyllum commune)，也可選擇使用其他真菌。
[0043] 此外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)也可用于表達(dá)生產(chǎn)本發(fā)明的人豬嵌合尿酸氧化酶。優(yōu)選 的細(xì)胞包括:CH0細(xì)胞系、多種C0S細(xì)胞系、NS0細(xì)胞、敘利亞地鼠（Syrian Hamster)卵巢細(xì)胞 系、Hela細(xì)胞或人胎腎細(xì)胞系（即HEK293、HEK293EBNA)。
[0044] 可以通過公知的方法將含有目的多核苷酸序列(如人豬嵌合尿酸氧化酶的編碼序 列以及表達(dá)控制序列）的載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)，所采用的方法取決于細(xì)胞宿主的類型。例 如，對(duì)原核細(xì)胞通常采用氯化鈣轉(zhuǎn)染法，而對(duì)于其他細(xì)胞宿主可以使用磷酸鈣處理或電穿 孔法。
[0045] 如前所述的本發(fā)明人豬嵌合尿酸氧化酶可以從宿主細(xì)胞內(nèi)部或外部(如培養(yǎng)基） 分離得到，且純化為高純度的均一蛋白。此種蛋白分離純化的方法不限于任何特定方法。事 實(shí)上，可用任何本領(lǐng)域已公知的方法，例如柱層析法、過濾法、超濾法、鹽析法、等電點(diǎn)沉淀 法、透析法等。對(duì)于層析，例如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、反相層 析、吸附層析等都可以應(yīng)用。這些層析可用液相層析如HPLC和FPLC來操作?？刹捎猛ㄓ玫牡?白檢測方法檢測蛋白濃度和純度，例如HPLC法、SDS-聚丙烯酰胺電泳法、等電點(diǎn)電泳法、 BCA法、Lowry法、Western Blot法等。因此，本發(fā)明可提供高純度重組的尿酸酶嵌合蛋白及 其突變體蛋白。
[0046] 2.下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是本發(fā)明不限于所給出的例 子。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法;試劑和材料，如無特殊說明， 均可通過商業(yè)途徑獲得。
[0047]實(shí)施例1人豬嵌合尿酸氧化酶壓-#3!14?5-6117- 8-24突變體DNA的構(gòu)建及其在大腸桿 菌BL21中重組表達(dá)。
[0048] 以蛋白（Seq ID No:3)的DNA序列為原始模板，用重疊延伸PCR法突 變制備含有目標(biāo)突變的DNA。
[0049] 制備Hi 一 2P3H4P5-6H7-8 - 24片段的過程如下。
[0050] 第一階段PCR:模板序列為出一2?3貼5-6117- 8蛋白的0嫩序列，引物為表1中引物1和引 物4，PCR反應(yīng)體系和方法均采用PCR反應(yīng)試劑盒(TAKARA，大連），按商家的說明書設(shè)置。
[0051 ] PCR 條件為：95 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 20s，共 30 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán) 95 °C 變性 5min， 最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物-24上片段。
[0052]第二階段PCR:模板序列同第一階段PCR，引物為表1中引物2和引物3。
[0053] PCR 條件為：951€3〇8,551€3〇8,72°(：10〇8，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)95°(：變性51^11， 最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物Hi-2Ρ3Η4Ρ5-6H7- 8-24下片段。
[0054] 第三階段PCR:模板為-6H7-8 - 24上片段和-6H7- 8 - 24下片段的 1:1混合溶液，引物為表1中引物1和引物2，按上述PCR條件擴(kuò)增獲得產(chǎn)物HuP^Ps-6H7-8- 24片段，其編碼的人豬嵌合尿酸氧化酶序列為SEQ ID No:4。
[0055] 將 H1-2P3H4P5-6H7-8 - 24片段和pET - 22b( + )同時(shí)使用NdeI和HindIII進(jìn)行雙酶 切，回收酶切片段，使用T4一DNA連接酶連接兩個(gè)酶切片段，使用《分子克隆》(盧圣棟編）中 所述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21。
[0056] 在含有AMP抗性的LB平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，經(jīng)過12 - 16h小時(shí)的生長，挑取單克隆 轉(zhuǎn)化菌落，在AMP+的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，進(jìn)行菌落PCR初步篩選出陽性克隆，經(jīng)測序確 定含有出-#3114?5-6117-8-240嫩的陽性重組質(zhì)粒中的尿酸氧化酶序列與理論完全一致。
[0057]使用大腸桿菌 BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)或 BL21 Star(DE3)plysS、表達(dá)人豬嵌 合尿酸氧化酶蛋白。這些菌株僅是許多適用于表達(dá)嵌合蛋白中的一些，它們可以分別通過 商業(yè)渠道自Novagen，Invitrogen及Stratagen獲得。利用轉(zhuǎn)化體在含有AMP的LB平板上的生 長能力可將其鑒別出來。
[0058]將上述經(jīng)過測序正確的BL21表達(dá)重組菌，按照1 %的甘油管接種量接入LB培養(yǎng)基 裝液量為30ml的250ml的三角瓶中，且培養(yǎng)基中含有100μg/ml的AMP。于37°C，220rpm搖床中 培養(yǎng)至〇D6Q()約為1.7時(shí)，加入終濃度為0.2μΜ的IPTG進(jìn)行尿酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)6h后收集 菌體，離心得到濕菌體，并以SDS-PAGE監(jiān)測。
[0059] 實(shí)施例2人豬嵌合尿酸氧化酶HHP3H4P5-6H7-8 - 24 - 83突變體DNA的構(gòu)建及其在大 腸桿菌中重組表達(dá)。
[0060]以Η^ΡΛΡδ-6H7-8 -24蛋白DNA序列為原始模板，用重疊延伸PCR法突變制備含有 目標(biāo)突變的DNA。
[0061 ] 制備壓一必!14?5-6117-8 - 24 - 83的具體過程如下。
[0062] 第一階段PCR:模板序列為實(shí)施例1所得出一必!^5-6117- 8 - 24片段，引物為表1中引 物1和引物6，PCR反應(yīng)體系和方法均采用PCR反應(yīng)試劑盒(TAKARA，大連），按商家的說明書設(shè) 置。
[0063] PCR 條件為：95 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 33s，共 30 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán) 95 °C 變性 5min， 最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物出-必!14?5-6117-「24 -83上片段。
[0064] 第二階段PCR:模板序列同第一階段PCR，引物為表1中引物2和引物5。
[0065] PCR 條件為：95 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 90s，共 30 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán) 95 °C 變性 5min， 最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物-24 -83下片段。
[0066] 第二階段 PCR:模板為 Hi-2P3H4P5-6H7-8 - 24 - 83 上片段和 Hi-2P3H4P5-6H7-8 - 24 - 83 下片段的1:1混合溶液，引物為表1中引物1和引物2,按上述PCR條件擴(kuò)增得到產(chǎn)物Hh2P3H4P5-6H7-8-24 - 83突變體DNA，其編碼的人豬嵌合尿酸氧化酶序列為SEQ ID No:5。
[0067] 將含所得DNA序列用Nde I和BamH I進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)方法同實(shí) 施例1。
[0068]各引物序列見表1。
[0069]表1各實(shí)施例所用引物序列
[0070]
[0071] 實(shí)施例3人豬嵌合尿酸氧化酶的純化。
[0072]將實(shí)施例1、2培養(yǎng)的發(fā)酵液以4000rpm、20min離心，收集菌體，菌體再用pH8.6的 0.05M Tri s-He 1緩沖液按1 g菌體10ml體積的比例重懸，離心，洗滌兩遍。取菌體，每1 g菌體 補(bǔ)入10ml緩沖液(pH8.6 Tris-Hcl)懸浮菌體，攪拌均勻并冷凍過夜，然后37°C水浴中迅速 解凍，如此反復(fù)凍融4次。將上述菌體懸液融化后，超聲(功率60%、40min、超聲5s、間隙5s)， 注意超聲破壁時(shí)溫度保持在10度以下;待破菌完全后，8000r/min，4°C離心30min，分別取上 清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和酶活性測定。
[0073] 取破壁菌體懸液離心后的沉淀，每克沉淀以150ml緩沖液(0.1M Na2C03 - NaHC03、 pH 10.3)溶解，在4 °C中攪拌使沉淀溶解，然后以8000r/min，離心30min，取上清和沉淀分別 進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和酶活性測定。
[0074] 將溶解后蛋白溶液在4°C，以8000r/min離心30min，棄沉淀，取上清即為尿酸酶粗 酶溶液。先將10 %的硫酸銨加入到尿酸酶粗酶溶液，4°C放置過夜。4°C，12000r/min離心 15min，收集沉淀，緩沖液(0.1M Na2C03 - NaHC03、pH 10.3)溶解，即得蛋白樣品溶液。SDS - PAGE電泳分析，以分級(jí)沉淀的方式確認(rèn)最優(yōu)鹽析濃度。
[0075] 0 36?11&仰86?上陰離子填料裝柱（1.2\20〇11)，用？!110.3 0.謂碳酸鹽緩沖液平 衡過夜，流速為1. 〇ml/min。將所得蛋白溶液上樣，流速為0.5ml/min;上樣完畢后用pHIO. 3 0.1M碳酸鹽緩沖液沖洗柱子至基線，然后用pHIO. 3 0.1M碳酸鹽緩沖液+0.5M NaCl梯度洗 脫，最后用pHIO. 3 0.1M碳酸鹽緩沖液+2.0M NaCl洗脫，洗脫流速為0.5ml/min。整個(gè)洗脫過 程用部分收集器收集流出液，每試管3ml，紫外280nm檢測蛋白流出情況，并用SDS -PAGE電 泳分析純化效果，最后合并目的蛋白峰(所得即為高純度人豬嵌合尿酸氧化酶），BCA法測定 蛋白含量，此時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE和HPLC檢測純度，均可達(dá)到95 %以上。
[0076]上述過程中，針對(duì)實(shí)施例2樣品純化時(shí)進(jìn)行的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖3所示。
[0077]實(shí)施例4各尿酸氧化酶的活性檢測。
[0078]尿酸氧化酶的活性測定:尿酸氧化酶催化尿酸降解，尿酸在293nm處具有特征吸收 峰，但是尿酸降解后的產(chǎn)物在此波長無吸收峰，因此可以根據(jù)293nm處吸光值的減少量來確 定尿酸被尿酸氧化酶降解的量，然后使用尿酸的摩爾消光系數(shù)算出尿酸濃度，根據(jù)尿酸濃 度的變化可以計(jì)算出尿酸氧化酶的活性。將紫外分光光度計(jì)波長調(diào)至293nm處，預(yù)熱30min， 使用硼酸一硼酸鈉緩沖液作為空白調(diào)零，取3ml于37°C預(yù)熱30min的60μΜ的尿酸溶液加入石 英比色皿中，補(bǔ)加0.5ml的上述粗酶液快速混勾，開始計(jì)時(shí)，每lmin記一次吸光值讀數(shù)，測量 5min內(nèi)293nm吸光度的變化值。
[0079]在37°C、pH8.5時(shí)，每分鐘轉(zhuǎn)化Ιμπιο?尿酸為尿囊素的酶量定義為一個(gè)國際單位 (IU)。按照如下公式計(jì)算尿酸酶活性。
[0080]
[0081] 上式中：U =尿酸酶活力單位;Αο為反應(yīng)初始時(shí)的0D293吸光值，Α為反應(yīng)5min后0D293的吸光值;Vt =反應(yīng)液總體積(ml) ;df =稀釋倍數(shù);11.254為尿酸在293nm波長下的微摩爾消 光系數(shù);Ve =酶液體積(ml)。
[0082] 各尿酸酶蛋白按實(shí)施例3方法分離純化后比活計(jì)算結(jié)果如下表所示，
[0083]
'[0084] 注1:PU0X(豬尿酸酶）的酶活數(shù)據(jù)獲得過程為:采用與實(shí)施例1相同的方法獲得豬 尿酸氧化酶基因的DNA，并進(jìn)行雙酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)、發(fā)酵后，按實(shí)施例3方法純 化，檢測純化所得蛋白的酶活數(shù)據(jù)。
[0085] 注2: SEQ ID N0:3的酶活數(shù)據(jù)獲得過程為:采用與實(shí)施例1相同的方法獲得SEQ ID NO: 3的DNA，并進(jìn)行雙酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)、發(fā)酵后，按實(shí)施例3方法純化，檢測純化 所得蛋白的酶活數(shù)據(jù)。
[0086] 由以上結(jié)果可知，SEQ ID NO :3所示人豬嵌合尿酸氧化酶、SEQ ID NO :4所示人豬 嵌合尿酸氧化酶、SEQ ID NO:5所示人豬嵌合尿酸氧化酶都是具有催化活性的尿酸氧化酶， 其中以SEQ ID N0:5所示人豬嵌合尿酸氧化酶的活性最為突出。而且，SEQ ID N0:5所示人 豬嵌合尿酸氧化酶的酶活數(shù)據(jù)是豬尿酸酶的接近1.4倍，明顯高于發(fā)明人之前申請(qǐng)的發(fā)明 (申請(qǐng)?zhí)?01410048071.9)中酶活最高的E24A-Ml 121- I115H-H119R-C141V-Q145V - Q151I - K208D - I214A-M219L-S222F - L232S - T233A-C240Y 尿酸酶(該尿酸酶的酶活數(shù) 據(jù)是豬尿酸酶的約1.1倍），這一優(yōu)勢在進(jìn)行本研究之前是無法預(yù)料的。
[0087] 本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均 落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有催化活性的人豬嵌合尿酸氧化酶，其特征是，該酶的序列是將SEQIDNO: 1所 示序列進(jìn)行若干位點(diǎn)氨基酸殘基替換所得的重組氨基酸殘基序列;所述若干位點(diǎn)氨基酸殘 基替換由1 一3個(gè)外顯子替換、以及0至2個(gè)定點(diǎn)替換組成； 所述外顯子替換選自： 第84至122位氨基酸殘基序列替換為SEQIDNO: 2的第84至122位氨基酸殘基序列； 第149至211位氨基酸殘基序列替換為SEQIDN0:2的第149至211位氨基酸殘基序列； 第212至252位氨基酸殘基序列替換為SEQIDNO: 2的第212至252位氨基酸殘基序列； 所述定點(diǎn)替換選自： 第24位谷氨酸替換為天冬氨酸； 第83位谷氨酸替換為甘氨酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有催化活性的人豬嵌合尿酸氧化酶，其特征是，所述若干位點(diǎn) 氨基酸殘基替換由3個(gè)外顯子替換和1 一 2個(gè)定點(diǎn)替換組成。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有催化活性的人豬嵌合尿酸氧化酶，其特征是，所述若干位點(diǎn) 氨基酸殘基替換由3個(gè)外顯子替換和2個(gè)定點(diǎn)替換組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有催化活性的人豬嵌合尿酸氧化酶，其特征是，所述重組氨基 酸殘基序列為SEQIDNO: 3至SEQIDNO: 5之一。5. 權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述人豬嵌合尿酸氧化酶用于制備降尿酸藥物或藥物組合物 的用途。6. 含有權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述人豬嵌合尿酸氧化酶的藥物組合物。7. 編碼權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述人豬嵌合尿酸氧化酶的基因序列。8. 含有權(quán)利要求7所述基因序列的表達(dá)載體。9. 含有權(quán)利要求8所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。10. 制備權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述人豬嵌合尿酸氧化酶的方法，其特征是，包括以下步 驟:采用權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞表達(dá)所述人豬嵌合尿酸氧化酶，然后經(jīng)分離、純化后獲 得人豬嵌合尿酸氧化酶成品。
【文檔編號(hào)】A61K38/44GK105838686SQ201610316709
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月13日
【發(fā)明人】陳建華, 謝光蓉, 李苗苗
【申請(qǐng)人】中國藥科大學(xué)